U-vormige horizontale zwemtechniek voor het bereiden van sperma van hoge kwaliteit met een lage DNA-fragmentatie-index

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor het screenen van sperma van hoge kwaliteit met een lage DNA-fragmentatie-index door gebruik te maken van de beweeglijkheidskenmerken van het sperma en thigmotaxis. De methode maakt gebruik van een U-vormige horizontale zwembaan, waardoor sperma van hoge kwaliteit de andere kant kan bereiken via bufferdruppels, terwijl dood sperma, celresten en onzuiverheden worden uitgesloten.

Samenvatting

Menselijk sperma is een complex mengsel van progressief beweeglijke spermatozoa, niet-progressief beweeglijke spermatozoa, onbeweeglijke spermatozoa, celresten en stroperig zaadplasma. Sperma van hoge kwaliteit verwijst naar progressief beweeglijke spermatozoa met een normale morfologie, die vaak een lagere DNA-fragmentatie-index (DFI) en een hoger bevruchtingspotentieel vertonen. Het bereiden van sperma van hoge kwaliteit is een cruciale stap in de door de mens geassisteerde voortplantingstechnologie. De traditionele methode voor het bereiden van sperma, discontinue dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), is tijdrovend en arbeidsintensief. Herhaalde centrifugatie kan het DNA van het sperma beschadigen, waardoor de daaropvolgende bevruchting en embryonale ontwikkeling worden beïnvloed. Deze studie introduceert een U-vormige horizontale zwemmethode (UHS) voor het bereiden van intracytoplasmatisch sperma-injectie (ICSI) sperma, die de nadelige effecten van centrifugatie op sperma-DNA aanzienlijk elimineert. De UHS-methode omvat het creëren van een UHS-baan met behulp van een bemestingsmedium in een ICSI-operatieschaal. Een microdruppel van 10 μL bevruchtingsmedium wordt op het startpunt aan de linkerkant van de UHS-baan geplaatst om het sperma vast te houden. Twee extra bufferdruppels van het bemestingsmedium van 10 μl worden met tussenpozen langs het linker middelste gedeelte van de baan geplaatst, waarbij alle druppels zijn verbonden door het bemestingsmedium. Het gerecht wordt vervolgens bedekt met kweekolie en een nacht geïncubeerd bij 37 °C met 6% CO₂ om in evenwicht te komen. Vervolgens wordt bij het startpunt 3 μL sperma aan de microdruppel toegevoegd. Spermatozoa van hoge kwaliteit zwemmen naar de rechterkant van de UHS-baan en vergemakkelijken hun afzuiging in de ICSI-injectienaald. Dood sperma, celresten en andere stroperige onzuiverheden blijven grotendeels achter op het beginpunt of in de bufferdruppels. We hebben tegelijkertijd 21 spermamonsters verwerkt met behulp van zowel UHS- als DGC-technieken en hun DFI vergeleken. De resultaten toonden aan dat de DFI in de DGC-groep 5,5% ± 3,2% bedroeg, terwijl de DFI in de UHS-groep 1,7% ± 1,1% bedroeg. Het verschil tussen de twee groepen was statistisch significant (P < 0,05).

Inleiding

Sperma-optimalisatie en spermatozoa-bereidingstechnieken spelen een cruciale rol bij het verkrijgen van celfracties verrijkt met structureel en functioneel superieure spermatozoa, wat een belangrijke stap is in de door de mens geassisteerde voortplantingstechnologie¹. Het doel van sperma-optimalisatie is: (1) Prostaglandinen, immuunactieve cellen, anti-sperma-antilichamen, immobiel sperma van lage kwaliteit, bacteriën en puin in het zaadplasma te verminderen of te verwijderen; (2) Verminder of elimineer de viscositeit van sperma; en (3) Bevorder de capaciteit van het sperma en verbeter het bevruchtingsvermogen. Een ideale techniek voor het bereiden van sperma zou een zeer functionele spermapopulatie moeten herstellen die de DNA-integriteit behoudt en geen disfunctie veroorzaakt door de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) door sperma en leukocyten².

