Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

MultiBac-systeemgebaseerde zuivering en biofysische karakterisering van humaan myosine-7a

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67135

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedures voor het recombinant produceren van het humaan myosine-7a holo-enzym met behulp van het MultiBac Baculovirus-systeem en voor het bestuderen van de beweeglijkheid ervan met behulp van een op maat gemaakte in vitro filament glijdende test.

Samenvatting

Myosine-7a is een op actine gebaseerd motoreiwit dat van vitaal belang is voor auditieve en visuele processen. Mutaties in myosine-7a leiden tot Ushersyndroom type 1, de meest voorkomende en ernstige vorm van doofblindheid bij de mens. Er wordt verondersteld dat myosine-7a een transmembraanadhesiecomplex vormt met andere Usher-eiwitten, essentieel voor de structureel-functionele integriteit van fotoreceptor- en cochleaire haarcellen. Vanwege de uitdagingen bij het verkrijgen van puur, intact eiwit, blijven de exacte functionele mechanismen van humaan myosine-7a echter ongrijpbaar, met beperkte structurele en biomechanische studies beschikbaar. Recente studies hebben aangetoond dat myosine-7a van zoogdieren een multimeer motorcomplex is dat bestaat uit een zware keten en drie soorten lichte ketens: regulerende lichte keten (RLC), calmoduline en calmoduline-achtig eiwit 4 (CALML4). In tegenstelling tot calmoduline bindt CALML4 niet aan calciumionen. Zowel de calciumgevoelige als de ongevoelige calmodulines zijn van cruciaal belang voor myosine-7a van zoogdieren voor een goede fijnafstemming van de mechanische eigenschappen. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om recombinant humaan myosine-7a holo-enzym te produceren met behulp van het MultiBac Baculovirus-eiwitexpressiesysteem. Dit levert milligrammen zeer zuiver eiwit van volledige lengte op, waardoor de biochemische en biofysische karakterisering ervan mogelijk is. Verder presenteren we een protocol voor het beoordelen van de mechanische en beweeglijke eigenschappen met behulp van op maat gemaakte in vitro motiliteitstesten en fluorescentiemicroscopie. De beschikbaarheid van het intacte humane myosine-7a-eiwit, samen met het gedetailleerde functionele karakteriseringsprotocol dat hier wordt beschreven, maakt de weg vrij voor verder onderzoek naar de moleculaire aspecten van myosine-7a in zicht en gehoor.

Inleiding

Myosines zijn moleculaire motoreiwitten die interageren met actine om tal van cellulaire processen aan te sturen 1,2,3,4. Mensen bezitten 12 klassen en 39 myosine-genen5, die betrokken zijn bij een breed scala aan fysiologische functies, zoals spiercontractie6 en sensorische processen7. Elk myosinemolecuul is een multimeer complex dat bestaat uit een zware keten en lichte ketens. De zware ketting is verdeeld in kop-, nek- en staartregio's. De kop bevat actine- en nucleotidebindingsplaatsen die verantwoordelijk zijn voor ATP-hydrolyse en het genereren van kracht op actinefilamenten2. De nek wordt gevormd door verschillende α-spiraalvormige IQ-motieven waarbij een specifieke set lichte kettingen is gebonden. Ze fungeren samen als een hefboomarm om de conformationele veranderingen van de motor te versterken tot grote bewegingen 8,9,10. De staart bevat klasse-specifieke subdomeinen en speelt een regulerende rol bij het afstemmen van de motorische activiteit van myosine en het bemiddelen van interacties met cellulaire bindingspartners 2,11.

Humaan myosine-7a, een lid van klasse 7 myosines, is essentieel voor auditieve en visuele processen 12,13. De IQ-motieven van humaan myosine-7a worden geassocieerd met een unieke combinatie van lichte ketens, waaronder de regulerende lichte keten (RLC), calmoduline en calmoduline-achtig eiwit 4 (CALML4)14,15,16. Naast het stabiliseren van de hefboomarm, reguleren deze lichte ketens de mechanische eigenschappen van myosine-7a als reactie op calciumsignalering, een kenmerk dat uniek lijkt te zijn voor de isovorm van zoogdier14.

