Nanofibrillaire basale membraan nabootsen gemaakt van recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde in op maat gemaakte weefselkweekinzetstukken

Samenvatting

Weefselkweekinserts met plastic membranen zijn de gouden standaard in celkweeklaboratoria als permeabele dragers om cellagen en modellen van barrièreweefsels te vestigen. Hierin presenteren we een eenvoudige methode om het plastic membraan te vervangen door een biologisch relevanter membraan gemaakt van een recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde-eiwit.

Samenvatting

Het repliceren van weefselbarrières is van cruciaal belang voor het genereren van relevante in vitro modellen voor het evalueren van nieuwe therapieën. Tegenwoordig wordt dit vaak gedaan met behulp van weefselkweekinzetstukken met een plastic membraan, dat een apicale en een basale zijde genereert. Deze membranen bieden niet alleen ondersteuning voor de cellen, maar zijn ook verre van het nabootsen van hun oorspronkelijke tegenhanger, het basale membraan, dat een nanofibrillaire, op eiwitten gebaseerde matrix is. In dit werk laten we een eenvoudige manier zien om de biologische relevantie van de weefselkweekinserts aanzienlijk te verbeteren door het plastic membraan te vervangen door een membraan gemaakt van een puur recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde-eiwit. Het zijdemembraan vormt zich door zelfassemblage en zal zich spontaan hechten aan een membraanvrije weefselkweekinzet, waar het ondersteuning kan bieden aan cellen. Op maat ontworpen weefselkweekinserts kunnen worden geprint met behulp van een standaard 3D-printer, volgens de instructies in het protocol, of in plaats daarvan kunnen commerciële inserts worden gekocht en gebruikt. Dit protocol laat zien hoe het kweeksysteem met zijdemembranen in inserts is opgezet en vervolgens hoe dezelfde celkweektechnieken die worden gebruikt bij traditionele, in de handel verkrijgbare inserts kunnen worden geïmplementeerd.

Inleiding

In vitro modellen die weefselbarrières kunnen repliceren, hebben steeds meer aandacht gekregen vanwege hun toepasbaarheid bij het testen van nieuwe therapieën en het vergemakkelijken van het begrip van fundamentele ziektemechanismen ^1,2. Om de oorspronkelijke micro-omgeving nauwkeurig na te bootsen, is het van cruciaal belang om de functie van het basale membraan (BM), een zeer gespecialiseerd extracellulaire matrix (ECM) -complex, te recapituleren. De BM komt voor in bijna elk weefsel in het menselijk lichaam, waar het ondersteuning biedt aan endotheel- en epitheelcellen en ze scheidt van onderliggend weefsel ^2,3. Naast het bieden van fysieke ondersteuning, reguleert en onderhoudt de BM ook biochemische signalen tussen de cellen en het omliggende weefsel. Deze vitale functies maken het noodzakelijk om steigers te ontwerpen die lijken op de structuur, evenals de mechanische en functionele kenmerken van de native BM³.

Een van de meest gebruikelijke manieren om de BM tegenwoordig in vitro na te bootsen, is door het gebruik van in de handel verkrijgbare weefselkweekinserts (TC-inserts). Dit zijn in wezen plastic cilinders met een permeabel membraan dat de kamer verdeelt in apicale en basolaterale zijden ^4,5. Hoewel ze gemakkelijk te gebruiken zijn, zijn de membranen in commerciële inzetstukken over het algemeen stijf, geslepen en gemaakt van polymeren zoals poly(carbonaat) (PC) en poly(ethyleentereftalaat) (PET)^3,4,6. Ze zijn flexibel in termen van diameter, poriedichtheid en grootte en kunnen worden gecoat om de celadhesie te verbeteren, maar missen alle andere relevante kenmerken van de BM, zoals vergelijkbare dikte⁶, onderling verbonden poreusheid, vezelarchitectuur en relevante elastische modulus³.

De standaardisatie van TC-inserts en hun gebruiksgemak heeft verschillende groepen, waaronder de onze, geïnspireerd om het plastic membraan te vervangen door een meer in vivo-achtige tegenhanger (zie tabel 1). De gebruikte materialen variëren van polymeren zoals Polydimethylsiloxaan (PDMS)⁷, Poly(lactide-co-caprolacton) (PLCL)⁸ en polycaprolacton (PCL)^4,9,10 tot op eiwitten gebaseerde materialen zoals gelatine ^2,11,12, collageen ^5,13 en recombinant spinrag 14,15,16,17. Membranen van deze materialen zijn op verschillende manieren bevestigd, zowel aan in de handel verkrijgbare inserts waarvan het membraan is verwijderd 4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21 , evenals op maat ontworpen inzetstukken die zijn vervaardigd door middel van 3D-printen 1,11,15,17,20 of spuitgieten ^9,22. De meeste hiervan lijken echter nog steeds verre van op de oorspronkelijke BM in termen van dikte, waar de replica's variëren van honderden^11,18 tot enkele micrometers ^{5,10,14,21,22}. Velen van hen vereisen ook complexe formatie- en/of handmatige bevestigingsmethoden 1,7,13,14,18,19,21, waardoor schaalvergroting en replicatie in andere laboratoria een uitdaging is.