De meest gebruikte technologie voor het bereiden van sperma is momenteel de DGC-methode. De voordelen van deze methode zijn het hoge herstelpercentage³ en de gemakkelijke standaardisatie. In de praktijk kan het flexibel worden geselecteerd op basis van de kwaliteit van het monster voor de dubbele-dichtheidsgradiëntmethode⁴, de mini-DGC-methode of de enkellaagse gradiëntcentrifugatiemethode⁵. Deze methode kan worden gebruikt om sperma van hoge kwaliteit te bereiden met een goede vitaliteit, vrij van celresten, besmette witte bloedcellen, niet-kiemcellen en gedegenereerde kiemcellen. Het nadeel van deze methode is echter dat er centrifugatie nodig is, wat schade aan het DNA van het sperma kan veroorzaken⁶.

De hier gepresenteerde methode is een bewerking van de oorspronkelijke studie van Baldini et ^al.7, die zich richtte op horizontale spermamigratie in injectieschaaltjes. Deze aangepaste methode omvat een U-vormige horizontale baan om sperma van hoge kwaliteit met een sterke vitaliteit te scheiden. Het vermijdt DNA-schade veroorzaakt door centrifugatie en minimaliseert de invloed van dood sperma, celresten en andere stroperige onzuiverheden tijdens intracytoplasmatische sperma-injectieprocedures (ICSI).

De specifieke aanpak omvat het gebruik van een bemestingsmedium om een UHS-baan te creëren in de ICSI-operatieschotel. Een microdruppel van 10 μL bevruchtingsmedium wordt op het linker startpunt van de UHS-baan geplaatst om het sperma vast te houden. Twee extra bufferdruppels van het bemestingsmedium van 10 μl bevinden zich met tussenpozen in het linker middelste gedeelte van de UHS-baan en alle druppels zijn verbonden door het bemestingsmedium. Na het afdekken van de opstelling met teeltolie, wordt de schaal een nacht geïncubeerd bij 37 °C met 6% CO₂ voor evenwicht. Vervolgens wordt 3 μL sperma toegevoegd aan de microdruppel bij het startpunt aan de linkerkant van de UHS-baan. Sperma van hoge kwaliteit zwemt naar de baan aan de rechterkant van de UHS-baan, waardoor ze gemakkelijker kunnen worden verzameld met de ICSI-injectienaald. Dood sperma, celresten en andere stroperige onzuiverheden blijven voornamelijk op de oorspronkelijke locatie of in de bufferdruppels.

De microfluïdische chip simuleert het natuurlijke selectieproces in het vrouwelijke voortplantingsstelsel, waardoor hoogwaardige sperma uit sperma optimaal kan worden geïsoleerd zonder centrifugatie. Dit is van cruciaal belang voor het verbeteren van de beweeglijkheid van het sperma⁸, het verminderen van de DNA-fragmentatie-index van het sperma⁹ en het verbeteren van zwangerschapsresultaten¹⁰. De fabricage van dergelijke apparaten is echter complex, kostbaar en uitdagend om op grote schaal te implementeren.

Het hierin beschreven protocol biedt een nieuw, eenvoudig en haalbaar alternatief. Door gebruik te maken van de beweeglijkheidskenmerken van het sperma, bereikt deze methode resultaten die vergelijkbaar zijn met die van microfluïdische technologie. Het geprepareerde sperma vertoont een sterke vitaliteit, lage DNA-fragmentatie-indices en is zeer geschikt voor gebruik in ICSI.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de Medisch Ethische Commissie van het Affiliated Huai'an First People's Hospital van de Nanjing Medical University (Goedkeuringsnummer: KY-2024-181-01). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten van wie de monsters in dit onderzoek werden gebruikt. De procedure moet worden uitgevoerd door ervaren personeel in overeenstemming met goede laboratoriumpraktijken en klinische richtlijnen ^11,12. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Bereiding van een ICSI-operatieschotel

