Profilering van maternale gedragsreacties tijdens beeldvorming van de hele hersenen

Samenvatting

Hier wordt een pijplijn voor video-analyse gepresenteerd die uitdagingen op het gebied van gedragsmonitoring binnen MRI-omgevingen overwint, waardoor niet-geïnstrueerde gedragsreacties op externe signalen kunnen worden gedetecteerd. Deze analyse zal een beter begrip van opgewekte interne toestandsveranderingen en hersenbrede activiteit vergemakkelijken.

Samenvatting

Recente ontwikkelingen in beeldvormingsinstrumenten voor het hele brein hebben neurowetenschappers in staat gesteld te onderzoeken hoe gecoördineerde hersenactiviteit externe signalen verwerkt, interne toestandsveranderingen beïnvloedt en gedragsreacties uitlokt. Functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI) is bijvoorbeeld een niet-invasieve techniek die het mogelijk maakt om de activiteit van de hele hersenen te meten bij wakkere, zich gedragende muizen met behulp van de bloedoxygenatieniveau-afhankelijke (BOLD) respons. Om BOLD-reacties die worden opgeroepen door externe stimuli volledig te begrijpen, is het echter van cruciaal belang dat experimentatoren ook gedragsreacties tijdens scans beoordelen. De MRI-omgeving vormt een uitdaging voor dit doel, waardoor veelgebruikte methoden voor gedragsmonitoring onverenigbaar zijn. Deze uitdagingen omvatten (1) een beperkt gezichtsveld en (2) de beperkte beschikbaarheid van apparatuur zonder ferromagnetische componenten. Hier wordt een pijplijn voor gedragsvideo-analyse gepresenteerd die deze beperkingen overwint door waardevolle informatie te extraheren uit video's die binnen deze omgevingsbeperkingen zijn verkregen, waardoor gedrag kan worden geëvalueerd tijdens het verwerven van neurale gegevens van het hele brein. Door gebruik te maken van methoden zoals optische stroomschatting en dimensionaliteitsreductie, kunnen robuuste verschillen worden gedetecteerd in gedragsreacties op stimuli die tijdens fMRI-scans worden gepresenteerd. Representatieve resultaten suggereren bijvoorbeeld dat vocalisaties van muizenpups, maar geen zuivere tonen, significant verschillende gedragsreacties oproepen bij moederlijke versus maagdelijke vrouwelijke muizen. In de toekomst kan deze pijplijn voor gedragsanalyse, die in eerste instantie is afgestemd op het overwinnen van uitdagingen in fMRI-experimenten, worden uitgebreid naar verschillende neurale opnamemethoden, waardoor veelzijdige gedragsmonitoring in beperkte omgevingen wordt geboden. De gecoördineerde evaluatie van gedrags- en neurale reacties zal een beter begrip bieden van hoe de perceptie van stimuli leidt tot de coördinatie van complexe gedragsoutputs.

Inleiding

Het monitoren van gedragsreacties tijdens neurale opnames is essentieel voor het begrijpen van door prikkels opgewekte gecoördineerde activiteit in de hersenen. In het geval dat niet wordt voorspeld dat dieren op een specifieke en doelgerichte manier op stimuli reageren, kan het observeren van niet-geïnstrueerd gedrag inzicht bieden in hoe externe signalen hun interne toestanden informeren ^1,2. Recente ontwikkelingen in neuroimaging-tools, zoals wide-field calciumbeeldvorming en functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI), hebben neurowetenschappers in staat gesteld om onderzoeken uit te breiden tot buiten enkelvoudige hersengebieden. Om echter een beter begrip van dergelijke hoogdimensionale neurale gegevens te bereiken, moet het vermogen om de gedragsoutput van deze complexe patronen te evalueren ook dienovereenkomstig toenemen.

State-of-the-art methoden voor het karakteriseren van taakgeïnstrueerd gedrag worden veel gebruikt in neurowetenschappelijk onderzoek, waaronder temperatuur- en druksensoren om snuiven te detecteren ^3,4, lichtstralen om likken te detecteren⁵ en markerloze pose-schatting om vooraf bepaalde lichaamsdelen te volgen⁶. De datagestuurde evaluatie van niet-geïnstrueerde gedragspatronen blijft echter een uitdaging in het veld⁷. Hoewel methoden voor datagestuurde gedragsanalyse snel vooruitgaan, vereisen bestaande methoden doorgaans aanzienlijke rekenkracht, gespecialiseerde apparatuur of een bijzonder duidelijk beeld van het dier 2,6,8,9. Hier wordt een pijplijn voor gedragsvideo-analyse gepresenteerd die gemakkelijk vatbaar is voor alle videografiegegevens en waarmee waardevolle gedragsmetingen kunnen worden geëxtraheerd uit video's die zijn verkregen tijdens passieve stimulatie.

Deze pijplijn voor gedragsanalyse is ontworpen om compatibel te zijn met de gecoördineerde verwerving van neurale en videogegevens bij dieren die met het hoofd zijn gefixeerd en worden blootgesteld aan een breed scala aan externe stimuli en meerdere opnameomgevingen, zelfs die met aanzienlijke beperkingen. De MRI-omgeving brengt bijvoorbeeld specifieke uitdagingen met zich mee voor gedragsmonitoring, waaronder een beperkt gezichtsveld en beperkte beschikbaarheid van apparatuur zonder ferromagnetische componenten. Deze beperkingen maken veelgebruikte methoden onverenigbaar, waardoor maatregelen zoals hoofdbeweging (d.w.z. hoe de hersenen bewegen tussen volumeverwervingen) een van de meest toegankelijke maar beperkte manieren zijn om lichamelijke reacties tijdens scans^{te beoordelen 10}. Door deze beperkingen te overwinnen, vergemakkelijkte dit protocol de analyse van MR-compatibele videografiegegevens, wat aantoont dat vrouwelijke muizen met verschillende maternale ervaringen verschillende gedragsreacties vertonen op auditieve stimuli. Moeders en maagden kregen auditieve stimuli te zien tijdens fMRI-scans, waaronder verontruste pup-vocalisaties ("pup calls") en zuivere tonen. Deze stimuli werden passief gepresenteerd, dus zonder enige geïnstrueerde gedragsoutput. Hoewel werd voorspeld dat moeders meer zouden reageren op pup-oproepen in vergelijking met maagden, is er weinig literatuur over hoe vrouwelijke muizen reageren op babysignalen in een hoofd-gefixeerde omgeving. Daarom was er geen specifieke gedragsoutput om a priori te volgen, waardoor dit experiment de perfecte test was voor de voorgestelde datagestuurde gedragsanalyses. Met behulp van methoden zoals optische stroomschatting en dimensionaliteitsreductie werden groepsverschillen in gedragsreacties gedetecteerd, zowel in omvang als in ruimtelijke manifestatie.

