Methodenartikel

Fabricage en karakterisering van micronaaldpleisters voor het laden en afleveren van exosomen

DOI:

10.3791/67109

⸱

12 juli 2024

 ,  , 
1Medical School, Faculty of Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen hebben een aanzienlijk klinisch potentieel, maar hun praktische toepassing is beperkt vanwege de gemakkelijke in vivo klaring en slechte stabiliteit. Micronaalden bieden een oplossing door gelokaliseerde toediening mogelijk te maken door fysiologische barrières en conservering in droge toestand te doorboren, waardoor de beperkingen van exosoomtoediening worden aangepakt en hun klinische bruikbaarheid wordt uitgebreid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen, als opkomende biotherapeutica en vectoren voor de toediening van geneesmiddelen van de "volgende generatie", hebben een enorm potentieel op diverse biomedische gebieden, variërend van medicijnafgifte en regeneratieve geneeskunde tot ziektediagnose en tumorimmunotherapie. De snelle klaring door traditionele bolusinjectie en de slechte stabiliteit van exosomen beperken echter hun klinische toepassing. Micronaalden dienen als een oplossing die de verblijftijd van exosomen op de toedieningsplaats verlengt, waardoor de geneesmiddelconcentratie behouden blijft en aanhoudende therapeutische effecten worden vergemakkelijkt. Bovendien hebben micronaalden ook het vermogen om de stabiliteit van bioactieve stoffen te behouden. Daarom introduceren we een micronaaldpleister voor het laden en afleveren van exosomen en delen we de methoden, waaronder isolatie van exosomen, fabricage en karakterisering van met exosomen beladen micronaaldpleisters. De micronaaldpleisters werden vervaardigd met behulp van trehalose en hyaluronzuur als tipmaterialen en polyvinylpyrrolidon als rugmateriaal door middel van een gietmethode in twee stappen. De micronaalden vertoonden een robuuste mechanische sterkte, met tips die bestand waren tegen 2 N. Varkenshuid werd gebruikt om de menselijke huid te simuleren, en de uiteinden van micronaalden smolten volledig binnen 60 s na het doorboren van de huid. De exosomen die uit de micronaalden vrijkwamen, vertoonden morfologie, deeltjesgrootte, markereiwitten en biologische functies die vergelijkbaar waren met die van verse exosomen, waardoor dendritische cellen konden worden opgenomen en hun rijping werd bevorderd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen, kleine blaasjes die door cellen in de extracellulaire matrix worden afgegeven, zijn voorgesteld als potentiële biotherapeutica en vectoren voor medicijnafgifte voor de behandeling van verschillende ziekten enkankers. Tijdens hun biogeneseproces kapselen exosomen verschillende biologisch actieve moleculen in de cellen in, waaronder functionele eiwitten en nucleïnezuren2. Als gevolg hiervan hebben exosomen, wanneer ze tijdens het transportproces door ontvangende cellen worden opgenomen, het vermogen om genexpressie en cellulaire functies in de doelcellen te moduleren3. Als een soort natuurlijke informatieboodschapper zijn exosomen ten volle benut bij weefselregeneratie, immuunregulatie en als drager van de bevalling4. Door middel van technische technieken kunnen specifieke liganden worden verrijkt op het oppervlak van exosomen, waardoor de inductie of remming van signaleringsgebeurtenissen in ontvangende cellen mogelijk wordt of gericht op specifieke celtypen5. Chemotherapeutische middelen kunnen ook in exosomen worden geladen voor de behandeling van kanker6. Bovendien hebben exosomen het vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren voor therapeutische ladingafgifte, waardoor ze veelbelovend zijn voor de behandeling vanhersenaandoeningen. Vergeleken met liposomen vertonen exosomen een verbeterde cellulaire opname en verbeterde biocompatibiliteit8. Ze zijn in staat om efficiënt andere cellen binnen te dringen, terwijl ze een betere tolerantie en lagere toxiciteit vertonen9. De traditionele bolusinjectie van exosomen is echter vatbaar voor sekwestratie en snelle klaring door de lever, nieren en milt in de bloedbaan10. Bovendien hebben exosomen een slechte stabiliteit in vitro en zijn ze vatbaar voor opslagomstandigheden, die hun klinische toepassingen beperken11.