1. Gebruik een bemestingsmedium van 20 μl om U-vormige sporen te maken in de ICSI-bedieningsschaal (Figuur 1). De lengte van de linker baan van de U-vormige baan moet ongeveer 30 mm zijn en de lengte van de rechterbaan moet ook ongeveer 30 mm zijn.
2. Zuig met een pipet 10 μL bemestingsmedium op en creëer een cirkelvormige druppel op het linker startpunt van de U-vormige baan. Verbind het met het linker startpunt van de U-vormige baan om de spermavoorraadoplossing toe te voegen.
3. Maak met tussenpozen twee bufferdruppels van 10 μL bemestingsmedium op het linker middelste gedeelte van de UHS-baan. Sluit alle druppels aan op het bemestingsmedium.
4. Maak een lange strook vloeistofdruppel aan de rechterkant van de U-vormige baan met behulp van 2,5 μL Polyvinylpyrrolidon (PVP). Zorg ervoor dat de PVP-strip evenwijdig is aan de rechterrijstrook van de U-vormige rijstrook.
5. Maak zes microdruppels met behulp van het eicelverwerkingsmedium aan de rechterkant van de PVP-strip, met 20 μL per druppel.
6. Voeg 7 ml kweekolie toe aan de schaal en zorg ervoor dat de olie het hoogste punt van de druppel bedekt. Plaats het een nacht in een 37 °C, 6% CO₂ incubator voor evenwicht.

2. Afname van spermamonsters

1. Geef patiënten duidelijke schriftelijke en mondelinge instructies met betrekking tot het afnemen van het spermamonster. Zorg ervoor dat de monsterafname voltooid is en instrueer patiënten om zich 3-7 dagen voorafgaand aan de afname te onthouden van ejaculatie.
2. Verzamel sperma via masturbatie in een wegwerpbare, steriele en niet-giftige gespecialiseerde spermaverzamelbeker. Zorg ervoor dat het volledige ejaculaat wordt verzameld en instrueer de persoon om elk verlies van een fractie van het monster te melden.
3. Controleer de namen, geldige identificatiedocumenten en vingerafdrukken van de echtgenoot van de patiënt. Markeer de naam en het medisch dossiernummer van de echtgenoot van de patiënt op het lichaam en het deksel van de sperma-afnamebeker.
4. Nadat de mannelijke patiënt sperma heeft verzameld, overhandigt u het monster face-to-face tussen het personeel en de patiënt. Neem een kleine hoeveelheid van het spermamonster voor verpakking en opslag. Zorg ervoor dat de patiënt tekent bij de verpakking.
5. Nummer en bewaar de ingekapselde exemplaren gedurende 2 jaar. Noteer patiëntinformatie, identificatienummer en handtekeningen van de ontvanger en getuigen in het logboek van de spermaverwerking.
6. Als een medewerker van het voortplantingscentrum de identiteit van een verdachte patiënt ontdekt, stop dan met het ontvangen van het monster en verifieer de identiteit van de patiënt opnieuw. Ontvang niet twee of meer exemplaren tegelijk. Als er een vermoeden van verwarring in de exemplaren bestaat, stop dan met het ontvangen ervan.

3. Analyse van het spermamonster

1. Let op de kleur van de spermamonsters.
   OPMERKING: Normaal sperma ziet er homogeen en grijsachtig wit uit na het vloeibaar maken. Sperma met een zeer lage spermaconcentratie kan transparant lijken. Als er rode bloedcellen aanwezig zijn, kan het sperma roodbruin lijken. Als de patiënt geelzucht heeft of bepaalde vitamines gebruikt, kan het sperma geel lijken.
2. Meet het spermavolume met behulp van de weegmethode, nauwkeurig tot op 0,1 ml.
3. Plaats het spermamonster gedurende 15-30 minuten bij 37 °C. Zuig het op in een plastic wegwerppipet met brede diameter (ongeveer 1,5 mm diameter), zodat het sperma door de zwaartekracht kan vallen. Let op de lengte van een draad.
   OPMERKING: Een normaal vloeibaar gemaakt ejaculaat vormt kleine, discrete druppels. Als de viscositeit abnormaal is, vormt de druppel een draad die langer is dan 2 cm.
4. Als het sperma binnen 60 minuten nog steeds niet vloeibaar wordt, voeg dan een gelijke hoeveelheid bevruchtingsmedium toe. Adem het mengsel vervolgens herhaaldelijk in en uit met behulp van een plastic wegwerppipet totdat het volledig vloeibaar is geworden.
5. Meet de pH-waarde van het sperma met behulp van precisie-pH-testpapier (pH 6,0-10,0).
6. Neem 10 μL volledig vloeibaar gemaakt sperma en druppel het op een Makler-telkamer. Evalueer de beweeglijkheid van het sperma onder een veld van 200x met een optische microscoop. Observeer de aanwezigheid van sperma-agglutinatie en niet-spermacellen.
7. Evalueer de spermaconcentratie onder een veld van 200x met een optische microscoop.