In de toekomst kan de gecoördineerde evaluatie van gedrags- en neurale reacties worden gebruikt om een beter begrip te krijgen van hoe externe stimuli interne toestanden veranderen en complexe gedragsoutput informeren. Dit begrip zou zich moeten uitstrekken tot stimuli die worden gepresenteerd zonder opgelegde taken en geïnstrueerd gedrag. De hier gepresenteerde analysepijplijn kan worden uitgebreid naar verschillende neurale opnametechnieken, waardoor veelzijdige gedragsmonitoring wordt geboden, zelfs in beperkte omgevingen.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), en alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen, voorschriften en aanbevelingen. De details van de gebruikte apparatuur en software staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Programmatuur

1. Download MATLAB van de Mathworks-website.
   OPMERKING: De code waaruit deze analysepijplijn bestaat, kan uitsluitend worden uitgevoerd via MATLAB en is speciaal geschreven om compatibel te zijn met MATLAB 2023a.
2. Voor deze pipeline zijn de Computer Vision Toolbox en de Image Processing Toolbox binnen MATLAB nodig. Voeg de toolboxen toe aan MATLAB-add-ons door te klikken op Add-ons beheren, Add-ons ophalen en vervolgens te zoeken en toe te voegen.
   OPMERKING: Vijf MATLAB-scripts worden geleverd als aanvullende bestanden, met de volgende titels: script1_videocoreg.m (aanvullend coderingsbestand 1), script2_optflow_roiselect.m (aanvullend coderingsbestand 2), script3_optflow_analysis.m (aanvullend coderingsbestand 3), script4_optflow_pca.m (aanvullend coderingsbestand 4) en script5_optflow_pca_analysis.m (aanvullend coderingsbestand 5). Er worden ook twee voorbeeldvideo's (Video 1 en Video 2) en de bijbehorende timingbestanden voor gebeurtenissen (Aanvullend Bestand 1 en Aanvullend Bestand 2) verstrekt. Het is aan te raden om eerst de pijplijn te doorlopen met de voorbeeldgegevens.
   LET OP: Pas op voor opmerkingen in de code die een uitroepteken bevatten, aangezien dit gebieden zijn die actie vereisen voordat ze worden uitgevoerd. Er zijn bijvoorbeeld opmerkingen zoals "bewerk het codeblok hieronder!" om aan te geven waar bewerkingen moeten worden aangebracht om te passen in bestandsstructuren, experimentdetails of analysebehoeften. Deze keuzes zijn standaard ingesteld om te passen bij de twee meegeleverde voorbeeldvideo's, maar moeten worden aangepast zodra men de pijplijn met zijn eigen gegevens begint uit te voeren.
3. Als u elke sectie van elk script wilt uitvoeren, klikt u op Uitvoeren en Vooruitgaan in het menu Editor .

2. Video co-registratie

OPMERKING: Het eerste script in deze analysepijplijn is script1_videocoreg.m (Supplementary Coding File 1), dat alle video's ruimtelijk op elkaar afstemt via coregistratie. De invoer voor dit script zijn de onbewerkte video's en de belangrijkste outputs zijn de getransformeerde video's.

1. Bewerk secties 1, 2, 3, 4, 5 en 6 van het script waar aangegeven om in gegevensstructuren te passen.
2. Voer sectie 1 uit.
3. Kies drie punten in elke video om te labelen, zoals in Afbeelding 1A. Deze drie punten worden gebruikt om alle frames aan elkaar te koppelen. Voer sectie 2 van het script uit om het eerste frame van elke video op te halen en gebruik de muis om eenmaal op de eerste twee punten te klikken en vervolgens te dubbelklikken op het derde punt. Nadat de punten van de laatste video zijn geselecteerd, drukt u op Enter.
4. Voer sectie 3 en sectie 4 uit.
5. Zet de vlag op 0 en voer sectie 5 uit. Zet vervolgens de vlag op 1 en voer sectie 5 opnieuw uit.
6. Voer sectie 6 uit en vergelijk de resulterende figuur naast elkaar met figuur 1B. Eventuele aberraties die worden waargenomen in het niet-uitgelijnde gemiddelde beeld aan de linkerkant, moeten worden verminderd in het uitgelijnde gemiddelde beeld aan de rechterkant.

3. Optische stroomschatting: Volledig gezichtsveld

OPMERKING: Om de beweging door de scanvideo's te beoordelen, moet de optische stroom worden geschat voor elke getransformeerde video. Dit kan worden gedaan voor het volledige gezichtsveld (FOV) van elke video met het meegeleverde script script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2). De invoer voor dit script zijn de getransformeerde video's en de uitvoer zijn 3D-matrices die de optische stroomgrootte van elke pixel in de loop van de tijd voor elke video aangeven. Figuur 2A toont een voorbeeldframe met optische stroomvectoren bedekt in blauw, waarbij de lengte van elke vector de relatieve optische stroomgrootte van die pixel weergeeft. Het opslaan van de uitvoer als video's bleek efficiënter te zijn dan het opslaan ervan als 3D-matrices.