Hierin presenteren we een eenvoudige methode om een zijden membraan te vormen en aan inserts te bevestigen en laten we zien hoe cellen aan weerszijden van het membraan kunnen worden gekweekt. De zijdemembranen worden gevormd door zelfassemblage van het FN-4RepCT (FN-silk) eiwit op het vloeistof-luchtgrensvlak van een staande oplossing^16,17. FN-zijde is een recombinant geproduceerde korte versie van Major Ampullulate Spidroin 1 van Euprosthenops australis, gefunctionaliseerd met een RGD-motief afgeleid van fibronectine²³. Het is aangetoond dat het zich samenvoegt tot fibrillaire matrices die celadhesie, groei en migratie bevorderen 15,16,17,23,24,25. De methode voor de bevestiging van het membraan op de insert is gebaseerd op spontane hechting en is geschikt bevonden voor in de handel verkrijgbare inserts waarvan het membraan is verwijderd¹⁶, evenals 3D-geprinte inserts van polymelkzuur (PLA)¹⁷ en Dental LT¹⁵. In dit artikel wordt beschreven hoe deze methode wordt gebruikt voor inserts die zijn gedrukt met Dental LT. Nadat de FN-silk-membranen aan de inserts zijn bevestigd, kunnen ze in wezen worden behandeld als standaard commerciële weefselkweekinserts. Kortom, we presenteren een eenvoudige methode om meer relevante in vitro modellen van weefselbarrières te genereren door plastic membranen te vervangen door een op eiwitten gebaseerd, FN-silk membraan.

Protocol

1. 3D-bedrukken van inserts

1. Download het . STL-ontwerpbestand (JoVe_Silk_Insert.stl) van aanvullend bestand 1.
2. Bereid de bestanden voor op het afdrukken door ze te openen in het softwarepakket dat is bedoeld voor het converteren van een . STL-bestand naar een printbestand voor de 3D-printer die wordt gebruikt.
3. Gebruik de speciale software om ondersteuningen toe te voegen. De ondersteunende structuur wordt ontworpen door de software en de benodigde hoeveelheid is afhankelijk van de printer en de software die wordt gebruikt. Richt de wisselplaat zo dat noch het bouwplatform, noch de steunen de bodem raken.
4. Print het gewenste aantal inserts met behulp van een biocompatibele hars (zoals Dental LT of BioMed) of filament (zoals PLA) dat geschikt is voor de 3D-printer die wordt gebruikt.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat het materiaal bestand is tegen een geschikt sterilisatieproces, zoals autoclaveren, bestraling of onderdompeling in ethanol.
5. Maak de bedrukte inzetstukken los van het drukplatform en verwijder de geprinte draagstructuur van het afgewerkte onderdeel.
6. Als u een harsprinter gebruikt, verwerk dan de inzetstukken volgens het standaardprotocol van de fabrikant.
   OPMERKING: De verwerking kan variëren, afhankelijk van welke hars wordt gebruikt. Het protocol dat wordt gebruikt voor de hars die hierin wordt gebruikt, is opgenomen in aanvullend bestand 2.
7. Steriliseer de inzetstukken met behulp van een techniek die geschikt is voor het materiaal van uw keuze.
   OPMERKING: Aanbevelingen zijn autoclaveren, bestraling of onderdompeling in 70% ethanol, of een combinatie daarvan. Als u een harsprinter gebruikt, kan een uitgebreid uitloogprotocol nodig zijn om optimale biocompatibiliteit te bereiken. Raadpleeg het protocol in aanvullend bestand 2 voor een aanbeveling.
8. Zorg ervoor dat de inzetstukken volledig droog zijn en bewaar ze steriel tot gebruik.

2. Vorming van FN-zijde membranen

1. Vul een doos met droogijs en breng deze naar de -80 °C vriezer.
2. Verzamel de FN-silk flacons uit de vriezer van -80 °C en plaats ze in droogijs voor transport. Breng de FN-silk flacons naar een biologische veiligheidskast en voer daar verdere stappen uit. Plaats de FN-silk flacons in een rek met microcentrifugebuisjes om te ontdooien zonder ze overmatig aan te raken.
3. Terwijl de FN-zijde aan het ontdooien is, pak je de plaat met 48 vakjes uit. Zodra de FN-silk volledig is ontdooid, gaat u binnen 10 minuten verder met de volgende stap, bij voorkeur zo eerder.
4. Verdun de FN-zijdeoplossing in gekoeld PBS of PBS op kamertemperatuur tot de gewenste concentratie, bij voorkeur 1,8 mg/ml. Pipetteer 550 μL FN-zijdeoplossing rechtstreeks op de bodem van een lege put in de plaat met 48 putjes. Pipeteer de FN-silk oplossing tot het gewenste aantal membranen is bereid.
   OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen en verwijder eventuele luchtbellen onmiddellijk met een pipet. Gebruik geen putten in rij A of F of kolom 1 of 8, noch aangrenzende putten (zie schema in aanvullende figuur S1).
5. Plaats het deksel op de plaat met 48 putjes en plaats deze in een grotere, steriele doos om tijdens de incubatie een steriele omgeving te bieden.
6. Verplaats de doos voorzichtig uit de biologische veiligheidskast en laat hem 's nachts in de omgevingsomstandigheden op een ongestoorde plaats zonder noemenswaardige luchtstroom staan.