Defecten in het gen dat codeert voor de zware myosine-7a-keten (MYO7A/USH1B) zijn verantwoordelijk voor syndroom van Usher type 1, de ernstigste vorm van gecombineerd gezichts- en gehoorverlies bij de mens17. Bovendien is het lichte ketengen CALML4 een van de kandidaatgenen die in kaart zijn gebracht om het causale allel voor USH1H te bevatten, een andere variant van type 1 Ushersyndroom 15,18. In het netvlies komt myosine-7a tot expressie in het retinale pigmentepitheel en fotoreceptorcellen13. Het is betrokken bij de lokalisatie van melanosomen in het retinale pigmentepitheel (RPE)19 en fagocytose van de buitenste segmentschijven van de fotoreceptor door de RPE-cellen20. In het binnenoor wordt myosine-7a voornamelijk aangetroffen in de stereocilia, waar het een cruciale rol speelt bij het tot stand brengen van haarbundels en bij het afschermen van het mechano-elektrische transductieproces 12,21,22.

Hoewel het belang van myosine-7a in sensorische cellen goed is ingeburgerd, blijven de functionele mechanismen op moleculair niveau slecht begrepen. Deze lacune in kennis is deels te wijten aan de uitdagingen bij het zuiveren van het intacte eiwit, met name de isovorm van zoogdieren. Onlangs is er aanzienlijke vooruitgang geboekt met behulp van het MultiBac-systeem om het volledige menselijke myosine-7a holo-enzym14 recombinant tot expressie te brengen. Deze vooruitgang heeft structurele en biofysische karakteriseringen van dit motoreiwit mogelijk gemaakt, wat heeft geleid tot de ontdekking van verschillende unieke eigenschappen van humaan myosine-7a die specifiek zijn aangepast voor auditieve functies van zoogdieren14,23.

Het MultiBac-systeem is een geavanceerd baculovirus/insectencelplatform dat speciaal is ontworpen voor de expressie van eukaryote multimere complexen24,25. Een belangrijk kenmerk van dit systeem is het vermogen om meerdere genexpressiecassettes te hosten, die elk coderen voor een subeenheid van het complex, binnen een enkel MultiBac-baculovirus. De assemblage van de multigenexpressiecassettes wordt vergemakkelijkt door een zogenaamde vermenigvuldigingsmodule: een homing endonuclease (HE) site en een matching ontworpen BstXI site die de meerdere kloonsites (MCS) flankeert. Deze module maakt de iteratieve assemblage van een enkele expressiecassette mogelijk door middel van beperking/ligatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van het feit dat de HE- en BstXI-beperkingssites worden geëlimineerd bij hun ligatie. In dit artikel worden menselijke myosine-7a zware ketens, RLC, calmoduline en CALML4 elk gekloond in de vermenigvuldigingsmodule binnen de pACEBac1-vector (Figuur 1A), die vervolgens via het iteratieve proces worden samengevoegd tot een multigenexpressiecassette (Figuur 1B). De myosine-7a-multigencassette is geïntegreerd in het baculovirale genoom (bacmid) door de transpositie van het mini-Tn7-element van de pACEBac1-vector naar de mini-attTn7-doelplaats in het genoom (Figuur 1C). Na procedures voor bacmidezuivering, baculovirusproductie en amplificatie (Figuur 1D,E) wordt het recombinante myosine-7a MultiBac-baculovirus bereid en kan het worden gebruikt voor grootschalige eiwitproductie (Figuur 1F). Bovendien kunnen de myosine-7a lichte ketens afzonderlijk worden geproduceerd in E. coli en worden gezuiverd met behulp van een splitsbare His6-SUMO-tag 26,27,28. De gezuiverde lichte ketens zijn nuttig voor het bestuderen van hun bindingsdynamiek en regulatie van myosine-7a.

