Methodenartikel

Dissectie van eierstokken, middendarm en speekselklieren van muggen voor microbioomanalyses op orgaanniveau

4.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67128

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  , 
1Infectious Diseases and Vectors: Ecology, Genetics, Evolution and Control (MIVEGEC), University of Montpellier, INRAe, CNRS, IRD, 2Unité de Recherche et d’Expertise en Entomologie Médicale, Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie

In dit artikel

Samenvatting

Microbiële gemeenschappen in muggen zijn veelbelovend voor vector biologische bestrijdingsstrategieën. De meeste symbionten zijn niet te kweken, waardoor metagenomische analyses nodig zijn. We beschrijven een methode om vrouwelijke muggen te ontleden en eierstokken, middendarm en speekselklieren te scheiden, kruisbesmetting te voorkomen, microbioomstudies op orgaanniveau te vergemakkelijken en het begrip van de rol van micro-organismen in de biologie van muggen te vergroten.

Samenvatting

De wereldwijde last van door muggen overgedragen ziekten, waaronder malaria, dengue, West-Nijl, Zika, Usutu en gele koorts, blijft toenemen en vormt een aanzienlijke bedreiging voor de volksgezondheid. Met de opkomst van resistentie tegen insecticiden en de afwezigheid van effectieve vaccins, ontstaan er nieuwe strategieën die zich richten op de microbiota van de mug. Toch blijft het merendeel van de symbionten resistent tegen teelt. Het karakteriseren van de diversiteit en functie van bacteriële genomen in muggenspecimens is daarom afhankelijk van metagenomica en daaropvolgende assemblage- en binning-strategieën. Het verkrijgen en analyseren van metagenoom-geassembleerde genomen (MAG's) van gescheiden organen kan met name belangrijke informatie opleveren over de specifieke rol van mug-geassocieerde microben in de eierstokken (de voortplantingsorganen), de middendarm (sleutel voor voedselvertering en immuniteit) of de speekselklieren (essentieel voor de overdracht van door vectoren overgedragen ziekten, aangezien ziekteverwekkers ze moeten koloniseren om het speeksel binnen te dringen en de bloedbaan te bereiken tijdens een bloedmaaltijd). Deze nieuw gereconstrueerde genomen kunnen vervolgens de weg vrijmaken voor de ontwikkeling van nieuwe vector biologische bestrijdingsstrategieën. Om dit doel te bereiken, is het nodig om muggenorganen te isoleren en kruisbesmetting tussen deze organen of met micro-organismen die in andere muggenorganen aanwezig zijn, te voorkomen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd en contaminatievrij dissectieprotocol voor het bestuderen van het microbioom van muggen op orgaanniveau.

Inleiding

Muggen verspreiden een breed scala aan ziekteverwekkers die ziekten veroorzaken en vormen een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid. Vanwege een verhoogde prevalentie van resistentie tegen insecticiden onder muggenpopulaties en bij gebrek aan effectieve vaccins tegen deze ziekteverwekkers, zijn er nieuwe biologische bestrijdingsmethoden in opkomst die zich richten op het muggenmicrobioom. Met name de intracellulaire bacterie Wolbachia, die de overdracht van ziekteverwekkers kan verstoren en de voortplanting van de gastheer kan manipuleren, valt op 1,2,3. Bovendien staan andere muggensymbionten centraal in de overleving, ontwikkeling of het immuunsysteem van hun gastheer, evenals bij infectie en overdracht van ziekteverwekkers, en zijn ze veelbelovend voor hun exploitatie om door vectoren overgedragen ziekten te bestrijden 4,5,6,7,8.

Micro-organismen die met muggen worden geassocieerd, omvatten alle domeinen van het microbiële leven (inclusief bacteriën, eukaryoten en schimmels) die intiem interageren met hun gastheer, maar ook met elkaar in de verschillende lichaamscompartimenten 9,10. Daarom kan een beter begrip van de microbiota, de potentiële seizoensvariatie11 en de mechanismen waarmee de leden rechtstreeks interageren in verschillende muggenweefsels helpen bij het ontwikkelen van nieuwe gerichte biologische bestrijdingsmethoden of het verbeteren van bestaande. De meeste symbionten blijven echter resistent tegen teelt, waardoor hun karakterisering onmogelijk wordt.

