Methodenartikel

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 mei 2025

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verrijking en sequentiebepaling van proteïne-geassocieerd nieuwvormings-DNA (eSPAN) is ontwikkeld om de relatieve abundantie van een chromatine-geassocieerd eiwit op twee replicerende DNA-strengen te detecteren, waardoor moleculaire inzichten in chromatine-replicatie en de gekoppelde processen worden onthuld. Dit protocol beschrijft eSPAN-procedures in gist- en muis embryonale stamcellen (ES).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoomduplicatie wordt geregeld door replisola-eiwitten, inclusief helicasen, die dubbelstrengs DNA ontwijnden in individuele antiparallelle enkele strengen, die elk verschillende replicatiemodi vereisen: continu (leidend) en ononderbroken (achterblijvend). Het begrijpen van de interacties van chromatine-geassocieerde eiwitten met replicerende DNA-strengen in vivo is cruciaal voor het verduidelijken van de mechanismen van chromatine-assemblage en DNA-reparatie gekoppeld aan DNA-replicatie. Dit protocol presenteert de verrijking en sequentie van eiwit-geassocieerd nasent DNA (eSPAN) methode, ontworpen om relatieve eiwitniveaus op nasent leidende en achterblijvende DNA-strengen op replicatievorken te kwantificeren. De eSPAN-procedure begint met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP, in gist) of splitsing onder doelen en tagmentering (CUT&Tag; in zoogdiercellen) van een eiwit van belang, gevolgd door verrijking van het eiwit-geassocieerde nasent DNA door bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitatie. Strandelijk volgende generatie-sequencing wordt toegepast op geïsoleerde ssDNA. Deze techniek kan worden gebruikt om te bepalen of een eiwit is verrijkt op leidende of achterblijvende replicatievorken. De eSPAN biedt genoom-brede streng-voorkeur van chromatine-geassocieerde eiwitten, inclusief histonen op replicatievorken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In eukaryotische organismen wordt genoomduplicatie geïnitieerd vanuit meerdere locaties, replictie-oorsprong genoemd, waar het origin recognition complex (ORC) bindt en de recrutering van de eiwitmachinerie start, inclusief de CMG-helicase, om DNA-replicatie te initiëren1. De replisoommachinerie bij elke replictie-oorsprong vormt twee replicatiefoorken die bidirectioneel bewegen2,3. De tweeling-replicatiefoorken repliceren de twee ouderlijke DNA-strengen door de continue synthese van de leidende streng en discontinu synthese van de achterblijvende streng. Gezien deze asymmetrische aard van elke replicatiefoork, zijn de replicatiecomponenten, inclusief de DNA-polymerasen op de leidende en achterblijvende strengen, verschillend. Eerdere genetische analyse op basis van mutante DNA-polymerasen toont aan dat DNA Pol ε en DNA Pol δ de belangrijkste polymerasen zijn die verantwoordelijk zijn voor de replicatie van respectievelijk de leidende en achterblijvende streng4,5. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de strengvoorkeur van DNA-polymerase te detecteren, inclusief Pu-seq6,7, HydEn-seq8, en emRiboSeq of RiboSeq9,10. Deze genetische methoden om de strengspecificiteit te onderscheiden zijn beperkt tot DNA-polymerasen en vereisen het introduceren van mutaties in elk eiwit4,5,11,12. Het volgen van de associatie van een doeleiwit met leidende en achterblijvende strengen van DNA-replicatiefoorken zal waardevolle inzichten in DNA-replicatie opleveren. In dit verband ontwikkelden we eerst de eSPAN-techniek (verrijking en sequencing van eiwit-geassocieerd nasend DNA, Figuur 1) in gistcellen. Als een proof-of-principal studie toonden we eerst aan dat Pol δ en Pol δ verrijkt zijn op respectievelijk de leidende en achterblijvende strengen. We ontdekten ook de strengvoorkeur van belangrijke DNA-replicatiecomponenten, inclusief de replicatieve DNA-helicase, het enkelstrengs DNA-bindende eiwit (replicatie-eiwit A) en de proliferating cell nuclear antigen (PCNA) lamp en zijn loader replicatie factor C (RFC)13. Belangrijk is dat wij en anderen deze methode hebben gebruikt om mechanismen van parentaal histone transfer te onthullen, een proces dat meer dan 4 decennia lang ongrijpbaar was14,15,16,17.