Het gezuiverde myosine-7a-eiwit kan worden onderworpen aan structurele, biochemische en biofysische studies om inzicht te krijgen in de structureel-functionele regulatie van dit motoreiwit. Bovendien kunnen de interacties met het actinenetwerk en andere bindende eiwitten29 worden onderzocht met behulp van een verscheidenheid aan in vitro reconstitutiebenaderingen. Bevindingen van deze analyses zullen de biofysische eigenschappen van dit myosine informeren, wat leidt tot een mechanistisch begrip van hoe myosine-7a de cytoskeletveranderingen aanstuurt en uiteindelijk de unieke morfologie en functie van sensorische cellen vormt. In dit artikel beschrijven we een workflow voor de glijdende test van actinefilamenten die specifiek is aangepast voor myosine-7a van zoogdieren. De glijdende test van actinefilamenten is een robuuste in vitro motiliteitstest die kwantitatief de beweging bestudeert van fluorescerende actinefilamenten die worden voortgestuwd door een groot aantal myosinemotoren die zijn geïmmobiliseerd op een dekglaasoppervlak 30,31,32. De voordelen van deze test zijn onder meer de eenvoud van de installatie, de minimale apparatuurvereisten (een breedveldfluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera) en de hoge reproduceerbaarheid. Bovendien, omdat de beweging van actinefilamenten wordt aangedreven door een cluster van geïmmobiliseerde myosinemotoren, is deze test bijzonder nuttig voor het bestuderen van de beweeglijkheid van monomere myosines zoals myosine-7a 14,33. De protocollen omvatten verschillende aanpassingen, van experimentele procedures tot beeldvormingsanalyse, specifiek afgestemd op de unieke beweeglijke eigenschappen van zoogdiermyosine-7a. Met de beschikbaarheid van intact myosine-7a-eiwit en het functionele karakteriseringsprotocol dat hier wordt beschreven, legt dit artikel de basis voor verder onderzoek naar de moleculaire rol van myosine-7a in zowel fysiologische als pathologische processen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Hier beschrijven we een protocol voor het synthetiseren van het intacte menselijke myosine-7a holo-enzym en het karakteriseren van de beweeglijkheid ervan in vitro. Dit protocol is verdeeld in drie secties: ten eerste, het tot expressie brengen van het menselijke myosine-7a met behulp van het MultiBac baculovirus-eiwitexpressiesysteem; Ten tweede, het afzonderlijk zuiveren van myosine-7a lichte ketens met behulp van het E.coli His6-SUMO-systeem; en tot slot, het bestuderen van de beweeglijkheid van humaan myosine-7a met behulp van de actine-filament gliding assay.