De komst van sequencingmethoden van de tweede en derde generatie, samen met state-of-the-art assemblage- en binning-benaderingen, hebben de reconstructie van microbiële genomen mogelijk gemaakt en toegang gekregen tot de diversiteit en het functionele potentieel van niet-kweekbare microben. Hier presenteren we een methode voor de dissectie van de eierstokken, middendarm en speekselklieren van vrouwelijke muggen, terwijl kruisbesmetting wordt voorkomen. Dit protocol kan worden gevolgd door genomische DNA-extractie en daaropvolgende metabarcoding of shotgun metagenomische sequencing om de diversiteit en functie van muggenmicrobiota op orgaanniveau te onderzoeken. We geven een voorbeeld van muggendissectie en microbioomgegevens voor Culex spp.-specimens, hoewel dit protocol kan worden uitgebreid naar vectoren van andere geslachten zoals Anopheles of Aedes.

Protocol

OPMERKING: Figuur 1 toont een schema van de methode met een samenvatting van de verschillende stappen van het protocol.

1. Voorbereiding van het materiaal

  1. Voordat u met het experiment begint, bereidt u een bleekoplossing met 0,5% actief chloor (aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie) om de apparatuur en de werkbank te desinfecteren.
    1. Los in 900 ml water drie oplosbare tabletten op, elk met 1,5 g actief chloor. Wacht 15 minuten totdat de tabletten volledig zijn opgelost, wat resulteert in een bleekoplossing van 0,5%.
    2. Doe de 0,5% bleekoplossing in een spuitfles. Spuit de oplossing vervolgens op alle dissectieapparatuur, inclusief microscopische objectglaasjes en werkbank.
      NOTITIE: De apparatuur en werkbank moeten voor gebruik ~10 minuten drogen.
  2. Om de muggen voor elke dissectie te spoelen om besmetting van de monsters met externe bacteriën te voorkomen, bereidt u vier pas gesteriliseerde buisjes van 1,5 ml voor: twee met 96% ethanol en twee andere met 1x PBS-buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
  3. Bereid de buisjes voor om de monsters na de dissectie van elke mug op te slaan: vier steriele buisjes van 1,5 ml, elk met 100 μl conserveringsbuffer.
    OPMERKING: Bereid een buis voor de speekselklieren, een voor de eierstokken, een voor de middendarm en een voor het muggenkarkas.

2. Muggen collectie

  1. Verzamel en houd volwassen vrouwelijke individuen in leven (uit het veld of laboratorium, 4-7 dagen) tot sterilisatie aan het oppervlak.

3. Sterilisatie van het oppervlak van muggen

OPMERKING: Reinig pincetten en naalden en gebruik nieuwe, gesteriliseerde buisjes tussen elk orgaan en individu. Als er geen bleekmiddel beschikbaar is, zorg er dan voor dat de ontleedtang en naalden tussen de dissectie van elk individu en orgaan grondig worden gesteriliseerd om kruisbesmetting van biologisch materiaal te voorkomen. Dissectie-instrumenten moeten voor het volgende gebruik droog zijn, zonder resten van bleekmiddel/ethanol.

  1. Om te voorkomen dat vrouwtjes hun darminhoud legen bij blootstelling aan alcohol, koel ze af op ijs of in een vriezer bij -20 °C (gedurende 4 minuten zodat de weefsels en organen niet bevriezen).
  2. Breng individuele muggen over in een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml met 1 ml 96% ethanol. Draai voorzichtig (handmatig) gedurende 30 s (schud de mug goed in de buis om de schubben en mogelijke bacteriële verontreinigingen op het oppervlak van de insecten los te maken). Spoel twee keer met behulp van tubes met ethanol.
  3. Breng de mug over in een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml met 1 ml steriele 1x PBS-oplossing en draai voorzichtig (handmatig) gedurende 30 s (om DNA-precipitatie met ethanol te voorkomen). Spoel twee keer met tubes met steriel 1x PBS.