De eSPAN-methode omvat twee opeenvolgende stappen: verrijking van het doeleiwit door ChIP18 of CUT&Tag19 en verrijking van het nasend DNA geassocieerd met het eiwit door BrdU immunoprecipitatie. In een standaard giststam (W303 of S288C) kunnen extracellulair BrdU of EdU niet in cellen binnendringen en zich in chromosomen incorporeren. Deze stammen missen een geschikte nucleoside transporter voor thymidine opname evenals de thymidine kinase die nodig is om thymidine te fosforyleren tot TMP, dat BrdU (of EdU) omzet in BrdUMP (EdUMP). Expressie van humaan equilibratief nucleoside transporter 1 (hENT1) en herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) verbetert de thymidine opname en de omzetting van BrdU (of EdU) naar BrdUMP (EdUMP)20. Daarom moesten de stammen voor het uitvoeren van het eSPAN-experiment in gist worden voorzien van een BrdU-Incorporerende (BrdU-Inc) structuur (HSV-TK en hENT1)13,21.

Eerder hebben we het eSPAN-protocol voor DNA-replicatie-eiwitten in gist geleverd22. Onlangs hebben we de CUT&Tag-methode geïntegreerd in het eSPAN-protocol in zoogdiercellen om technisch uitdagende stappen aan te pakken die optimalisatie vereisen, zoals cross-linking, chromatine-shearing, en om het aantal startcellen te minimaliseren17,23. Hier leverden we histone eSPAN voor visualisatie met behulp van gistcellen (Figuur 2). Deze methode wordt voornamelijk gebruikt om de distributie van gemodificeerde vormen van histonen op replicerende DNA-strengen te analyseren. Hoewel we verschillende histon-merken hebben getest, gebruikten we H3K4me3, een markering op de parentaal histone H3, als voorbeeld. Om replisoomcomponenten en factoren betrokken bij DNA-reparatie bij replicatiefoorken te analyseren, raden we aan chromatine in kleine fragmenten te sheren met behulp van sonicatie zoals beschreven in onze eerste publicatie22. Voor zoogdiercellen hebben we de gemodificeerde Cut&Tag-procedures geadopteerd om de ChIP-stap te vervangen zoals beschreven in gist23. Deze aanpassing vermindert de hoeveelheid startmateriaal (cellen) en, belangrijker nog, maakt de generatie van eSPAN-bibliotheken voor sequencing mogelijk zonder het gebruik van single-stranded DNA-voorbereidingskits. Voor het gistprotocol hebben we ervoor gekozen om de Cut&Tag-methode niet te gebruiken omdat de hoeveelheid startmateriaal voldoende was. Wat nog belangrijker is, vonden we dat de Cut&Tag-procedures niet consistent effectief waren voor gistcellen in onze handen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Voor richtlijnen voor de voorbereiding van buffer en reagens, zie richtlijnen voor de voorbereiding van buffer en reagens (Aanvullend bestand 1).

1. Histone eSPAN in knopgist

OPMERKING: De meeste giststammen missen een functionele nucleoside transporter voor thymidineopname. Om DNA efficiënt te labelen met BrdU of EdU voor eSPAN, is een thymidine kinase-positieve (TK+) stam21 vereist. Bovendien kunnen alleen giststammen van het type 'A' worden gebruikt voor celcyclusarrest met behulp van alfa-factor.

