Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een uitgebreide pijplijn om de efficiëntie van menselijke erytropoëse in vitro en ex vivo te beoordelen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

10 januari 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

In dit artikel

Samenvatting

Het modelleren van erytropoëse biedt een waardevolle kans om de biologische betekenis van actoren in dit proces te begrijpen en om nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren die differentiatiedefecten kunnen verlichten. Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode om CD34+ hematopoëtische stam- en voorlopercellen ex vivo efficiënt te differentiëren.

Samenvatting

Erytropoëse, een opmerkelijk dynamisch en efficiënt proces dat verantwoordelijk is voor het genereren van het dagelijkse quotum rode bloedcellen (ongeveer 280 ± 20 miljard cellen per dag), is cruciaal voor het behoud van de individuele gezondheid. Elke verstoring in dit traject kan aanzienlijke gevolgen hebben en leiden tot gezondheidsproblemen. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie vertoont naar schatting 25% van de wereldbevolking symptomen van bloedarmoede. Dit protocol beschrijft hoe menselijke erytroïde cellen zowel in vitro kunnen worden gegenereerd met behulp van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) uit bronnen zoals navelstrengbloed (UCB) of bloed van gezonde donoren als ex vivo met HSPC's geïsoleerd uit het beenmerg van patiënten. Met behulp van een genetische benadering kunnen interessante genen worden gemoduleerd in HSPC's en kan hun impact op erytropoëse in verschillende stadia van het differentiatieproces worden gevolgd. Deze methode maakt het mogelijk om verbindingen te screenen die het vermogen van HSPC's om te differentiëren tot rijpe erytroïde cellen verstoren, verbeteren of redden en om de rol van interessante genen tijdens het erytroïde differentiatieproces te onderzoeken.

Inleiding

Elke dag worden ongeveer 280 miljard rode bloedcellen (RBC's) in het beenmerg geproduceerd om het zuurstoftransport door het hele lichaam te garanderen1. Erytropoëse is een fijn afgestemd differentiatieproces dat rijpe, functionele rode bloedcellen produceert uit hematopoëtische stamcellen. Veel ziekten, zowel verworven als aangeboren, kunnen dit proces beïnvloeden, waaronder myelodysplastisch syndroom, aplastische anemie, thalassemie en aangeboren dyserytropoëtische anemie2.

De klinische manifestatie van verstoorde erytropoëse is bloedarmoede, wereldwijd een belangrijke oorzaak van morbiditeit. Symptomen van bloedarmoede variëren van vermoeidheid, kortademigheid en duizeligheid tot levensbedreigende aandoeningen, zoals hartfalen en hartstilstand3. Met bloedarmoede die wereldwijd 1,8 miljard mensen treft4, blijft het ex vivo modelleren van erytropoëse om deze aandoeningen en hun onderliggende mechanismen te onderzoeken een wereldwijde prioriteit. De hier beschreven methode heeft tot doel een eenvoudig en robuust model te bieden voor het bestuderen van zowel gezonde als zieke erytroïde differentiatie. Dit model maakt het mogelijk om de rol van specifieke genen in dit proces te ontleden en maakt het mogelijk om verbindingen te testen die ten goede kunnen komen aan anemische patiënten. Historisch gezien heeft het modelleren van ineffectieve erytropoëse veel uitdagingen gehad, waaronder een gebrek aan stamcellen in sommige zieke beenmerg en moeilijkheden bij het nabootsen van de beenmergniche.