4. Ontleding van muggen

  1. Plaats enkele kleine druppels steriele 1x PBS op het glaasje om het plaatsen van de mug en het spoelen van ontlede organen te vergemakkelijken.
    OPMERKING: De druppels steriele PBS moeten groot genoeg zijn om plaats te bieden aan de muggenorganen.
  2. Pak de schoongemaakte mug en plaats deze op een druppel steriele 1x PBS op het microscoopglaasje.
  3. Ontleed de speekselklieren met een gesteriliseerde tang en naald zoals hieronder beschreven.
    1. Houd de borstkas van de mug vast met een pincet om te voorkomen dat deze beweegt. Plaats vervolgens een naald in de nek, onder het hoofd, en trek voorzichtig aan de kop van de mug om deze van de thorax te scheiden.
      OPMERKING: De speekselklieren bevinden zich in de bovenste thorax en zijn verbonden met het hoofd door het speekselkanaal. Tijdens de dissectie is het van cruciaal belang om dit kanaal niet te breken, omdat de speekselklieren niet met het hoofd meekomen als u het uit de borstkas trekt. Daarom is het belangrijk om een verse mug te hebben, geen bevroren.
    2. Wanneer het hoofd loskomt van de thorax, observeer dan de twee speekselklieren, elk bestaande uit drie lobben. Snijd de speekselklieren ter hoogte van het speekselkanaal door, haal ze met een naald op en plaats ze in een nieuwe druppel steriele 1x PBS om deze te spoelen en besmetting tussen organen te voorkomen.
    3. Haal de speekselklieren op met een naald en plaats ze in een nieuwe gesteriliseerde buis met 100 μL conserveringsbuffer.
  4. Ontleed de eierstokken met een gesteriliseerde tang en naald als volgt.
    1. Leg de mug op zijn rug. Gebruik een tang om de mug bij de borstkas vast te houden om beweging tijdens de dissectie te voorkomen en prik met een naald in het derde buiksegment (beginnend vanaf de onderkant).
      OPMERKING: Verwijder eventueel de poten en vleugels van de mug om de dissectie te vergemakkelijken.
    2. Terwijl je het derde buiksegment doorboort, trek je de buik naar beneden om deze te openen en de inwendige organen te onthullen. Verwijder eventuele resterende stukjes exoskelet van muggen om het vrijkomen van de organen te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Organen in de buik zoals de darmen, Malpighian tubuli en eierstokken zijn zichtbaar.
    3. Haal beide eierstokken op met een gesteriliseerde pincet en plaats ze in een nieuwe druppel steriele 1x PBS op het microscoopglaasje om ze af te spoelen. Pak de eierstokken vast en plaats ze in het buisje van 1,5 ml met de conserveringsbuffer van 100 μl.
  5. Nu de buik open is en de organen bloot liggen, haalt u de middendarm op met een nieuwe gesteriliseerde tang en/of naald.
    1. Scheid de middendarm van de voordarm en de achterdarm; verwijder vervolgens de Malpighian tubuli uit de middendarm. Pak de middendarm vast met een steriele naald en plaats deze op een nieuwe steriele 1x PBS-druppel om deze te spoelen en besmettingen tussen organen te voorkomen.
    2. Breng over naar een nieuwe steriele 1x PBS-druppel. Open de middendarm met een pincet om bacteriën te bevrijden en te verrijken zoals beschreven in aanvullend bestand 1. Pak de middendarm vast met een tang en pipet alle PBS-bevattende bacteriën om het hele materiaal (vloeistof en weefsel) op te slaan in een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml met 100 μL conserveringsbuffer.
    3. Voeg opnieuw 5 μL 1x PBS toe op de eerder gebruikte plaats in het microscoopglaasje en pipetteer PBS direct terug in hetzelfde buisje van 1,5 ml om bacteriën op te halen die mogelijk aan het microscoopglaasje zijn blijven plakken.
  6. Gebruik een steriele tang om het karkas (resterend lichaam) vast te pakken en bewaar het in een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml met 100 μl conserveringsbuffer.
  7. Opslag van materiaal tot verdere verwerking
    1. Etiket buisjes met 'Soort, Orgaan, Datum, Naam van de Onderzoeker'.
    2. Bewaar ontlede eierstokken, middendarm, speekselklieren en karkas bij -20 °C tot verwerking.
  8. Houd in een spreadsheet alle bijbehorende metadata voor de monsters bij, inclusief soort (of alleen genusniveau), verzameldatum, land, provincie, breedtegraad, lengtegraad, naam van de persoon die de dissectie heeft gedaan, zwangere vrouw of niet, bloedmeel of niet.