1. MultiBac-systeemgebaseerde productie van myosine-7a-complex

  1. Het creëren van een baculovirus-multigencassette voor het tot expressie brengen van humaan myosine-7a-complex (16 dagen)
    OPMERKING: Er is één klooncyclus (4 dagen) nodig om de cDNA's van myosine-7a-subeenheden in de pACEBac1-vectoren in te voegen en drie klooncycli om de stapsgewijze ligatie van alle vermenigvuldigingsmodules die nodig zijn voor het tot expressie brengen van het myosine-7a-complex te voltooien, wat resulteert in een totaal van 16 dagen.
    1. Kloon de cDNA's die coderen voor de zware myosine-7a-keten (HC), calmoduline, CALML4 en RLC in de pACEBac1-vectoren met behulp van een commerciële kit volgens de protocollen van de fabrikant (zie Tabel met materialen; Figuur 1A). Een FLAG-tag wordt ingebracht aan de C-terminus van de myosine-7a HC om te helpen bij de zuivering.
      OPMERKING: Zoogdiermyosine-7a wordt geproduceerd als twee splicing-isovormen, die alleen verschillen door een segment van 11 aminozuren aan de N-terminus23. Deze korte N-terminale extensie speelt een cruciale rol bij het reguleren van de ATPase-activiteit van myosine-7a14. Het is aangetoond dat het toevoegen van een N-terminale tag de normale regulatie door deze N-terminale extensie kan verstoren en de enzymatische activiteit en beweeglijkheid van de motor aanzienlijk kan verminderen14. Daarom wordt een C-terminale FLAG-tag gebruikt om te voorkomen dat de natuurlijke regulatie van het eiwit wordt verstoord.
    2. Construeer de multigenexpressiecassette voor het myosine-7a-holo-enzym met behulp van homing-endonuclease/BstXI-vermenigvuldiging zoals hieronder beschreven (Figuur 1B).
      OPMERKING: De homing endonuclease I-CeuI produceert samenhangende uiteinden die compatibel zijn met de uiteinden die worden gegenereerd door de BstXI-digest. Bij ligatie wordt een homing endonuclease/BstXI hybride restrictieplaats gecreëerd die door geen van beide enzymen kan worden doorgesneden. Dezelfde procedure kan worden herhaald om meer vermenigvuldigingsmodules te integreren. Als er meerdere restrictieplaatsen voor I-CeuI en BstXI aanwezig zijn op de insert- of vectorconstructies, moeten deze extra plaatsen worden geëlimineerd door site-directed mutagenese om ervoor te zorgen dat de I-CeuI- en BstXI-snijlocaties uniek zijn.
    3. Voorbereiding van de inzet: Vermaal het insertconstruct (bijv. pACEBac-M7a HC) met het homing-endonuclease I-CeuI (zie Materiaaltabel) en zuiver vervolgens het gelineariseerde plasmide met behulp van een PCR-zuiveringskit (zie Materiaaltabel). Verder verteert u het gelineariseerde plasmide met BstXI (zie Tabel met materialen), scheidt u het fragment met de genexpressiecassette met behulp van gelelektroforese en zuivert u het met behulp van een Gel Extraction Kit (zie Tabel met materialen).
      OPMERKING: I-CeuI en BstXI vereisen verschillende buffercondities, volgens de protocollen van de fabrikant, om 100% activiteit te bereiken. Bovendien vereist een volledige snede met I-CeuI minimaal 3 uur, terwijl BstXI slechts 15 minuten incubatietijd vereist. De vergistingen moeten dus opeenvolgend worden uitgevoerd.
    4. Vectorvoorbereiding: Lineariseer het vectorconstruct (bijv. pACEBac-CaM) door middel van BstXI-digestie. Alkalische fosfatase is opgenomen in het vectorpreparaat om te voorkomen dat het vectorplasmide aan zichzelf bindt (zie Tabel met materialen). Verkrijg het vergistingsproduct door elektroforese en zuiver het met een Gel Extraction Kit.
    5. Ligatie: Ligate de met I-CeuI/BstXI behandelde insert en de met BstXI behandelde vector met T4 DNA-ligase (zie Tabel met materialen). Voer ligatiereacties uit bij kamertemperatuur (20 °C -25 °C) gedurende 10 minuten met een massaverhouding van 1:1 van het invoeg-DNA tot vector-DNA, waarbij de totale massa dicht bij 100 ng blijft bij elke ligatiereactie.
    6. Transformatie en plasmideanalyse: Transformeer de ligatiemengsels in DH5α-cellen (zie Materiaaltabel) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en screen de positieve kolonies op gentamicineresistentie. Zuiver de plasmiden met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie Materiaaltabel) en controleer de juiste klonen (bijv. plasmiden die zowel M7a HC als CaM bevatten) op basis van specifieke restrictieverteringspatronen en DNA-sequentiebepaling van de inserts.
    7. Integratie van meerdere genexpressiecassettes: Herhaal stap 1.1.2 tot en met 1.1.6 om extra gencassettes te integreren die andere myosine-7a-subeenheden tot expressie brengen.
