Bergmeyer glucosekwantificering voor microbiologische monsters

Summary

Bergmeyer glucosekwantificering is een spectrofotometrische enzymatische techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor klinische tests die de hoeveelheid glucose nauwkeurig en gevoelig meten. Hierin presenteren we een protocol voor het gebruik van deze methode voor microbiologische monsters.

Abstract

De glucoseconcentratie is een belangrijke indicator van het cellulaire metabolisme en kan een indicatie zijn van het totale metabolisme, een afwijking in het glucosemetabolisme en, in sommige gevallen, hoe cellen het glucosemetabolisme koppelen aan het energetische metabolisme. Bovendien zijn intracellulaire en extracellulaire glucosespiegels indicatief voor de cellulaire metabole status. Enzymatische technieken, zoals Bergmeyer-glucosekwantificering, zijn nauwkeuriger en gevoeliger dan andere technieken, zoals dinitrosalicylzuur of fluorescentiemethoden, die meestal in de microbiologie worden gebruikt. Hoewel Bergmeyer glucosekwantificering voornamelijk in het klinische gebied wordt gebruikt, kan het ook op elke cel worden toegepast, maar is het niet in detail gerapporteerd voor bacteriën, schimmels, gisten of andere micro-organismen.

Hierin presenteren we een methodologie om glucose uit bacteriën en gistmonsters te kwantificeren met behulp van de enzymatische Bergmeyer-glucosekwantificeringsmethode. De procedure omvatte de enzymen glucose-oxidase, peroxidase en o-dianisidinedihydrochloride die gedurende 20 minuten bij 37 °C werden geïncubeerd, gevolgd door de toevoeging van zwavelzuur. De extinctie wordt vervolgens gemeten bij 545 nm. Het is belangrijk om te benadrukken dat, hoewel deze techniek problemen oplevert bij het meten van hoge glucoseconcentraties (boven 60 g/L), het mogelijk is om concentraties onder 50 g/L te meten met behulp van verdunningsfactoren. Deze enzymatische benadering is waardevol voor onderzoek en analyse in de microbiologie en andere wetenschappelijke gebieden. De precisie en gevoeligheid van de methode maken het nuttig voor het detecteren van zelfs lage concentraties glucose in microbiologische monsters.

Introduction

Glucose dient als de primaire energie- en koolstofbron voor tal van micro-organismen, waaronder bacteriën, gisten en schimmels. Deze micro-organismen nemen glucose op via transporters op het extracellulaire membraan, waar het een reeks biochemische reacties ondergaat binnen de metabole route van de glycolyse om te worden omgezet in pyruvaat¹. Er zijn verschillende technieken voor het kwantificeren van reducerende suikers zoals glucose. Zo kunnen bijvoorbeeld Benedictus' reagens², het gebruik van 3,5-dinitrosalicylzuur (DNS)^3,4, de anthrona methode⁵ of fenol-zwavelzuur⁶ methoden worden gebruikt. Deze methoden detecteren echter alle reducerende suikers die in het monster aanwezig zijn, zoals fructose en maltose, die kunnen bijdragen aan het signaal en de nauwkeurige kwantificering van een bepaalde suiker kunnen bemoeilijken.

Bovendien vereisen ze een strikte temperatuurregeling en de omgang met gevaarlijke stoffen, wat het proces kan bemoeilijken en de nauwkeurigheid kan beïnvloeden. Deze methoden kunnen ook last hebben van interferentie van andere verbindingen die in het monster aanwezig zijn, waardoor nauwkeurige glucosekwantificering moeilijk wordt. Omgekeerd biedt hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) een nauwkeuriger alternatief, waardoor onderscheid kan worden gemaakt tussen glucose en andere reducerende suikers, zij het met hogere operationele kosten. Deze contrasterende methoden benadrukken de voortdurende behoefte aan de ontwikkeling van nauwkeurige en kosteneffectieve glucosekwantificeringstechnieken⁷.