Micronaalden, een reeks naaldpunten van micrometrische grootte, hebben het vermogen om fysiologische barrières te doorbreken voor de afgifte van geneesmiddelen met kleine moleculen12, eiwitten13, nucleïnezuren14 en nanomedicijnen15. Micronaalden zijn nauwkeurig ontworpen om laesies op het huidoppervlak aan te pakken, en hun verspreide uiteinden zorgen voor een uniforme verdeling van het geneesmiddel op de beoogde plaats, waardoor hun therapeutische impact wordt versterkt16. Het ontwerp en de materiaalsamenstelling van micronaalden vergemakkelijken de droge opslag van bioactieve stoffen zoals eiwitten en nucleïnezuren, waardoor hun stabiliteit wordt verbeterd17. Traditionele injectiemethoden hebben een relatief korte werkingsduur en kunnen pijn veroorzaken, waardoor angst bij patiënten wordt opgewekt18. De lengte van de micronaald ter grootte van een micrometer minimaliseert weefseltrauma en voorkomt zenuwstimulatie, waardoor pijn wordt geëlimineerd en de therapietrouw van de patiënt wordtverbeterd19. Bovendien stelt het gebruiksvriendelijke karakter van micronaalden patiënten in staat om de behandeling zelf toe te dienen zonder dat er gespecialiseerd personeel nodigis 16. Naast de huid kunnen micronaalden ook worden gebruikt in weefsels zoals de ogen20, mondslijmvlies21, hart22 en bloedvaten23. De toepassing van micronaalden voor de klinische toediening van exosomen biedt een veelbelovende en prospectieve strategie.

Daarom introduceren we een exosoom-geladen micronaald (exo@MN) patch en onthullen we de fabricagemethode. De micronaaldpleisters werden vervaardigd met behulp van een gietmethode in twee stappen, samen met centrifugeren en vacuümdrogen, wat de aggregatie van exosomen aan de uiteinden van de micronaald bevordert, waardoor de afgifte-efficiëntie wordt verbeterd. Zowel de naaldpunten als de achterkant zijn gemaakt van materialen die een uitstekende biocompatibiliteit en oplosbaarheid in water vertonen. Trehalose en hyaluronzuur (HA) werden opgenomen als tipmaterialen om bescherming te bieden voor de exosomen, en polyvinylpyrrolidon (PVP) opgelost in absolute ethanol werd gekozen als dragermateriaal. De morfologie van de micronaaldpleister werd gekarakteriseerd met behulp van microscopie en scanning-elektronenmicroscoop (SEM). De mechanische tests van de micronaald werden beoordeeld met behulp van een trekmeter om hun vermogen om de huid binnen te dringen te bevestigen, en de afgiftesnelheid op varkenshuid werd onderzocht op 60 s. Bovendien werden de morfologie, grootte en eiwitinhoud van zowel verse exosomen als exosomen in exo@MN gekarakteriseerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscoop (TEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA) en western blotting (WB). De internalisatie van exosomen door dendritische cellen (DC's) werd gekarakteriseerd met behulp van confocale laserscanmicroscoop (CLSM) en de rijping van DC's werd geëvalueerd door middel van flowcytometrie. De morfologische karakterisering en biologische functies van de twee soorten exosomen zijn in wezen consistent.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor dit onderzoek is geen ethische goedkeuring vereist, aangezien de varkenshuid die voor de in sectie 3 beschreven experimenten is gebruikt, als eetbare varkensoren op de markt is gekocht en niet afkomstig is van proefdieren.