Eerdere studies hebben vergelijkbare of complexere protocollen gebruikt; bijvoorbeeld, Bondu et al. gebruikte een cocktail van cytokinen, waaronder erytropoëtine (EPO), stamcelfactor (SCF) en interleukine-6 (IL6) gedurende 4 dagen voordat IL6 uit de cocktail van erytroïde differentiatie werd verwijderd, in tegenstelling daartegen, Yip et al. voegden EPO pas toe aan hun cytokinescocktail na 7 dagen vloeibare cultuur. Elvarsdóttir et al. ontwikkelden een driedimensionaal (3D) kweekmodel voor CD34+-cellen om de hoogste expansie en rijping van erytroïde cellen te vergemakkelijken, inclusief de vorming van erytroblastische eilanden en ontkernde erytrocyten, die belangrijk zijn voor het bestuderen van fenomenen zoals ringsideroblasten 5,6,7,8 . Dit protocol gebruikt slechts drie cytokinen bij het uitbreiden van de cellen (d.w.z. SCF, trombopoëtine [TPO] en FMS-achtig tyrosinekinase 3 [FLT3]) en drie cytokinen die gedurende het hele differentiatieproces worden gehandhaafd (d.w.z. EPO, IGF1 en SCF). Een van de belangrijkste criteria die in deze verschillende onderzoeken worden gedeeld, is het gebruik van CD34+-cellen. Hoewel de oorsprong van deze cellen varieert, worden ze consequent gebruikt in deze verschillende protocollen. De bronnen kunnen variëren van niet-invasieve verzameling van UCB tot meer invasieve procedures om beenmergmonsters van volwassenen te verkrijgen die kunnen worden geoogst van patiënten die kunnen worden gemobiliseerd met granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF) of beenmergpuncties. Over het algemeen worden vloeibare cultuurmodellen over 14 dagen overgedragen, terwijl 3D-modellen cellen gedurende langere perioden kunnen behouden. Deze protocollen zijn essentieel voor het modelleren van genetische ziekten en verstoringen in erytropoëse. Genetische benaderingen, zoals korte haarspeld-RNA (shRNA) knockdowns, kunnen worden gebruikt om interessante genen uit te schakelen en hun rol in erytropoëse te bestuderen. De impact van gen-uitschakeling kan vervolgens in verschillende stadia van differentiatie worden gevolgd, waardoor een ex vivo menselijk model van de productie van rode bloedcellen wordt verkregen om bloedarmoede bij zowel gezondheid als ziekte te bestuderen. Dit protocol omvat de transductie van CD34+ navelstrengbloedcellen met shRNA die constitutief een reportergen tot expressie brengen, zoals verbeterd groen fluorescentie-eiwit (EGFP), waardoor de monsters kunnen worden gesorteerd door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Cellen worden vervolgens gedurende 2 weken geïncubeerd in differentiatiemedia en gecontroleerd door middel van flowcytometrie-analyse en immunochemische kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Onderzoek naar primaire steekproeven werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling (REC-referentie: 21/EE/0133; IRAS-project-ID: 283103).

1. Productie van lentivirussen

OPMERKING: Lentivirussen moeten worden geproduceerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau L2 onder steriele omstandigheden. Alle vereiste PBM's voor dit lab moeten worden gedragen, inclusief dubbele handschoenen. Verontreinigd materiaal wordt ontsmet met virucide-ontsmettingsmiddel voordat het in een geautoclaveerde bak wordt gegooid. Hier wordt een shRNA-scramble (controle) met een EGFP-reportergen gebruikt om het proces te illustreren.

Dag 1

  1. Verwarm gelatine bij 37 °C in een waterbad tot het volledig is opgelost. Verdun gelatine met 0,1% in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Bestrijk een schaaltje van 150 mm met 2 ml 0,1% gelatine. Gebruik 2 schaaltjes per virus. Incubeer de schaaltjes gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  3. Zaai 5 miljoen HEK293T cellen per met gelatine omhulde schaal in 20 ml 10% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) en plaats de cellen in een broedmachine bij 37 °C.

Dag 2

  1. Controleer of de cellen ongeveer 50% samenvloeiing hebben bereikt. Verander het medium met 22 ml 10% DMEM zonder de cellaag 2 uur voorafgaand aan transfectie te verstoren.
  2. Bereid de transfectiemix voor.
    OPMERKING: Één transfectiemengsel wordt bereid per gerecht, aangezien een groter volume de calcium-fosfaatprecipitaatvorming zou kunnen beïnvloeden.
    1. Bereid het reactiemengsel in een centrifugebuis van 15 ml als volgt: 32 μg plasmide, 20 μg PAX (pCMVdR8.74)-plasmide, 9 μg VSVG (pMD.G2)-plasmide en breng het volume op 1125 μl met behulp vanH2O.
    2. Voeg 125 μL CaCl2 toe aan de reactie en incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een roller.
    3. Bereid 1,25 ml 2x HEPES voor in een aparte centrifugebuis van 15 ml.
    4. Voeg 2x HEPES druppel voor druppel toe aan het reactiemengsel terwijl je voorzichtig vortext en plaats het mengsel vervolgens 10 minuten op een roller bij RT.
  3. Doseer de reactie druppel voor druppel in een spiraalpatroon op de cellen en plaats de cellen in een broedmachine bij 37 °C nadat u de plaat voorzichtig in een kruisvorm hebt bewogen om het medium te homogeniseren.