De glucose-oxidase-peroxidase-zwavelzuur (GOX-H₂SO₄) methode maakt gebruik van twee enzymen, glucose-oxidase (GOD) en peroxidase (POD). GOD is een enzym oxidoreductase dat zeer selectief is voor de oxidatie van β-D-glucose⁸. Dit complex werkt als een katalysator tijdens de reactie die optreedt wanneer glucose in de aanwezigheid van zuurstof is, waarbij gluconzuur en waterstofperoxide (H₂O₂) worden geproduceerd. H₂O₂ wordt gedetecteerd door middel van een chromogene zuurstofacceptor, o-dianisidine, die bij interactie met POD de oxidatie ervan veroorzaakt en H₂O₂ afgeeft, waardoor wordt voorkomen dat gluconzuur weer wordt omgezet in glucose (zie figuur 1). De verkregen kleur wordt gestabiliseerd door de toevoeging van zwavelzuur (H₂SO₄), dat ook de enzymatische reactie stopt, waardoor mogelijke interferentie wordt vermeden die zou kunnen optreden als de reactie doorgaat⁹.

Figuur 1: Overzicht van de glucosekwantificeringsmethode met behulp van het glucose-oxidase-enzym, dat reageert met glucose om waterstofperoxide (_H2O₂) en gluconzuur te produceren. Vervolgens reageert het peroxidase-enzym met H₂O₂ in aanwezigheid van O-dianisidinedihydrochloride. In de laatste stap wordt zwavelzuur (H₂SO₄) toegevoegd om de enzymatische reactie te stoppen, wat resulteert in een roze kleur die wordt gemeten bij 529 nm. Afkortingen: POD = peroxidase; GOD = glucose-oxidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De enzymatische methode GOX-H₂SO₄ is een techniek die veel wordt gebruikt om de glucoseconcentratie in biologische monsters te meten, waarvan de meeste van klinisch belang zijn. Er zijn echter maar weinig studies die een techniek hebben onderzocht waarmee de hoeveelheid glucose in een groeimedium kan worden gekwantificeerd om de consumptie ervan te evalueren. Daarom wordt in dit protocol de methodologie gepresenteerd om glucose te kwantificeren door middel van de enzymatische reactie van glucose-oxidase, peroxidase, o-dianisidinedihydrochloride en H₂SO₄ in microbiologische vloeistofmonsters, die ontstaat als een wijziging van het werk van Bergmeyer⁹, door 50% (v/v) H₂SO₄ en lagere hoeveelheden reagentia te gebruiken.