1. Isolatie van exosomen

  1. Celcultuur
    1. Kweek ovariumepitheelcellen ID8 van muizen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kweekmedium met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing (100×) (zie Materiaaltabel) in petrischaaltjes met een diameter van 15 cm.
    2. Incubeer ID8-cellen in een CO2 -incubator (zie materiaaltabel) bij 37 °C en 5% CO2 tot de celdichtheid 90% bereikt.
  2. Isolatie van exosomen
    1. Verwijder het voedingsmedium van de petrischaaltjes en was ze twee keer met de fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco. Voeg 20 ml DMEM toe zonder foetaal runderserum (zie Materiaaltabel) en penicilline-streptomycine-oplossing (zie Materiaaltabel). Ga door met incuberen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
    2. Verzamel het celcultuursupernatans van 20 petrischaaltjes met een diameter van 15 cm. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatans voor het verwijderen van vrije cellen.
    3. Centrifugeer bij 2000 x g gedurende 10 min 4 °C en verzamel het supernatans voor het verwijderen van celresten.
    4. Sluit het wegwerpvacuümfiltratiesysteem van 0.22 μm (zie Materiaaltabel) aan op de circulatiepomp (zie Materiaaltabel). Creëer een vacuüm om het supernatans door het polyethersulfonmembraan van 0,22 μm te laten gaan en de onderste kamer van het filtersysteem binnen te gaan, waardoor blaasjes of onzuiverheden groter dan 0,22 μm van het supernatant effectief worden verwijderd.
      1. Om de vacuümpomp aan te sluiten, zet u de pompschakelaar aan en sluit u deze vervolgens aan op de luchtinlaat van het vacuümfiltratiesysteem. Verbreek bij het sluiten eerst de verbinding met de pomp en schakel vervolgens de vacuümpomp uit. Deze procedure helpt terugstroming van de vacuümpomp en verontreiniging van de kweekvloeistof te voorkomen.
    5. Voeg 15 ml supernatans toe aan de binnenband van de 100 kDa ultrafiltratiebuis (zie Materiaaltabel). Centrifugeer op 3500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder de vloeistof uit de buitenste buis.
      OPMERKING: Bewaar deeltjes groter dan 100 kDa op het membraan van de binnenbuis, terwijl eiwitten kleiner dan 100 kDa samen met de oplossing naar de buitenste buis worden gecentrifugeerd. De exosomen waren groter dan 100 kDa en werden geaggregeerd op het membraan van de binnenband.
    6. Herhaal de bovenstaande stappen totdat het totale volume van de vloeistof binnen 5 ml is. Verzamel de vloeistof uit de binnenband en voeg 1 ml DPBS toe. Gebruik een pipet om herhaaldelijk in de binnenband te pipetteren, zorg ervoor dat de aangehechte exosomen in DPBS worden geresuspendeerd en verzamel ze vervolgens.
    7. Centrifugeer bij 10000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C en breng het supernatans over in een 6 ml snelklikcentrifugebuisje (zie Materiaaltabel). Sluit de buis af met een heatsealer.
    8. Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 2 uur 4 °C met behulp van een ultracentrifuge (zie Materiaaltabel). Snijd de snelklikcentrifugebuis open, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 μL DPBS. Dit is de exosoomoplossing.
      OPMERKING: Tijdens het resuspenderen van de pellet is het noodzakelijk om de buiswand minstens 200 keer te pipetteren en te schudden met een pipet.

2. Fabricage van exo@MN

  1. Voorbereiding van de hoofdmal
    1. Bouw een micronaaldmodel met een array van 10 x 10 met behulp van CAD-software, met conische uiteinden met de volgende parameters: een hoogte van 1200 μm, een basisdiameter van 400 μm en een pitch (afstand tussen aangrenzende micronaalden) van 900 μm.
    2. Gebruik HTL-hars als materiaal en print de mastermal van de micronaald met behulp van een 3D-printer (zie Materiaaltabel).
    3. Dompel de mastermal gedurende 1 uur onder in absolute ethanol om eventuele hars die aan het oppervlak kleeft te verwijderen.
    4. Stel de mal 5 minuten bloot aan ultraviolet licht om hem uit te harden.
    5. Dompel de vorm nogmaals 1 uur onder in absolute ethanol en droog hem vervolgens 1 uur op 60 °C in een droogoven. De mastermal is klaar.
  2. Voorbereiding van de productiemal
    1. Meng A- en B-componenten van polydimethylsiloxaan (PDMS, zie Materiaaltabel) in een verhouding van 10:1. Roer goed en giet het mengsel in een mastervorm.
    2. Plaats de PDMS-vorm gedurende 15 minuten onder een druk van 1 psi om luchtbellen uit het PDMS-mengsel te verwijderen.
    3. Laat de PDMS-mal gedurende 2 uur uitharden bij 60 °C en demold vervolgens om de productiemal van de micronaald te verkrijgen.
    4. Reinig de productiemal voor gebruik met ultrapuur water.
  3. Bereiding van de oplossing
    1. Kwantificeer het eiwitgehalte van de exosoomoplossing met behulp van een BCA-testkit (zie Materiaaltabel). Voeg een geschikte hoeveelheid DPBS toe om een concentratie van 10 μg/μL voor de exosoomoplossing te bereiken.
    2. Bereid een oplossing van 200 mg/ml trehalose (zie Materiaaltabel) met DPBS als oplosmiddel. Roer gedurende 20 minuten om ervoor te zorgen dat het volledig is opgelost.
    3. Bereid een oplossing van 200 mg/ml hyaluronzuur (HA, zie materiaaltabel) met DPBS als oplosmiddel. Roer een nacht om ervoor te zorgen dat het volledig is opgelost.
    4. Bereid een oplossing van 150 mg/ml polyvinylpyrrolidon (PVP, zie Materiaaltabel) met absolute ethanol als oplosmiddel. Roer een nacht om ervoor te zorgen dat het volledig is opgelost.
    5. Meng de exosoomoplossing (10 μg/μl) en trehalose-oplossing (200 mg/ml) in een volumeverhouding van 1:1. Voeg vervolgens een gelijk volume HA-oplossing toe (200 mg/ml). Meng grondig om de tipoplossing te verkrijgen.
  4. Fabricage van exo@MN
    1. Verwerk het oppervlak van de PDMS-mal met behulp van een plasmareiniger (zie Materiaaltabel) gedurende 30 s op een lage kwaliteit om de hydrofiliciteit te verbeteren.
    2. Voeg 40 μL van de tipoplossing toe aan de PDMS-vorm. Centrifugeer bij kamertemperatuur (RT) en 3000 x g gedurende 3 minuten om ervoor te zorgen dat de vloeistof de naaldlaag van de mal vult.
    3. Verwijder overtollige vloeistof in de vorm en droog bij RT in een vacuümdroogoven (zie Materiaaltabel) gedurende 1 dag.
    4. Voeg 200 μL PVP-oplossing toe aan de PDMS-mal. Centrifugeer 3000 x g gedurende 3 minuten bij RT om ervoor te zorgen dat de vloeistof de steunlaag van de mal vult.
    5. Droog de vorm bij RT 1 dag in een droogoven en demvorm vervolgens om de exo@MN pleister te verkrijgen.
      NOTITIE: Bewaar de exo@MN pleister in een droogoven tot gebruik gebruik.