4. Eicellen oppakken

1. Maak een gerecht klaar voor het oppakken van eicellen (OPD) de dag voor het ophalen van de eicel. Voeg 2,5 ml eicelverwerkingsmedium toe aan een steriel kweekschaaltje van 35 mm. Voeg vervolgens 1,5 ml olie toe en plaats de schaal een nacht in een incubator van 37 °C om in evenwicht te komen.
2. Bereid twee gerechten voor eicelcultuur (OCS) de dag voor het ophalen van de eicel. Voeg 1 ml bemestingsmedium toe aan de binnenring van een steriele kweekschaal met centrale putjes en voeg vervolgens 1 ml olie toe. Voeg 4 ml bemestingsmedium toe aan de buitenste ring. Plaats de schaal in een incubator van 37 °C met 6% CO₂ om een nacht in evenwicht te blijven.
3. Zet alle kachels en verwarmingsplaten aan en meet de temperatuur 30 minuten voor het ophalen van de eicel.
4. Was de handen met handdesinfecterend middel en spoel grondig af met stromend water. Draag schone, steriele en stofvrije handschoenen.
5. Verwarm de steriele kweekschaal voor op een verwarmingsplatform van 37 °C.
6. Controleer strikt de identiteit van de patiënt voordat de eicel wordt opgehaald.
7. Adem follikelvloeistof in steriele reageerbuisjes in door negatieve druk en overhandig het vervolgens onmiddellijk aan laboratoriumembryologen.
8. Giet alle follikelvloeistof in steriele kweekschaaltjes en zoek naar eicelcorona cumuluscomplexen (OCCC's) onder een stereomicroscoop met een lage vergroting. Pak de OCCC's op met een pipet en plaats ze in een OPD voor tijdelijke opslag bij 37 °C.
9. Noteer de hoeveelheid, kleur, aantal follikels en aantal OCCC's in de folliculaire vloeistof.
10. Breng na het ophalen van de eicel de OCCC's over naar OCS met behulp van een steriele pasteurpipet. Plaats ze snel gedurende 2 uur in een kweekincubator (37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ en verzadigde vochtigheid).
11. Bereid een gerecht met vier putjes voor, voeg 0,5 ml hyaluronidase-oplossing toe aan het eerste putje en 1 ml eicelverwerkingsmedium aan elk van de overige drie putjes. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
12. Gebruik een pasteurpipet om OCCC's vanaf stap 4.10 gedurende 30 s over te brengen in een goed bevattend hyaluronidase. Breng de OCCC's vervolgens over in een goed bevattend eicelverwerkingsmedium.
13. Gebruik een eicelstripbuis met een diameter van 150 μm om de OCCC's te blazen en op te zuigen om granulosacellen te verwijderen. Gebruik vervolgens een nieuwe pasteurpipet om de eicellen over te brengen naar het eicelverwerkingsmedium om te wassen. Breng ze over naar een andere OCD met evenwichtstemperatuur en plaats ze in een couveuse van 37 °C met 6% CO₂ .