Protocol

1. Voorbereiding van de oplossing

1. Bereid 100 ml 0,1 M fosfaatbuffer voor. Weeg 1,28 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH₂PO₄) en 0,1304 g dikaliumfosfaat (K₂HPO₄) af en voeg deze toe aan een glazen bekerglas. Voeg nu 70 ml gedeïoniseerd water (H₂Odi) toe en pas de pH aan op 5,5 met behulp van 1 M zoutzuur (HCl) of kaliumhydroxide (KOH). Breng de oplossing over in een maatkolf en stel het uiteindelijke volume in op 100 ml. Breng de oplossing vervolgens over in een oranje container en bewaar de oplossing maximaal 3 maanden bij 4-8 °C.
   LET OP: Draag nitrilhandschoenen tijdens het bereidingsproces om huidcontact en mogelijke besmetting te voorkomen, aangezien o-dianisidinedihydrochloride mogelijk kankerverwekkend is.
2. Bereid een oplossing van 1% g/v van o-dianisidinedihydrochloride. Weeg 0,01 g o-dianisidinedihydrochloride af en doe dit in een centrifugebuis van 2,0 ml. Voeg met een micropipet van 1.000 ml 1,0 ml H₂Odi toe om de verbinding op te lossen en meng vervolgens langzaam door op en neer te pipetteren. Bescherm de oplossing tegen licht door de container in aluminiumfolie te wikkelen en bewaar deze bij -20 °C om de stabiliteit te behouden.
   OPMERKING: Om de ondersteuning van de buis tijdens de meting op de analytische balans te vergemakkelijken, kan een bekerglas van 10 ml als extra ondersteuning worden gebruikt. Dit helpt om de buis te stabiliseren en zorgt voor een nauwkeurige meting door het risico van verplaatsing of kanteling te minimaliseren die de verkregen resultaten op de balans zou kunnen veranderen.
3. Voeg in een maatkolf van 100 ml 10 ml fosfaatbufferoplossing toe, gevolgd door 1 ml 1 ml o-dianisidinedihydrochlorideoplossing. Pas vervolgens het eindvolume aan op 100 ml met fosfaatbuffer om een eindconcentratie van 0,01% o-dianisidine-buffermengsel te verkrijgen. Breng de oplossing over in een amberkleurige kolf en wikkel deze in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Bewaar de oplossing bij 4-8 °C gedurende maximaal 3-4 maanden.
   OPMERKING: Koeling is essentieel om ontbinding te voorkomen, wat de integriteit van experimentele metingen in gevaar zou kunnen brengen. Om degradatie van het o-dianisidine-buffermengsel te voorkomen, kan een kleine hoeveelheid van 13 ml (voldoende voor 12 monsters) tot gebruik in een plastic buis van 14 ml op ijs worden geplaatst.
4. Bereid 50% H₂SO₄ oplossing. Plaats een maatkolf van 100 ml met 30 ml H₂Odi in een ijsbad en laat het 10 minuten afkoelen. Giet vervolgens langzaam 51 ml H₂SO₄ (98% v/v) langs de wanden van de kolf en schud voorzichtig om de oplossing te homogeniseren. Wacht tot het mengsel is afgekoeld, want de reactie is exotherm (genereert warmte). Stel het eindvolume in op 100 ml met H₂Odi en breng de oplossing over in een glazen amberkleurige kolf.
   NOTITIE: Gebruik een zuurkast en volg alle veiligheidsprotocollen, zorg ervoor dat u de juiste beschermende uitrusting draagt. Bereid 50 ml 40% calciumcarbonaatoplossing voor om eventuele lekkages te neutraliseren.
5. Bereid 50 mM natriumacetaatoplossing door 0,04 g natriumacetaat op te lossen in 5 ml H₂Odi in een bekerglas. Pas de pH aan op 5,1 met behulp van ijsazijn. Stel ten slotte het volume in op 10 ml met H₂Odi.

2. Bereiding van enzymen

1. Weeg in een steriel microbuisje van 2,0 ml 0,01 g glucoseoxidase af en meng met 1 ml 50 ml natriumacetaat, pH 5,0, om een eindconcentratie van 10 mg/ml te verkrijgen. Dek de tube af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 °C.
   OPMERKING: De oplossing kan maximaal 2 maanden worden bewaard bij -20 °C.
2. Bereken het volume enzymoplossing V₂ dat nodig is om de gewenste enzymactiviteit in elke plastic cuvet te bereiken (met een totaal volume van 1,5 ml) met behulp van Eq (1): V₁C₁ = V₂C₂, waarbij V₁ 1.500 μl is, C₁ 28,5 U enzymactiviteit is en C₂ (de concentratie van de enzymoplossing) 12.970 E/ml (10 mg van het enzym [129.000 eenheden/g] in 1 ml van H₂Odi).
   V₂ = (1.500 μL × 28,5 U)/12.970 U = 3,29 μL (1)
   OPMERKING: Voor nauwkeuriger pipetteren kan de waarde worden afgerond op 3,3 μL.
3. Weeg in een nieuw microbuisje van 2 ml 0,0031 g peroxidase-enzym af en voeg 1 ml fosfaatbuffer met een pH van 5,5 toe om een eindconcentratie van 3,1 mg/ml te bereiken. Dek de microtube af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 °C.
4. Bereken het volume van de peroxidaseoplossing dat nodig is om de gewenste enzymactiviteit per cuvet te bereiken met behulp van Eq (1). Begin met een totaal cuvettenvolume van 1.500 μL en een doelenzymactiviteit van 1,25 E. Bepaal vervolgens het benodigde volume van de enzymoplossing, gegeven de concentratie van 1.551 E.
   V₂ = (1.500 μL × 1,25 U)/1.551 U = 1,208 μL
   OPMERKING: Voor nauwkeuriger pipetteren werd de waarde afgerond op 1,20 μl.

3. Glucose standaard

1. Bereid een D-glucosestandaard van 1 g/l voor door 0,01 g D-glucose toe te voegen aan 10 ml H₂Odi in een maatkolf. Om de concentratie te verdunnen tot 0,5 g/l, neemt u 500 μl van de stockoplossing en mengt u deze met 500 μl H₂Odi om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.
   OPMERKING: Dit verdunningsproces is essentieel voor het creëren van nauwkeurige standaardoplossingen.

4. Standaard bochtvoorbereiding

1. Voeg met behulp van een nieuw microbuisje van 2 ml de buffer- en glucosevolumes toe die in tabel 1 worden aangegeven.
2. Stel het droge thermobad in op 37 °C. Zodra de temperatuur stabiel is, voegt u 3,3 μL glucose-oxidase toe aan alle buisjes en voegt u vervolgens 1,2 μL peroxidase toe aan elk buisje. Incubeer de buisjes gedurende 20 minuten bij 37 °C.
3. Voeg na incubatie onmiddellijk 750 μL 50% H₂SO₄ (v/v) toe aan elke microbuis en laat het mengsel 2 minuten afkoelen in een ijsbad. Dit resulteert in een eindvolume van 1.500 μL. Breng ten slotte de oplossing over in een plastic cuvet en meet de absorptie bij 529 nm.

Tabel 1: Glucosekalibratiecurve voor de GOX-H₂SO_4-methode . Afkortingen: GOD = glucose-oxidase; POD = peroxidase; H₂SO₄ = zwavelzuur. Klik hier om deze tabel te downloaden.

5. Testen van microbiologische monsters

1. Verkrijg het monster door bacteriën of gist te laten groeien in een vloeibaar kweekmedium onder specifieke omstandigheden, waaronder temperatuur, roersnelheid en incubatietijd. Zodra de cultuur de gewenste optische dichtheid (OD) of celconcentratie heeft bereikt, verzamelt u de cultuur voor verdere verwerking.
   OPMERKING: Pseudomonas reptilivora werd gekweekt met een constante roersnelheid van 300 tpm en 28 °C, terwijl Debaryomyces hansenii werd gekweekt met een roersnelheid van 200 tpm bij 30 °C in een orbitale schudder. In het specifieke geval van D. hansenii werd eetbare koolzaadolie ook gebruikt als inductor voor de productie van lipase.
2. Reinig het werkgebied met een oplossing van 70% alcohol of een geschikt reinigingsmiddel volgens de bioveiligheidsprotocollen. Steek een brander aan om asepsis te voorkomen.
3. Breng 100 μl van de kweekmedia over in een microbuisje van 1,5 ml of 2 ml met behulp van steriele uiteinden.
4. Centrifugeer de monsters bij 7.500 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C of bij 10.000 × g gedurende 7 minuten zonder temperatuurregeling. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant, dat glucose in oplossing bevat, en gooi de pellet weg.
5. Gebruik 0,5 μL van het bovenstaande voor glucoseconcentraties variërend van 1 tot 20 g/L, meng vervolgens met 749,5 μL o-dianisidine-buffer, 3,3 μL GOD en vervolgens 1,2 μL POD. Incubeer de microbuisjes gedurende 20 minuten bij 37 °C, zoals beschreven in stap 4.2 en voeg onmiddellijk 750 μL 50% H₂SO₄ toe en laat het 2 minuten afkoelen in een ijsbad.
   1. Voor concentraties boven 20 g/l moet een verdunning van 1:1 met steriel H₂Odi worden uitgevoerd voordat u verder gaat.
   2. Als de bovenstaande monsters eerder bij -80 °C of -20 °C zijn ingevroren, ontdooi ze dan bij kamertemperatuur en vortex gedurende 30 s voor gebruik. Als verdunning nodig is, gebruik dan steriel H₂Odi.
   3. Voor monsters met glucoseconcentraties van meer dan 30 g/l moet een verdunning van 1:1 met steriel H₂Odi worden uitgevoerd, wat resulteert in een verdunningsfactor van 2.
6. Bereken de totale glucoseconcentratie in elk monster met behulp van Eq (2) in een spreadsheetprogramma.
   (2)
   Waar:
   x = glucoseconcentratie (g/l) δ = Eindreactievolume (0,0015 l)
   y = absorptiecottie M.S. = hoeveelheid gebruikt monster*
   OPMERKING: De b - en m-waarden zijn afkomstig uit de vergelijking die de trendlijn van de kalibratiecurve voor de methode modelleert (y = mx + b). *De M.S.-waarde moet gebaseerd zijn op de hoeveelheid monster die is gebruikt om de verhouding bij de overeenkomstige verdunning te verkrijgen (d.w.z. als u 0,5 μL van de supernatant neemt, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); als een verdunningsfactor (DF) wordt gebruikt, vermenigvuldig dan de verkregen extinctie met de DF.
   Als bijvoorbeeld een absorptie van 0,5 wordt verkregen en een DF van 2 wordt gebruikt, zou het resultaat 1,0 zijn. Daarom is y = 1,0, en deze waarde moet worden ingevoerd in Eq (2), zoals eerder beschreven.

6. Analytische validatie

1. Bereken de analytische validatieparameters van de GOX-H₂SO_4-methode volgens wat is vastgesteld door het National Metrology Center en de Mexican Accreditation Entity¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Bereken de precisie als percentage van de variatiecoëfficiënt of %CV = (S/x) × 100, waarbij x het gemiddelde van de steekproefgroep is en S de standaarddeviatie met een acceptatiewaarde van ≤10%.
   2. Bepaal de lineariteit door de standaardcurve aan te passen aan lineair model R² boven 0,995.
   3. Bereken de berekeningslimiet (LOQ) met behulp van de vergelijking: LOQ = yB + 10sB, waarbij yB de analytconcentratie vertegenwoordigt die een signaal produceert dat gelijk is aan het doelsignaal, en 10sB staat voor 10x de standaarddeviatie van de blanco
   4. Bereken de systematische fout met behulp van deze vergelijking: Schuin = x - m, waarbij x = gemiddelde van de experimentele concentratie en m de theoretische concentratie is.
   5. Bepaal de nauwkeurigheid als de mate van overeenstemming tussen een reële waarde en een theoretische waarde.
      Herstel% = (CR/CV) × 100
      Waarbij CR het gemiddelde is van de experimentele concentratie en CV de variatiecoëfficiënt van de theoretische concentratie.

7. Interferentie door andere reducerende suikers

1. Evalueer vier reducerende suikers afzonderlijk: glucose, fructose, galactose en xylose uit een stockoplossing van 0,5 g/l. Gebruik bovendien trehalose als negatieve controle. Volg het protocol voor alle monsters en meet de extinctie bij 545 en 529 nm.

Results

De spectrofotometrische analyse van GOX-H₂SO₄ onthulde een enkele maximale extinctie bij 529 nm (λmax) (Figuur 2A), met extra extinctiewaarden waargenomen bij 545 nm. Door de extinctiewaarden bij verschillende glucoseconcentraties te analyseren, verkregen we een lineariteit (R²) van 0,9977 voor λ529 nm en R² van 0,9967 voor λ545 nm (Figuur 2B). Lineariteit, binnen een bepaald bereik, verwijst naar het v...

Discussion

Het kwantificeren van glucose in kweekmedia is essentieel voor het begrijpen van microbiële groei en metabolische activiteit, aangezien glucose dient als primaire energiebron voor veel micro-organismen. In deze studie hebben we de GOX-H₂SO_4-methode gebruikt om glucosespiegels in kweekmedia nauwkeurig te meten, met als doel microbiële processen in bacteriën of gistfermentaties te optimaliseren. Onze bevindingen komen overeen met die van Yuen en McNeill

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	-	-
2.0 mL microtube	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Calcium Carbonate
D-Glucose	Meyer	50-99-7	D-Glucose
Drybath	FisherScientific	11-718-4	Serial 911NO251. Block WxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
Glucose oxidase	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Enzyme poeder
H2O	-	-	De-ionized water
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Zwavelzuur
HCl	Meyer	7647-01-0	Zoutzuur
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Dikaliumfosfaat
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Monokaliumfosfaat
KOH	Meyer	1310-58-3	Kaliumhydroxide
Lambda 35	PerkinElmer	-	Spectrofotometer
Microtube centrifuge	-	-	-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma Aldrich	D3252	Chromogeen
Peroxidase	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzyme poeder
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
Sodium acetate	Meyer	127-09-3	Meyer
Weighing spatulas	-	-	-