figure-protocol-1
Figuur 1: Fabricageproces van exo@MN patches. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Karakterisering van exo@MN patches

  1. Observatie van de morfologie
    1. Plak de achterkant van de pleister op een schuin oppervlak van 45° en plaats deze onder een stereomicroscoop (zie Tabel met materialen).
    2. Zet de illuminator aan en leg de morfologie van de patch vast met behulp van een 4x objectief.
  2. Scanning elektronenmicroscopie (SEM)
    1. Bevestig de pleister met behulp van geleidende lijm op de monstertafel en behandel deze gedurende 30 s met een automatische fijncoater (zie Materiaaltabel).
    2. Maak beelden van de exo@MN patch met behulp van SEM (zie Tabel met materialen) met een versnellende spanning van 1 kV.
  3. Mechanisch testen
    1. Knip een 3 x 3 array uit de pleister en plaats deze met de punten naar boven op het stijve platform van een trekmeter (zie Tabel met materialen). Pas de hoogte van de sonde aan om deze dicht bij de naaldpunten te brengen zonder ze aan te raken.
    2. Stel de parameters zo in dat ze stoppen wanneer de druk automatisch 20 N bereikt. Druk de naaldpunten verticaal samen met een snelheid van 0,5 mm/min en noteer het profiel van de belasting versus de verplaatsing.
  4. Ontbinding
    1. Koop verse varkensoren op de markt en snijd ze in stukjes (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Spreid de varkenshuid uit op een tafel en gebruik papier om het oppervlaktevocht te drogen.
    2. Bereid vier droge micronaaldpleisters voor met de naaldpunten naar beneden op de varkenshuid, waarbij u elke pleister iets uit elkaar plaatst. Druk met de duim en wijsvinger verticaal op elke micronaaldpleister. Verwijder elke 15 s een pleister.
    3. Plaats de verwijderde pleister onmiddellijk in een droogoven en laat 5 minuten drogen. Snijd een kolom met micronaaldpunten af, plaats ze horizontaal onder een microscoop (zie Materiaaltabel) en gebruik een 4x objectieflens om het oplossen van de uiteinden te observeren.

4. Karakterisering van exosomen in exo@MN patch

OPMERKING: De uiteinden van de micronaald van exo@MN worden opgelost in 100 μL DPBS-oplossing om de volgende karakterisering uit te voeren op de vrijgekomen exosomen.