1. Bewerk sectie 1 van het script waar aangegeven om in gegevensstructuren te passen.
2. Voer sectie 1 uit.

4. ROI selectie

OPMERKING: De volgende analysestappen worden veel beter beheersbaar gemaakt in termen van rekenbelasting en gegevensopslagbehoeften door een interessegebied (ROI) binnen het volledige gezichtsveld te selecteren waarop de analyse moet worden gericht. De ROI kan worden geselecteerd op basis van het experiment en het gedrag van interesse of via een meer datagestuurde aanpak. Voor de hier gepresenteerde representatieve resultaten werd de standaarddeviatie van de optische stroomgrootte van elke pixel in het volledige gezichtsveld berekend met het script script2_optflow_roiselect.m, sectie 2 (aanvullend coderingsbestand 2). De invoer voor dit deel van het script is de uitvoer van sectie 1 en de belangrijkste uitvoer is een visualisatie van de standaarddeviatie van de optische stroomgrootte over alle pixels in alle video's. In de gepresenteerde representatieve resultaten vertoonde het gezichtsveld van de spiegel een relatief hoge standaarddeviatie van de optische stroom, wat de gedemonstreerde keuze van de ROI leidde.

1. Bewerk sectie 2 van het script waar aangegeven om in gegevensstructuren te passen.
2. Voer sectie 2 uit en gebruik de resulterende afbeelding om te zien waar de optische stroom het meest dramatisch fluctueert in de geanalyseerde video's. Een voorbeeld van deze afbeelding wordt getoond in Figuur 2B.

5. Kwantificering van optische stroom: ROI

OPMERKING: Sectie 3 van het script script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) stelt de gebruiker in staat om een ROI te selecteren met een tekengereedschap en de grenscoördinaten op te slaan. De invoer voor dit deel van het script is de uitvoer van sectie 1 en de uitvoer zijn 1D-vectoren die de gemiddelde optische stroomgrootte van de ROI in de loop van de tijd voor elke video aangeven.

1. Bewerk sectie 3 van het script waar aangegeven om te passen bij gegevensstructuren en analysebehoeften.
   OPMERKING: Er zijn een paar opties met betrekking tot hoe verder te gaan met ROI-selectie. Kies een optie:
   1. Optie 1: Analyseer het volledige gezichtsveld van de video.
      1. Stel de vlag selectROI in op 0 en stel provideROI in op 0.
   2. Optie 2: Analyseer een nieuwe ROI.
      1. Stel de vlag selectROI in op 1 en stel provideROI in op 0. Bewerk vervolgens newCoordsName.
   3. Optie 3: Analyseer een eerder getrokken ROI.
      OPMERKING: Selecteer deze optie alleen als men deze code eerder heeft uitgevoerd en een ROI heeft gecreëerd.
      1. Stel de vlag selectROI in op 0 en stel provideROI in op 1. Bewerk vervolgens inputCördinaten om een vooraf bepaalde set coördinaten op te geven.
2. Voer sectie 3 uit.

6. Vergelijking van optische stroomomvang

OPMERKING: Het meegeleverde script script3_optflow_analysis.m (Supplementary Coding File 3) vereist de meeste specialisatie om in de gegevens van de gebruiker te passen. De belangrijkste inputs zijn de 1D-vectoren die de gemiddelde optische stroomgrootte van de ROI in de loop van de tijd voor elke video aangeven, en wanneer ze op de juiste manier worden gecombineerd met het begin van gebeurtenissen en informatie over groepen/condities, zijn de belangrijkste outputs statistische vergelijkingen die kunnen worden afgestemd op analyse-interesses.

1. Bewerk secties 1-3 van het script om te passen bij gegevensstructuren en analysebehoeften.
2. Stel de vlaggen zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial en applyLPfilter in op 0 of 1 zoals gewenst in sectie 1. In de gepresenteerde representatieve resultaten waren zsc, blrm en applyLPfilter ingesteld op 1 en alle andere opties op 0.
3. Stel LPfilter in op een getal dat het gewenste laagdoorlaatfilter in hertz (Hz) aangeeft. In de gepresenteerde representatieve resultaten werd een laagdoorlaatfilter van 5 Hz toegepast, omdat niet werd verwacht dat gedragsreacties sneller dan 5 Hz zouden fluctueren.
4. Voer secties 1-3 uit. Sectie 3 moet grafieken opleveren voor de gemiddelde optische stroomtijdreeksen van de groep, de gemiddelde cumulatieve optische stroom van de groep en de samenvattende cumulatieve optische stroom, met inbegrip van grafieken zoals weergegeven in figuur 3. Sectie 3 kan worden uitgevoerd voor elke combinatie van groeps-/conditievergelijkingen.

7. Optische stroom PCA

OPMERKING: Voortbouwend op de schatting van de omvang van de optische stroom, bevatten de uitgangen van script2_optflow_roiselect.m (aanvullend coderingsbestand 2) ook informatie over de ruimtelijke verdeling van de optische stroom frame voor frame per video. Om de dimensionaliteit van deze ruimtelijke informatie te verminderen, voert het meegeleverde script script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4)  een hoofdcomponentenanalyse (PCA) uit op de geschatte optische stroom. De belangrijkste ingangen zijn de 3D optische flowmatrices, die eerder zijn opgeslagen als video's voor elke gedragsvideo, en de belangrijkste uitvoer is één .mat-bestand per video met pc en uitgelegde variantie-informatie.

1. Bewerk sectie 1 van het script zodat deze past bij de gegevensstructuren en analysebehoeften.
2. Stel de analyse-opties vlaggen stimnum, dsfactor en fnfactor naar wens in in Sectie 1. In de gepresenteerde representatieve resultaten werd elk stimulustype afzonderlijk geanalyseerd en werd de standaardwaarde van 1 gehandhaafd voor dsfactor en fnfactor, wat resulteerde in geen downsampling in ruimte of tijd.
3. Voer sectie 1 uit.

