MultiBac-systeemgebaseerde zuivering en biofysische karakterisering van humaan myosine-7a

Summary

Dit protocol beschrijft de procedures voor het recombinant produceren van het humaan myosine-7a holo-enzym met behulp van het MultiBac Baculovirus-systeem en voor het bestuderen van de beweeglijkheid ervan met behulp van een op maat gemaakte in vitro filament glijdende test.

Abstract

Myosine-7a is een op actine gebaseerd motoreiwit dat van vitaal belang is voor auditieve en visuele processen. Mutaties in myosine-7a leiden tot Ushersyndroom type 1, de meest voorkomende en ernstige vorm van doofblindheid bij de mens. Er wordt verondersteld dat myosine-7a een transmembraanadhesiecomplex vormt met andere Usher-eiwitten, essentieel voor de structureel-functionele integriteit van fotoreceptor- en cochleaire haarcellen. Vanwege de uitdagingen bij het verkrijgen van puur, intact eiwit, blijven de exacte functionele mechanismen van humaan myosine-7a echter ongrijpbaar, met beperkte structurele en biomechanische studies beschikbaar. Recente studies hebben aangetoond dat myosine-7a van zoogdieren een multimeer motorcomplex is dat bestaat uit een zware keten en drie soorten lichte ketens: regulerende lichte keten (RLC), calmoduline en calmoduline-achtig eiwit 4 (CALML4). In tegenstelling tot calmoduline bindt CALML4 niet aan calciumionen. Zowel de calciumgevoelige als de ongevoelige calmodulines zijn van cruciaal belang voor myosine-7a van zoogdieren voor een goede fijnafstemming van de mechanische eigenschappen. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om recombinant humaan myosine-7a holo-enzym te produceren met behulp van het MultiBac Baculovirus-eiwitexpressiesysteem. Dit levert milligrammen zeer zuiver eiwit van volledige lengte op, waardoor de biochemische en biofysische karakterisering ervan mogelijk is. Verder presenteren we een protocol voor het beoordelen van de mechanische en beweeglijke eigenschappen met behulp van op maat gemaakte in vitro motiliteitstesten en fluorescentiemicroscopie. De beschikbaarheid van het intacte humane myosine-7a-eiwit, samen met het gedetailleerde functionele karakteriseringsprotocol dat hier wordt beschreven, maakt de weg vrij voor verder onderzoek naar de moleculaire aspecten van myosine-7a in zicht en gehoor.

Introduction

Myosines zijn moleculaire motoreiwitten die interageren met actine om tal van cellulaire processen aan te sturen 1,2,3,4. Mensen bezitten 12 klassen en 39 myosine-genen⁵, die betrokken zijn bij een breed scala aan fysiologische functies, zoals spiercontractie⁶ en sensorische processen⁷. Elk myosinemolecuul is een multimeer complex dat bestaat uit een zware keten en lichte ketens. De zware ketting is verdeeld in kop-, nek- en staartregio's. De kop bevat actine- en nucleotidebindingsplaatsen die verantwoordelijk zijn voor ATP-hydrolyse en het genereren van kracht op actinefilamenten². De nek wordt gevormd door verschillende α-spiraalvormige IQ-motieven waarbij een specifieke set lichte kettingen is gebonden. Ze fungeren samen als een hefboomarm om de conformationele veranderingen van de motor te versterken tot grote bewegingen ^8,9,10. De staart bevat klasse-specifieke subdomeinen en speelt een regulerende rol bij het afstemmen van de motorische activiteit van myosine en het bemiddelen van interacties met cellulaire bindingspartners ^2,11.

Humaan myosine-7a, een lid van klasse 7 myosines, is essentieel voor auditieve en visuele processen ^12,13. De IQ-motieven van humaan myosine-7a worden geassocieerd met een unieke combinatie van lichte ketens, waaronder de regulerende lichte keten (RLC), calmoduline en calmoduline-achtig eiwit 4 (CALML4)14,15,16. Naast het stabiliseren van de hefboomarm, reguleren deze lichte ketens de mechanische eigenschappen van myosine-7a als reactie op calciumsignalering, een kenmerk dat uniek lijkt te zijn voor de isovorm van zoogdier¹⁴.

Defecten in het gen dat codeert voor de zware myosine-7a-keten (MYO7A/USH1B) zijn verantwoordelijk voor syndroom van Usher type 1, de ernstigste vorm van gecombineerd gezichts- en gehoorverlies bij de mens¹⁷. Bovendien is het lichte ketengen CALML4 een van de kandidaatgenen die in kaart zijn gebracht om het causale allel voor USH1H te bevatten, een andere variant van type 1 Ushersyndroom ^15,18. In het netvlies komt myosine-7a tot expressie in het retinale pigmentepitheel en fotoreceptorcellen¹³. Het is betrokken bij de lokalisatie van melanosomen in het retinale pigmentepitheel (RPE)¹⁹ en fagocytose van de buitenste segmentschijven van de fotoreceptor door de RPE-cellen²⁰. In het binnenoor wordt myosine-7a voornamelijk aangetroffen in de stereocilia, waar het een cruciale rol speelt bij het tot stand brengen van haarbundels en bij het afschermen van het mechano-elektrische transductieproces 12,21,22.

Hoewel het belang van myosine-7a in sensorische cellen goed is ingeburgerd, blijven de functionele mechanismen op moleculair niveau slecht begrepen. Deze lacune in kennis is deels te wijten aan de uitdagingen bij het zuiveren van het intacte eiwit, met name de isovorm van zoogdieren. Onlangs is er aanzienlijke vooruitgang geboekt met behulp van het MultiBac-systeem om het volledige menselijke myosine-7a holo-enzym¹⁴ recombinant tot expressie te brengen. Deze vooruitgang heeft structurele en biofysische karakteriseringen van dit motoreiwit mogelijk gemaakt, wat heeft geleid tot de ontdekking van verschillende unieke eigenschappen van humaan myosine-7a die specifiek zijn aangepast voor auditieve functies van zoogdieren^14,23.

Het MultiBac-systeem is een geavanceerd baculovirus/insectencelplatform dat speciaal is ontworpen voor de expressie van eukaryote multimere complexen^24,25. Een belangrijk kenmerk van dit systeem is het vermogen om meerdere genexpressiecassettes te hosten, die elk coderen voor een subeenheid van het complex, binnen een enkel MultiBac-baculovirus. De assemblage van de multigenexpressiecassettes wordt vergemakkelijkt door een zogenaamde vermenigvuldigingsmodule: een homing endonuclease (HE) site en een matching ontworpen BstXI site die de meerdere kloonsites (MCS) flankeert. Deze module maakt de iteratieve assemblage van een enkele expressiecassette mogelijk door middel van beperking/ligatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van het feit dat de HE- en BstXI-beperkingssites worden geëlimineerd bij hun ligatie. In dit artikel worden menselijke myosine-7a zware ketens, RLC, calmoduline en CALML4 elk gekloond in de vermenigvuldigingsmodule binnen de pACEBac1-vector (Figuur 1A), die vervolgens via het iteratieve proces worden samengevoegd tot een multigenexpressiecassette (Figuur 1B). De myosine-7a-multigencassette is geïntegreerd in het baculovirale genoom (bacmid) door de transpositie van het mini-Tn7-element van de pACEBac1-vector naar de mini-attTn7-doelplaats in het genoom (Figuur 1C). Na procedures voor bacmidezuivering, baculovirusproductie en amplificatie (Figuur 1D,E) wordt het recombinante myosine-7a MultiBac-baculovirus bereid en kan het worden gebruikt voor grootschalige eiwitproductie (Figuur 1F). Bovendien kunnen de myosine-7a lichte ketens afzonderlijk worden geproduceerd in E. coli en worden gezuiverd met behulp van een splitsbare His6-SUMO-tag 26,27,28. De gezuiverde lichte ketens zijn nuttig voor het bestuderen van hun bindingsdynamiek en regulatie van myosine-7a.