  1. De microscopie van het transmissieelektron (TEM)
    1. Behandel het koperen gaas (zie Materiaaltabel) met een hydrofiele behandeling met behulp van een ionenreiniger (zie Materiaaltabel) gedurende 5 minuten.
    2. Doseer 10 μL van het monster op de koolstofzijde van het koperen gaas. Laat het 1 minuut staan en verwijder dan de vloeistof door het met filtreerpapier van de randen te deppen.
    3. Voeg 10 μl 3% uranylacetaat (zie materiaaltabel) toe aan het monster. Laat het 10 s staan en verwijder dan de vloeistof door met filtreerpapier van de randen te deppen.
    4. Voeg 10 μl 3% uranylacetaat toe aan het monster. Laat het 1 minuut staan, verwijder dan de vloeistof door het met filtreerpapier van de randen te deppen en aan de lucht te laten drogen bij RT.
    5. Maak beelden van de exosomen met behulp van TEM (zie Tabel met materialen) met een versnellende spanning van 80 kV.
  2. Analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)
    1. Verdun de exosoomoplossing met DPBS om een deeltjesconcentratie van 1 x 107 deeltjes/ml te bereiken. Injecteer langzaam 1 ml van de exosoomoplossing in de monsterkamer van de NTA met behulp van een spuit van 1 ml (zie Materiaaltabel).
    2. Stel het type standaardprocedure (SOP) van het instrument in op EV-488 om de grootteverdeling van de exosomen te detecteren.
  3. Western blotting (WB)
    1. Bereid de lysisbuffer voor door de lysisbuffer van de radioimmunoprecipitatietest (RIPA) te mengen: fenylmethaansulfonylfluoride (zie materiaaltabel) in een verhouding van 100:1. Lyseer de exosomen gedurende 20 minuten op ijs, werveling elke 10 minuten.
    2. Centrifugeer de oplossing bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatans om de eiwitconcentratie te meten.
    3. Voeg 5x SDS-PAGE laadbuffer (zie Materiaaltabel) toe aan het supernatans in een volumeverhouding van 1 : 4 en meng goed. Verwarm gedurende 10 minuten op 100 °C om de eiwitten te denatureren.
    4. Voeg 5 μl van een 180 kDa voorgekleurde eiwitmarker (zie materiaaltabel) en 10 μg gedenatureerd monster toe aan een geprefabriceerde gel van 4%-20% (zie materiaaltabel). Laat het elektroforesesysteem (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten op 60 V en vervolgens gedurende 50 minuten op 140 V draaien.
    5. Breng de eiwitten van de gel over naar een PVDF-membraan (zie Materiaaltabel) dat vooraf is geactiveerd met methanol. Voer het elektroforesesysteem uit bij 290 mA gedurende 90 minuten op ijs.
    6. Incubeer het PVDF-membraan gedurende 1 uur in 5% magere melkoplossing. Was driemaal met tris gebufferde zoutoplossing met tween (TBST, zie Materiaaltabel) gedurende elk 5 minuten.
    7. Knip de doelbanden uit op basis van de positie van het eiwit. Incubeer de banden met anti-muis CD63-antilichaam en anti-muis Alix-antilichaam (zie Materiaaltabel) verdund tot de juiste concentratie volgens de instructies van de fabrikant, en incubeer een nacht bij 4 °C.
    8. Was de banden drie keer met TBST. Incubeer met HRP-geconjugeerd anti-konijn IgG (zie Materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur. Was vervolgens opnieuw drie keer met TBST.
    9. Breng een super ECL-detectiereagens aan (zie Tabel met materialen) om het oppervlak van de banden te bedekken en belicht en leg de banden onmiddellijk bloot en vast met behulp van een gelimager (zie Tabel met materialen).
  4. Confocale laserscanmicroscopie (CLSM)
    1. Kweek 5 x 105 DC's in een confocale schaal met behulp van 2 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium (zie Materiaaltabel). Voeg exosomen of exo@MN toe en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.
    2. Voeg een druppel Hoechst 33342 toe aan elk confocaal schaaltje en incubeer in het donker bij 37 °C gedurende 20 min.
    3. Voer beeldvorming uit met een CLSM (zie Materiaaltabel) met behulp van een 60x objectieflens. Breng een druppel immersieolie (zie Materiaaltabel) aan op de lens en plaats de confocale schotel op de objecttafel. Pas de x/y/z-assen aan om het juiste brandpuntsvlak van de cellen te vinden.
    4. Start de beeldvorming met DAPI/TRITC/TD-kanalen, selecteer een resolutie van 1024 px en stel de snelle modus in op 1/8 s.
  5. Flowcytometrie
    1. Kweek DC's in een plaat met 6 putjes, elk putje bevat 5 x 105 cellen en 2 ml 1640 medium. Voeg gelijke hoeveelheden oplossing van respectievelijk DPBS, exosomen, micronaalden zonder exosomen en exo@MN toe en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.
    2. Breng het medium van elke put over in centrifugaalbuizen. Centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
    3. Voeg 0,5 μl FITC-CD11c-antilichaam, 2,5 μl APC-CD80-antilichaam en 0,5 μl Pacific Blue I-A/I-E-antilichaam (zie materiaaltabel) toe aan 100 μl 5% BSA-oplossing (zie materiaaltabel). Meng goed, resuspendeer de cellen en incubeer op een shaker in ijs en in het donker gedurende 20 minuten.
    4. Voeg 1 ml DPBS toe en centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C en verwijder vervolgens het supernatant. Herhaal de wasbeurt twee keer om ongebonden antilichamen te verwijderen en ga vervolgens verder met het analyseren van de overeenkomstige fluorescerende kanalen via flowcytometrie (zie Materiaaltabel).
      1. Eerst wordt in het FSC-A/SSC-A-spreidingsdiagram de hoofdcelpopulatie als P1 gegated. In het spreidingsdiagram SSC-A/SSC-H van de P1-celpopulatie plaatst u een vierkant P2-gebied langs de diagonaal om geaggregeerde cellen te verwijderen.
      2. Voer fluorescentieanalyse uit op de P2-celpopulatie met behulp van de FITC-, APC- en Pacific Blue-kanalen. Stel de stopvoorwaarde in om 10.000 cellen in de P2-poort te verzamelen.