3. Hechten van FN-zijde membranen aan inserts

1. Breng de volgende dag de steriele inzetstukken naar de biologische veiligheidskast.
2. Breng de grote steriele doos met de 48-wells plaat met de FN-silk membranen terug in de biologische veiligheidskast en voer daar verdere stappen uit. Til de plaat met 48 putjes voorzichtig uit de grote steriele doos.
3. Controleer de membraanvorming visueel door de troebelheid in de putjes te observeren en open het deksel van de plaat met 48 putjes met de membranen. Pak een inzetstuk op met een steriel pincet en leid het inzetstuk naar beneden op het membraan totdat de handvatten van het inzetstuk de bovenkant van het putje raken, zoals weergegeven in afbeelding 1. Houd de onderkant van het inzetstuk evenwijdig aan de onderkant van de plaat.
4. Herhaal stap 3.3 totdat de inzetstukken op alle gevormde membranen zijn neergelaten. Plaats het deksel op de plaat met 48 putjes en plaats de plaat terug in de steriele doos. Laat de plaat 2 uur bij omgevingsomstandigheden met rust om de membranen aan de inzetstukken te laten hechten.
5. Verwarm het groeimedium of PBS voor op 37 °C.
6. Pak een bord met 24 putjes uit.
7. Zodra er 2 uur zijn verstreken, haalt u de plaat met 48 putjes uit de doos en opent u het deksel. Gebruik een steriel pincet om een inzetstuk aan de handvatten vast te houden en uit de plaat met 48 putjes te tillen.
8. Vul de wisselplaat direct na het optillen met voorverwarmd kweekmedium of PBS. Gebruik 100 μl kweekmedium als u doorgaat met basaalzijdige zaaiing of 200 μl als u doorgaat met apicale zijzaaiing. Als de membranen worden bewaard voor later gebruik, gebruik dan in plaats daarvan 200 μL PBS.
   CONTROLEPUNT: Als de vloeistof boven het membraan wordt vastgehouden, is het optillen gelukt. Als er vloeistof op de bank druppelt, lekt het membraan en moet dit worden genegeerd.
9. Plaats het inzetstuk in een leeg putje van de plaat met 24 putjes.
10. Til alle inzetstukken uit de plaat met 48 putjes en breng ze over naar de plaat met 24 putjes. Vul de putjes met 1.000 μL groeimedium als u doorgaat met celzaaien of PBS voor opslag terwijl u de plaat licht gekanteld houdt.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat de rand van het membraan zich onder het vloeistofniveau bevindt (Figuur 2).
11. Als cellen meteen moeten worden gezaaid, ga dan verder met sectie 4 of 5, afhankelijk van aan welke kant van het membraan de cellen moeten worden gezaaid. Als dit niet het geval is, plaatst u het deksel op de plaat met 24 putjes en plaatst u deze in de koelkast (4 °C) of in een incubator van 37 °C. Als het in de couveuse wordt geplaatst, vul dan om de dag de PBS aan om ervoor te zorgen dat het benodigde volume behouden blijft.

4. Celuitzaaiing aan de apicale zijde van het membraan

OPMERKING: Als de membranen in PBS zijn bewaard, vervang dan de PBS door voorverwarmd kweekmedium zoals beschreven in sectie 6.

1. Oogst de cellen. Bereid de celsuspensie zo voor dat het gewenste aantal cellen per membraan aanwezig is in 20-50 μL van de suspensie. Resuspendeer om de gewenste celconcentratie te bereiken.
2. Gebruik een P100- of P200-pipet om 20-50 μl van de celsuspensie op te zuigen. Richt de pipetpunt naar het midden van het membraan, houd de punt 1-2 mm verwijderd van het oppervlak van het kweekmedium in de inzetstuk en druk langzaam op de pipetzuiger om een druppel aan de rand van de punt te creëren. Breng de druppel in contact met het kweekmedium in de inzet.
   OPMERKING: Houd de pipet loodrecht op het werkoppervlak.
3. Herhaal stap 4.2 voor de overige membranen. Resuspendeer de celvoorraad na het zaaien van vijf membranen om een homogene celverdeling te garanderen. Verplaats de plaat in een achtvormig patroon om een betere celverdeling op het membraan te garanderen.
4. Kweek onder standaardomstandigheden (37 °C en 5% CO₂) en wissel om de dag van medium.

5. Celzaaiing aan de basale zijde van het membraan

OPMERKING: Als de membranen in PBS zijn bewaard, vervang dan de PBS door 100 μL voorverwarmd groeimedium en vul de putjes met 1 ml voorverwarmd groeimedium zoals beschreven in sectie 6.