  2. Productie en zuivering van recombinant bacmide-DNA (4 dagen; Figuur 1C).
    OPMERKING: Dag 1 - Bacteriële transformatie en groei van getransformeerde kolonies. Dagen 2-3 - Groeiende kolonies en screening op succesvolle transformatie. Dag 3 - Selecteren en strepen van positieve kolonies, beginnen met nachtelijke inoculatie. Dag 4 - Zuivering van bacmid DNA.
    1. Transformeer DH10Bac-competente cellen (zie Materiaaltabel) met 1 ng van het gesequencede pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM-plasmide volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Plaat 20-200 μl van de cellen op een agarplaat met 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine, 10 μg/ml tetracycline, 100 μg/ml gehalogeneerd indolyl-β-galactoside en 40 μg/ml IPTG (zie materiaaltabel) en incubeer de plaat bij 37°C gedurende 48 uur om de ontwikkeling van een diepblauwe kleur in negatieve klonen mogelijk te maken.
      OPMERKING: De gehalogeneerde indolyl-β-galactoside kleurt kolonies die LacZ blijven uitdrukken (wat aangeeft dat de transpositie niet succesvol was), waardoor de selectie van witte kolonies mogelijk is waar de transpositie succesvol was.
    3. Selecteer zorgvuldig een geïsoleerde witte kolonie en kweek 's nachts cellen in 5 ml LB-medium met 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine en 10 μg/ml tetracycline bij 37 °C in een orbitale shaker bij 225 rpm.
    4. Centrifugeer de cultuur bij 2.465 x g gedurende 10 minuten om de E coli te pelleteren. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 300 μL Buffer P1 uit de kit.
      OPMERKING: Hoewel hier buffers van de Miniprep-kit worden gebruikt, wijkt het protocol voor het zuiveren van het bacmid-product af van het protocol dat bij de kit wordt geleverd.
    5. Voeg 300 μL van de Buffer P2 uit de kit toe. Meng door de buisjes een paar keer om te keren en incubeer vervolgens 3 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Voeg 300 μL van de N3-buffer uit de kit toe en meng door inversie om de lysisreactie te stoppen. Centrifugeer bij 17.885 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    7. Breng het supernatans over in een schone steriele buis en herhaal het centrifugeren nog eens 10 minuten.
    8. Breng 800 μl van het supernatans over in een andere steriele microcentrifugebuis van 1,7 ml (zie materiaaltabel) en voeg 600 μl koude isopropanol toe (zie materiaaltabel) en meng door middel van rigoureuze inversie. Centrifugeer vervolgens bij 17.885 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    9. Gooi het supernatans weg en zoek de kleine, witte korrel. Was de pellet met 800 μL koude 70% ethanol (zie Materiaaltabel) en centrifugeer op 17.885 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voeg voorzichtig ethanol toe langs de buiswand om verstoring van de pellet te voorkomen.
    10. Gooi het supernatans weg en herhaal de ethanolwasbeurt een keer. Laat de pellet 5 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Zuig overtollige vloeistof indien nodig voorzichtig op.
    11. Los de pellet op met 20 μL EB-buffer uit de Kit. Zorg ervoor dat de pellet volledig is opgelost door op de buis te tikken of voorzichtig te mengen door te pipetteren. Bepaal de concentratie met behulp van een spectrofotometer (zie Tabel met materialen).
    12. Pas het buffervolume indien nodig aan om de bacmideconcentratie op ongeveer 1 μg/μL te brengen. Bewaar baamide-DNA bij 4 °C tot het klaar is voor de productie van het P0-virus.
      OPMERKING: De gezuiverde bacmid kan op 4 °C worden bewaard en blijft enkele maanden werkzaam. We hebben succesvolle transfecties gezien met bacmideproducten tot 1 jaar oud. Als alternatief kan de bacmide worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C. Meerdere vries-/dooicycli moeten worden vermeden omdat ze de transfectie-efficiëntie verminderen.
  3. Transfecte Sf9-insectencellen met bacmide om recombinant baculovirus te produceren (6 dagen; Figuur 1D)
    OPMERKING: Dag 1 - Transfectie van cellen met bacmide-DNA. Dag 2-6 - Observeer de groei en expressie van cellen. Dag 6 - Verzameling van het P0-virus.
    1. Voeg Sf9-cellen in kweekmedia (zie Materiaaltabel) toe aan een plaat met 6 putjes in een concentratie van 0,33 x 106 cellen/ml met 3 ml per putje. Laat de plaat 30 minuten op kamertemperatuur staan zodat de cellen zich aan de bodem van de plaat kunnen hechten.