5. Statistische analyse

  1. Druk kwantitatieve gegevens uit als gemiddelden ± standaarddeviaties (SD). Beoordeel statistische significantie met behulp van t-toetsanalyse met behulp van een geschikte softwaretoepassing voor gegevensanalyse. Beschouw p-waarden kleiner dan 0,05 om statistische significantie aan te geven. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van exosomen, fabricage en karakterisering van exo@MN patch. Figuur 1 illustreert het processtroomschema voor de fabricage van exo@MN patch. De exosomen werden gemengd met trehalose en HA, en het mengsel werd vervolgens toegevoegd aan de micronaaldvorm en gecentrifugeerd. Dit proces vergemakkelijkte de aggregatie van exosomen aan de naaldpunten, waardoor een snelle afgifte werd bevorderd. Na het drogen werd PVP-oplossing toegevoegd en gecentrifugeerd om de mal volledig te vullen. Na volledige droging werd de mal verwijderd om de exo@MN plekken te verkrijgen. De morfologie van de micronaalden werd gekarakteriseerd met behulp van microscopie en SEM, zoals weergegeven in figuur 2. De uiteinden in de exo@MN patch vertoonden een conische vorm die was gerangschikt in een reeks van 10 x 10 met scherpe en intacte naaldpunten. De punt van de micronaald is bestand tegen een kracht van 2 N, waardoor deze door de huidbarrière kan dringen. Bovendien werd varkenshuid gebruikt als surrogaat voor de menselijke huid om het aanbrengen van exo@MN patches te simuleren. De pleisters werden op de varkenshuid gedrukt om de loslaattijd te observeren, waarbij de uiteinden van de micronaald binnen 60 s volledig smolten. De exo@MN patches werden opgelost in DPBS en gekarakteriseerd, zoals weergegeven in figuur 3. TEM-beelden legden blaasjes vast met typische komvormige structuren, consistent met de morfologie van exosomen. Uit de deeltjesgrootteverdeling van de exo@MN oplossing door NTA bleek dat de deeltjes voornamelijk geconcentreerd waren binnen het bereik van 50-250 nm. Er waren echter ook enkele grotere deeltjes aanwezig, die kunnen worden toegeschreven aan de adhesieve eigenschappen van het HA-materiaal, waardoor exosoomaggregatie ontstaat. WB-analyse van de CD63/Alix-eiwitten in de exo@MN oplossing toonde aan dat exo@MN in staat was om eiwitten van exosomen gedeeltelijk vast te houden. De biologische functionaliteit van exosomen die vrijkomen uit de exo@MN werd gevalideerd in figuur 4, waarbij de nadruk lag op de opname van exosomen door cellen en de activering van dendritische cellen in vergelijking met verse exosomen. CLSM-beelden bevestigden de efficiënte opname van zowel verse exosomen als exosomen in de exo@MN door DC's. Representatieve beelden en proportionele statistieken van flowcytometrie tonen aan dat de exosomen in exo@MN biologische functies bezitten die de activering van DC's bevorderen die vergelijkbaar zijn met verse exosomen.

figure-results-1
Figuur 2: Karakterisering van exo@MN patches. (A) Stereomicroscoopbeelden van exo@MN patches. Schaalbalk = 400 μm. (B) SEM-beeld van exo@MN patches. Schaalbalk = 200 μm. (C) De belastings- versus verplaatsingsprofielen van exo@MN patch. (D) Microscopische beelden van exo@MN pleisters die op verschillende tijdstippen in de varkenshuid zijn ingebracht. Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Karakterisering van verse exosomen en exosomen in exo@MN. (A) Morfologie van exosomen door TEM. Schaalbalk = 100 nm. (B) Deeltjesgrootteverdeling van exosomen door NTA. (C) CD63 en Alix van exosomen door WB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Biologisch testen van verse exosomen en exosomen in exo@MN. (A) CLSM-beelden van exosomen opgenomen door DC's. Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatieve grafieken van activering van DC's door flowcytometrie. (C) Kwantificering van het percentage CD11c+CD80+MHCII+ DC's. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Momenteel zijn de belangrijkste methoden voor het isoleren van exosomen ultracentrifugatie, dichtheidsgradiëntcentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatie, immunoaffiniteit magnetische kralen en microfluïdica24. Vanwege de beperkte laadcapaciteit van micronaalden, veroorzaakt door hun kleine naaldpuntruimte, is het noodzakelijk om de concentratie van exosomen te verhogen om meer te laden. Daarom kozen we voor ultrafiltratie om het supernatans van de celcultuur te concentreren en gebruikten we vervolgens ultracentrifugatie om de exosomen te isoleren. De concentratie van exosomen werd verhoogd met een kleine hoeveelheid vloeibare resuspensie, zodat de micronaalden konden worden geladen met tientallen tot honderden microgrammen exosomen. Deze methode resulteert echter in een significante aanwezigheid van eiwitten in de geïsoleerde exosoomoplossing. Bovendien treedt er een aanzienlijk verlies van exosomen op tijdens het centrifugatieproces. Tegenwoordig is een van de beperkingen van de therapeutische toepassing van exosomen het gebrek aan effectieve methoden om exosomen met hoge zuiverheid en in grote hoeveelheden te isoleren. Aangezien het klinische potentieel van exosomen steeds meer wordt verkend, is er behoefte aan de ontwikkeling van meer geavanceerde technieken in de toekomst om de uitdagingen in verband met de extractie ervan aan te pakken.