8. Vergelijking van PCA met optische stroom

OPMERKING: Het meegeleverde script script5_optflow_pca_analysis.m (Supplementary Coding File 5) voert verkennende vergelijkingen uit van PCA-resultaten tussen groepen. De belangrijkste inputs zijn de stimulusspecifieke pc en verklaarde variantie-informatie verkregen uit script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4), en de belangrijkste outputs zijn statistisch gedrempelde heatmaps die de belastingen van de eerste pc weergeven, hoewel andere pc's ook met dit script kunnen worden geanalyseerd.

1. Bewerk sectie 1 van het script zodat deze past bij gegevensstructuren en analyse.
2. Voer sectie 1 en sectie 2 uit.
3. Bewerk de invoer van sectie 3 , met name de groeps - en myTitle-variabelen , om de gewenste groepsanalyse weer te geven, evenals de threshT. threshT vertegenwoordigt de T-statistische drempel waarboven de resultaten als significant worden beschouwd, die kan worden berekend op basis van openbaar beschikbare T-statistiek naar p-waardetabellen en de vrijheidsgraden.
4. Voer sectie 3 uit voor elke interessegroep. De code moet een statistische kaart met groepsoverzichten opleveren, zoals die worden weergegeven in het linker- en middenpaneel van figuur 4. Pas het bereik van de caxis, en dus de limieten van de kleurenbalk, naar wens aan voor visualisatie.
5. Bewerk de invoer van sectie 4 , met name de mag - en myTitle-variabelen om de gewenste groepsvergelijking weer te geven, evenals threshT. threshT vertegenwoordigt de T-statistische drempel waarboven de resultaten als significant worden beschouwd, die kan worden berekend op basis van openbaar beschikbare T-statistiek naar p-waardetabellen en de vrijheidsgraden.
6. Voer sectie 4 uit voor elke interessegroepvergelijking. De code moet een statistische kaart met groepsvergelijkingen opleveren, zoals weergegeven in het rechterpaneel van Figuur 4. Pas het bereik van de caxis, en dus de limieten van de kleurenbalk, naar wens aan voor visualisatie.

Resultaten

Om het potentieel van deze analysepijplijn aan te tonen, werden gedragsvideo's van vrouwelijke muizen met het hoofd - met name moeders en maagden - verkregen, terwijl de muizen auditieve stimuli kregen tijdens functionele magnetische resonantie beeldvorming (fMRI) scans. De stimuli bestonden uit pup-oproepen en zuivere tonen die passief werden gepresenteerd, dus zonder enige geïnstrueerde gedragsoutput. De oproepen van de pups waren opnames van ultrasone vocalisaties die werden uitgezonden door 6 dagen oude muizenpups die tijdelijk van hun nest waren geïsoleerd. Deze pup-oproepen lokken meestal de moederlijke handeling van het ophalen van de pup uit, waarbij de moeder de pup lokaliseert, ernaar toe beweegt, onderzoekt, vervolgens oppakt en terugbrengt naar de veiligheid van het nest - een gedrag dat maagdelijke vrouwtjes meestal niet vertonen¹¹. Eerder werk heeft aangetoond dat pup-oproepen robuuste opgeroepen activiteit uitlokken in de primaire auditieve cortex van moeders, maar niet van maagden, terwijl zuivere toonreacties geen groepsverschillen vertonen¹². Daarom werd verondersteld dat groepsverschillen in gedragsreacties op pup-oproepen, maar niet zuivere tonen, zouden worden geïdentificeerd. Er is echter weinig literatuur over het specifieke gedrag van vrouwelijke muizen als reactie op pup-signalen in een omgeving die aan het hoofd is bevestigd. Daarom werd er geen specifieke gedragsoutput verwacht, waardoor dit experiment de perfecte test is voor de voorgestelde datagestuurde gedragsanalyses.

In de loop van acht dagen raakten alle dieren geleidelijk gewend aan de behandeling door de onderzoeker, het fixeren van het hoofd en de MRI-omgeving. Gewenning aan hoofdfixatie en de experimentele omgeving is cruciaal voor het beoordelen van gedragsreacties op gepresenteerde stimuli. Als ze niet goed gewend zijn aan de omgeving, kunnen dieren alleen stressreacties vertonen, waardoor eventuele stimulusgestuurde effecten worden weggespoeld die anders via videografie zouden kunnen worden ontleed.

Hoewel de opstelling van het gedragsapparaat over het algemeen hetzelfde was voor elke data-acquisitiesessie, is het mogelijk dat het gezichtsveld (FOV) van de camera iets verschoof telkens wanneer een dier met het hoofd werd gefixeerd voor fMRI-scans (zie voorbeeld FOV's in figuur 1A). Dit was waarschijnlijk te wijten aan kleine veranderingen in de positionering van de camerabevestiging, evenals individuele variaties in de schedelbevestiging van de hoofdstijl voor elk dier. Daarom moesten de video's van de scans via lineaire coregistratie op elkaar worden uitgelijnd om de ruimtelijke informatie die ze bevatten over de scans en dieren te kunnen vergelijken. De coregistratie werd afgestemd op de representatieve gegevens. Op een standaard scandag werden bijvoorbeeld 3-4 scans per dier gemaakt, wat resulteerde in 3-4 video's per dier per dag. Tussen elke scan was er geen beweging van de wiegcomponenten, inclusief de camera- en hoofdfixatiecomponenten. Dus zodra de coregistratietransformatie voor één video per dier per dag was bepaald, kon deze worden toegepast op de andere 2-3 video's van dat dier op dezelfde dag. Hoewel dit tijd bespaarde in de coregistratiestap van deze pijplijn, kunnen indien nodig ook ruimtelijke transformaties voor elke video afzonderlijk worden berekend. Drie kenmerken die in elke video aanwezig zijn, werden gekozen als punten voor het labelen en berekenen van ruimtelijke transformatie. In de getoonde representatieve gegevens waren die drie punten het midden van de hoofdstijl, het vooraanzicht van het rechteroog van het dier en het profielaanzicht van het rechteroog van het dier (zichtbaar in een spiegel die in een hoek van 45 graden was geplaatst). Voorbeelden van co-registratie van video's zijn weergegeven in figuur 1A,B, die het gemiddelde frame toont dat is berekend op basis van alle video's die tijdens dit experiment zijn gemaakt, zowel voor als na co-registratie, om het effect van deze stap aan te tonen.