  1. Gistcelsynchronisatie en BrdU-labeling (8 u)
    1. Een enkele kolonie van een geschikte giststam (TK+) inoculeren in 10 mL YPD-medium en overnacht laten groeien bij 30 °C op een schuddende incubator bij 220 rpm.
    2. De optische dichtheid, OD600 nm, meten met een spectrofotometer en de cultuur verdunnen in vers 200 mL YPD-medium met OD600 ~0.2-0.3.
    3. De cultuur laten groeien tot OD600 ~0.4-0.5 (gewoonlijk duurt dit 3-4 u) bij 30 °C in een schuddende incubator bij 220 rpm.
    4. 300 μL α-factor (5 mg/mL) toevoegen en 1.5 u laten kweken bij 25 °C, 220 rpm.
    5. Nog een dosis van 300 μL α-factor (5 mg/mL) toevoegen en nog 1.5 u laten groeien bij 25 °C, 220 rpm.
    6. De 37,5% paraformaldehyde-fixeringsoplossing voorbereiden en het medium voorverwarmen (200 mL YPD +HU (hydroxyureum)+ BrdU) tot 30 °C tijdens de celsynchronisatie.
      VOORZICHT: Omdat BrdU een potentieel mutageen en teratogeen is, dient het met zorg te worden behandeld. Bereid een 37,5% paraformaldehyde-oplossing in een chemisch afzuigkap voor om blootstelling aan schadelijke dampen te voorkomen, aangezien paraformaldehyde een potentieel carcinogeen is.
    7. Controleer de morfologie van de cellen (een staafvorm) met een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat ten minste 90% van de gistcellen zich in de G1-fase bevindt 15 min voor de G1-arrest. Als alternatief kan flowcytometrieanalyse (FACS) worden uitgevoerd om G1-arrest te bevestigen24.
      OPMERKING: Controleer de celmorfologie en bevestig G1-arrest (90% met een staafvorm) in deze stap.
    8. De cellen (pellet) verzamelen door centrifugatie bij 1600 g gedurende 5 min bij 4 °C en de celpellet tweemaal wassen met 20 mL ijskoud tweevoudig gedestilleerd water.
    9. De cellen resuspenderen in voorverwarmd (30 °C) 200 mL YPD +HU+ BrdU.
      OPMERKING: Het doel van de HU-release is om ervoor te zorgen dat de meeste gistcellen zich in de vroege replicatie-S-fase bevinden, wat de consistentie zal verbeteren en de reproduceerbaarheid van de resultaten zal garanderen. Het weglaten van HU is acceptabel als het werken met logfase-cellen vereist is.
    10. De cellen kweken op een schuddende incubator bij 30 °C, 220 rpm gedurende 45 min.
      OPMERKING: FACS-analyse kan worden uitgevoerd om de vroege S-fase te bevestigen. Voor FACS-analyse is het belangrijk om een log-fase-monster op te nemen als controle om de G1-celpopulatie nauwkeurig te definiëren. Voor efficiënte BrdU-incorporatie is het voordelig om te beginnen met snelgroeiende cellen. Sommige mutanten met langzame groeitempten hebben de neiging om een slechte BrdU-labelingsefficiëntie te vertonen. De efficiëntie van BrdU-incorporatie en de prestaties van BrdU-IP worden beoordeeld door kwantitatieve PCR door gerepliceerde en ongerepliceerde regio's te vergelijken22 met behulp van DNA geïsoleerd uit stap 1.6.7.
  2. Staalfixatie en verzameling (1 u)
    1. Voeg vers bereid 6 mL 37% paraformaldehyde toe om een ​​eindconcentratie van 1% te bereiken, goed mengen en 20 min incuberen bij 25 °C met zacht schudden, 90 rpm.
    2. De fixatie blussen door 12 mL 2,5 M glycijn toe te voegen, goed mengen en 5 min in te cuberen bij 25 °C met zacht schudden, 90 rpm.
    3. De cellen pelletten bij 1600 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT). Was de cellen vervolgens twee keer met 20 mL koud water door ze gedurende 5 min bij 1600 g te centrifugeren.
    4. Verzamel de cellen in 2 mL schroevendebuisjes (50 mL cellen/buisje) en bewaar ze bij -80 °C.
      ​OPMERKING: Cellen kunnen tot een jaar worden bewaard (pauzepunt).
  3. Gistcellyse en chromatinefragmentatie (5 u)
    1. De cellenpellets ontdooien, door voorzichtig voortdraaien resuspenderen en wassen met 0,4 mL ChIP-lysebuffer met proteaseremmers en antibioticummix (om de groei van besmettende bacteriën te voorkomen) en centrifugeren bij 5 000 g gedurende 1 min.
    2. Voeg 0,1 mL ChIP-lysebuffer toe met proteaseremmers en een antibioticummix, gevolgd door ongeveer 100 μL glazen kralen (0,5 mm).
    3. Lyse door kralen te kloppen gedurende 3 cycli (30 s aan/uit, 1 min uit) in een koude kamer bij 4 °C.
    4. Maak gaten in de bodem van de buis met een 16 G hete naald.
      OPMERKING: Om de hete naald te bewaren, probeer de buis dicht bij het vuur te houden.
    5. Verzamel het lysate door de buis in een 1,5 mL lege DNA-buis met lage binding te nestelen en centrifugeer