De sleuteltechnologie in deze studie is het ontwerp van op exosomen gebaseerde micronaalden. Om de verspilling van exosomen te minimaliseren en sterkere therapeutische effecten te bereiken, werd een gietmethode in twee stappen toegepast om exo@MN pleisters te fabriceren. Trehalose is eerder gerapporteerd als een geschikt materiaal voor gevriesdroogd behoud van exosomen25, terwijl HA uitstekende biocompatibiliteit, hydrofiliciteit vertoont en functioneert bij het remmen van ontstekingen en het bevorderen van huidherstel26. De fabricage van met exosomen beladen naaldpunten met behulp van deze twee materialen helpt de biologische activiteit van exosomen te behouden, waardoor ze snel kunnen oplossen en vrijkomen in de huid. Bovendien minimaliseert deze aanpak het risico op infectie en draagt het bij aan een snel herstel van de huid. Door centrifugeren en vacuümdrogen werden de exosomen geconcentreerd aan de uiteinden van de micronaalden. Gezien de onverenigbaarheid van ethanol en trehalose, werd PVP opgelost in absolute ethanol gekozen als dragermateriaal. Deze gelaagde fabricagemethode verbeterde effectief de afgifte-efficiëntie van de exosomen.

De slechte stabiliteit van exosomen in vitro, of ze nu worden bewaard bij 4 °C, 37 °C of -80 °C, kan leiden tot veranderingen in de exosoomstructuur of degradatie11. Om dit probleem op te lossen, hebben verschillende onderzoeken de opslagmethoden van exosomen onderzocht, zoals vriesdrogen. Micronaaldtechnologie biedt een andere nieuwe strategie. Door bij RT te drogen, kan micronaaldtechnologie de stabiliteit van exosomen verbeteren en kan deze direct worden gebruikt voor exosoomafgifte zonder andere behandelingen. Bovendien is het extractieproces voor exosomen complex en vatbaar voor degradatie, waardoor grootschalige toepassingen een uitdaging zijn. Het opslaan van geëxtraheerde exosomen met behulp van micronaaldtechnologie vereenvoudigt de extractiestappen niet, maar vermindert het aantal benodigde extracties. Een enkele extractie kan een grote hoeveelheid exo@MN pleisters opleveren, die voor een langere periode kunnen worden opgeslagen. Het gebruik van exosoommicronaalden uit dezelfde batch voor elke behandeling minimaliseert de potentiële impact van variaties tussen verschillende batches op therapeutische resultaten, waardoor de herhaalbaarheid en betrouwbaarheid van het exosoom-nanoplatform wordt verbeterd27. Dit biedt meer mogelijkheden voor de klinische toepassing van exosomen.