5. Spermaselectie en ICSI-operatie

1. Voeg 5 μL sperma toe aan de microdruppel van het bevruchtingsmedium aan het linker startpunt van de U-vormige baan in de ICSI-operatieschaal, die is bereid van stap 1.1 tot stap 1.6.
2. Plaats de ICSI-operatieschaal in een broedmachine bij 37 °C, 6% CO₂ gedurende 30-60 min.
3. Open de omgekeerde microscoop, het besturingssysteem van de microscoop en de verwarmingsfase van de stage om ervoor te zorgen dat alle bedieningselementen worden hersteld naar hun oorspronkelijke regelbare bereik, waardoor een soepele en comfortabele bediening mogelijk is.
4. Installeer de ICSI-naald in de naaldhouder. Bevestig de naaldhouder op de micromanipulator, stel de bevestigingsnaald en injectienaald in de 4x objectieflens af en pas achtereenvolgens hun hoeken en posities aan zodat de twee naalden relatief en evenwijdig aan de tafel zijn. Controleer het bewegingsbereik van de operatienaald onder de × 20 objectieflens.
5. Pas de hoek en positie van de eicelhoudernaald en injectienaald onder de 4x objectieflens aan, zodat de twee naaldkoppen relatief en evenwijdig aan de tafel zijn. Beweeg de operatienaald naar voren, naar achteren, naar links en naar rechts. Controleer het bewegingsbereik van de operatienaald onder de 10x en 20x objectieven.
6. Til de eicelbevestigingsnaald en injectienaald op om ervoor te zorgen dat de hoogte tussen de operatietafel en de verwarmingstafel het mogelijk maakt om het operatievat gemakkelijk te plaatsen zonder de operatienaald aan te raken.
7. Breng na dubbele controle de geselecteerde eicellen uit stap 4.12 over naar microdruppels van het eicelverwerkingsmedium in de ICSI-operatieschaal, één per druppel.
8. Plaats het operatieschaaltje met de eicel op het hete podium van de voorbereide microscoopoperator.
9. Pas de brandpuntsafstand van de microscoop onder de 10x objectieflens aan om de randen van de microdruppels in de operatieschaal duidelijk en zichtbaar te maken.
10. Laat de injectienaald in de PVP-strip van de ICSI-operatieschotel zakken. Stel de microscoop zo af dat de injectienaald duidelijk zichtbaar is en inhaleer tegelijkertijd een kleine hoeveelheid PVP in de injectienaald.
11. Beweeg de injectienaald in de lange strook aan de rechterkant van de U-vormige baan en extraheer spermatozoa van hoge kwaliteit met een goede morfologie en progressieve beweeglijkheid.
12. Breng het sperma over in de PVP-strip aan de rechterkant en plaats het sperma op de bodem van de operatieschaal.
13. Druk de injectienaald voorzichtig in het middelste of onderste deel van de spermastaart, trek de injectienaald snel terug en krab aan het sperma om het te laten stoppen.
14. Adem het sperma van de staart tot de kop in de injectienaald in.
15. Breng de injectienaald over in de druppel van het eicelverwerkingsmedium die de eicel aan de rechterkant bevat.
16. Laat de eicelbevestigingsnaald zakken en beweeg de eicel voorzichtig om het eerste poollichaam op 12 uur te positioneren, waarbij de eicel wordt vastgezet.
17. Stel de microchirurgische naald en het eicelmembraan in op hetzelfde horizontale vlak. Duw het sperma naar de punt van de injectienaald.
18. Ga verticaal door de zona pellucida op 3 uur op de eicel en blijf de naald injecteren totdat deze het midden van de eicel bereikt of de middenpositie iets kruist, met een lichte terugtrekking van de injectienaald.
    OPMERKING: Wanneer snelle reflux optreedt in het cytoplasma en het sperma, geeft dit aan dat het eicelmembraan is gebroken en de aspiratie is gestopt.
19. Injecteer langzaam sperma in het cytoplasma van de eicel en verlaat de injectienaald. De diepte van de sperma-injectie in het cytoplasma moet ongeveer 50%-75% van de eiceldiameter zijn.
20. Pas na het terugtrekken van de injectienaald de onderdruk van de eicelbevestigingsnaald aan om de eicellen vrij te maken.
21. Herhaal de bovenstaande stappen totdat alle rijpe eicellen zijn geïnjecteerd.
22. Breng de ICSI-schaal over van de warmhoudplaat van de microscoop naar de snijmicroscoop.
23. Haal de decolletécultuurschaal uit de broedmachine.
24. Breng de geïnjecteerde spermacel over naar een microdruppel in een splitsingskweekschaaltje.
25. Plaats de snijcultuurschaal terug in een broedmachine van 37 °C, 6% CO₂, 5% Ø₂ .