1. Oogst de cellen en bereid de celsuspensie zo voor dat het gewenste aantal cellen per membraan aanwezig is in 20 μL van de suspensie. Resuspendeer om de gewenste celconcentratie te bereiken.
2. Pak het deksel van een petrischaaltje uit en open het. Zorg ervoor dat de hoogte van de petrischaal voldoende is om de inzetstukken te plaatsen zonder dat de onderkant het deksel raakt.
3. Til het inzetstuk met een pincet uit de plaat met 24 putjes en laat het kweekmedium in de putjes. Gebruik een pincet in elke hand om het inzetstuk om zodat de basale zijde naar boven wijst en de apicale zijde naar het werkgebied. Plaats het omgekeerde inzetstuk in de petrischaal zoals in figuur 3C. Herhaal dit voor de overige inzetstukken.
   OPMERKING: Verwijder het kweekmedium aan de apicale zijde niet. Het houdt het membraan nat tijdens de incubatie.
4. Resuspendeer de celvoorraad om een gelijkmatige celverdeling in de oplossing te garanderen en zuig 20 μl van de celsuspensie op met een P100- of P200-pipet. Richt de pipetpunt naar het midden van het membraan, houd de punt 1-2 mm verwijderd van het membraan en druk langzaam op de pipetzuiger om een druppel aan de rand van de punt te creëren. Houd de pipet loodrecht op het membraanoppervlak en laat de druppel op het membraan vallen. Herhaal dit voor de overige membranen.
   OPMERKING: Resuspendeer de celvoorraad na het zaaien van vijf membranen om een gelijkmatige celverdeling te garanderen.
5. Plaats het deksel op de petrischaal, breng de petrischaal en de plaat met 24 putjes naar de broedmachine en broed de inzetstukken met de cellen onder standaardomstandigheden (37 °C en 5 % CO₂) gedurende 30 minuten uit.
6. Breng de 24-wells plaat met kweekmedium en de petrischaal in de biologisch veiligheidskast. Open beide deksels en gebruik een pincet in elke hand, pak een inzetstuk op en keer het om zodat de apicale kant van het membraan nu naar boven wijst en de basale kant naar beneden.
7. Voeg met behulp van een P200-pipet 200 μL kweekmedium toe aan de binnenkant van het inzetstuk. Plaats het inzetstuk in een van de voorgevulde kuiltjes van de plaat met 24 putjes en herhaal dit voor de resterende membranen.
8. Kweek onder standaardomstandigheden (37 °C en 5% CO₂) en wissel om de dag van medium.

6. Gemiddelde verandering van culturen in ondergedompelde omstandigheden

1. Bereid een nieuwe plaat met 24 putjes voor met het verse kweekmedium door 1.000 μl/putje toe te voegen. Til met een pincet een inzetstuk uit de plaat met 24 putjes, kantel deze lichtjes en verwijder het medium van de apicale zijde.
2. Voeg 200 μL vers kweekmedium toe aan de inzet. Plaats het inzetstuk in een kuiltje dat voorgevuld is met vers kweekmedium. Herhaal dit voor alle membranen.

7. Gemiddelde verandering van culturen in luchtbrugomstandigheden

1. Til het inzetstuk met een pincet op en plaats het in een leeg putje van een bord met 24 putjes. Herhaal dit voor nog vier membranen.
2. Kantel de plaat met 24 putjes lichtjes en voeg langzaam 1.000 μL vers kweekmedium toe aan elk plaatputje. Herhaal dit voor de overige membranen.

8. Meten van transepitheliale elektrische weerstand (TEER)

1. Bereid een plaat met 24 putjes voor met 1.000 μL kweekmedium of PBS in de putjes en breng de membranen erin over. Zorg ervoor dat er 200 μL van de overeenkomstige oplossing boven het membraan is.
2. Gebruik een pincet om het inzetstuk in de plaat goed te stabiliseren door voorzichtig op de inzetarmen te drukken. Zonder het pincet te verwijderen, steekt u de TEER-elektrode in de put en registreert u de meting.
3. Verwijder de elektrode en til vervolgens het pincet op.
4. Herhaal stap 8.2-8.3 voor de overige membranen.

Resultaten

Representatieve foto's van de inserts
Foto's van de inserts voor en na het loslaten van het printplatform worden weergegeven in figuur 3A,B. Een afbeelding van een afgewerkte wisselplaat waarvan de steun is verwijderd, wordt weergegeven in figuur 3C. Het resultaat is een partij 3D-geprinte inserts, klaar voor sterilisatie en vervolgens gebruik.

Hijsen en hanteren van FN-silk membranen
Een algemeen schema van de vorming van het FN-silk-membraan en het handmatig heffen is weergegeven in figuur 1. Het resultaat zijn een aantal inserts met een FN-silk membraan eraan. Om het hoogste slagingspercentage bij het optillen van intacte membranen te garanderen, moeten de stappen die in het protocol worden beschreven, nauwkeurig worden gevolgd. Figuur 4 toont foto's van een membraan terwijl het intact is (A,D) en na het scheuren (B,E,F). De scheur kan worden gevisualiseerd met behulp van helderveldmicroscopie (Figuur 4E,F) en/of door het druppelen van vloeistof door het membraan (Figuur 4B). Het is belangrijk om de inzetstukken loodrecht op het membraan op te tillen en te laten zakken, om ervoor te zorgen dat het membraan gelijkmatig hecht en onder de inzetstukken rekt. De hechting van het membraan kan visueel worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 4A. Als de wisselplaat volgens de instructies wordt neergelaten en de vloeistofniveaus worden aangehouden zoals weergegeven in figuur 2, blijft het membraan gedurende lange kweekperioden aan de wisselplaat bevestigd.