Deze pijplijn is sterk afhankelijk van optische stroom, een computervisiemethode die wordt gebruikt om de beweging van objecten in een video te schatten door hun schijnbare snelheden tussen opeenvolgende frames^{te schatten 13}. Er werd gekozen voor optische stroom omdat het de kwantificering van beweging mogelijk maakt - een proxy van gedragsreacties - zonder vooraf bepaalde lichaamsdelen of acties van belang. Bovendien was deze methode vatbaar voor de beperkte beeldkwaliteit van de representatieve video's, die werden verkregen met de enige MR-compatibele camera die toegankelijk was op het moment van het experiment. In deze pijplijn wordt het Horn-Schunck-algoritme van wereldwijde, dichte optische stroomschatting gebruikt; andere algoritmen, zoals het Lucas-Kanade-algoritme, kunnen echter gemakkelijk worden gebruikt met kleine wijzigingen in de meegeleverde MATLAB-scripts 14,15,16. Figuur 2A toont een voorbeeld van een videoframe met relatieve optische stroomsnelheidsvectoren die voor elke pixel over elkaar heen liggen. Merk op dat de grotere vectoren verschijnen in gebieden waar je beweging zou verwachten, zoals de snuit en poten van het dier.

Terwijl de pijplijn de optische stroom voor alle video's over het volledige gezichtsveld schatte, werden de resterende analysestappen veel beter beheersbaar gemaakt in termen van rekenbelasting en gegevensopslagbehoeften door een interessegebied (ROI) binnen het gezichtsveld te selecteren. De ROI kan worden geselecteerd op basis van het experiment en vooraf bepaald gedrag dat van belang is of via een meer datagestuurde aanpak. Aangezien de representatieve gegevens geen specifieke gedragsoutput bevatten om a priori te volgen, werd een datagestuurde aanpak gevolgd. De standaarddeviatie van de optische stroomgrootte werd berekend over alle video's bij elke pixel, zoals gevisualiseerd in figuur 2B. Gebieden met de hoogste standaarddeviatie omvatten contouren van het dier, zoals rond het oog en de snuit, die het vertrouwen wekken dat de waargenomen optische stroomfluctuaties werden geleid door bewegingen van dieren en niet door ruis in de video's. Gebieden met een kleinere standaarddeviatie waren onder meer de contouren van de houder, die het gevolg kunnen zijn van kleine trillingen in de camera en de houder die tijdens het scannen zijn opgetreden. De MRI-omgeving wordt onvermijdelijk bereden door trillingen tijdens het verzamelen van gegevens als gevolg van het wisselen van gradiënten, die zich kunnen manifesteren in optische stroomfluctuaties die worden waargenomen in reflecterende componenten van de wieg. Gelukkig zijn deze trillingen constant tijdens de gegevensverzameling, dus onafhankelijk van de stimulusconditie en zullen ze naar verwachting de resultaten van gedragsanalyse niet beïnvloeden. Bijzonder verhoogde standaarddeviaties van de optische stroom werden waargenomen in de pixels van de spiegel, die overeenkomen met de profielweergave van het gezicht van het dier, die de selectie van de ROI voor de representatieve gegevens leidde. Dit was ook een regio waar gedragsreacties, zoals kloppen en snuiven, konden worden verwacht als onderdeel van het typische gedragsrepertoire van vrouwelijke muizen die op zoek waren naar een geïsoleerde pup die pup-oproepen uitzendt¹⁷.

Na het kiezen van een ROI en het extraheren van de gemiddelde framegewijze grootte van de optische stroom voor alle video's, kon de optische stroom tijdens interessante tijdperken worden vergeleken tussen groepen en omstandigheden. Merk op dat de eerste 20 seconden (s) van de optische stroomvector van elke video werden gemaskeerd voor helderheidsstabilisatie; Dit kan echter worden aangepast aan experimentele behoeften. Voor elke video werd de framegewijze optische stroomvector voor de gekozen ROI Z-gescoord en vervolgens, in navolging van eerder werk in de classificatie van gezichtsuitdrukkingen, werd deze laagdoorlaat gefilterd op 5 hertz (Hz) om er rekening mee te houden dat de framerate van 30 Hz van de camera sneller was dan verwachte gedragsfluctuaties². Ten slotte werden de Z-gescoorde en gefilterde vectoren opgedeeld in stimuluspresentatie-epochs om het effect van stimuluspresentatie op de optische stroom te beoordelen. Voor elk tijdperk werd het gemiddelde basissignaal vóór de stimulus afgetrokken om de optische stroom te normaliseren naar de pre-stimulusperiode. Figuur 3A toont voorbeeldige optische stroomtijdreeksen voor twee video's, een moeder en een maagd, met samenvattende groepsgegevens in figuur 3B-E. Figuur 3B en Figuur 3D tonen de cumulatieve optische stroom in de loop van de tijd tijdens de presentatie van de stimulus ten opzichte van de basislijn, terwijl Figuur 3C en Figuur 3E de cumulatieve optische stroom 2,5 s na het begin van de stimulus samenvatten. De cumulatieve optische stroom werd berekend om de algehele beweging in de loop van de tijd vast te leggen zonder aan te nemen dat spontane gedragsreacties op een tijdgebonden manier zouden optreden. Over het algemeen tonen deze representatieve resultaten aan dat pup-oproepen, maar niet zuivere tonen, significant verschillende gedragsreacties opriepen van maternale versus maagdelijke vrouwelijke muizen, zoals voorspeld (Mann-Whitney U-test tussen de groepen: pup-oproepen: p = 0,026; zuivere tonen: p = 0,093). Dit stimuluseffect overleefde echter geen 2-weg ANOVA, terwijl het groepseffect dat wel deed (stimulus: F(1,10) = 0,19, p = 0,67; groep: F(1,10) = 8,61, p = 0,015). Over het algemeen suggereren deze resultaten dat moeders een hogere stimulus-opgewekte beweging vertoonden in vergelijking met maagden, waarbij de maternale reactie op pup-oproepen consistenter was dan op pure tonen. Dit kan een weerspiegeling zijn van verhoogde oplettendheid of stress bij moeders, evenals de gedragsrelevantie van pup-oproepen, die, in tegenstelling tot pure tonen, de reactie van het ophalen van pups oproepen bij moeders in naturalistische omgevingen. Alles bij elkaar suggereren deze representatieve resultaten dat schatting van de optische stroom tijdens externe stimuluspresentatie informatie kan extraheren over genuanceerde, spontane gedragsreacties.