6. Bereiding van sperma met behulp van de DGC-methode

1. Voeg 1,5 ml centrifugatieoplossing met een dichtheidsgradiënt van 45% toe aan een steriele reageerbuis met conische bodem van 15 ml.
2. Voeg langzaam 1,5 ml centrifugatieoplossing met 90% dichtheidsgradiënt toe aan de bodem van de centrifugatieoplossing met 45% dichtheidsgradiënt, waarbij de interface tussen de twee vloeistoffen behouden blijft.
3. Voeg het vloeibare sperma voorzichtig toe aan de gradiëntcentrifugatieoplossing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 300 x g (bij kamertemperatuur).
4. Verwijder het bovenstaande en voeg ongeveer 0,5 ml van het resterende spermasediment toe aan 3 ml bevruchtingsmedium. Blaas en meng goed.
5. Centrifugeer bij kamertemperatuur bij 200 x g gedurende 5 min.
6. Pipetteer het bovenstaande en laat ongeveer 0,2 ml sediment achter.
7. Voeg een geschikte hoeveelheid bevruchtingsmedium toe om het sediment te resuspen, tel de spermaconcentratie en vitaliteit en registreer. Plaats in een 37°C, 6% CO2 incubator voor later gebruik.

7. Detectie van de nucleaire DNA-integriteit van het sperma (Sperm Chromatin Dispersion Method, SCD)

1. Stel de binnentemperatuur in op 20-28 °C voordat u het experiment uitvoert. Verwijder de reagenskit en laat deze 30-60 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen.
2. Bereid de denatureringsoplossing voor: Neem 0,8 ml geconcentreerde denatureringsoplossing en voeg deze toe aan 100 ml gedestilleerd water.
3. Bereid de 70% ethanoloplossing voor: Neem 26,65 ml gedestilleerd water en 70,35 ml watervrije ethanol om de 70% ethanoloplossing te bereiden.
4. Bereid de 90% ethanoloplossing voor: Neem 9,55 ml gedestilleerd water en 90,45 ml watervrije ethanol om de 90% ethanoloplossing te bereiden.
5. Plaats de agarosebuis met een laag smeltpunt (met 25 μL agaroseoplossing met een laag smeltpunt) gedurende 1-2 minuten in een waterbad van 90-100 °C totdat de agarosegel volledig is gesmolten. Plaats de buis vervolgens gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C tot de temperatuur constant is.
6. Neem 3-10 μL sperma vóór de optimalisatiebehandeling en spermasuspensie na de optimalisatiebehandeling. Voeg ze toe aan agarosebuisjes met een laag smeltpunt en meng vervolgens grondig.
7. Neem 30 μL van de agarosesuspensie met een laag smeltpunt die sperma bevat en laat deze in horizontale positie op een voorbehandeld glasplaatje vallen.
8. Bedek het dekglas (22 mm x 11 mm) voorzichtig met de schuif en vermijd de vorming van luchtbellen zoveel mogelijk.
9. Plaats de voorbehandelde glasplaat gedurende 4 minuten in een koelkast bij 2-8 °C en houd de dia gedurende het hele proces in een horizontale positie. Verwijder de glasplaat uit de koelkast en schuif voorzichtig om het afdekglas te verwijderen.
10. Dompel de voorbehandelde glasplaat snel 7 minuten onder in de denatureringsoplossing.
11. Verwijder de voorbehandelde glasplaat en laat deze 5 s in gedestilleerd water weken.
12. Verwijder de voorbehandelde glasplaat en laat hem rechtop staan. Gebruik filterpapier om eventuele waterdruppels op het oppervlak van de objectglaasje te absorberen en vermijd het aanraken van het monstergebied.
13. Dompel het voorbehandelde glasplaatje onder in de lysisbuffer en reageer nauwkeurig gedurende 20 minuten.
14. Dompel de voorbehandelde fragmenten 3 minuten onder in de wasoplossing om de lysisoplossing weg te spoelen.
15. Verwijder de voorbehandelde glasplaat en dompel deze 2 minuten onder in een 70% ethanoloplossing.
16. Verwijder de voorbehandelde glasplaat en dompel deze 2 minuten onder in een 90% ethanoloplossing.
17. Verwijder de voorbehandelde glasplaat en dompel deze 2 minuten onder in watervrije ethanoloplossing.
18. Verwijder de voorbehandelde glasplaat en laat deze op natuurlijke wijze aan de lucht drogen.
19. Bereid de Wright-kleurstofoplossing A en oplossing B in een bruine lege fles in een verhouding van 1:1.
20. Plaats het voorbehandelde glasplaatje horizontaal en voeg de gemengde kleurstofoplossing toe aan het objectglaasje, zorg ervoor dat de verfoplossing het hele glaasje bedekt (ongeveer 0.5-1 ml verfoplossing).
21. Spoel na 5 minuten vlekken de glas-in-looddia 10-15 keer voorzichtig af met gedestilleerd water om overtollig kleurmiddel te verwijderen.
22. Laat het glasplaatje op natuurlijke wijze drogen en observeer het onder een optische microscoop op 400×. Tel meer dan 200 spermacellen en bepaal het percentage abnormaal sperma met kleine haloringen, geen haloringen en degeneratie.