Resultaten

x'Mosquito dissecties
Volgens het protocol verzamelden en isoleerden we de eierstokken, middendarm, speekselklieren en het karkas van twee Culex pipiens molestus-exemplaren (waaronder een drachtig vrouwtje) uit een laboratoriumkolonie. We bevestigden schone dissecties na observatie van volledige (d.w.z. ongebroken) en goed geïsoleerde organen zonder achtergebleven puin onder de verrekijker. Het hele lichaam, het hoofd en de thorax, de ontlede speekselklieren, de eierstokken en de middendarm van een Culex pipiens molestus-exemplaar worden weergegeven in figuur 2. Zoals verwacht waren de middendarm en speekselklieren een orde van grootte kleiner dan de eierstokken van de mug. De eieren van een drachtig Culex-exemplaar, samen met zijn darm- en Malpighian-tubuli, zijn weergegeven in figuur 3. Merk op dat dissecties meer kans hebben om te mislukken wanneer het materiaal niet vers is en weefsel waarschijnlijk zal breken (Figuur 4B,C). We raden daarom aan om het materiaal direct na het verzamelen te ontleden (binnen minder dan 12 uur) indien mogelijk, aangezien de weefsels nog elastisch zijn (Figuur 4A). Op dezelfde manier kan dissectie van bevroren materiaal worden uitgevoerd, maar er is een veel hoger risico op falen en kruisbesmetting tussen organen als gevolg van fragiele weefsels (Figuur 4).

Gegevens over het microbioom
Daarnaast verzamelden en scheidden we de middendarmen en eierstokken van drie individuele Culex quinquefasciatus exemplaren uit Noumea, Nieuw-Caledonië, volgens dezelfde procedure. We hebben DNA uit elk orgaan geëxtraheerd, monsters voorbereid voor sequencing van het hele genoom en microbioomgegevensanalyses uitgevoerd zoals beschreven in aanvullend dossier 1. Een bacteriële taxonomische diversiteitsanalyse op niet-samengestelde, op kwaliteit gefilterde korte lezingen met behulp van PhyloFlash12 toonde duidelijke dominante taxa in de middendarm in vergelijking met eierstokken (Figuur 5A). Met name ovariële bacteriegemeenschappen werden gedomineerd door Wolbachia, met de extra aanwezigheid van een Spirochaetaceae fylotype in de eierstokken van individu 3, terwijl middendarmgemeenschappen een grotere diversiteit vertoonden, waaronder Gammaproteobacteriën, Spirochaetaceae en Firmicutes. Op basis van dezelfde sequentiegegevens hebben we vier metagenoom-geassembleerde genomen (MAG's) gereconstrueerd met voltooiing > 80% en redundantie < 5%, behorend tot de klassen Spirochaetia, Alpha- en Gammaproteobacteria (Tabel 1).

Zoals verwacht dekten de hierin gereconstrueerde MAG's niet de volledige taxonomische diversiteit die werd voorspeld door de PhyloFlash-resultaten vanwege de specifieke tekortkomingen van genoomreconstructie met behulp van metagenomische shortreads. De MAG toegewezen aan Wolbachia (Ref. MAG 3 in Tabel 1) werd gedetecteerd in alle eierstokken en twee van de middendarmen en had een hogere dekking in de eierstokken (Figuur 5B). We hebben ook twee MAG's gereconstrueerd die behoren tot de familie Enterobacteriaceae , waaronder het geslacht Pantoea (Ref. MAG 1 en 2 in Tabel 1), in de middendarmen verkregen van Culex-individuen 2 en 3, die niet werden gedetecteerd in de overeenkomstige eierstokken (Figuur 5B). Ten slotte hebben we ook een Spirochaetaceae bacterieel genoom gereconstrueerd, Ref. MAG 4 (Tabel 1), toegewezen aan het geslacht BR149 dat met succes werd geïsoleerd uit de middendarmen van Culex pipiens door Graña-Miraglia en collega's13. Interessant is dat deze MAG werd gedetecteerd in de darmen van individuen 1 en 3, evenals in de eierstokken van individu 3 (Figuur 5B).