Hierin wordt de membraanhechting aan de insert gevalideerd door een permeatie-experiment 15,16,17 uit te voeren op membranen die 9 dagen onder standaard celkweekomstandigheden zijn gehouden. Kortom, bij het toevoegen van een fluorescerend molecuul bovenop het membraan en het meten van het signaal in de oplossing eronder, volgt het permeatieprofiel van de zijdemembranen dat van een in de handel verkrijgbare weefselkweekinsert (figuur 4C), waarbij geen lekkage wordt vertoond gedurende 36 uur permeatie en wordt aangegeven dat het membraan zowel intact blijft als aan het inzetstuk vastzit. Soortgelijke experimenten zijn eerder uitgevoerd met cellen die aan één¹⁵ of beide zijden van het zijdemembraan waren gezaaid¹⁷. De sterkte van de hechting is eerder aangetoond met behulp van macro-indrukking¹⁶ en inflatietests ^16,17. Binnen de macro-indrukkingsexperimenten werd een stylus gebruikt om het membraan uit te rekken, dat onder een kracht van 1,4 mN scheurde, terwijl het vastzat aan het inzetstuk¹⁶.

Opgemerkt moet worden dat het slagingspercentage van het optillen van intacte membranen gerelateerd is aan het materiaal en de nabehandeling van de inzetstukken. Met dit protocol was 95% van de membranen die werden opgetild met behulp van inserts die waren bedrukt met de gebruikte hars geschikt voor celzaaien, vergeleken met 74% wanneer in plaats daarvan een vergelijkbare hars werd gebruikt. We speculeren dat de hechting wordt geholpen door hydrofobe interacties en van der Waals-krachten, en dat het veranderen van de materiaaleigenschappen dus de sterkte van de hechting verandert. Dit wordt verder ondersteund door het feit dat de membranen niet goed hechten aan hydrofiele materialen (gegevens niet getoond).

Representatieve resultaten van celkweek op de FN-silk membranen
Immunofluorescentiebeelden van keratinocyten (HaCaT) gekweekt aan de apicale of basale zijde van het membraan worden weergegeven in figuur 5. Er werd waargenomen dat de aangehechte cellen (Figuur 5D.i) het kweekgebied op dag 1 gelijkmatig bedekten terwijl ze de typische keratinocytenmorfologie verwierven (Figuur 5A.i-B.i). Op dag 3 hadden de keratinocyten een confluente laag gevormd (Figuur 5A.ii-B.ii) en vormden ze een netwerk van tight junctions (Figuur 5D.ii), wat aangeeft dat ze fysiologische epitheelfuncties aannamen. De hoge niveaus van levensvatbaarheid van cellen die werden bereikt in FN-zijdematrices 15,17,23,24 kwamen ook naar voren in de hierin beschreven opstelling van de zijdemembraan-insertcultuur. Na 3 dagen in kweek bleven de keratinocyten zeer levensvatbaar (Figuur 5C.i-iv). Bovendien werd er geen verschil in de verdeling van dode cellen waargenomen tussen het centrum (Figuur 5C.i-ii) en de periferie van het membraan (Figuur 5C.iii-iv), wat geen significant effect van het insertiemateriaal op de levensvatbaarheid van HaCaT aantoonde. Over het algemeen bood het zijde-insert-kweeksysteem een vergelijkbare (Figuur 5i-ii, v-vi) zo niet verbeterde (Figuur 5iii-iv, vii-viii) levensvatbaarheid van keratinocyten als die van een commercieel PET-membraan-insertsysteem.