Ten slotte werd een meer verkennende analyse uitgevoerd om de ruimtelijke kenmerken van het gedrag in de representatieve gegevens bloot te leggen. Om te onderzoeken welke pixels in de ROI op een gecoördineerde manier fluctueerden tijdens de presentatie van de stimulus, werd hoofdcomponentenanalyse (PCA) uitgevoerd op de ruimtelijke optische stroominformatie in de loop van de tijd. Deze analyse onthulde pixels die het meest bijdroegen aan de eerste pc, evenals pixels die groepsverschillen vertoonden voor elke stimulusconditie, zoals weergegeven in figuur 4. De meest rechtse panelen van figuur 4A,B suggereren dat moeders meer beweging in de neus vertoonden in vergelijking met maagden tijdens de presentatie van beide stimulustypen. Over de twee groepen en twee stimuluscondities verklaarde de eerste PC 5,41% ± 0,59% van de totale variantie in de optische stroomanalyse. Hoewel de spiegel-ROI voor dit deel van onze analyse werd gehandhaafd, zouden toekomstige analyses zich kunnen uitbreiden naar een breder deel van het gezichtsveld om gecoördineerde bewegingen voorbij het gezicht te karakteriseren als reactie op stimuli. Het vergelijken van pootbewegingen kan bijvoorbeeld meer significante groepsverschillen aan het licht brengen, aangezien pup-oproepen meestal het ophalen van pups initiëren bij moeders, maar niet bij maagden, en dat de poten vrijer kunnen bewegen dan de kop van het dier.

Hoewel de representatieve resultaten tot nu toe suggereerden dat deze pijplijn niet-geïnstrueerde gedragsreacties op externe stimuli in beperkte videografie-omgevingen kan beoordelen, bleef de vraag of de waargenomen fluctuaties in optische stroom echt zinvol diergedrag weerspiegelden. Om deze vraag te beantwoorden, werd een afzonderlijke validatiedataset geanalyseerd met behulp van dezelfde pijplijn. In een afzonderlijk experiment werden mannelijke muizen met waterbeperking getraind om een lichtsignaal te associëren met de toediening van een waterbeloning van 6 μL ("hoge beloning") of 1 μL ("lage beloning"). Met name had dit experiment, in tegenstelling tot het auditieve stimulatie-experiment, een a priori gedragsuitlezing: liksnelheid. Er werd een lickometer tot stand gebracht via videogebaseerde detectie van likstenen, mogelijk gemaakt door de analyse van de pixelhelderheid dicht bij de watertuit. De gedragsuitlezing die door de lickometer wordt geleverd, kan dus worden gebruikt om de gedragsuitlezing van deze pijplijn te vergelijken die wordt geleverd door optische stroomschatting, ter ondersteuning van de validiteit ervan bij het detecteren van spontaan gedrag. Na coregistratie van video's, schatting van de optische stroom, ROI-selectie (opnieuw met inbegrip van het gezichtsveld van de spiegel) en kwantificering van de optische stroom, bleek uit een vergelijking van de omvang van de optische stroom een significant verschil tussen de gedragsreacties op hoge versus lage beloningen. De resultaten van deze analyse worden weergegeven in Figuur 5A,B, waar Figuur 5A de gemiddelde tijdreeksen van de groep laat zien, en Figuur 5B de cumulatieve optische stroom 2,5 s na het begin van de stimulus samenvat (tussen-conditie gepaarde Wilcoxon signed-rank test: p = 0,031). Merk op dat de optische stroomwaarden groter waren in vergelijking met het spontane gedrag dat in de representatieve gegevens werd geregistreerd, wat de uitdaging van het evalueren van niet-geïnstrueerde, genuanceerde gedragsreacties verder benadrukt. Figuur 5C geeft de werkelijke liksnelheid weer die door de lickometer is geregistreerd voor elk van de twee beloningsvoorwaarden, terwijl Figuur 5D laat zien dat er meer likken worden geregistreerd tijdens de hoge beloningsconditie in vergelijking met de lage beloningsconditie binnen 2,5 s na toediening van de beloning (tussen de condities gepaarde Wilcoxon signed-rank test: p = 0,031). Al met al lieten beide analyses een vergelijkbare trend zien in de vergelijking van hoge versus lage beloningsreacties, waardoor de gepresenteerde video-analysepijplijn werd gevalideerd voor het vastleggen van betekenisvolle verschillen in diergedrag onder verschillende omstandigheden.