    2. Bereid voor elk putje een transfectiemengsel door 10 μl kationische lipidetransfectiereagens (zie materiaaltabel) te combineren met 250 μl verbeterd Minimal Essential Medium (MEM)-medium (zie Materiaaltabel) in een steriele microcentrifugebuis. Meng door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    3. Voeg 1 μg (op basis van de in stap 1.2.12 bepaalde concentratie) onverdund myosine-7a-baamide toe aan het transfectiemengsel. Meng door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Verdeel het hele DNA-lipidenmengsel gelijkmatig druppelsgewijs over de putjes. Laat een putje over voor niet-getransfecteerde cellen als negatieve controle.
    5. Sluit de plaat met 6 putjes af met folie (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 6 dagen bij 27 °C. Observeer groei en onthechting gedurende deze tijd. Als er een fluorescerend label op het construct aanwezig is, controleer dan op fluorescentieontwikkeling (Figuur 2).
    6. Wanneer de getransfecteerde cellen tekenen van een infectie in een laat stadium vertonen, brengt u het medium met het virus uit de geïnfecteerde putjes over in een kegelvormige buis van 15 ml en centrifugeert u gedurende 10 minuten op 805 x g .
    7. Breng het supernatans over in een schone conische buis van 15 ml, wikkel het in aluminiumfolie en bewaar het bij 4 °C. Dit product is nu het P0-virus en kan naar onze ervaring tot vier maanden effectief worden bewaard en gebruikt.
  4. Versterken baculovirus voorraad (3-5 dagen ; Figuur 1E)
    1. Bereid 100 ml (of het gewenste volume) Sf9-cellen in een concentratie van 2 x 106 cellen/ml in Sf9-celkweekmedia in een erlenmeyer van 250 ml (zie Materiaaltabel).
    2. Voeg een verhouding van 1:100 (v/v) P0-virusvoorraad toe aan de Sf9-celsuspensiecultuur en incubeer bij 27 °C in een orbitale shaker bij 135 tpm.
    3. Bewaak de groei elke 24 uur totdat de cellen ~90% celdood bereiken. Eenmaal in dit bereik, centrifugeert u de celsuspensie bij 500 x g gedurende 10 minuten en verzamelt u het supernatans dat het P1-virus bevat.
    4. Filtreer het supernatans met behulp van 0,22 μm vacuümfiltratie (zie Tabel met materialen). Bewaar het gefilterde product in het donker en bewaar het bij 4 °C. Dit product is nu het P1-virus.
      OPMERKING: De virustiter neemt af bij langdurige opslag bij 4 °C. Overweeg om nieuwe virusvoorraad te maken als deze langer dan 4 maanden is bewaard, of titer de virusvoorraad voor gebruik in expressie34.
  5. Eiwitexpressie (60 -72 uur tussen het begin van de expressie en het verzamelen van de celpellet; Figuur 1E)
    1. Bereid in de logfase groeiende Sf9-cellen voor in een concentratie van 2 x 106 cellen/ml en voeg P1-virus toe in een verhouding van 12 ml virus tot 300 ml celsuspensie.
      OPMERKING: De eiwitopbrengst is ongeveer 1 mg/L. Het wordt aanbevolen om minimaal 1,5 L celsuspensie te gebruiken voor deze eiwitexpressie.
    2. Kweek de cellen bij 27 °C in een orbitale shaker bij 135 tpm gedurende ongeveer 60 uur.
      OPMERKING: Kleine monsters kunnen op verschillende tijdstippen worden verzameld en geanalyseerd met behulp van SDS-gels om de eiwitexpressieniveaus te beoordelen. Bovendien, als de eiwitten zijn versmolten met fluorescerende tags, kunnen expressieniveaus worden geëvalueerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. De cellen moeten uiterlijk bij het begin van de celdood worden geoogst.
    3. Centrifugeer de celsuspensie bij 3.735 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren. De pellets kunnen worden opgeslagen bij -80 °C tot verder gebruik of worden bewaard voor langdurige opslag. We gebruiken celpellets meestal binnen enkele weken, maar hebben enkele maanden na het invriezen het actieve eiwit teruggewonnen.
  6. Eiwitzuivering (2 dagen ; Figuur 1F)
    OPMERKING: Dag 1 - Eiwitextractie en -zuivering met behulp van FLAG-affiniteitschromatografie. Dag 2 - Aliquot en bevriezing van monsters na nachtelijke dialyse. Het hieronder beschreven protocol is voor het zuiveren van myosine-7a uit 1,5 L celpellets.
    1. Bereid Master Buffer voor met 10 mM MOPS (pH 7,2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 μg/ml leupeptine en 100 μg/ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Filtreer het met een filter met een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar de buffer bij 4 °C (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: PMSF is onstabiel in waterige oplossingen. Bereid de PMSF-bouillonoplossing als 1 M in 100% ethanol en bewaar deze maximaal 6 maanden bij -20 °C.