Figuur 1: Gedetailleerde illustratie van de vorming en het optillen van enkelvoudige FN-zijde membranen. (A) Vul elk tweede putje (vermijd de buitenste rij/kolom) in een plaat met 48 putjes met FN-silk-eiwitoplossing waar (B) het zichzelf een nacht assembleert tot een membraan op het vloeistof-luchtgrensvlak. (C) Pak het inzetstuk vast met een pincet en laat het langzaam op het membraan zakken met behulp van de (D,E) geleiders op het 3D-geprinte inzetstuk om ervoor te zorgen dat het inzetstuk loodrecht op het membraan wordt neergelaten. Vergroting van de hechting van het zijdemembraan met een dwarsdoorsnede van het inzetstuk (F) direct boven het membraan en (G) wanneer het het zijdemembraan raakt. Gedurende de incubatietijd van 2 uur hecht (H) het zijdemembraan zich spontaan aan het inzetstuk, dat vervolgens (I) wordt gebruikt om het membraan van het grensvlak te tillen. Afkortingen: FN = fibronectine; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gedetailleerde illustratie die laat zien hoe het FN-silk membraan moet worden gehanteerd na het optillen van de formatieplaat. (A) Het inzetstuk (grijs) met het membraan (paars) direct na het optillen. (B) Vloeistof (blauw) wordt toegevoegd aan de apicale zijde van het membraan, die vervolgens in een (C) plaat met 24 putjes wordt geplaatst waar het langere deel van de inzetarmen aan de wanden hangt en het kortere deel het inzetstuk in het midden van de plaat houdt. (D) Vloeistof wordt toegevoegd aan de put, ervoor zorgend dat het vloeistofniveau in evenwicht is en boven de rand van het membraan ligt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Foto's van de 3D-geprinte inserts. (A) De inzetstukken direct nadat ze uit de 3D-printer zijn verwijderd, nog steeds bevestigd aan de bouwplaat. (B) Eén inzetstuk nadat het van de bouwplaat is verwijderd, voordat de steunen worden gebroken. (C) Eén inzetstuk nadat de steunen zijn verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Een FN-zijde membraan voor en na het breken. (A) Foto van een intact membraan met 200 μL geverfd (blauw) PBS aan de apicale zijde. De membraanrand die om het inzetstuk is gewikkeld, wordt aangegeven met witte pijlen. (B) Foto van hetzelfde membraan na het scheuren. PBS lekt door het membraan. (C) Grafiek van de permeatie van een fluorescerend molecuul van 3 kDa gedurende 36 uur door een zijdemembraan of een in de handel verkrijgbaar PET-membraan dat gedurende 9 dagen onder standaardcelkweekomstandigheden wordt bewaard. (D) Helderveldbeeld van een membraan vóór het scheuren. (E) Helderveldbeeld van hetzelfde membraan na scheuren. Het defecte gebied wordt aangegeven door de blauwe stippellijn. (F) Vergrote weergave van de scheur weergegeven in D met de rand van het gescheurde membraan aangegeven met blauwe pijlen. Schaalbalken = 1 mm (D,E), 200 μm (F). Afkortingen: FN = fibronectine; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; PET = poly(ethyleentereftalaat). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Keratinocyten (HaCaT) gekweekt op het FN-zijdemembraan. Op dag 1 hebben keratinocyten zich gehecht en het oppervlak van het membraan aan de apicale (A.i) of basale zijde (B.i) (phalloidine, groen) gelijkmatig bedekt. Op dag 3 wordt een confluente monolaag gevormd aan de apicale (A.ii) of basale (B.ii) zijde (phalloidine, groen). (C) Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen op het zijdemembraan (i-iv) vergeleken met een commercieel PET-membraan (v-viii) in het midden (i, ii, v, vi) en de periferie (iii, iv, vii, viii) van de cellaag. Levende cellen worden weergegeven in groen (i, iii, v, vii) en dode cellen in rood (i, iii, v, vii) of wit (ii, iv, vi, viii). De stippellijn markeert de interfase tussen membraan en inzetstuk. (D) In detail ingezoomd, (i) indicatie (witte pijlen) celadhesie aan het membraan (phalloidine, wit) en (ii) een tight junction netwerk gevormd na 3 dagen in cultuur (ZO-1, wit). Schaalbalken = 1 mm (bovenste rij: A,B), 100 μm (onderste rij: A,B,Ci, ii, v, vi), 500 μm (C iii, iv, vii, viii), 50 μm (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Overzicht van eerder werk waarbij membranen zijn geïntegreerd in celcultuurinserts. Afkortingen: PCL = polycaprolacton; PEGDA = poly (ethyleenglycol) diacrylaat; PLGA = poly(melkzuur-co-glycolzuur); PDMS = Polydimethylsiloxaan; PC = Polycarbonaat; RSS = Recombinant spinnenzijde-eiwit; PLCL = Poly(lactide-co-caprolacton); RHSIF = Recombinant hagfish slime intermediate filament eiwitten Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Overzicht van eerder werk met een samenvatting van de verschillende celtypen die op de FN-zijdemembranen zijn gekweekt. FN-4repCT (FN-zijde) is een korte versie van de draglinezijde van Euprosthenops australis, die recombinant is geproduceerd en gefunctionaliseerd met een RGD-motief van fibronectine op genetisch niveau. Dit eiwit wordt gebruikt in alle hier samengevatte gevallen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Problemen oplossen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Ontwerpbestand (.stl) voor het 3D-printen van de inserts. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Protocol voor afdrukken, nabehandeling en sterilisatie bij gebruik van de printer en hars gespecificeerd in de materiaaltabel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Schema van het patroon dat wordt voorgesteld om te gebruiken bij het plaatsen van de FN-zijdeoplossing in de plaat met 48 putjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het hierin beschreven protocol schetst een eenvoudige manier om biologisch relevante celkweekinserts te maken. Het begint met het printen van de inserts, gevolgd door de vorming en bevestiging van FN-silk-membranen, en eindigt met het laten zien hoe cellen kunnen worden gezaaid aan zowel de apicale als de basale kant van het membraan. Er is één echt cruciale stap in dit protocol om langdurig succes met celculturen te garanderen en dat is het laten zakken en optillen van de inzetstukken op het membraan. Succesvolle uitvoering van deze stappen zal resulteren in een zijdemembraan-insert-kweeksysteem dat bestand is tegen celcultuur, vergelijkbaar met in de handel verkrijgbare systemen met synthetische membranen. Om dit te garanderen, zijn aan de zijkanten van de op maat gemaakte inzetstukken geleiderails geïmplementeerd om te voorkomen dat ze onder een hoek worden neergelaten of zijwaarts in de put worden bewogen, wat zou leiden tot een ongelijkmatige hechting van het membraan, het ontstaan van zwakke punten en vervolgens lekkage. Het komt vaak voor dat er kleine problemen optreden wanneer u voor het eerst een protocol volgt. Om de nieuwe gebruiker te helpen deze te omzeilen, mochten ze deze ervaren tijdens het volgen van het hierboven gepresenteerde protocol, hebben we mogelijke problemen en hun oplossingen uiteengezet in Tabel 3.