Alles bij elkaar suggereren de hier getoonde representatieve resultaten dat de presentatie van pup-oproepen significant verschillende reacties opriep bij maternale versus maagdelijke vrouwelijke muizen, terwijl zuivere tonen dat niet deden. De analyse van een validatiedataset geeft het vertrouwen dat de waargenomen verschillen in optische stroom betekenisvolle verschillen in gedragsreacties op externe stimuli weerspiegelen.

Figuur 1: Coregistratie van video's. (A) Voorbeelden van coregistratie van video's met vooraf bepaalde kenmerken (midden van de hoofdstijl, vooraanzicht van het rechteroog, profielaanzicht van het rechteroog) gelabeld in drie frames, elk afkomstig uit verschillende video's van verschillende dieren. Merk in de overlay op hoe de drie punten niet op elkaar waren afgestemd, wat aantoont hoe de gedragsopstelling enigszins veranderde tussen data-acquisitiesessies. (B) Het gemiddelde frame over de laatste 10 s van elke video voor (links) en na (rechts) het uitvoeren van videocoregistratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schatting van de optische stroom. (A) Voorbeeldkader met relatieve optische stroomvectoren met blauwe eroverheen gelegd. (B) De gemiddelde pixelgewijze standaarddeviatie van de optische stroom over alle video's. De gekozen ROI rond de profielweergave van het gezicht van het dier via de spiegel wordt in magenta omlijnd. De kleurenbalk komt overeen met de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Visualisatie en vergelijking van optische stroom tussen groepen en omstandigheden. (A) Voorbeeldige Z-gescoorde en 5 Hz laagdoorlaatgefilterde tijdreeksen van optische stroom voor één video van een moeder en één video van een maagd. (B) en (D) Cumulatieve optische stroom gemeten tijdens de stimulusperiode van pup-oproepen (B) en zuivere tonen (D). Arcering vertegenwoordigt de standaardfout van het gemiddelde (SEM). (C) en (E) Cumulatieve optische stroom tijdens de eerste 2,5 s van de stimuluspresentatie voor pup-oproepen (C) en zuivere tonen (E). * Geeft p < 0,05 aan, tussen de Mann-Whitney U-test tussen de groep (pup-oproepen: p = 0,026; zuivere tonen: p = 0,093), N = 6 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: PC₁ vergelijking tussen groepen. (A,B) Kaarten die de belasting van de eerste hoofdcomponent (PC₁) van de optische stroom weergeven tijdens pup-oproepen (A) en zuivere tonen (B) over groepen heen, statistisch gedrempeld op p < 0,05 zonder correctie voor meerdere vergelijkingen. Heatmap geeft de mate aan waarin de fluctuatie van de optische stroom van elke pixel heeft bijgedragen aan PC₁, ten opzichte van andere pixels. Kleine zwarte tekst geeft het percentage variantie aan dat wordt verklaard door PC₁ (oproepen van moeders jongen: 4,95% ± 0,72%; oproepen van maagden jongen: 4,44% ± 0,59%; zuivere tonen van moeders: 4,95% ± 0,39%; zuivere tonen van maagden: 4,72% ± 1,24% (gemiddelde ± standaarddeviatie)). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Validatie van de pijplijn voor gedragsanalyse. (A) Gemiddelde Z-score, pre-stimulus baseline afgetrokken en 5 Hz laagdoorlaat gefilterde tijdreeksen van optische stroom tijdens hoge en lage beloning. Arcering staat voor de SEM, de witte verticale lijn geeft de beloning aan en de rode sterretjes geven tijdelijke optische stroomartefacten aan als gevolg van het begin en de verschuiving van de lichtcue. (B) Samenvatting van de cumulatieve optische stroom gedurende de eerste 2,5 s na de levering van de beloning. * Geeft p < 0,05 aan, tussen de conditie gepaarde Wilcoxon signed-rank test (p = 0,031). (C) Gemiddelde liksnelheid, verkregen door lickometer, tijdens levering met hoge en lage beloning. Arcering staat voor SEM en de witte verticale lijn geeft de levering van de beloning aan. (D) Aantal licks geregistreerd gedurende de eerste 2,5 s na de levering van de beloning. * Geeft p < 0,05 aan, tussen de aan de conditie gekoppelde Wilcoxon signed-rank test (p = 0,031), N = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Voorbeeld video 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Voorbeeld video 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Gebeurtenistimingbestand voor video 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Gebeurtenistimingbestand voor video 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: script1_videocoreg.m. Dit script lijnt alle video's ruimtelijk op elkaar af via coregistratie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: script2_optflow_roiselect.m. Dit script schat de optische stroom voor het volledige gezichtsveld van elke getransformeerde video en maakt het mogelijk om een ROI voor de rest van de pijplijn te selecteren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 3: script3_optflow_analysis.m. Dit script vergelijkt de optische stroomgrootte over verschillende groepen/voorwaarden voor de gekozen ROI. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 4: script4_optflow_pca.m. Dit script voert PCA uit op de geschatte optische stroom van de gekozen ROI. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 5: script5_optflow_pca_analysis.m. Dit script vergelijkt PCA-resultaten in verschillende groepen/voorwaarden voor de gekozen ROI. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De gepresenteerde pijplijn voor gedragsanalyse maakt het mogelijk om waardevolle informatie te extraheren uit video's van dieren die niet-geïnstrueerd gedrag vertonen als reactie op passief gepresenteerde stimuli. Deze representatieve gedragsvideo's werden verkregen in combinatie met functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI) van de hele hersenen, waarvoor meerdere beperkingen werden overwonnen om gedragsreacties in de MRI-omgeving vast te leggen. Met behulp van de methode van optische stroomschatting werden verschillen onthuld in de manier waarop moeders versus maagden reageren op oproepen van pups - maar niet op zuivere tonen - wat de initiële hypothese 13,14,15,16 ondersteunt. Door gebruik te maken van de dimensionaliteitsreductie van de optische stroominformatie, werd deze bevinding uitgebreid tot een verkennende analyse van de ruimtelijke verdeling van dit gedrag.