Dag 3

  1. Vervang het medium met 16 ml 10% DMEM zonder de laag van de cel te verstoren.

Dag 4

  1. Vang het bovenstaande op en bewaar het een nacht bij 4 °C. Voeg 16 ml verse DMEM toe aan elke plaat zonder de cellaag te verstoren.

Dag 5

  1. Verzamel het bovenstaande en vul het met het bovenstaande vanaf dag 4. Filter om vuil te verwijderen met een filter van 0,45 μM.
  2. Breng elke 30 ml (dag 4 + dag 5) overvloeiend over in een conische buis voor ultracentrifugatie. Voeg de buizen toe in een schommelemmer, eventueel met adapters voor de conische bodem.
  3. Balanceer de buisjes van aangezicht tot aangezicht met een nauwkeurigheid van 0,02 g en ultracentrifugeer op 90.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.
  4. Gooi het bovenstaande weg en voeg 200 μL stamcelmedium per buisje toe. Sluit de buisjes af met parafilm en incubeer de buis 2-4 uur in een koude ruimte onder roeren.
  5. Maak van elk virus een aliquoot van 20 μl en bewaar de injectieflacons bij -80 °C. Bewaar 2 μL van elk virus en voeg 400 μL DMEM toe.
    OPMERKING: Deze verdunning wordt gebruikt voor titratie.

2. Titratie van het lentivirus

OPMERKING: Lentivirussen moeten onder steriele omstandigheden worden gehanteerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau L2. Alle vereiste PBM's voor dit lab moeten worden gedragen, inclusief dubbele handschoenen. Verontreinigd materiaal wordt ontsmet met virucide-ontsmettingsmiddel voordat het in een geautoclaveerde bak wordt gegooid.

  1. Zaad HEK293T in een bord met 24 putjes. Voeg 50.000 cellen/putje toe in 500 μL 10% DMEM.
    OPMERKING: Gebruik 6 putjes per virus en bewaar er één goed voor niet-getransduceerde cellen.
  2. Voer de transductie uit. Voeg in de verschillende putjes toe: 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL en 64 μL van het verdunde virus uit stap 1.13. Homogeniseer voorzichtig.
  3. Vervang het medium 24 uur later door 500 μL 10% DMEM toe te voegen.
  4. Bereid de cellen op dag 4 na de transductie voor op flowcytometrie.
    1. Bereid FACS-buffer voor met PBS, 2% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine (P/S), 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 1/2.000 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
    2. Verwijder het bovenstaande en voeg 500 μL FACS-buffer rechtstreeks met EDTA toe aan elk putje.
    3. Maak de cellen los door op en neer te pipetteren.
  5. Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm en breng ze over in FACS-buisjes.
  6. Bepaal het percentage EGFP-cellen door middel van flowcytometrie.
  7. Stel de volgende poorten in:
    1. Stel DAPI versus side scatter (SSC-A) in om dode cellen uit te sluiten.
    2. Stel SSC-hoogte (SSC-H) versus SSC-gebied (SSC-A) in om celaggregaten uit te sluiten en afzonderlijke cellen te selecteren.
    3. Stel een voorwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A) in versus SSC-A in om de cellen te poorten en het vuil te verwijderen op basis van de grootte.
    4. Stel groen fluorescentie-eiwit (GFP) versus SSC-A in om GFP+ -cellen te selecteren.
  8. Titer het virus.
    1. Bereken de deeltjesconcentratie (aantal deeltjes/ml) voor elke toestand:
    2. EGFP-cellen x Verdunningsfactorvirus (200) x Aantal gezaaide cellen x1000)/ volume van het virus.
      OPMERKING: Cellen werden bijvoorbeeld behandeld met 64 μL virus verdund bij 1/200. Na flowcytometrie-analyse was 54% van de cellen EGFP+. In die omstandigheden zal de titer (54% x 200 x 50.000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 deeltjes/ml zijn.

3. Transduceren van CD34+ -cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed

OPMERKING: Dit deel wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Hier worden CD34+ UCB-cellen (zuiverheid >85%) getransduceerd met één shRNA (controle) die een eGFP-reporter herbergt. Het experiment wordt uitgevoerd met drie technische replicaten. Het aandeel moet worden aangepast aan het aantal monsters.

Dag 1

  1. Bereid de volgende media voor en buffer:
    1. Ontdooimedium bereiden: FBS aangevuld met 1% P/S en 10 μg/ml DNAse
    2. Bereid FACS-buffer voor: PBS aangevuld met 1% P/S en 2% FBS (± 10 μg/ml DNAse)
    3. Bereid stimulatiemedia (in stamcelmedium) voor door 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT-3, 10 ng/ml IL-6, 25 ng/ml g-csf, 20 ng/ml TPO en 1% HEPES toe te voegen.
  2. Ontdooi 100.000 CD34+ UCB-cellen door ze 30 s in het waterbad van 37 °C te dompelen. Voeg druppelsgewijs 1 ml ontdooimedium toe aan elke injectieflacon en suspendeer vervolgens voorzichtig door op en neer te pipetteren.
  3. Breng de celsuspensie druppel voor druppel over in een totaal van 5 ml ontdooimedium voorzichtig.
    OPMERKING: Om celverlies te voorkomen, houdt u een aliquot van 2 ml ontdooimedium opzij dat aan het einde zal worden gebruikt om de punt en de injectieflacon te wassen.
  4. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT. Spoel cellen in 10 ml FACS-buffer + DNAse.
  5. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT. Resuspendeer de celpellet in 2 ml stimulatiemedia (wastip en tube met stimulatiemedium).
  6. Tel de cellen met 5 μL celsuspensie en 5 μL trypanblauw.
    OPMERKING: Streef naar minimaal 75.000 cellen in totaal (25.000 cellen/voorwaarde).
  7. Breng de 2 ml celsuspensie over in een plaat met 24 putjes en incubeer gedurende ≥4-6 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Alle cellen (75.000-100.000) worden in deze stap in één putje gezaaid.
  8. Verzamel de cellen in FACS-buisjes en vul ze aan met 1 ml stamcelmedium. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT.
  9. Ontdooi het virus en voeg het vereiste volume toe aan stimulatiemedia bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 30.
  10. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in virusbevattende media met 100.000 cellen per 100 μL virus in 1 putje van een plaat met 96 putjes. Voeg PBS toe aan lege putjes en broed een nacht bij 37 °C.

Dag 2

  1. Bereid expansiemedium (in stamcelmedium) voor door 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT3-L en 20 ng/ml TPO toe te voegen.
  2. Voeg het volledige volume celsuspensie van de platenput met 96 putjes toe aan FACS-buisjes met 1 ml stamcelmedium. Was het putje en de punt met stamcelmedium, wat resulteert in de toevoeging van 2 ml stamcelmedium aan de celsuspensie in de FACS-buis.
  3. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT.
  4. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 2 ml expansiemedia. Voeg de celsuspensie toe aan een putje met 24 putjes (was het putje en de kantel tijdens het proces om een totaal van 2 ml te verkrijgen). Incubeer de cellen gedurende 4 dagen bij 37 °C.
    OPMERKING: De celsortering wordt dan op dag 7 uitgevoerd.

4. CD34+ EGFP+ Celsortering en erytroïde differentiatie

OPMERKING: Dit deel wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

  1. Bereid de volgende media voor en buffer.
    OPMERKING: Media met cytokinen moeten vers worden bereid:
    1. Bereid de FACS-buffer voor door PBS aan te vullen met 1% P/S en 2% FBS.
    2. Bereid expansiemedia (in stamcelmedium) voor door 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT3-L en 20 ng/ml TPO toe te voegen.
    3. Bereid erytrocytendifferentiatiemedia (in stamcelmedium) voor door 25 ng/ml SCF, 3 E/ml EPO en 50 ng/ml IGF1 toe te voegen.
    4. Bereid 2x erytrocytdifferentiatiemedia (in stamcelmedium) voor door 50 ng/ml SCF, 6 E/ml EPO en 100 ng/ml IGF1 toe te voegen.
  2. Voeg het volledige volume cellen toe aan een aparte FACS-buis (was het putje en de tip in het proces met stamcelmedium). Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 100 μL FACS-buffer.
  3. Voeg 5 μL CD34 Ab/tube toe en incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 20 min.
  4. Resuspendeer de cellen in 1 ml FACS-buffer met DAPI (1/2000 verdunning in FACS-buffer) en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT.
  5. Resuspendeer de cellen in 200 μl FACS-buffer met DAPI (1/2000 verdunning in FACS-buffer) en filtreer de cellen door een zeef van 40 μM alvorens te sorteren.
  6. Bereid de kralen voor op controle:
    1. Voeg 0,5 μL CD34 antilichaam (Ab) toe aan 1 druppel bolletjes in 100 μL PBS en incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 20 min.
    2. Voeg 1 ml PBS toe. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 500 μl PBS.
  7. Bereid leukemische cellijnen voor op GFP-controle.
    OPMERKING: Gebruik elke beschikbare GFP+ -cellijn als besturing; In plaats daarvan kunnen kralen worden gebruikt.
    1. Voeg GFP-cellen (2 FACS-buisjes met 100.000 cellen) en GFP+ (1 FACS-buisje met 100.000 cellen) toe aan de FACS-buis.
      LET OP: In totaal 3 tubes.
    2. Was de cellen in 1 ml FACS-buffer. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT.
    3. Resuspendeer 100.000 GFP-cellen in 500 μL FACS-buffer (niet-gekleurd), 100.000 GFP-cellen in 500 μL FACS-buffer met DAPI (1/2000 verdunning in FACS-buffer) (DAPI gekleurd), en 100.000 GFP+ -cellen in 500 μL FACS-buffer (GFP+ -cellen).
      NOTITIE: Controlebuizen worden gebruikt voor poort- en compensatie-instellingen op de flowcytometer. Als de gebruikte cellen 100% GFP zijn, kunnen GFP-cellen aan de buis worden toegevoegd (50.000 GFP-cellen en 50.000 GFP+-cellen).
    4. Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm voordat u ze sorteert.
  8. Stel de volgende poorten in:
    1. Stel DAPI versus side scatter (SSC-A) in om dode cellen uit te sluiten.
    2. Stel SSC-hoogte versus SSC-gebied (SSC-A) in om celaggregaten uit te sluiten en afzonderlijke cellen te selecteren.
    3. Stel een voorwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A) in versus SSC-A in om het vuil te verwijderen op basis van de grootte.
    4. Stel GFP versus SSC-A in om GFP+ -cellen te selecteren.
    5. Stel CD34 (PerCP-Cy5.5) versus SSC-A in om CD34+ -cellen te selecteren.
  9. Draai de FACS-buis van de verzameling om voordat u de cel verzamelt om de wanden van de buis met FBS te bedekken.
  10. Verzamel cellen in het stamcelmedium.
    OPMERKING: Streef naar 75.000-80.000 cellen (25.000 cellen x 3)
  11. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT en resusinfecteer de cellen in 3 ml erytroïde differentiatiemedia.
  12. Resuspendeer en doseer vervolgens 1 ml per putje in 3 putjes van een plaat met 24 putjes. Vul alle buitenste putten met PBS.
  13. Voer om de dag een halve uitputting van de media uit en vervang deze door een 2x erytrocytdifferentiatiemedia.
    1. Om de media te verversen, moet u ervoor zorgen dat de cellen zich op de bodem van de plaat bevinden. Leun voorzichtig op de plaat en verwijder 500 μL media.
    2. Ververs door 500 μL toe te voegen met een 2x cytokine erytroïde differentiatiemedia.
    3. Breng de cellen op dag 6 over naar een plaat met 12 putjes en voeg 1 ml media toe om een eindvolume van 2 ml te maken.

5. Analyse van erytroïde differentiatie door middel van flowcytometrie twee keer per week van dag 6 tot dag 14

  1. Bereid de volgende media voor en buffer.
    1. Bereid de FACS-buffer voor door PBS aan te vullen met 1% P/S en 2% FBS
    2. Bereid erytrocytendifferentiatiemedia (in stamcelmedium) voor door 25 ng/ml SCF, 3 E/ml EPO en 50 ng/ml IGF1 toe te voegen.
  2. Verzamel 200 μL cellen uit elk putje van de plaat met 12 putjes en vervang ze door 250 μL 2x erytroïde differentiatiemedia. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan elke buis.
  3. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 100 μL FACS-buffer.
  4. Voeg 1 μL CD71 Ab (1/100), 1 μL CD34 Ab (1/100) en 1 μL CD235a Ab (1/100) toe en incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 20 min.
  5. Resuspendeer cellen in 1 ml FACS-buffer met DAPI (1/2000 verdunning in FACS-buffer). Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT.
  6. Resuspendeer de cellen in 200 μl FACS-buffer met DAPI (verdunning 1/2000 in FACS-buffer).
  7. Bereid de kralen voor op controle:
    1. Voeg 1 druppelcompensatiekorrels toe aan twee buisjes in 100 μL PBS en voeg vervolgens 0,55 μL van een enkel antilichaam toe aan elk buisje om enkele kleurcontroles te maken (één voor CD34, één voor CD71 en één voor CD235a).
      OPMERKING: 1 druppel is voldoende voor beide bedieningselementen.
    2. Incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 20 min. Voeg 1 ml PBS toe.
    3. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 500 μl PBS.
  8. Bereid een leukemische cellijn voor op controle.
    OPMERKING: K562-cellen brengen de CD71-marker tot expressie en kunnen worden gebruikt als positieve controle om de FACS in te stellen.
    1. Voeg GFP-cellen (2 FACS-buisjes met 100.000 cellen) en GFP+-cellen (1 FACS-buisje met 100.000 cellen) toe aan de FACS-buis.
    2. Was de cellen in 1 ml FACS-buffer. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 320 x g bij RT.
    3. Resuspendeer 100.000 GFP+-cellen in FACS-buffer (niet-gekleurd), 100.000 GFP-cellen in FACS-buffer met DAPI (1/2000 verdunning in FACS-buffer) (DAPI gekleurd) en 100.000 GFP+ -cellen in FACS-buffer (GFP+ -cellen).
  9. Stel de volgende poorten in:
    1. Stel DAPI versus side scatter (SSC-A) in om dode cellen uit te sluiten.
    2. Stel SSC-hoogte versus SSC-gebied (SSC-A) in om celaggregaten uit te sluiten en afzonderlijke cellen te selecteren.
    3. Stel een voorwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A) in versus SSC-A in om het vuil te verwijderen op basis van de grootte.
    4. Stel CD235a (APC-Cy7) in versus CD71 (PE).
    5. CD34 (PerCP-Cy5.5) instellen versus SSC-A.
  10. Voer een steekproef uit van niet-gekleurde GFP-cellen en volledig gekleurde cellen om de spanningen aan te passen zodat cellen op de juiste plaats zitten.
  11. Voer kralen, GFP+ -cellen en DAPI-gekleurde cellen uit. Compenseer en pas compensatie toe op de instellingen van de cytometer.
  12. Voer de samples uit en neem de gebeurtenissen op.

6. Analyse van erytroïde differentiatie door Giemsa-kleuring

  1. Bereid 5 dia-kleurpotjes voor:
    1. Bereid een dia-kleurpotje voor met May-Grünwald's eosine-methyleenblauwoplossing, 1:1 bouillon en PBS.
    2. Bereid een dia-kleurpotje voor met 2,5 ml Giemsa-bouillon + 50 ml PBS.
    3. Maak een dia-kleurpot klaar met gedestilleerd water.
    4. Bereid een dia-kleurpot voor met PBS.
    5. Bereid een dia-kleurpotje voor met ijskoude methanol.
  2. Verzamel 100.000 cellen voor een optimale kleuring, voeg 1 ml PBS toe en centrifugeer 300 x g gedurende 5 minuten.
  3. Gooi het medium weg en suspendeer opnieuw in 150 μl PBS.
  4. Bereid de objectglaasjes, het filtreerpapier en de conische adapter voor in een cytocentrifuge en druppel de celbereiding langzaam in de conische adapter.
  5. Centrifugeer 3 minuten op 800 x g . Verwijder de glaasjes en plaats ze 15 minuten in het potje met methanolglaasjes in ijs.
  6. Dompel de objectglaasjes 5 minuten onder in de May-Grünwald-oplossing en schud af en toe om een goede kleuring te garanderen.
  7. Dompel de dia's vervolgens onder in de PBS-pot totdat er geen vlek meer wegloopt.
  8. Dompel de objectglaasjes 20 minuten onder in de Giemsa oplossing en schud ze af en toe om een goede kleuring te garanderen.
  9. Dompel dia's voorzichtig onder met PBS totdat er geen vlek meer wegloopt.
  10. Laat de dia's nog 3 minuten in PBS staan.
  11. Dompel de dia's snel onder in gedestilleerd water en laat ze aan de lucht drogen bij RT.
  12. Voeg een druppel kunsthars toe op elke plek van de cellen en voeg er voorzichtig een dekglaasje aan toe.
  13. Laat de glaasjes 1 uur drogen bij RT en sluit het dekglaasje af met nagellak om uitdroging te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

CD34+-cellen uit navelstrengbloed of beenmerg worden eerst ontdooid, gestimuleerd en getransduceerd met een shRNA dat GFP tot expressie brengt (Figuur 1A). CD34+GFP+-cellen worden 4 dagen na transductie gesorteerd volgens de poortstrategie die wordt geïllustreerd in Figuur 1B. Representatieve resultaten toonden de rijping van CD34+-cellen na transductie en FACS-sortering. Cellen worden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een efficiënte en betrouwbare methode beschreven om erytroïde differentiatie te induceren van CD34+ hematopoëtische stamcellen (HSPC's) geïsoleerd uit volwassen beenmerg (BM) of uit navelstrengbloed (UCB). Deze pijplijn omvat de bewerking/modificatie van primaire cellen om de functie van elk interessant gen tijdens het erytroïde differentiatieproces te onderzoeken. Deze methode is met succes gebruikt om de functionele relevantie te onderzoeken van genen die niet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

CP, SB en K.RP. werden ondersteund door het HARP-programma, de Barts Charity (G-002167), het Kay Kendall Leukemie Fonds (KKL1149) en de Academie voor Medische Wetenschappen (SBF004\1099). We danken Dr. Pantelitsa Protopapa voor de MGG-kleuring en microscopie. We erkennen ook de flowcytometrie- en microscopiefaciliteiten van het Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London. We danken de Britse liefdadigheidsinstelling Anthony Nolan voor het verstrekken van de navelstrengbloedeenheden die in dit manuscript zijn gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2x HEPESMerck51558
BeadsThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 antibodyBD Biosciences347222
CD71 PE antibodyBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX mounting medium VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
GelatinMerckG1393
Giemsa solutionAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
Human EPOPeproTech100-64
Human Flt-3 ligandPeproTech300-19
Human G-CSFPeproTech300-23
Human IGF1PeproTech100-11
Human IL-6PeproTech200-06
Human SCFPeproTech300-07
Human TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesNA
May-Grunwald solution Generon26250-01
Pannoramic 250 High Throughput Scanner 3DHISTECHNA
Penicillin/StreptomycinThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Stem Cell Medium mediumStem Cell Technologies9655

Referenties

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Erytroïde differentiatiehematopoëtische stamcellenex vivo erytropoiesein vitro erytropoieseflowcytometrieCD34-antilichaamerytroïde lineageerytroïde differentiatiemediaAnnexine V-kleuring
Een uitgebreide pijplijn om de efficiëntie van menselijke erytropoëse in vitro en ex vivo te beoordelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.