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eSPAN kan worden gebruikt om streng-specifieke informatie over een doelwit-eiwit te verkrijgen, zoals histonen en histonmodificaties. In dit representatieve resultaat werden de monsterverzameling en eSPAN-processen uitgevoerd volgens het schema in Figuur 2 met behulp van het knopvormende gistsysteem. De monsterbehandeling en -verzameling volgen de hydroxyureum-behandelde vroege S-fase-voorwaarde zoals in dit protocol. Er werden twee giststammen gebruikt, WT (wild-type) en mcm2-3A mu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detectie van eiwitten geassocieerd met leidende en achterblijvende replicatiestrengen is belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van chromatine-replicatie en het bijbehorende proces, die direct relevant zijn voor menselijk kankeronderzoek en de mechanismen van geneesmiddelresistentie. Verschillende methoden, zoals 2D-gel, native Chromatine immunoprecipitatie(nChIP), iPOND en nascent chromatin capture29,30,31, zijn gebru...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-subsidies R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) en de Hormel Startup Fund (C.Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575020
1.5 mL DNA low-binding tubes Eppendorf22431021
10x Ampligase bufferLucigenA1905B
10x PBS Corning21-040-CV
10x TBSBioRad1706435
16 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlid NeedleBD Biosciences305198
ACCEL-NGS 1S PLUS DNA LIBRARY KITIntegrated DNA Technologies10009817ssDNA and low-input DNA library prep kit 
Agilent 2100 bioanalyzer Agilent2100 bioanalyze
Agilent DNA 1000 kit Agilent5607-1504
Ampligase LucigenA0110KHandle paraformaldehyde with care, it is flammable solid hazardous.
AMPure XPBeckmanA63881
AMPure XP SPRI ReagentBeckman CoulterA63882
Anti-BrdU antibody BD Biosciences555627
Anti-H3K4me3 antibody abcamab8580
Automated cell counter , model TC10BioRad145-0001
Bacitracin Sigma11702
Bacto peptone Thermo Fisher Scientific211830
Benzamidine Hydrochloride SigmaB2417Combustible Solids
BrdU SigmaB5002Handle BrdU with care as it is a potential mutagen and teratogen.
BSANew England BiolabsB9000S
CaCl2SigmaC4901
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific  model Forma series II water-jacketed CO2 incubator3140
Cell culture medium 
Cell line ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200–400 dry mesh size
Chloroform Sigma366919
Concanavalin A (ConA)-coated magnetic beads Polysciences86057-10
DigitoninMillipore300410-5MG
DMSOSigmaD8418
E. coli tRNA Sigma10109541001
Ethanol Thermo Fisher ScientificBP2818100Handle ethanol with care, it is flammable
glucoseSigmaG7021
Glycerol SigmaG5516
HCl SigmaH1758
HEPES SigmaH3375
Isopropanol Thermo Fisher ScientificBP26324Handle isoproponol with care, it is flammable
KAPA HiFi HotStart Ready MixRoche7958889001
KClSigmaP9541
KOHsigma221473Handle KOH with care, it is corrosive
Low-speed vacuum
Magnet stand MilliporeLSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal CyclerEppendorf5331
MgCl2SigmaM8266
Micrococcal nuclease  (MNase)WorthingtonLS004798
MinElute PCR purification kit Qiagen28006
Mini-beads beaterMini BeadBeater 24 Disruptor607
Mini-centrifuge Eppendorf5424R
MnCl2Sigma244589
Multiplatform shakerFisherbrand02-217-765
Multiplatform shaker incubatorBenchmarkINCU-SHAKER 10L
Multithermal heat block EppendorfThermomixer C
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS)SigmaT5130200–400 dry mesh size
NaCl SigmaS9888
NaOH SigmaS8045Handle NaOH with care, it is corrosive
NEBNext HiFi 2× PCR master mixNew England BiolabsM0541
NP-40 Igepal CA-630Thermo ScientificJ61055.AP
Paraformaldhydesigma158127Handle paraformaldehyde with care, it is flammable solid hazardous.
pA-Tn5 enzyme Addgene121137
PefablocSigma11429868001
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol Invitrogen15593049
Pipette P1000, P200, P20 and P2Eppendorf2231300004
PMSFSigma10837091001
Protease inhibitor cocktail tabletSigmaS8830
Protease inhibitor cocktail tablet SigmaS8830
Protein G-sepharose beads GE Healthcare17-0618-02
Protein precipitation solutionQiagen848023
Protein precipitation solutionQiagen848023Handle KOH with care, it is corrosive
Protein precipitation solution Qiagen848023
Proteinase K Sigma311584401
QIAquick PCR purification kit Qiagen28106
RNase ASigma10109169001
SDS Sigma