In toekomstig onderzoek is het de moeite waard om methoden te onderzoeken die een nauwkeurige controle van het laadvermogen mogelijk maken en medicijnvariaties tussen naaldpunten minimaliseren. Dit kan worden bereikt door procesoptimalisatie, implementatie van kwaliteitscontrolemaatregelen en gebruik van geavanceerde technieken. Het aanpakken van deze aspecten zal aanzienlijk bijdragen aan de ontwikkeling van betrouwbare en consistente systemen voor de toediening van geneesmiddelen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H.C., F.L.Q en S.J.M zijn uitvinders in een octrooiaanvraag die is ingediend op basis van de gegevens in dit manuscript. H.C. is de wetenschappelijke grondlegger van Medcraft Biotech. Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.L.Q. waardeert de steun van het Pioneer R&D-programma van Zhejiang (2022C03031), het National Key Research and Development Program van China (2021YFA0910103), de National Natural Science Foundation of China (22274141, 22074080), de Natural Science Foundation van de provincie Shandong (ZR2022ZD28) en het Taishan Scholar Program van de provincie Shandong (tsqn201909106). H.C. erkent de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82202329). De auteurs erkennen het gebruik van instrumenten in de Shared Instrumentation Core Facility van het Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academie van Wetenschappen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100x penicillin-streptomycin solutionsJrunbio ScientificMA0110Celcultuur
180 kDa voorgekleurde eiwitmarkerThermo26616Western blotting
3% Uranyl acetaatHenan Ruixin Experimentele BenodigdhedenGZ02625Morfologische karakterisering van exosomen
3D printerBMF technologienanoArch S130Vormvoorbereiding
4%–20% voorgegoten gelGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5× SDS-PAGE laadbufferTitan04048254Western blotting
Anti-muis Alix antilichaamBiolegend12422-1-APWestern blotting
Anti-muis CD63 antilichaamBiolegendab217345Western blotting
APC anti-muis CD80 antilichaamBiolegend104713Antilichaam
Auto fijnlakkerZIZHUJBA5-100Morfologische karakterisering van micronaald
BCA-assaykitBeyotimeP0012Eiwitconcentratietest
CentrifugeThermo FisherMuitifuge X1R proCelcentrifuge
Circulerende watervacuümpompYuhua InstrumentSHZ-D(III)Filtratie
CO2-incubatorEppendorfCellXpert C170Celcultuur
Confocale laserscanningmicroscoopNikonA1HD25Fluorescentiebeeldvorming
KopergaasBeijing Zhongjingkeyi Technology JF-ZJKY/300Morfologische karakterisering van exosomen
D- (+) -Trehalose dihydraatAladdin5138-23-4Fabricage van micronaald 
Dulbecco’s aangepast Eagle’s mediumMeilunbioMA0212Celcultuur
Dulbecco’s fosfaatgebufferd zoutwaterMeilunbioMA0010Celcultuur
ElektroforesesysteemBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Foetaal bovien serumJrunbio ScientificJR100Celcultuur
FITC anti-muis CD11c antilichaamBiolegend117305Antilichaam
FlowcytometrieBDLSR FortessaFluorescentiedetectie
Gel imagerCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP-geconjugeerd anti-konijn IgGCST7074SWestern blotting
HTL-harsBMF technologieVormvoorbereiding
Hyaluronzuur (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Fabricage van micronaald 
DoopwaterNikonMXA22168Fluorescentiebeeldvorming
IonreinigerJEOLEC-52000ICMorfologische karakterisering van exosomen
MicroscoopOlympusCKX53Observatie van het oplosproces van de micronaaldtip
Muis ovarieel epitheelkankercel ID8MeisenCTCC CC90105Celcultuur
NanodeeltjesvolganalyseParticle MetrixZetaViewGrootteanalyse van exosomen
Pacific Blue anti-muis I-A/I-E antilichaamBiolegend107619Antilichaam
FenylmethaansulfonylfluorideBeyotimeST507Proteaseremmers
PlasmareinigerHefei Kejing Material TechnologyPDC-36GFabricage van micronaald 
PolydimethylsiloxaanDow Corning9016-00-6Vormvoorbereiding
Polyvinylpyrrolidon (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Fabricage van micronaald 
Prism GraphPadVersion 9Statistische analyse
PVDF-membraanMilliporeIPVH00010Western blotting
Quick-snap centrifugeBeckman344619Exosomenextractie
RIPA-lysebufferApplygenC1053Lyse membraan
Roswell Park Memorial Institute 1640MeilunbioMA0548Celcultuur
Scanning elektronenmicroscoopJEOLJSM-IT800Morfologische karakterisering van micronaald
StereomicroscoopOlympusSZX16Karakterisering van morfologie
Super ECL detectiereagensApplygenP1030Western blotting
TrekmeterInstron68SC-05Mechanische testen
Transmissie-elektronenmicroscoopJEOLJEM-2100plusMorfologische karakterisering van exosomen
Tris-gebufferd zoutwaterSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosomenextractie
UltrafiltratiebuisMilliporeUFC910096Exosomenconcentratie
VacuumdroogovenShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Fabricage van micronaald
VacuumfiltratiesysteemBiosharpBS-500-XTFiltratie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977(2020).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
  5. Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
  6. Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
  7. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  8. Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
  9. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  10. Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
  11. Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
  12. Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
  13. Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).
  14. Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
  15. Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
  16. Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
  17. Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644(2022).
  18. Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
  19. Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
  20. Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305(2022).
  21. Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).
  22. Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
  23. Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
  24. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).
  25. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
  26. Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).
  27. Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aflevering van exosomenStabiliteit van exosomenGeneesmiddelentoedieningIsolatie van exosomenHyaluronzuurTrehalose micronaaldenPolyvinylpyrrolidon onderlaagMechanische testsOpname door dendritische cellen

Gerelateerde artikelen