8. Statistische analyse

1. Voer statistische analyses uit met behulp van in de handel verkrijgbare software.
2. Vergelijk de DFI (%) tussen origineel sperma, DGC en UHS met behulp van de Friedman-test.
   OPMERKING: Gebruik voor paarsgewijze vergelijkingen van twee methoden de Wilcoxon signed-rank-test. Beschouw een p-waarde ≤ 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

De UHS- en DGC-methoden werden gebruikt om de behandeling van 21 monsters te optimaliseren en de DNA-fragmentatie-index van het sperma tussen de twee methoden te vergelijken. De methode met behulp van de UHS-baan in de ICSI-schaal kan DGC vervangen, wat schade aan sperma kan veroorzaken. Sperma van hoge kwaliteit met een goede progressieve beweeglijkheid zwemt soepel langs de rand van de U-vormige baan (Figuur 2), waardoor het voor de ICSI-naald gemakkelijke...

Discussie

De belangrijkste stap bij het scheiden van sperma van hoge kwaliteit met behulp van de UHS-methode die in dit artikel wordt beschreven, is het opzetten van een UHS-baan met bufferdruppels. Zowel de UHS-baan als de bufferdruppels worden gemaakt met behulp van gewassen en ontvangen sperma. De UHS-baan begeleidt sperma van hoge kwaliteit om vrij te zwemmen en zich op te hopen langs de rand van de baan, waardoor het gemakkelijk te verzamelen is. De bufferdruppels verminderen de viscositeit v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7% Polyvinyl pyrrolidone Solution	Vitrolife Sweden AB	10111	ICSI
Aspirator	LABOTECT	-	Aspirator
Biological clean workbench	Suzhou Antai	-	Biologische schone werkbank
Blastocyst culture medium	Vitrolife Sweden AB	10132	Blastocyst culture medium
Cleavage culture medium	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 incubator	Thermo Scientific	-	CO2 incubator
Culture oil	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
Disposable plastic transfer pipette	BD Falcon	357575	wegwerpbare kunststof overdrachtpipet
Fertilization medium	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI operating dish	BD Falcon	351006	Petrischaal
Instant hyaluronidase	Vitrolife Sweden AB	10017	Instant hyaluronidase
Inverted microscope	NIKON	-	Omgekeerd microscoop
IVF Workstation	Denmark K-SYSTEM	-	IVF Workstation
Makler counting chamber	Sefi Medical Instruments		Makler tellingkamer
Micro operating system	NIKON	-	Micro operating systeem
Oocyte processing medium	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
Optical microscope	OLYMPUS	-	Optische microscoop
Phase contrast microscope	NIKON	-	Phase contrast microscoop
Sperm Counting Board	Markler	-	Spermatellingbord
Sperm gradient separation solution	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
Sperm nucleus DNA integrity Kit	Shenzhen HuaKang	-	Spermakern DNA-integriteitskit (SCD)
Stereoscopic microscope	NIKON	-	Stereoscopisch microscoop
Tabletop centrifuge	HETTICH	-	Tabelcentrifuge
Thermostatic test tube rack	GRANT	-	Thermostatisch buisjesrek
Tri-gas incubator	ASTEC	-	Tri-gas incubator