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de methode met een samenvatting van de verschillende stappen. Materiaalvoorbereiding, muggenverzameling, muggenreiniging, muggendissecties en opslag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Culex pipiens molestus vrouwtje. (A) Het hele lichaam. (B) Hoofd en thorax. (C) Ontlede speekselklieren. (D) Ontlede eierstokken. (E) Ontlede darm met Malpighi-tubuli. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Ontleed achterlijf van een drachtig Culex pipiens molestus vrouwtje. De voordarm, middendarm, achterdarm, Malpighian tubuli en eieren van het exemplaar worden getoond. Rode streepjes geven aan waar moet worden gesneden om de middendarm te scheiden van de voordarm en de achterdarm. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: F = voordarm; M = middendarm; H = dikke darm; E = eieren; MT = Malpighian tubuli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Ontleding van verse en diepgevroren Culex-muggen.Witte rechthoeken illustreren (A) muggenweefsel met intacte organen van een vers ontleed exemplaar en (B,C) gebroken biologisch materiaal van exemplaren die vóór dissectie zijn ingevroren. Schaalbalken = 720 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Voorbeeld microbioomanalyse op drie Culex quinquefasciatus individuen. (A) Visualisatie van bacteriële diversiteit geschat door de extractie van SSU rRNA-lezingen met PhyloFlash12 in de middendarm en eierstokken van de drie monsters. (B) Gemiddelde dekking van de gereconstrueerde MAG's over de monsters. Afkortingen: MAG = metagenoom-geassembleerd genoom; Ind = Individueel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MAGReferentie MAG 4Referentie MAG 2Referentie MAG 1Referentie MAG 3
Lengte (zp)1,287,7904,910,8664,751,2761,298,266
Aantal contigs9162149123
GC %34.0555.4554.0534.15
Voltooiing (%)84.597.1898.5991.55
Redundantie (%)02.824.220
DomeinBacteriënBacteriënBacteriënBacteriën
StamSpirochaetotaProteobacteriënProteobacteriënProteobacteriën
KlasSpirochaetiaGammaproteobacteriënGammaproteobacteriënAlfaproteobacteriën
BevelenWRBN01 zei:EnterobacteralesEnterobacteralesRickettsiales
FamilieWRBN01 zei:EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceaeAnaplasmataceae
GeslachtBR149Pantoea-Kanton Wolbachia

Tabel 1: Gereconstrueerde MAG's van de drie Culex quinquefasciatus individuen. Genoomgrootte, aantal contigs, aandeel van GC, schattingen van voltooiing en redundantie op basis van de single-copy kerngenencollectie die beschikbaar is in Anvi'o17 en taxonomie verkregen met behulp van GTDB18.

Aanvullend bestand 1: Gedetailleerde voorbeeldprocedure voor de analyse van microbioomgegevens , beginnend bij het verzamelen van monsters, DNA-extractie en sequencing van het hele genoom, gevolgd door de bio-informaticaworkflow voor genoomreconstructie en schatting van prokaryote en eukaryote leesproporties Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

We raden aan om bijzondere aandacht te besteden aan de volgorde van orgaandissectie, te beginnen met de speekselklieren. We zagen inderdaad dat ze gemakkelijker uit de thorax van Culex-exemplaren konden worden geëxtraheerd als de integriteit van de mug behouden bleef. Schade aan de buik of borstkas kan de druk in het lichaam van de mug verminderen, waardoor de procedure wordt belemmerd. Het is echter ook mogelijk om tussen de thorax en de buik te snijden en vervolgens de speekselklieren uit het hoofd en de thorax te trekken (A. B. Failloux, persoonlijke communicatie). Bovendien kan het verwerven van bekwame ontleedvaardigheden een uitdaging zijn, dus we raden aan om voorafgaand aan het experiment op een voldoende aantal exemplaren te oefenen.

Het isoleren van muggenorganen en het systematisch vermijden van kruisbesmetting is cruciaal voor een breed scala aan stroomafwaartse microbiota-analyses van muggen. Een genoom-opgelost metagenoomonderzoek na de dissectie van enkele eierstokken uit Culex pipiens-exemplaren in Zuid-Frankrijk maakte de ontdekking mogelijk van het eerste plasmide van Wolbachia in Culex pipiens (pWCP14). Met behulp van een vergelijkbare aanpak onderzochten we de verspreiding en frequentie van pWCP in Culex pipiens en Culex quinquefasciatus specimens uit zowel continentale als eilandgebieden wereldwijd, in verschillende milieu- en laboratoriumomstandigheden. Over het algemeen onthulden de gegevens een opmerkelijk geconserveerd Wolbachia-plasmide-element in Culex-muggen, wat suggereert dat dit mobiele element een cruciale rol speelt in de biologie van endosymbionten 15, wat verdere analyse rechtvaardigt.