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Stillman, B. ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex. Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).
  2. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).
  3. Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. Eukaryotic DNA replication fork. Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).
  4. Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication. Science. 317 (5834), 127-130 (2007).
  5. Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. Division of labor at the eukaryotic replication fork. Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).
  6. Daigaku, Y., et al. A global profile of replicative polymerase usage. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).
  7. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  8. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).
  9. Reijns, M. aM., et al. Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome. Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).
  10. Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).
  11. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  12. Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication. Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).
  13. Yu, C., et al. Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall. Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).
  14. Gan, H., et al. The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands. Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).
  15. Yu, C., et al. A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands. Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).
  16. Petryk, N., et al. Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication. Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).
  17. Li, Z., et al. DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands. Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).
  18. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  19. Kaya-Okur, H. S., et al. Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).
  20. Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains. Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  21. Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).
  22. Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast. Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).
  23. Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells. Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).
  24. Rosebrock, A. P. Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  25. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).
  26. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 10208(2016).
  27. Foltman, M., et al. Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication. Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).
  28. Jia, J., Yu, C. The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance. Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).
  29. Alabert, C., et al. Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components. Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).
  30. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  31. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).
  32. Ramachandran, S., Henikoff, S. Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing. Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).
  33. Petryk, N., et al. Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq. Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).
  34. Zhong, J., et al. Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application. BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).
  35. Li, Z., et al. Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements. Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).
  36. Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance. Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).
  37. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sequencing van nascent DNAeiwit geassocieerd DNAchromatinimmunoprecipitatieBrdU immunoprecipitatieleading en lagging strandsrecycling van ouderlijke histonenreplicatievorkeiwittensingle stranded DNA bibliotheekMNase digestiestrand specifieke sequencing

Gerelateerde artikelen