Het is aangetoond dat het membraan zelf gunstig is voor het modelleren van verschillende barrièreweefsels (over het hoofd gezien in tabel 2); Er moet echter worden opgemerkt dat de hars die wordt gebruikt om de inserts hierin te printen, niet uitgebreid is getest op zijn effect op de levensvatbaarheid van andere celtypen. Hoewel we dergelijke problemen tot nu toe niet zijn tegengekomen, is het mogelijk dat de hars de levensvatbaarheid en groei van sommige gevoelige cellen negatief kan beïnvloeden. Het wordt daarom aanbevolen om een levensvatbaarheidstest uit te voeren die vergelijkbaar is met de hier gepresenteerde test om de compatibiliteit van de hars met elk gebruikt celtype te verifiëren. Als cytotoxiciteit wordt ervaren, moet een grondiger uithardings- en/of uitloogprotocol worden opgesteld om te voorkomen dat niet-uitgeharde monomeren na verloop van tijd uitlogen en de cellen beschadigen. Een voorbeeld van zo'n protocol, dat werd gebruikt voor de hars die werd gebruikt om de inserts binnen dit protocol te printen, is te vinden in Supplemental File 2. Dit protocol is eerder gebruikt om inserts voor te bereiden voor het kweken van bEnd.3 hersenendotheel op zijden membranen gedurende maximaal 8 dagen¹⁵.

Het belangrijkste voordeel van de methode die in dit werk wordt gepresenteerd, is dat het een eenvoudige manier biedt om de huidige plastic membranen op weefselkweekinserts te vervangen en als zodanig statische weefselkweekmodellen te verbeteren. De belangrijkste beperking is dat de gebruiker toegang nodig heeft tot 3D-printapparatuur of tijd moet kopen in een faciliteit om zijn inserts te printen. Indien nodig kan dit echter worden omzeild door in de handel verkrijgbare weefselkweekinserts te gebruiken na het verwijderen van hun membranen. Bovendien, hoewel de zijdemembranen in wezen kunnen worden gebruikt als gewone weefselkweekinzetstukken, zijn ze dunner en hebben ze een eiwitsamenstelling, en daarom gevoeliger dan hun huidige synthetische commerciële tegenhangers. Daarom vereisen ze een voorzichtigere behandeling door de gebruikers en moeten ze nat worden gehouden om hun elasticiteit te behouden. Opgemerkt moet worden dat de membranen bestand zijn tegen uitrekken en opblazen^16,17, waardoor ze bijvoorbeeld geschikt zijn voor het nabootsen van ademhalingsbewegingen. Toch is het waarschijnlijk dat nieuwe gebruikers in de beginfase enkele membranen zullen breken, maar naarmate hun ervaring met membraanbehandeling toeneemt, zal het slagingspercentage naar verwachting toenemen. Als er problemen blijven bestaan, moet de gebruiker Tabel 3 raadplegen voor het oplossen van problemen.

In het afgelopen decennium zijn er verschillende alternatieven voor de commerciële plastic inzetstukken gepresenteerd (Tabel 1), en elke keer dat de prestaties van celculturen werden vergeleken, hebben de nieuwe, meer biologisch relevante membranen betere resultaten opgeleverd dan hun commerciële plastic tegenhangers ^{2,5,6,7,14,22}. Dit is voornamelijk waargenomen in termen van verbeterde barrièrefunctie ^{2,5,6,7,14,22}, maar ook in de vorming van meer native-achtige celgroei ¹⁴ en verhoogde interacties via het membraan in co-cultuursystemen⁷. Deze trend is eerder waargenomen voor de FN-silk membranen bij het opstellen van een bloedvatwandmodel. In deze studie werden HDMEC en gladde spiercellen (SMC's) gekweekt aan weerszijden van het membraan. Er werd aangetoond dat de SMC's een dikkere ECM afscheidden wanneer ze samen met de HDMEC op de FN-zijdemembranen werden gekweekt in vergelijking met de commerciële PET-membranen. Evenzo heeft de HDMEC een strakkere barrière ingesteld op de FN-zijdemembranen¹⁷. De verbeterde resultaten van de celkweek zijn waarschijnlijk te danken aan verbeterde cellulaire communicatie en meer in vivo-achtige kweekomstandigheden. Het FN-silk-membraan komt veel dichter bij de oorspronkelijke BM in termen van dikte, structuur en mechanische eigenschappen. De native BM is tussen 20 nm en 3 μm²² dun, de PET-membranen 10 μm en de FN-silk-membranen ongeveer 1 μm, en vallen dus ruim binnen het native bereik. De structuur van het FN-zijdemembraan is ook nanofibrillair¹⁶, net als de oorspronkelijke BM²², terwijl het PET-membraan bestaat uit plastic met spoorgeëtste poriën, meestal tussen 0,4 μm en 8 μm in diameter⁷. De PET-membranen zijn ook veel stijver dan de BM, met een Young's modulus rond de 2 GPa, vergeleken met de BM die varieert van kPa tot MPa, maar over het algemeen rond de 250-500 kPa²² wordt genoemd. De FN-silk membranen hebben een Young's modulus van 115 kPa¹⁶, wat binnen de oorspronkelijke omstandigheden valt. Er moet ook worden opgemerkt dat zodra cellen op het membraan zijn gekweekt, hun sterkte de dominante factor wordt, niet het membraan zelf¹⁷. Uiteindelijk moet ook worden opgemerkt dat de geïntegreerde functionalisering van het FN-silk-eiwit ervoor zorgt dat cellen zich direct aan het membraan hechten en dat een coating dus niet nodig is. Voor de PET-membranen is het vaak standaard om te coaten met een ECM-eiwit om een goede celhechting te garanderen⁷.