Hier geven we aanvullende voorbeelden van microbioomanalyses van muggen op middendarm- en eierstokmonsters die met behulp van deze systematische procedure zijn verkregen. We zagen een duidelijk verschil in microbiota tussen weefsels (Figuur 5), met zowel gedeelde als orgaanspecifieke bacteriële taxa. Zoals verwacht werd de aanwezigheid van Wolbachia gedetecteerd in beide organen, met een hogere relatieve abundantie (gebaseerd op niet-gemonteerde korte lezingen) en een gemiddelde dekking van MAG's in de eierstokken van muggen in vergelijking met de middendarmen, in overeenstemming met de observatie dat deze endosymbiont wordt overgedragen via de eierstokken en zich vervolgens verspreidt naar de somatische weefsels. Hoewel deze studie beperkt was tot monsters uit Nieuw-Caledonië, kan dit protocol het onderzoek naar de genomische variabiliteit van Wolbachia op wereldschaal vergemakkelijken, evenals de rol ervan in verschillende fenotypes, waaronder dichtheidsregulatie van zichzelf en virale bescherming. Bovendien illustreert dit werk hoe de hier gepresenteerde dissectieprocedure het onderzoek naar de taxonomische diversiteit en potentiële functionele mogelijkheden van muggensymbionten in middendarmmonsters mogelijk maakt.

We verkregen twee enterobacteriële conceptgenomen die alleen aanwezig waren in twee monsters van de middendarm, wat het ontbreken van besmetting tussen organen voor deze twee monsters bevestigt. Met betrekking tot spirocheten, die zowel in de middendarm als in de eierstokken van individu 3 worden gedetecteerd, observeerden Juma en collega's in 2020 de aanwezigheid van deze bacteriën op het oppervlak van eiervlotten. De auteurs suggereerden dat de bacteriële gemeenschappen die in de eiervlotten worden aangetroffen, voornamelijk maternale overgeërfd zouden kunnen zijn van de eierstokken, aangezien de eiervlotten werden bewaard in gedeïoniseerd en bacterievrij water. Ze konden echter de mogelijkheid van bacteriële kolonisatie direct na de ovipositie niet uitsluiten en adviseerden verder onderzoek naar het eierstokmicrobioom16.

Hoewel het oorspronkelijk is ontworpen voor exemplaren van het Culex pipiens-soortencomplex , voorzien we de toepasbaarheid van dit protocol op een bredere gemeenschap van medische entomologen die andere vectoren bestuderen, zoals Anopheles of Aedes. Door op het niveau van individuele organen te werken, kan deze methode zowel intra- als interindividuele genomische vergelijkingen mogelijk maken, waardoor inzicht wordt geboden in symbionte genomische variabiliteit op een fijne schaal, met het potentieel om vectorcontrolestrategieën te bevorderen. Deze methode van dissectie en isolatie van de speekselklieren, eierstokken en middendarm, waardoor microbiële kruisbesmetting wordt voorkomen, zou ook een nuttig protocol kunnen zijn voor studies naar de dynamiek van virale infecties in deze drie organen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

We danken Gilbert Legoff voor het leren van Jordan Tutagata hoe hij speekselklieren van muggen moet ontleden en Giuliano Mucci voor het helpen met foto's van de muggenorganen. We danken Anna-Bella Failloux en Nonito Pages voor hun nuttige discussie over het protocol. Dit werk werd ondersteund door de ERC RosaLind Starting Grant "948135" aan JR. We danken het Vectopole-platform (IRD, Montpellier) voor de technische ondersteuning en voor de kweek en het onderhoud van de muggenpopulaties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alcohol 96°Fisher scientific10332562
Binocular magnifier 
BleachRAJA145517150 tabletten van 1,5 g
DNA prep kitIlluminaWordt geleverd door het MGX-sequencingplatformVoorheen bekend als Nextera DNA Flex
DNA-RNA Shield (50 mL)Zymo researchZR1100-50Conserveringsbuffer
DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen69504DNA-extractiekit
Filter tips 20 µLStarlabS1120-3810
Filter tips 200 µLStarlabS1120-8710
Filter tips 1000 µLStarlabS1122-1730-C
ForcepsFST (Fine Science Tools)11252-20Dumont Forceps #5
Library quantification kitRocheWordt geleverd door het MGX-sequencingplatformKAPA Library Quantification Kits
Micropipettes 2-20 µLEppendorf6.291704
Micropipettes 20-200 µLEppendorf6.291703
Micropipettes 100-1000 µLEppendorf7.648488
Microscope slides EprediaJ1800BMNZafmeting: 75 mm x 50 mm
NeedlesTerumoAN*2719R1
NGS kit AgilentWordt geleverd door het MGX-sequencingplatformFragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit
NovaSeq 6000IlluminaWordt geleverd door het MGX-sequencingplatformSequencer
PBS Phosphate Buffered Saline (Steriel)Fisher scientific10212990
Permanent zwarte marker
Steriele Eppendorf Dutscher338711,5 mL
Steun voor naaldenFST (Fine Science Tools)26016-12Moria MC1 Pin Holder 12 cm