Het gezuiverde myosine-7a-eiwit kan worden onderworpen aan structurele, biochemische en biofysische studies om inzicht te krijgen in de structureel-functionele regulatie van dit motoreiwit. Bovendien kunnen de interacties met het actinenetwerk en andere bindende eiwitten²⁹ worden onderzocht met behulp van een verscheidenheid aan in vitro reconstitutiebenaderingen. Bevindingen van deze analyses zullen de biofysische eigenschappen van dit myosine informeren, wat leidt tot een mechanistisch begrip van hoe myosine-7a de cytoskeletveranderingen aanstuurt en uiteindelijk de unieke morfologie en functie van sensorische cellen vormt. In dit artikel beschrijven we een workflow voor de glijdende test van actinefilamenten die specifiek is aangepast voor myosine-7a van zoogdieren. De glijdende test van actinefilamenten is een robuuste in vitro motiliteitstest die kwantitatief de beweging bestudeert van fluorescerende actinefilamenten die worden voortgestuwd door een groot aantal myosinemotoren die zijn geïmmobiliseerd op een dekglaasoppervlak 30,31,32. De voordelen van deze test zijn onder meer de eenvoud van de installatie, de minimale apparatuurvereisten (een breedveldfluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera) en de hoge reproduceerbaarheid. Bovendien, omdat de beweging van actinefilamenten wordt aangedreven door een cluster van geïmmobiliseerde myosinemotoren, is deze test bijzonder nuttig voor het bestuderen van de beweeglijkheid van monomere myosines zoals myosine-7a ^14,33. De protocollen omvatten verschillende aanpassingen, van experimentele procedures tot beeldvormingsanalyse, specifiek afgestemd op de unieke beweeglijke eigenschappen van zoogdiermyosine-7a. Met de beschikbaarheid van intact myosine-7a-eiwit en het functionele karakteriseringsprotocol dat hier wordt beschreven, legt dit artikel de basis voor verder onderzoek naar de moleculaire rol van myosine-7a in zowel fysiologische als pathologische processen.

Protocol

OPMERKING: Hier beschrijven we een protocol voor het synthetiseren van het intacte menselijke myosine-7a holo-enzym en het karakteriseren van de beweeglijkheid ervan in vitro. Dit protocol is verdeeld in drie secties: ten eerste, het tot expressie brengen van het menselijke myosine-7a met behulp van het MultiBac baculovirus-eiwitexpressiesysteem; Ten tweede, het afzonderlijk zuiveren van myosine-7a lichte ketens met behulp van het E.coli His6-SUMO-systeem; en tot slot, het bestuderen van de beweeglijkheid van humaan myosine-7a met behulp van de actine-filament gliding assay.

1. MultiBac-systeemgebaseerde productie van myosine-7a-complex

1. Het creëren van een baculovirus-multigencassette voor het tot expressie brengen van humaan myosine-7a-complex (16 dagen)
   OPMERKING: Er is één klooncyclus (4 dagen) nodig om de cDNA's van myosine-7a-subeenheden in de pACEBac1-vectoren in te voegen en drie klooncycli om de stapsgewijze ligatie van alle vermenigvuldigingsmodules die nodig zijn voor het tot expressie brengen van het myosine-7a-complex te voltooien, wat resulteert in een totaal van 16 dagen.
   1. Kloon de cDNA's die coderen voor de zware myosine-7a-keten (HC), calmoduline, CALML4 en RLC in de pACEBac1-vectoren met behulp van een commerciële kit volgens de protocollen van de fabrikant (zie Tabel met materialen; Figuur 1A). Een FLAG-tag wordt ingebracht aan de C-terminus van de myosine-7a HC om te helpen bij de zuivering.
      OPMERKING: Zoogdiermyosine-7a wordt geproduceerd als twee splicing-isovormen, die alleen verschillen door een segment van 11 aminozuren aan de N-terminus²³. Deze korte N-terminale extensie speelt een cruciale rol bij het reguleren van de ATPase-activiteit van myosine-7a¹⁴. Het is aangetoond dat het toevoegen van een N-terminale tag de normale regulatie door deze N-terminale extensie kan verstoren en de enzymatische activiteit en beweeglijkheid van de motor aanzienlijk kan verminderen¹⁴. Daarom wordt een C-terminale FLAG-tag gebruikt om te voorkomen dat de natuurlijke regulatie van het eiwit wordt verstoord.
   2. Construeer de multigenexpressiecassette voor het myosine-7a-holo-enzym met behulp van homing-endonuclease/BstXI-vermenigvuldiging zoals hieronder beschreven (Figuur 1B).
      OPMERKING: De homing endonuclease I-CeuI produceert samenhangende uiteinden die compatibel zijn met de uiteinden die worden gegenereerd door de BstXI-digest. Bij ligatie wordt een homing endonuclease/BstXI hybride restrictieplaats gecreëerd die door geen van beide enzymen kan worden doorgesneden. Dezelfde procedure kan worden herhaald om meer vermenigvuldigingsmodules te integreren. Als er meerdere restrictieplaatsen voor I-CeuI en BstXI aanwezig zijn op de insert- of vectorconstructies, moeten deze extra plaatsen worden geëlimineerd door site-directed mutagenese om ervoor te zorgen dat de I-CeuI- en BstXI-snijlocaties uniek zijn.
   3. Voorbereiding van de inzet: Vermaal het insertconstruct (bijv. pACEBac-M7a HC) met het homing-endonuclease I-CeuI (zie Materiaaltabel) en zuiver vervolgens het gelineariseerde plasmide met behulp van een PCR-zuiveringskit (zie Materiaaltabel). Verder verteert u het gelineariseerde plasmide met BstXI (zie Tabel met materialen), scheidt u het fragment met de genexpressiecassette met behulp van gelelektroforese en zuivert u het met behulp van een Gel Extraction Kit (zie Tabel met materialen).
      OPMERKING: I-CeuI en BstXI vereisen verschillende buffercondities, volgens de protocollen van de fabrikant, om 100% activiteit te bereiken. Bovendien vereist een volledige snede met I-CeuI minimaal 3 uur, terwijl BstXI slechts 15 minuten incubatietijd vereist. De vergistingen moeten dus opeenvolgend worden uitgevoerd.
   4. Vectorvoorbereiding: Lineariseer het vectorconstruct (bijv. pACEBac-CaM) door middel van BstXI-digestie. Alkalische fosfatase is opgenomen in het vectorpreparaat om te voorkomen dat het vectorplasmide aan zichzelf bindt (zie Tabel met materialen). Verkrijg het vergistingsproduct door elektroforese en zuiver het met een Gel Extraction Kit.
   5. Ligatie: Ligate de met I-CeuI/BstXI behandelde insert en de met BstXI behandelde vector met T4 DNA-ligase (zie Tabel met materialen). Voer ligatiereacties uit bij kamertemperatuur (20 °C -25 °C) gedurende 10 minuten met een massaverhouding van 1:1 van het invoeg-DNA tot vector-DNA, waarbij de totale massa dicht bij 100 ng blijft bij elke ligatiereactie.
   6. Transformatie en plasmideanalyse: Transformeer de ligatiemengsels in DH5α-cellen (zie Materiaaltabel) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en screen de positieve kolonies op gentamicineresistentie. Zuiver de plasmiden met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie Materiaaltabel) en controleer de juiste klonen (bijv. plasmiden die zowel M7a HC als CaM bevatten) op basis van specifieke restrictieverteringspatronen en DNA-sequentiebepaling van de inserts.
   7. Integratie van meerdere genexpressiecassettes: Herhaal stap 1.1.2 tot en met 1.1.6 om extra gencassettes te integreren die andere myosine-7a-subeenheden tot expressie brengen.
2. Productie en zuivering van recombinant bacmide-DNA (4 dagen; Figuur 1C).
   OPMERKING: Dag 1 - Bacteriële transformatie en groei van getransformeerde kolonies. Dagen 2-3 - Groeiende kolonies en screening op succesvolle transformatie. Dag 3 - Selecteren en strepen van positieve kolonies, beginnen met nachtelijke inoculatie. Dag 4 - Zuivering van bacmid DNA.
   1. Transformeer DH10Bac-competente cellen (zie Materiaaltabel) met 1 ng van het gesequencede pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM-plasmide volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
   2. Plaat 20-200 μl van de cellen op een agarplaat met 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine, 10 μg/ml tetracycline, 100 μg/ml gehalogeneerd indolyl-β-galactoside en 40 μg/ml IPTG (zie materiaaltabel) en incubeer de plaat bij 37°C gedurende 48 uur om de ontwikkeling van een diepblauwe kleur in negatieve klonen mogelijk te maken.
      OPMERKING: De gehalogeneerde indolyl-β-galactoside kleurt kolonies die LacZ blijven uitdrukken (wat aangeeft dat de transpositie niet succesvol was), waardoor de selectie van witte kolonies mogelijk is waar de transpositie succesvol was.
   3. Selecteer zorgvuldig een geïsoleerde witte kolonie en kweek 's nachts cellen in 5 ml LB-medium met 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine en 10 μg/ml tetracycline bij 37 °C in een orbitale shaker bij 225 rpm.
   4. Centrifugeer de cultuur bij 2.465 x g gedurende 10 minuten om de E coli te pelleteren. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 300 μL Buffer P1 uit de kit.
      OPMERKING: Hoewel hier buffers van de Miniprep-kit worden gebruikt, wijkt het protocol voor het zuiveren van het bacmid-product af van het protocol dat bij de kit wordt geleverd.
   5. Voeg 300 μL van de Buffer P2 uit de kit toe. Meng door de buisjes een paar keer om te keren en incubeer vervolgens 3 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Voeg 300 μL van de N3-buffer uit de kit toe en meng door inversie om de lysisreactie te stoppen. Centrifugeer bij 17.885 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   7. Breng het supernatans over in een schone steriele buis en herhaal het centrifugeren nog eens 10 minuten.
   8. Breng 800 μl van het supernatans over in een andere steriele microcentrifugebuis van 1,7 ml (zie materiaaltabel) en voeg 600 μl koude isopropanol toe (zie materiaaltabel) en meng door middel van rigoureuze inversie. Centrifugeer vervolgens bij 17.885 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
   9. Gooi het supernatans weg en zoek de kleine, witte korrel. Was de pellet met 800 μL koude 70% ethanol (zie Materiaaltabel) en centrifugeer op 17.885 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voeg voorzichtig ethanol toe langs de buiswand om verstoring van de pellet te voorkomen.
   10. Gooi het supernatans weg en herhaal de ethanolwasbeurt een keer. Laat de pellet 5 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Zuig overtollige vloeistof indien nodig voorzichtig op.
   11. Los de pellet op met 20 μL EB-buffer uit de Kit. Zorg ervoor dat de pellet volledig is opgelost door op de buis te tikken of voorzichtig te mengen door te pipetteren. Bepaal de concentratie met behulp van een spectrofotometer (zie Tabel met materialen).
   12. Pas het buffervolume indien nodig aan om de bacmideconcentratie op ongeveer 1 μg/μL te brengen. Bewaar baamide-DNA bij 4 °C tot het klaar is voor de productie van het P0-virus.
       OPMERKING: De gezuiverde bacmid kan op 4 °C worden bewaard en blijft enkele maanden werkzaam. We hebben succesvolle transfecties gezien met bacmideproducten tot 1 jaar oud. Als alternatief kan de bacmide worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C. Meerdere vries-/dooicycli moeten worden vermeden omdat ze de transfectie-efficiëntie verminderen.
3. Transfecte Sf9-insectencellen met bacmide om recombinant baculovirus te produceren (6 dagen; Figuur 1D)
   OPMERKING: Dag 1 - Transfectie van cellen met bacmide-DNA. Dag 2-6 - Observeer de groei en expressie van cellen. Dag 6 - Verzameling van het P0-virus.
   1. Voeg Sf9-cellen in kweekmedia (zie Materiaaltabel) toe aan een plaat met 6 putjes in een concentratie van 0,33 x 10⁶ cellen/ml met 3 ml per putje. Laat de plaat 30 minuten op kamertemperatuur staan zodat de cellen zich aan de bodem van de plaat kunnen hechten.
   2. Bereid voor elk putje een transfectiemengsel door 10 μl kationische lipidetransfectiereagens (zie materiaaltabel) te combineren met 250 μl verbeterd Minimal Essential Medium (MEM)-medium (zie Materiaaltabel) in een steriele microcentrifugebuis. Meng door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
   3. Voeg 1 μg (op basis van de in stap 1.2.12 bepaalde concentratie) onverdund myosine-7a-baamide toe aan het transfectiemengsel. Meng door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
   4. Verdeel het hele DNA-lipidenmengsel gelijkmatig druppelsgewijs over de putjes. Laat een putje over voor niet-getransfecteerde cellen als negatieve controle.
   5. Sluit de plaat met 6 putjes af met folie (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 6 dagen bij 27 °C. Observeer groei en onthechting gedurende deze tijd. Als er een fluorescerend label op het construct aanwezig is, controleer dan op fluorescentieontwikkeling (Figuur 2).
   6. Wanneer de getransfecteerde cellen tekenen van een infectie in een laat stadium vertonen, brengt u het medium met het virus uit de geïnfecteerde putjes over in een kegelvormige buis van 15 ml en centrifugeert u gedurende 10 minuten op 805 x g .
   7. Breng het supernatans over in een schone conische buis van 15 ml, wikkel het in aluminiumfolie en bewaar het bij 4 °C. Dit product is nu het P0-virus en kan naar onze ervaring tot vier maanden effectief worden bewaard en gebruikt.
4. Versterken baculovirus voorraad (3-5 dagen ; Figuur 1E)
   1. Bereid 100 ml (of het gewenste volume) Sf9-cellen in een concentratie van 2 x 10⁶ cellen/ml in Sf9-celkweekmedia in een erlenmeyer van 250 ml (zie Materiaaltabel).
   2. Voeg een verhouding van 1:100 (v/v) P0-virusvoorraad toe aan de Sf9-celsuspensiecultuur en incubeer bij 27 °C in een orbitale shaker bij 135 tpm.
   3. Bewaak de groei elke 24 uur totdat de cellen ~90% celdood bereiken. Eenmaal in dit bereik, centrifugeert u de celsuspensie bij 500 x g gedurende 10 minuten en verzamelt u het supernatans dat het P1-virus bevat.
   4. Filtreer het supernatans met behulp van 0,22 μm vacuümfiltratie (zie Tabel met materialen). Bewaar het gefilterde product in het donker en bewaar het bij 4 °C. Dit product is nu het P1-virus.
      OPMERKING: De virustiter neemt af bij langdurige opslag bij 4 °C. Overweeg om nieuwe virusvoorraad te maken als deze langer dan 4 maanden is bewaard, of titer de virusvoorraad voor gebruik in expressie³⁴.
5. Eiwitexpressie (60 -72 uur tussen het begin van de expressie en het verzamelen van de celpellet; Figuur 1E)
   1. Bereid in de logfase groeiende Sf9-cellen voor in een concentratie van 2 x 10⁶ cellen/ml en voeg P1-virus toe in een verhouding van 12 ml virus tot 300 ml celsuspensie.
      OPMERKING: De eiwitopbrengst is ongeveer 1 mg/L. Het wordt aanbevolen om minimaal 1,5 L celsuspensie te gebruiken voor deze eiwitexpressie.
   2. Kweek de cellen bij 27 °C in een orbitale shaker bij 135 tpm gedurende ongeveer 60 uur.
      OPMERKING: Kleine monsters kunnen op verschillende tijdstippen worden verzameld en geanalyseerd met behulp van SDS-gels om de eiwitexpressieniveaus te beoordelen. Bovendien, als de eiwitten zijn versmolten met fluorescerende tags, kunnen expressieniveaus worden geëvalueerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. De cellen moeten uiterlijk bij het begin van de celdood worden geoogst.
   3. Centrifugeer de celsuspensie bij 3.735 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren. De pellets kunnen worden opgeslagen bij -80 °C tot verder gebruik of worden bewaard voor langdurige opslag. We gebruiken celpellets meestal binnen enkele weken, maar hebben enkele maanden na het invriezen het actieve eiwit teruggewonnen.
6. Eiwitzuivering (2 dagen ; Figuur 1F)
   OPMERKING: Dag 1 - Eiwitextractie en -zuivering met behulp van FLAG-affiniteitschromatografie. Dag 2 - Aliquot en bevriezing van monsters na nachtelijke dialyse. Het hieronder beschreven protocol is voor het zuiveren van myosine-7a uit 1,5 L celpellets.
   1. Bereid Master Buffer voor met 10 mM MOPS (pH 7,2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 μg/ml leupeptine en 100 μg/ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Filtreer het met een filter met een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar de buffer bij 4 °C (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: PMSF is onstabiel in waterige oplossingen. Bereid de PMSF-bouillonoplossing als 1 M in 100% ethanol en bewaar deze maximaal 6 maanden bij -20 °C.
   2. Bereid 75 ml extractiebuffer voor door de Master Buffer aan te vullen met 3 EDTA-vrije proteaseremmertabletten, 2 mM ATP en 0,1 mM dithiothreitol (DTT; zie Materiaaltabel).
   3. Voeg 75 ml extractiebuffer toe aan de pellet terwijl deze nog bevroren is. Laat de pellet in de extractiebuffer op ijs staan tot deze ontdooid is. Gebruik een serologische pipet om de pellet te breken om het ontdooiproces te versnellen.
   4. Gebruik een punt van 1/2-inch (13 mm) om de resuspensie gedurende 10 minuten op ijs te sonificeren met een amplitude van 50%, 5 s aan, 5 s uit.
   5. Centrifugeer het totale lysaat bij 33.746 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Bereid tijdens het centrifugeren 1,5 ml FLAG-hars voor door 3 ml van de 50% slurry Anti-FLAG-affiniteitshars (zie Materiaaltabel) te wassen met 40 ml PBS. Pelleteer de hars door te centrifugeren op 800 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder de PBS voorzichtig zonder de hars te verstoren.
   6. Voeg het supernatans van de lysaatcentrifugatie toe aan de gewassen hars en incubeer met continue rotatie bij 4 °C gedurende 1 uur.
   7. Pelleteer de hars door te centrifugeren bij 800 x g gedurende 2 minuten bij 4°C. Zonder de hars te verstoren, verwijdert u het supernatant.
   8. Resuspendeer de hars in 40 ml Master Buffer en centrifugeer bij 800 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de hars te verstoren. Herhaal de wasbeurt 1x.
   9. Breng de gewassen hars over naar twee polypropyleen centrifugekolommen (zie Materiaaltabel). Was elke kolom 1x met 2 ml Master Buffer. Verwijder de Master Buffer door de kolom gedurende 2 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 1.400 x g . De hars wordt op de bodem verpakt.
   10. Bereid een elutiebuffer voor door 100 μg/ml FLAG-peptide (zie materiaaltabel) toe te voegen aan de hoofdbuffer.
   11. Voeg 300 μL Elution Buffer toe aan de verpakte hars in elke kolom en meng voorzichtig door te pipetteren om ervoor te zorgen dat de hars volledig gehydrateerd is door de Elution Buffer. Laat de hars met de Elution Buffer 10 minuten op ijs incuberen.
   12. Centrifugeer de kolommen bij 1.400 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Breng de doorstroom over naar een schone microcentrifugebuis en bewaar deze op ijs. Dit is de eerste breuk.
   13. Herhaal de stappen 1.6.11-1.6.12 zodat er 4 breuken uit elke kolom worden verzameld.
   14. Voer SDS-PAGE gelelektroforese³⁵ uit met de elutiefracties om hun relatieve concentraties te bepalen. Terwijl de gel draait, bereidt u een dialysebuffer voor met 500 mM NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl₂, 0.1 mM EGTA en 1 mM DTT.
   15. Combineer de meest geconcentreerde fracties. Breng het monster over in een 10K MWCO-dialysecassette (zie Materiaaltabel) en dialyseer een nacht bij 4 °C. Gebruik 1 L dialysebuffer voor ongeveer 500 μL eiwit. Voer ten minste drie vervangingen van de dialysebuffer uit.
       OPMERKING: De spinkolom en centrifugatie-elutiemethode maken het mogelijk om eiwitten in hoge concentraties (0,5-1 mg/ml) te elueren. Verdere concentratiestappen zijn meestal niet nodig. Als echter meer geconcentreerde eiwitten gewenst zijn, laad dan monsters op 100.000 MWCO concentreerbuizen (zie Materiaaltabel) en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.400 x g . Herhaal dit proces totdat het gewenste volume van de eiwitoplossing is bereikt.
   16. Haal de volgende dag het monster voorzichtig uit de dialysecassette. Aliquot 15 μL per PCR-buisje en laat de buisjes in een bak met vloeibare stikstof vallen voor flitsbevriezing. De ingevroren eiwitten kunnen bij -80 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik (figuur 3A).
       OPMERKING: De opbrengst van myosine-7a bij deze methode ligt meestal tussen 0,5 en 1 mg/L.

2. Zuiveren van de lichte ketens RLC en CALML4 met behulp van het E. coli His6-SUMO systeem (7 dagen)

OPMERKING: Dagen 1-4 - Klonen en zuivering van de plasmiden. Dag 5 - Bacteriële transformatie. Dagen 6-7 - Zuivering, aliquoteren en invriezen van de uiteindelijke eiwitten.

1. Kloon de cDNA's die coderen voor RLC en CALML4 tot een pET-SUMO-vector, die een His6-sequentie bevat voorafgaand aan SUMO om te helpen bij de zuivering. Indien nodig kan het His6-SUMO-domein worden gesplitst van het fusie-eiwit met behulp van een SENP2-protease^26,36.
2. Transformeer voor elk lichteketeneiwit BL21 E. coli-competente cellen (zie Materiaaltabel) met het plasmide en start een nachtelijke vloeibare cultuur van 5 ml met de getransformeerde cellen.
3. Inoculeer de volgende dag de 5 ml nachtcultuur in 1 L Luria-Bertani (LB) bouillon met 50 μg/ml kanamycine. Laat de cultuur groeien bij 37 °C met continu schudden bij 270 tpm totdat de optische dichtheid (OD) 0,6 - 1,0 bereikt.
   OPMERKING: De OD-waarde verdubbelt ongeveer elke 20 minuten zodra deze 0.2 bereikt. Controleer de O.D. regelmatig.
4. Start eiwitexpressie door 250 μM isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan de cultuur toe te voegen. Incubeer gedurende 3-5 uur bij 37 °C of 16 °C 's nachts met continu schudden bij 270 tpm.
5. Pelleteer de E. coli door de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 4.347 x g . Gooi het supernatant weg.
6. Bereid een resuspensiebuffer voor die 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 5 mM imidazool en 10% glycerol bevat, pH 7,4 (zie Materiaaltabel). Blijf op het ijs.
7. Resuspendeer de pellet in 15-25 ml resuspensiebuffer en breng de suspensie over in een schoon bekerglas, waarbij het totale volume wordt aangepast aan 35 ml. Voeg DNase en RNase toe aan de suspensie in een verhouding van 1:1000 (v/v) voor een eindconcentratie van respectievelijk 1 μg/ml en 2 μg/ml. Voeg één EDTA-vrije proteaseremmertablet, 4 mM 2-mercaptoethanol en 1% Triton X toe aan de suspensie (zie Materiaaltabel). Blijf 20 minuten op het ijs staan.
8. Sonificeer de pelletsuspensie in ijswater met 1 s aan en 1 s uit gedurende in totaal 1 minuut bij 100% amplitude. Laat het gehomogeniseerde lysaat 2 uur continu draaien op 4 °C.
   OPMERKING: De toevoeging van Triton X helpt bij het lyseren van de cellen ter voorbereiding op sonicatie.
9. Centrifugeer de lysaten bij 26.900 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Terwijl dit gebeurt, begint u met het voorbereiden van de kobalthars (zie Tabel met materialen). Gebruik 500 μL kobalthars voor 1 L E. coli-cultuur . Was de hars 2x met ultrapuur water en eenmaal met Suspension Buffer door te centrifugeren op 4.347 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
10. Na het centrifugeren met lysaat het supernatans mengen met de gewassen hars en 30 minuten zachtjes schudden bij 4 °C.
11. Centrifugeer de lysaatharssuspensie bij 4.347 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. De hars wordt op de bodem van de buis verpakt. Zonder de hars te verstoren, verwijdert u het supernatant.
12. Was de hars met resuspensiebuffer door te centrifugeren bij 4.347 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Herhaal wasbeurten totdat het supernatans kleurloos is.
13. Bereid elutiebuffer voor die 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 5 mM imidazool, 10% glycerol, 4 mM 2-mercaptoethanol en 0,25 μM SENP2-protease bevat (zie Materiaaltabel). Bewaar het op ijs.
14. Resuspendeer de hars in 1 ml Resuspensiebuffer en incubeer deze een nacht bij 4 °C met continue rotatie.
15. Centrifugeer de volgende dag gedurende 2 minuten op 4.347 x g om de hars te pelleteren. Verzamel het supernatant, dat het gespleten lichte keteneiwit en het protease bevat.
16. Voeg 1 ml Elution Buffer toe aan de hars. Herhaal de centrifugatie en verzamel het supernatant.
17. Verwijder de protease door middel van snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC). Bereid in het kort de kolom voor het uitsluiten van de grootte voor (zie Materiaaltabel) met een buffer die 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% glycerol en 5 mM DTT (pH 7,4) bevat. Concentreer het supernatans tot 500 μL met behulp van een concentreerbuis van 10.000 MWCO. Laad het geconcentreerde monster met behulp van een injectiespuit op een kolom die is aangesloten op een geautomatiseerd chromatografiesysteem en giet door met een buffer die 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% glycerol en 5 mM DTT (pH 7,4) bevat. Bewaak de verzamelde fracties met behulp van een ultraviolette spectrofotometrie. Verzamel de eiwitfracties met een molecuulgewicht dat overeenkomt met de lichte ketens.
    OPMERKING: De protease kan ook worden verwijderd door affiniteitschromatografie als een zuiveringstag (bijv. GST-tag) in de protease is ingebouwd.
18. Laat een SDS-PAGE-gel uit met de elutiefracties om de zuiverheid en relatieve concentraties van de lichte keteneiwitten in elke fractie te bepalen. Gewenste fracties zijn die welke geconcentreerde lichte keteneiwitten bevatten zonder zichtbare proteasebanden. Combineer de gewenste eiwitfracties en concentreer ze met behulp van een 10.000 MWCO concentreerbuis³⁵.
19. Vries aliquots van eiwitten in vloeibare stikstof snel in en breng ze onmiddellijk over naar -80 °C voor langdurige opslag (figuur 3B).
    OPMERKING: De opbrengst van RLC en CALML4 met behulp van het E. coli His6-SUMO-systeem is ongeveer 1-2 mg/L.

3. Myosine-7a-op maat gemaakte actinefilament glijdende test (3 uur)

OPMERKING: De methoden die in deze sectie worden gebruikt, zijn vergelijkbaar met die beschreven voor andere myosines³¹ , met als belangrijkste wijzigingen de incubatie en toepassing van myosine in een buffer met hoge ionische sterkte en het lange interval dat nodig is om nauwkeurige metingen van frame-tot-frame verplaatsingen te bereiken.

1. Bereid 20 μM filamenteuze actine (F-actine) voor door bolvormig actine (G-actine) te polymeriseren in polymerisatiebuffer (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0)) bij 4 °C 's nachts. Label F-actine door 1,2x molaire overmaat rhodamine-phalloidine toe te voegen (zie Materiaaltabel). Dek af met aluminiumfolie en incubeer minimaal 2 uur op ijs.
   OPMERKING: G-actine kan worden gekocht bij commerciële verkopers (zie Materiaaltabel) of worden gezuiverd uit konijnenspieracetonpoeder^31,37. Het geëtiketteerde F-actine kan bij deze concentratie tot 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
2. Bereid een stroomkamer voor zoals eerder beschreven³¹. Plaats kort twee stroken dubbelzijdige tape met een onderlinge afstand van 2-3 mm op een gereinigd en met nitrocellulose behandeld microscoopglaasje (zie Materiaaltabel). Leg het dekglaasje met de nitrocellulosekant naar beneden op de strips, zodat een stroomkamer ontstaat met een volume van ongeveer 10 μl (figuur 4).
3. Uitvoeren van actine filament glijdende assay
   1. Voeg aan de stroomkamer een kamervolume van 0,2 mg/ml gezuiverd humaan myosine-7a-eiwit toe in 500 mM NaCl Motiliteitsbuffer (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Laat 5 minuten op kamertemperatuur incuberen.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om myosine-7a toe te voegen aan een buffer met veel zout, omdat dit de auto-geremde toestand verlicht en myosine-7a in staat stelt zich te hechten aan het oppervlak in de geactiveerde conformatie.
   2. Was de stroomkamer met driekamervolumes van 1 mg/ml BSA (zie materiaaltabel) in 150 mM NaCl Motiliteitsbuffer (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)) en trek de vloeistof erdoor met een schoon doekje aan de uitlaat om overtollige vloeistof te absorberen. Incubeer gedurende 1 minuut na de 3e^wasbeurt .
   3. Laat één kamervolume van 10 nM rhodamine phalloidine-gelabeld F-actine in 150 mM NaCl Motiliteitsbuffer door de stroomkamer stromen. Bewaak de binding van actinefilamenten aan het oppervlak onder een fluorescerende microscoop met 100x objectief. De dichtheid van actinefilamenten moet optimaal zijn (Figuur 5A), zodat er voldoende filamenten in het gezichtsveld zijn om te kunnen volgen, maar schaars genoeg om overlapping van meerdere filamenten te voorkomen, wat het volgen bemoeilijkt.
   4. Was de stroomkamer met driekamervolumes van 150 mM NaCl Motility Buffer om ongebonden actinefilamenten en overtollig rhodamine-falloidine te verwijderen.
   5. Start de beweeglijkheid door één kamervolume van de uiteindelijke buffer toe te voegen (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2,5 mg/ml glucose, 100 μg/ml glucose-oxidase, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
   6. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met behulp van 561 nm excitatie om rhodamine-falloidine-gelabelde actine te visualiseren. Zoek een gebied op de dia met de gewenste actinedichtheid (Figuur 5A) en maak gedurende 30 minuten elke 30 s beelden.
      OPMERKING: De snelheid van zoogdiermyosine-7a is ongeveer 5 nm/s. Bij het instellen van de acquisitieframesnelheid is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de verplaatsingen van de filamenten tussen frames lang genoeg zijn (meer dan één pixel) om nauwkeurige tracking mogelijk te maken. Subpixelbewegingen tussen frames kunnen zorgen voor een overschatting van de snelheid. Dankzij de framesnelheid van 30 s kunnen de actinefilamenten ongeveer 150 nm tussen frames verplaatsen, wat overeenkomt met meer dan twee pixels op de microscoop. Er moet echter voor worden gezorgd dat er een aanzienlijke verplaatsing kan worden waargenomen op de gebruikte microscoop. Indien beschikbaar, kan opname in meerdere posities worden gebruikt om tegelijkertijd meerdere gezichtsvelden te verzamelen voor analyse.
4. Analyse van de beweging van de actinefilamenten met behulp van het FAST-programma (geïnstalleerd op een Mac)³⁸.
   OPMERKING: Het FAST-programma dat hier wordt gebruikt, is slechts een van de vele opties voor het kwantificeren van de beweging van het filament. We hebben ervoor gekozen om FAST te gebruiken omdat het geautomatiseerd en snel is en er geen betaalde software voor nodig is. Andere opties zijn onder meer op MATLAB gebaseerde algoritmen zoals FIESTA, op ImageJ/FIJI gebaseerde methoden zoals MTrack2 en Manual Tracking, en op Python gebaseerde methoden zoals Philament³⁹.
   1. Download en installeer het FAST-programma (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3-compatibele versie met een extra module voor. nd2-bestandsconversie. NB: De originele versie van python2 is te vinden op github.com/turalaksel/FASTrack).
   2. Voer het FAST-programma uit zoals beschreven in³⁸ met een tolerantiewaarde van 33 om alleen soepel bewegende filamenten te behouden.
      OPMERKING: Als afbeeldingen drift bevatten door mechanische problemen met het podium of door het gelijktijdig verzamelen van meerdere series, moeten de films eerst worden gestabiliseerd. Hiervoor raden we de FIJI-plug-in Image Stabilizer aan, die kan worden gedownload op het volgende adres - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
   3. Gebruik het FAST-programma om de nieuw gemaakte .tif afbeeldingen te analyseren door eerst de waarden -xmax en -ymax in te stellen. Deze stellen de parameters in voor de output van het scatterplot door het programma en vertegenwoordigen de langste filamentlengte (in nm) en de maximale filamentsnelheid (in nm/s). We gebruikten in dit voorbeeld 20.000 nm voor -xmax en 20 nm/s voor -ymax om ervoor te zorgen dat alle gegevens worden vastgelegd (Figuur 5D).
   4. Gebruik -px om de pixelgrootte van het verkregen beeld in te stellen, die hier 65 nm zal zijn, en -minv om de minimale snelheid (in nm/s) in te stellen die nodig is voor een filament om in de analyse te worden opgenomen. Voor de lage snelheid van myosine-7a in dit voorbeeld gebruik je 0,1 nm/s.
   5. Gebruik -maxd om de maximaal toegestane afstand tussen frames in te stellen voor filamenten die moeten worden gekoppeld. Dit is ingesteld om te voorkomen dat er afzonderlijke filamenten tussen frames worden gekoppeld en in dit voorbeeld gebruiken we de standaard 2000 nm.
   6. Gebruik-pt om de tolerantie voor fluctuaties in filamentsnelheden in te stellen en neem alleen filamenten op met vloeiende bewegingen. In dit voorbeeld wordt een tolerantiedrempel van 33% gebruikt. Dit betekent dat filamenten met een standaarddeviatie van de snelheid groter dan 33% van het snelheidsgemiddelde worden uitgesloten van verdere analyse.
   7. Gebruik ten slotte -d om de map aan te geven met de .tif stapels voor analyse. De volledige opdrachtreeks met de gegeven parameters en waarden is: snel -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [mapnaam met films].
      OPMERKING: Het FAST-programma voert spreidingsdiagrammen uit (Afbeelding 5D) met de bijbehorende onbewerkte gegevens, die kunnen worden geëxtraheerd voor analyse en visualisatie in andere programma's (Afbeelding 5C). Het zal ook een grafiek van de paden van de gevolgde filamenten opleveren (Figuur 5B), die moet worden gebruikt om te controleren of de tracering werkt zoals verwacht. Voorbeelden van de plots en andere mogelijke datavisualisaties zijn hieronder opgenomen.

Results

Het gezuiverde myosine-7a-complex en de lichte keteneiwitten kunnen worden geëvalueerd door SDS-PAGE-gelelektroforese, zoals weergegeven in figuur 3. De band boven de 200 kDa-marker komt overeen met de zware myosine-7a-keten (255 kDa). De drie banden die tussen de 22 en 14 kDa-markers van boven naar beneden migreren, zijn respectievelijk RLC (20 kDa), calmoduline en CALML4. Hoewel calmoduline en CALML4 een vergelijkbaar molecuulgewicht hebben van ongeveer 17 kDa, kunnen de twee eiwitten worden gescheiden met behulp van een 16% Tris-Glycine-gel.

Video 1 en figuur 5 demonstreren een karakteristieke actinefilament glijdende test met zoogdiermyosine-7a. Een onmiddellijk kenmerk dat door deze test wordt onthuld, is de langzame beweeglijkheid van myosine-7a. De video wordt afgespeeld op 500 keer de normale snelheid om de beweging van actinefilamenten die door dit myosine worden aangedreven beter te visualiseren. Deze test kan worden aangepast om verder te bestuderen hoe externe factoren zoals temperatuur, ionische sterkte en viscositeit van de oplossing de activiteit van myosine-7a beïnvloeden. Bovendien kunnen myosine-7a-bindende eiwitten in de flowcel worden geïntroduceerd om hun effecten op actomyosine-interacties en motiliteit te onderzoeken.

Figuur 1: Workflow voor MultiBac-systeem-gebaseerde myosine-7a holo-enzymproductie. (A) Voeg de cDNA's die coderen voor de zware myosine-7a-keten, RLC, CALML4 en calmoduline in op de meerdere kloonplaatsen (MCS) van de pACEBac1-vector. (B) Construeer de multigenexpressiecassette voor het coderen van het myosine-7a-complex door iteratief de pACEBac1-vectoren te binden die de cDNA's van de zware myosine-7a-keten, RLC, CALML4 en calmoduline bevatten. (C) Integreer de myosine-7a-multigencassette in het baculovirusgenoom door de transpositie van het mini-Tn7-element van de pACEBac1-vector naar de mini-attTn7-doelplaats in het genoom. (D) Baculovirussen produceren die het myosine-7a-complex tot expressie brengen door Sf9-cellen te transfecteren met het recombinante bacide dat de myosine-7a-multigencassette bevat. (E) Het baculovirus kan worden geamplificeerd door het P0-virus te inoculeren in een Sf9-celsuspensiecultuur en het supernatant te verzamelen. Het resulterende product, het P1-virus, kan worden gebruikt voor grootschalige eiwitexpressie. (F) Workflow voor de FLAG-affiniteitskolomgebaseerde zuivering van het myosine-7a-complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve fluorescerende beelden van Sf9-cellen getransfecteerd met bacmide die myosine-7a tot expressie brengen met een C-terminale GFP-tag. De afbeeldingen tonen de normale progressie van baculovirusinfectie: cellen beginnen myosine-7a tot expressie te brengen rond dag 4 na transfectie, waarbij bijna alle cellen binnen een week geïnfecteerd raken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: SDS-gels van gezuiverd myosine-7a-complex en lichte keten-eiwitten. (A) Gezuiverd humaan myosine-7a holo-enzym over de volledige lengte met behulp van het MultiBac-systeem. De zware ketting (HC) en lichte kettingen zijn aangegeven. (B) Gezuiverde RLC en CALML4 met behulp van het His6-SUMO-systeem. Calmoduline (CaM) wordt gekocht (zie Tabel met materialen) en gezuiverd uit de hersenen van runderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Workflow voor assemblage van de stroomkamer en assays voor het glijden van actine. Een met nitrocellulose behandeld dekglaasje wordt met twee stukken dubbelzijdig plakband op een microscoopglaasje bevestigd. Hierdoor ontstaat een stroomkamer met een volume van ongeveer 10 μL. Eiwitten worden achtereenvolgens aan de kamer toegevoegd, terwijl overtollige oplossingen met behulp van tissuepapier door het kanaal worden afgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve resultaten van glijdende actinefilamenttesten en de trackinganalyse. (A) Voorbeeldframe van een timelapse-opname van de beweging van het actinefilament aangedreven door met oppervlak versierde myosine-7a-motoren. (B) Filament tracking beelduitvoer van het FAST-programma voor hetzelfde gezichtsveld als weergegeven in (A). (C) Representatief histogram van de actine-glijsnelheid gegenereerd door zoogdiermyosine-7a: 4,2 ± 1,4 nm/s (gemiddelde ± standaarddeviatie; het aantal sporen = 550). (D) Voorbeeld van automatisch gegenereerde uitvoer van het FAST-programma met de berekende filamentlengte en -snelheden. %STUCK toont het percentage filamenten dat als vastgelopen wordt beschouwd op basis van de door de gebruiker opgegeven minimale snelheidsgrens. MVEL vertegenwoordigt de gemiddelde snelheid van alle niet-vastzittende filamenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Actine filament glijdende test uitgevoerd met myosine-7a. Gezuiverd humaan myosine-7a over de volledige lengte is aan het oppervlak bevestigd. Deze film is opgenomen met 1 frame om de 30 s met een belichtingstijd van 200 ms. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de productie van recombinant humaan myosine-7a-eiwit uit insectencellen. Hoewel het Sf9/baculovirus-systeem is gebruikt om een verscheidenheid aan myosines 40,41,42,43 te produceren, is het zoogdiermyosine-7a pas onlangs met succes gezuiverd met behulp van het MultiBac-baculovirussysteem 14. Myosine-7a van zoogdieren blijkt zich te associëren met drie soorten lichte ketens, die allemaal essentieel zijn voor de structurele en functionele integriteit van het eiwit¹⁴. Dit in tegenstelling tot zijn ongewervelde homoloog en de meeste andere myosines, die doorgaans binden aan slechts één of twee lichte ketentypen^44,45. Dit betekent dat om het menselijke myosine-7a holo-enzym te synthetiseren, ten minste vier verschillende genen tegelijkertijd tot expressie moeten worden gebracht in elke Sf9-cel. In dit geval biedt het MultiBac-systeem aanzienlijke voordelen ten opzichte van co-infectie met meerdere baculovirussen, omdat het zorgt voor reproduceerbare verhoudingen van de myosine-7a-complexsubeenheden in elke geïnfecteerde cel. In feite hebben Belyaev et al. dit statistisch aangetoond: naarmate het aantal virustypen toeneemt, neemt de kans dat cellen een gelijke virusverhouding krijgen dramatisch af⁴⁶. Bij twee virustypen bereikt bijvoorbeeld slechts 12,78% van de cellen een gelijke verhouding, terwijl dit percentage daalt tot 0,29% wanneer vier virustypen worden gebruikt, ervan uitgaande dat elk virustype onafhankelijk over de cellen wordt verdeeld. Deze variabiliteit kan problematisch zijn wanneer de eiwitten van de subeenheid in een consistente verhouding moeten worden samengevoegd om de maximale opbrengst van het complex te produceren. Hoewel dit artikel zich richt op myosine-7a van zoogdieren, wordt het steeds duidelijker dat het MultiBac-systeem een meer geoptimaliseerde aanpak biedt voor het produceren van multimere complexen dan de co-infectiemethode, met name voor eiwitten met meer subeenheden en geproduceerd in lage opbrengsten.

Verschillende factoren zijn van cruciaal belang voor het bereiken van een hoge productie van myosine-7a-eiwit met behulp van deze methode. Ten eerste is het cruciaal om de optimale timing voor het oogsten van Sf9-cellen te bepalen. Dit zorgt voor een maximale eiwitproductie terwijl de schadelijke effecten van cellyse en dood veroorzaakt door het virus worden geminimaliseerd. De productie van multiBac-gebaseerde eiwitcomplexen vertoont vaak een vertraagde piek in expressie in vergelijking met monocistronische baculovirussystemen of bij het tot expressie brengen van kleinere eiwitten. We ontdekten dat de beste tijd om cellen te oogsten die zijn geïnfecteerd met het myosine-7a MultiBac-virus tussen 60 - 65 uur na infectie is. Continue monitoring van de eiwitexpressieniveaus gedurende het hele proces wordt sterk aanbevolen. Dit kan worden bereikt met behulp van fluorescerende microscopie als een fluorescerende eiwittag is gefuseerd of door middel van SDS-PAGE-analyse op een andere manier. Bovendien is het belangrijk om de levensvatbaarheid van cellen tegelijkertijd te controleren om de optimale timing te bepalen voor het bereiken van de hoogste eiwitopbrengst met minimale celdood.

Myosine-7a is een groot monomeer myosine dat vatbaar is voor eiwitafbraak¹⁴. Om degradatie tijdens het zuiveringsproces te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle buffers voorgekoeld zijn en dat alle procedures bij 4 °C worden uitgevoerd. Bovendien is het minimaliseren van de blootstelling van myosine-7a aan proteasen van cruciaal belang. Naast het gebruik van proteaseremmercocktails, raden we aan om de incubatie van het cellysaat met FLAG-hars te beperken tot slechts 1 uur. Het is niet aangetoond dat het verlengen van deze duur de harsbinding significant verbetert of de totale eiwitopbrengst verhoogt en een hoger risico op eiwitafbraak kan opleveren.

Een onderscheidend kenmerk van zoogdiermyosine-7a, vergeleken met isovormen van lagere soorten⁴⁴, is de combinatie van unieke lichte ketencomponenten. Deze lichte ketens spelen een belangrijke regulerende rol in de functie van myosine-7a. Calmoduline interageert bijvoorbeeld dynamisch met de myosine-zware keten op een Ca²⁺-afhankelijke manier⁴⁷, waardoor de beweeglijkheid en mechanische output worden gemoduleerd, een mechanisme dat specifiek lijkt te zijn aangepast aan de auditieve haarcellen van zoogdieren¹⁴. Hoewel de exacte bindingsaffiniteiten van calmoduline aan individuele IQ-motieven nog moeten worden bepaald in de context van het hele molecuul, hebben we waargenomen dat sommige calmoduline geleidelijk dissocieert naarmate de overtollige lichte ketens in het cellysaat tijdens de zuivering worden verwijderd. Dit kan de mechanische eigenschappen van myosine-7a veranderen. Om dit te verminderen, gebruiken we spinkolommen in combinatie met zachte centrifugatie voor de elutiestap. Hierdoor kunnen eiwitten in een klein volume en in een hoge concentratie worden geëlueerd, waardoor concentratiestappen niet nodig zijn. Deze praktijk verkort het totale eiwitzuiveringsproces en minimaliseert het risico op dissociatie van de lichte keten. In actine-glijtesten nemen we overtollige lichte keteneiwitten op in de uiteindelijke buffer om ervoor te zorgen dat de natuurlijke lichte ketens gebonden blijven aan de zware myosine-7a-keten.

De vereiste voor overtollige lichte ketens vertegenwoordigt een van de vele verschillen tussen de actine-glijdende test met myosine-7a en die van andere goed bestudeerde myosines zoals myosine-2. Myosine-2-testen worden meestal uitgevoerd bij een lage ionische sterkte (bijv. 50 mM). Naarmate de ionische sterkte wordt verhoogd naar fysiologisch (150 mM), hebben actinefilamenten de neiging los te laten en vertraagt de beweeglijkheid. In het geval van myosine-7a is de beweeglijkheid beperkt tot een lage ionische sterkte en wordt glijden alleen waargenomen bij meer dan of gelijk aan 150 mM. Vanwege de auto-remming van myosine-7a over de volledige lengte, wordt het op de dekglaasje aangebracht in een oplossing met hoge ionische sterkte op een manier die lijkt op hoe myosinefilamenten worden opgelost voordat ze worden aangebracht, zodat eiwitten kunnen binden in een oriëntatie en conformatie die vervolgens glijden mogelijk maakt.

De lage snelheid die wordt waargenomen in actine-glijtesten met myosine-7a introduceert enkele uitdagingen bij het verkrijgen en analyseren van motiliteitsgegevens. Inderdaad, de translocatie is enkele ordes van grootte langzamer in vergelijking met skeletspiermyosine, dat werd gebruikt toen deze test oorspronkelijk werd ontwikkeld³⁰. Deze lage snelheid kan leiden tot moeilijkheden bij nauwkeurige metingen en een overschatting van de snelheid die schaalt met framesnelheid⁴⁸. De lokalisatieprecisie van elke volgmethode is eindig, en zelfs een statisch object heeft een schijnbare verschuiving in positie tussen opeenvolgende afbeeldingen. Naarmate de bemonsteringsfrequentie toeneemt, leidt dit tot een kunstmatig hoge waarde voor snelheid. Dit effect geldt voor elk type motiliteitstest, maar het relatieve effect is erg klein voor assays waarbij een grote beweging van meerdere pixels optreedt tussen frames. Door datapunten met zeer lange tussenpozen te nemen (elke 60 s, 90 s, enz.), kan worden geverifieerd dat de gemeten snelheid nauwkeurig is, aangezien de waarde niet mag worden beïnvloed door de bemonsteringsfrequentie. Omdat het opname-interval voor myosine-7a zo lang is, kan de vertraging worden benut om tijdens dezelfde acquisitie vanuit verschillende posities op te nemen. Dit maakt het effectief mogelijk om meerdere films tegelijk op te nemen. Een nadeel van deze methode is dat mechanische onvolkomenheden met de tafel zullen leiden tot extra drift door het wisselen van posities. Dit kan worden verklaard met behulp van beeldstabilisatie zoals hierboven beschreven.

In de originele Python2-versie van de FAST-software (github.com/turalaksel/FASTrack) vertegenwoordigt elk uitvoergegevenspunt een snelheid voor een filament binnen een N-frame-venster (standaard 5 frames). Een aangepaste Python3-versie van de software (github.com/NeilBillington/FASTrack3) bevat een extra output waarin datapunten op filament-voor-filament-basis zijn. De standaardplots die door de software worden geproduceerd, zijn gebaseerd op de dataset van het N-venstertype. Beide uitvoertypen zijn even geldig, en hoewel de oorspronkelijke uitvoer veel meer datapunten per film zal produceren, gebruiken we meestal de op filament gebaseerde gegevens, omdat deze directer vergelijkbaar zijn met bestaande methoden voor het kwantificeren van filamentglijden en meer intuïtieve informatie opleveren over het aantal filamenten met specifieke snelheden in een bepaalde film. Merk op dat zelfs in deze filament-type analyse het aantal datapunten niet precies overeenkomt met het werkelijke aantal filamenten, aangezien het volgen stopt wanneer filamenten paden kruisen, en nieuwe sporen worden vervolgens gedetecteerd wanneer ze verschijnen na het kruisen.

Beperkingen van de methoden die in dit artikel worden beschreven, zijn dat zoogdiereiwit tot expressie wordt gebracht in insectencellen. Hoewel veel van dergelijke eiwitten, waaronder deze, op deze manier met succes tot expressie zijn gebracht, zijn er andere expressiesystemen die de oorspronkelijke omgeving van het eiwit beter kunnen nabootsen. Expressiesystemen van zoogdieren kunnen belangrijke post-translationele modificaties aan het eiwit introduceren die afwezig zijn in het insectensysteem. Hetzelfde geldt in nog sterkere mate voor expressie in een bacterieel systeem, zoals hier gebruikt voor het produceren van myosine lichte ketens. Toch zijn we van mening dat de relatieve eenvoud en het hoge rendement in deze gevallen opwegen tegen de mogelijke beperkingen. De in vitro motiliteitstest die wordt gebruikt om het eiwit te karakteriseren, is beperkt in de hoeveelheid informatie die het over het eiwit kan opleveren. Veel aspecten van myosineregulatie worden bijvoorbeeld gemaskeerd of omzeild door de test en kunnen dus niet met deze techniek worden onderzocht. Er bestaan veel andere soorten tests, zoals motiliteit van één molecuul, optische trapping en biochemische en biofysische technieken, om de eigenschappen van myosine in vitro te onderzoeken, maar de filamentglijtest wordt hier gekozen als een methode om myosine-activiteit te meten omdat er minder eiwit voor nodig is dan voor veel biochemische tests, eenvoudig uit te voeren is en waarbij succesvolle beweeglijkheid kan worden aangetoond, vertelt ons dat het eiwit zowel biochemisch als mechanisch actief is.

De hier beschreven workflow vertegenwoordigt een reeks methoden voor het produceren van hoogwaardig myosine-7a-eiwit en het karakteriseren van de mechanische eigenschappen ervan. Hoewel deze methoden specifiek zijn afgestemd op deze myosineklasse, zijn de expressie- en zuiveringsprocedures meer in het algemeen nuttig als richtlijn voor de productie van dit type labiel eiwit, bestaande uit verschillende verschillende polypeptiden en met een neiging tot dissociatie en afbraak. Bovendien zijn de karakteriseringsmethoden nuttig voor alle soorten motoreiwitten, en in het bijzonder zijn de overwegingen van gegevensverzameling en analyseparameters bedoeld om nuttig te zijn voor iedereen die de translocatiesnelheid van moleculaire motoren met lage snelheid meet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1