Bij het vergelijken van het FN-zijdemembraan met andere benaderingen die worden gebruikt om het PET-membraan te vervangen (over het hoofd gezien in Tabel 1), is het belangrijkste voordeel van onze methode het gebruik van het recombinant geproduceerde gefunctionaliseerde zijde-eiwit. Dit zorgt voor reproduceerbaarheid en gedefinieerde kweekomstandigheden in tegenstelling tot andere op eiwitten gebaseerde, dierlijke materialen zoals collageen. Merk nogmaals op dat de functionalisering van het eiwit ervoor zorgt dat er geen coatings nodig zijn, omdat cellen goed aan de membranen hechten, aangezien het¹⁷ is. Bovendien is de productie van membranen op basis van zijde die hierin worden beschreven, gebaseerd op zelfassemblage en vereist het geen complexe installatie of het gebruik van agressieve chemicaliën, in tegenstelling tot veel andere technieken die bijvoorbeeld afhankelijk zijn van elektrospinning. De spontane hechting van het membraan aan de wisselplaat elimineert ook de noodzaak van handmatige handelingen in verband met tweedelige inzetstukken, lijmen en siliconen montageringen, waardoor het schalen wordt vereenvoudigd en een gemakkelijke reproduceerbaarheid in elk laboratorium mogelijk is. Naast een gemakkelijke productie is onze methode gemakkelijk aan te passen aan de experimentele behoeften van de gebruiker, aangezien verschillende inzetmaterialen kunnen worden gebruikt en de membraandikte kan worden afgestemd door de zijdeconcentratie van de initiële oplossing aan te passen¹⁶. Ten slotte kan dit protocol, voor zover wij weten, het tot nu toe dunste vrijstaande membraan opleveren dat aan een weefselkweekinzetstuk is bevestigd, waardoor de grootste gelijkenis met het oorspronkelijke basale membraan mogelijk is.

Het hier gepresenteerde protocol voor de vorming en behandeling van zijdemembranen is eenvoudig te gebruiken voor iedereen die gewend is om met weefselkweekinserts in een celkweeklaboratorium te werken. Het is een eenvoudige manier om over te stappen van plastic membranen naar een meer in vivo-achtige tegenhanger, waardoor relevantere weefselmodellen kunnen worden gegenereerd met behulp van verschillende soorten cellen (tabel 2). De zijdemembranen kunnen de celcultuur aan hun apicale of basale zijde ondersteunen, evenals bilateraal co-culturen van verschillende celtypen¹⁷. De barrièreweefselmodellen die op de zijdemembranen zijn ontwikkeld, kunnen worden gebruikt voor hetzelfde scala aan toepassingen als de weefselkweekinserts, waaronder medicijnscreenings en permeatie- en infectiestudies. Voor gevallen waarin de overspraak tussen verschillende celtypen van belang is, is aangetoond dat ze beter presteren dan de TC-inserts vanwege hun meer in vivo-achtige eigenschappen¹⁷.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CHEMICALS
Alexa Fluor 488	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A-21121	Geit anti-muis, Verdunning 1:500
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A12379	Verdunning 1:400
anti-ZO-1 (1A12) antibody	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	33-9100	Muis anti-mens, Monoklonaal, Verdunning 1:200
Dextran, Alexa Fluor 680; 3.000 MW, Anionisch	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	D34681	Verdund 2,5% (w/v) in 200 ul van kweekmedium
DMEM/F-12	Gibco; Thermo Fisher Scientific	31330095	Aangevuld met 5% v/v FBS en 1% v/v Penicilline-Streptomycine
Ethanol	Solveco	1326	70% (CAS-nr 64-17-5)
Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, warmte-geïnactiveerd, Verenigde Staten	Gibco; Thermo Fisher Scientific	16140071
FN-zijde	Spiber technologies AB		Bewaar bij -80 °C
Isopropanol, EMPARTA ACS analysch reagens	Supelco	1096342511	≥99,5% (CAS-nr 67-63-0)
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	L3224
PBS	Zweedse veterinaire autoriteit / Statens veterinärmedicinska anstalt	992420	zonder Ca en Mg, gefilterd
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)	Gibco; Thermo Fisher Scientific	11548876
MATERIAL
Dental LT Clear Resin	Denthouse	#DLCL-01
HaCaT cellen	CLS	300493
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24-well	Fisher Scientific	10604903
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 48-wel	Fisher Scientific	10644901
TC inzet, voor 24-well platen, PET, transparant	Sarstedt	83.3932.041	poregrootte: 0,4 µm
ThinCert Cell Culture Inserts, translucent membraan (PET)	Greiner	662640	poregrootte: 0,4 µm
EQUIPMENT
EVOM meter met eetstokjes	World Precision Instruments (WPI) Germany, GMBH
Form 3B	FormLabs
Form Wash	FormLabs
Form Cure	FormLabs
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisherbrand
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop Eclipse Ti	Nikon
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop DMI6000 B	Leica
Laminaire stroom kap Ninosafe, klasse II	Labolutions
Midi CO2 Incubator, 40 L	Thermo Scientific