Deze analysepijplijn is breed vatbaar voor verschillende experimentele paradigma's. Het is volledig agnostisch voor het type neurale gegevens dat wordt verkregen en vereist geen buitensporige rekenkracht of gespecialiseerde apparatuur. De belangrijkste experimentele vereiste is dat videografiegegevens worden opgenomen met de relevante tijdstempels van het begin van de stimuluspresentatie. Bovendien zou de implementatie van deze pijplijn, door het verstrekken van de MATLAB-scripts die worden gebruikt om de gedemonstreerde analyses uit te voeren, vrij eenvoudig moeten zijn, zelfs voor degenen met minimale MATLAB-ervaring. De algemene stappen, zoals beschreven in het protocol, bestaan uit videocoregistratie, schatting van de optische stroom, selectie van interessegebieden (ROI), ROI-specifieke kwantificering van optische stromen, vergelijking van de optische stroomomvang, analyse van hoofdcomponenten (PCA) en PCA-vergelijking. Bij elke stap kan de pijplijn worden aangepast aan experimentele en analytische behoeften, zoals vermeld in het protocol en gemarkeerd met opmerkingen in de hele code.

Er zijn verschillende beperkingen waarmee u rekening moet houden bij het gebruik van de gepresenteerde video-analysepijplijn. Ten eerste moet het ontwerp van het gedragsapparaat zorgvuldig worden overwogen. Als het onduidelijk is welke gedragsreacties kunnen worden verwacht, kan het nuttig zijn om in toekomstige analyses zoveel mogelijk gezichtspunten van het dier te hebben. Daarom wordt aanbevolen om een of meer spiegels te installeren om tegelijkertijd de frontale en profielaanzichten van het dier vast te leggen, zoals weergegeven in de voorbeeldvideoframes in figuur 1A. Ten tweede wordt aanbevolen dat de verlichting voor video-acquisitie helder genoeg is om alle relevante kenmerken van het gezichtsveld (FOV) te zien, maar niet zo helder dat het verzadiging bereikt. In figuur 1A kan worden waargenomen dat het frontale aanzicht van de neus van de muis zich op een punt bevindt dat bijna verzadigd is, waardoor het moeilijk is om eventuele fluctuaties in helderheid vast te leggen die op beweging zouden duiden. Dit kan hebben bijgedragen aan het gebrek aan optische stroomvariatie dat in dit deel van het gezichtsveld werd waargenomen, zoals weergegeven in figuur 2B. Gelukkig had de profielweergave van de neus dit probleem niet, waardoor de analyse van de spiegel-ROI mogelijk was. Bovendien moet de mogelijkheid van verzadiging worden overwogen als er visuele stimuli bij het experiment betrokken zijn. In het experiment met de validatiedataset introduceerde een lichtsignaal dat werd gebruikt om de levering van een waterbeloning aan te geven, tijdelijke verzadiging in de verkregen video's, wat een tijdelijk artefact vormde in de schatting van de optische stroom. Dit artefact kan worden waargenomen in figuur 5A, waar de twee scherpe pieken in de optische stroomsporen voor beide beloningsvoorwaarden precies overeenkomen met wanneer de lichtcue werd in- en uitgeschakeld. Dit artefact maakte deze korte tijdvensters moeilijk te analyseren met de gepresenteerde pijplijn, en als deze niet aanwezig was geweest, waren de resultaten in figuur 5B mogelijk nog significanter geweest. Constante scèneverlichting is een noodzakelijke aanname voor de meeste optische stroomalgoritmen^14,16. Daarom wordt deze pijplijn voor videoanalyse niet aanbevolen voor experimenten waarbij de verlichting van de omgeving drastisch verandert, zowel binnen als tussen proeven door. Ten derde en ten slotte is de voldoende gewenning van dieren aan de opnameomgeving een belangrijk onderdeel van elk experiment dat gebruik zal maken van deze pijplijn. Als ze niet goed gewend zijn, kunnen dieren aanzienlijke stressreacties vertonen, waardoor subtiele stimulusgestuurde effecten worden weggespoeld die anders via videoanalyse zouden kunnen worden ontleed.

In de toekomst kan deze pijplijn voor gedragsanalyse worden gebruikt om de gecoördineerde evaluatie van gelijktijdig geregistreerde gedrags- en neurale reacties te vergemakkelijken. Zoals aangetoond, maakt het kwantitatief beoordelen van niet-geïnstrueerd gedrag het mogelijk om de opvallendheid van stimuli in een complexe opnameomgeving te evalueren, evenals het testen op verschillende gedragsreacties in experimentele groepen en omstandigheden. Verdere analyses kunnen worden uitgevoerd om individuele verschillen of trial-by-trial trends in gedragsreacties te onderzoeken, zodat de overeenkomstige neurale activiteit kan worden onderzocht. Bovendien kan het opnemen van PCA om ruimtelijke informatie te verkrijgen over stimulus-opgewekte beweging worden gebruikt om verder te onderzoeken of specifieke soorten gedragssequenties die tijdens de stimuluspresentatie worden waargenomen, verschillen tussen groepen en omstandigheden. Deze analysepijplijn kan eenvoudig worden uitgebreid naar verschillende neurale opnamemethoden, waardoor veelzijdige gedragsmonitoring in beperkte omgevingen wordt geboden. Door te onderzoeken hoe externe stimuli worden weergegeven in zowel de hersenen als het gedrag, zijn onderzoekers klaar om een beter begrip te krijgen van hoe de perceptie van stimuli interne toestanden en hun externe manifestaties beïnvloedt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MATLAB Computer Vision Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
MATLAB software	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
MR-compatibele camera “12M-i” met geïntegreerde LED-verlichting	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf