Bergmeyer glucosekwantificering voor microbiologische monsters

Summary

Bergmeyer glucosekwantificering is een spectrofotometrische enzymatische techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor klinische tests die de hoeveelheid glucose nauwkeurig en gevoelig meten. Hierin presenteren we een protocol voor het gebruik van deze methode voor microbiologische monsters.

Abstract

De glucoseconcentratie is een belangrijke indicator van het cellulaire metabolisme en kan een indicatie zijn van het totale metabolisme, een afwijking in het glucosemetabolisme en, in sommige gevallen, hoe cellen het glucosemetabolisme koppelen aan het energetische metabolisme. Bovendien zijn intracellulaire en extracellulaire glucosespiegels indicatief voor de cellulaire metabole status. Enzymatische technieken, zoals Bergmeyer-glucosekwantificering, zijn nauwkeuriger en gevoeliger dan andere technieken, zoals dinitrosalicylzuur of fluorescentiemethoden, die meestal in de microbiologie worden gebruikt. Hoewel Bergmeyer glucosekwantificering voornamelijk in het klinische gebied wordt gebruikt, kan het ook op elke cel worden toegepast, maar is het niet in detail gerapporteerd voor bacteriën, schimmels, gisten of andere micro-organismen.

Hierin presenteren we een methodologie om glucose uit bacteriën en gistmonsters te kwantificeren met behulp van de enzymatische Bergmeyer-glucosekwantificeringsmethode. De procedure omvatte de enzymen glucose-oxidase, peroxidase en o-dianisidinedihydrochloride die gedurende 20 minuten bij 37 °C werden geïncubeerd, gevolgd door de toevoeging van zwavelzuur. De extinctie wordt vervolgens gemeten bij 545 nm. Het is belangrijk om te benadrukken dat, hoewel deze techniek problemen oplevert bij het meten van hoge glucoseconcentraties (boven 60 g/L), het mogelijk is om concentraties onder 50 g/L te meten met behulp van verdunningsfactoren. Deze enzymatische benadering is waardevol voor onderzoek en analyse in de microbiologie en andere wetenschappelijke gebieden. De precisie en gevoeligheid van de methode maken het nuttig voor het detecteren van zelfs lage concentraties glucose in microbiologische monsters.

Introduction

Glucose dient als de primaire energie- en koolstofbron voor tal van micro-organismen, waaronder bacteriën, gisten en schimmels. Deze micro-organismen nemen glucose op via transporters op het extracellulaire membraan, waar het een reeks biochemische reacties ondergaat binnen de metabole route van de glycolyse om te worden omgezet in pyruvaat¹. Er zijn verschillende technieken voor het kwantificeren van reducerende suikers zoals glucose. Zo kunnen bijvoorbeeld Benedictus' reagens², het gebruik van 3,5-dinitrosalicylzuur (DNS)^3,4, d....

Protocol

1. Voorbereiding van de oplossing

1. Bereid 100 ml 0,1 M fosfaatbuffer voor. Weeg 1,28 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH₂PO₄) en 0,1304 g dikaliumfosfaat (K₂HPO₄) af en voeg deze toe aan een glazen bekerglas. Voeg nu 70 ml gedeïoniseerd water (H₂Odi) toe en pas de pH aan op 5,5 met behulp van 1 M zoutzuur (HCl) of kaliumhydroxide (KOH). Breng de oplossing over in een maatkolf en stel het uiteindelijke volume in op 100 ml. Breng de oplossing vervolgens over in een oranje container en bewaar de oplossing maximaal 3 maanden bij 4-8 °C.
   LET OP: Draag nitrilha....

Results

De spectrofotometrische analyse van GOX-H₂SO₄ onthulde een enkele maximale extinctie bij 529 nm (λmax) (Figuur 2A), met extra extinctiewaarden waargenomen bij 545 nm. Door de extinctiewaarden bij verschillende glucoseconcentraties te analyseren, verkregen we een lineariteit (R²) van 0,9977 voor λ529 nm en R² van 0,9967 voor λ545 nm (Figuur 2B). Lineariteit, binnen een bepaald bereik, verwijst naar het v.......

Discussion

Het kwantificeren van glucose in kweekmedia is essentieel voor het begrijpen van microbiële groei en metabolische activiteit, aangezien glucose dient als primaire energiebron voor veel micro-organismen. In deze studie hebben we de GOX-H₂SO_4-methode gebruikt om glucosespiegels in kweekmedia nauwkeurig te meten, met als doel microbiële processen in bacteriën of gistfermentaties te optimaliseren. Onze bevindingen komen overeen met die van Yuen en McNeill

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	-	-
2.0 mL microtube	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Calcium Carbonate
D-Glucose	Meyer	50-99-7	D-Glucose
Drybath	FisherScientific	11-718-4	Serial 911NO251. Block WxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
Glucose oxidase	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Enzyme powder
H2O	-	-	Deionized water
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Sulfuric acid
HCl	Meyer	7647-01-0	Hydrochloridric acid
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Dipotassium phosphate
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Monopotassium phosphate
KOH	Meyer	1310-58-3	Potassium hydroxide
Lambda 35	PerkinElmer	-	Spectrophotometer
Microtube centrifuge	-	-	-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma Aldrich	D3252	Chromogenic
Peroxidase	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzyme powder
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
Sodium acetate	Meyer	127-09-3	Meyer
Weighing spatulas	-	-	-