Referenties

  1. Achee, N. L., et al. Alternative strategies for mosquito-borne arbovirus control. PLOS Negl Trop Dis. 13 (1), e0006822(2019).
  2. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  3. Porter, J., Sullivan, W. The cellular lives of Wolbachia. Nat Rev Microbiol. 21 (11), 750-766 (2023).
  4. Coon, K. L., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes host communities of bacteria that are essential for development but vary greatly between local habitats. Mol Ecol. 25 (22), 5806-5826 (2016).
  5. Didion, E. M., et al. Microbiome reduction prevents lipid accumulation during early diapause in the northern house mosquito, Culex pipiens pipiens. J Insect Physiol. 134, 104295(2021).
  6. Gabrieli, P., et al. Mosquito trilogy: Microbiota, immunity and pathogens, and their implications for the control of disease transmission. Front Microbiol. 12, 630438(2021).
  7. Garrigós, M., Garrido, M., Panisse, G., Veiga, J., Martínez-de La Puente, J. Interactions between West Nile Virus and the microbiota of Culex pipiens vectors: A literature review. Pathogens. 12 (11), 1287(2023).
  8. Zheng, R., et al. Holobiont perspectives on tripartite interactions among microbiota, mosquitoes, and pathogens. ISME J. 17 (8), 1143-1152 (2023).
  9. Flores, G. A. M., et al. Wolbachia dominance influences the Culex quinquefasciatus microbiota. Sci Rep. 13 (1), 18980(2023).
  10. Hegde, S., et al. Interkingdom interactions shape the fungal microbiome of mosquitoes. Anim Microbiome. 6 (1), 11(2024).
  11. Suo, P., et al. Seasonal variation of midgut bacterial diversity in Culex quinquefasciatus populations in Haikou city, Hainan province, China. Biology. 11 (8), 1166(2022).
  12. Gruber-Vodicka, H. R., Seah, B. K. B., Pruesse, E. phyloFlash: Rapid small-subunit rRNA profiling and targeted assembly from metagenomes. mSystems. 5 (5), e00920-e00920 (2020).
  13. Graña-Miraglia, L., et al. Spirochetes isolated from arthropods constitute a novel genus Entomospira genus novum within the order Spirochaetales. Sci Rep. 10 (1), 17053(2020).
  14. Reveillaud, J., et al. The Wolbachia mobilome in Culex pipiens includes a putative plasmid. Nat Commun. 10 (1), 1051(2019).
  15. Ghousein, A., et al. pWCP is a widely distributed and highly conserved Wolbachia plasmid in Culex pipiens and Culex quinquefasciatus mosquitoes worldwide. ISME Commun. 3 (1), 40(2023).
  16. Juma, E. O., Kim, C. -H., Dunlap, C., Allan, B. F., Stone, C. M. Culex pipiens and Culex restuans egg rafts harbor diverse bacterial communities compared to their midgut tissues. Parasit Vectors. 13 (1), 532(2020).
  17. Lee, M. D. GToTree: a user-friendly workflow for phylogenomics. Bioinformatics. 35 (20), 4162-4164 (2019).
  18. Parks, D. H., et al. A complete domain-to-species taxonomy for bacteria and Archaea. Nat Biotechnology. 38 (9), 1079-1086 (2020).

Herprints en machtigingen

Tags

MuggendisbioomOrgaandissectieMetagenomische analyseMidden Darm van de mugIsolatie van het microbioomVectorbiologische bestrijdingBacteriële genomenKruiscontaminatie
Dissectie van eierstokken, middendarm en speekselklieren van muggen voor microbioomanalyses op orgaanniveau
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.