    2. Bereid 75 ml extractiebuffer voor door de Master Buffer aan te vullen met 3 EDTA-vrije proteaseremmertabletten, 2 mM ATP en 0,1 mM dithiothreitol (DTT; zie Materiaaltabel).
    3. Voeg 75 ml extractiebuffer toe aan de pellet terwijl deze nog bevroren is. Laat de pellet in de extractiebuffer op ijs staan tot deze ontdooid is. Gebruik een serologische pipet om de pellet te breken om het ontdooiproces te versnellen.
    4. Gebruik een punt van 1/2-inch (13 mm) om de resuspensie gedurende 10 minuten op ijs te sonificeren met een amplitude van 50%, 5 s aan, 5 s uit.
    5. Centrifugeer het totale lysaat bij 33.746 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Bereid tijdens het centrifugeren 1,5 ml FLAG-hars voor door 3 ml van de 50% slurry Anti-FLAG-affiniteitshars (zie Materiaaltabel) te wassen met 40 ml PBS. Pelleteer de hars door te centrifugeren op 800 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder de PBS voorzichtig zonder de hars te verstoren.
    6. Voeg het supernatans van de lysaatcentrifugatie toe aan de gewassen hars en incubeer met continue rotatie bij 4 °C gedurende 1 uur.
    7. Pelleteer de hars door te centrifugeren bij 800 x g gedurende 2 minuten bij 4°C. Zonder de hars te verstoren, verwijdert u het supernatant.
    8. Resuspendeer de hars in 40 ml Master Buffer en centrifugeer bij 800 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de hars te verstoren. Herhaal de wasbeurt 1x.
    9. Breng de gewassen hars over naar twee polypropyleen centrifugekolommen (zie Materiaaltabel). Was elke kolom 1x met 2 ml Master Buffer. Verwijder de Master Buffer door de kolom gedurende 2 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 1.400 x g . De hars wordt op de bodem verpakt.
    10. Bereid een elutiebuffer voor door 100 μg/ml FLAG-peptide (zie materiaaltabel) toe te voegen aan de hoofdbuffer.
    11. Voeg 300 μL Elution Buffer toe aan de verpakte hars in elke kolom en meng voorzichtig door te pipetteren om ervoor te zorgen dat de hars volledig gehydrateerd is door de Elution Buffer. Laat de hars met de Elution Buffer 10 minuten op ijs incuberen.
    12. Centrifugeer de kolommen bij 1.400 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Breng de doorstroom over naar een schone microcentrifugebuis en bewaar deze op ijs. Dit is de eerste breuk.
    13. Herhaal de stappen 1.6.11-1.6.12 zodat er 4 breuken uit elke kolom worden verzameld.
    14. Voer SDS-PAGE gelelektroforese35 uit met de elutiefracties om hun relatieve concentraties te bepalen. Terwijl de gel draait, bereidt u een dialysebuffer voor met 500 mM NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA en 1 mM DTT.
    15. Combineer de meest geconcentreerde fracties. Breng het monster over in een 10K MWCO-dialysecassette (zie Materiaaltabel) en dialyseer een nacht bij 4 °C. Gebruik 1 L dialysebuffer voor ongeveer 500 μL eiwit. Voer ten minste drie vervangingen van de dialysebuffer uit.
      OPMERKING: De spinkolom en centrifugatie-elutiemethode maken het mogelijk om eiwitten in hoge concentraties (0,5-1 mg/ml) te elueren. Verdere concentratiestappen zijn meestal niet nodig. Als echter meer geconcentreerde eiwitten gewenst zijn, laad dan monsters op 100.000 MWCO concentreerbuizen (zie Materiaaltabel) en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.400 x g . Herhaal dit proces totdat het gewenste volume van de eiwitoplossing is bereikt.
    16. Haal de volgende dag het monster voorzichtig uit de dialysecassette. Aliquot 15 μL per PCR-buisje en laat de buisjes in een bak met vloeibare stikstof vallen voor flitsbevriezing. De ingevroren eiwitten kunnen bij -80 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik (figuur 3A).
      OPMERKING: De opbrengst van myosine-7a bij deze methode ligt meestal tussen 0,5 en 1 mg/L.

2. Zuiveren van de lichte ketens RLC en CALML4 met behulp van het E. coli His6-SUMO systeem (7 dagen)

OPMERKING: Dagen 1-4 - Klonen en zuivering van de plasmiden. Dag 5 - Bacteriële transformatie. Dagen 6-7 - Zuivering, aliquoteren en invriezen van de uiteindelijke eiwitten.

  1. Kloon de cDNA's die coderen voor RLC en CALML4 tot een pET-SUMO-vector, die een His6-sequentie bevat voorafgaand aan SUMO om te helpen bij de zuivering. Indien nodig kan het His6-SUMO-domein worden gesplitst van het fusie-eiwit met behulp van een SENP2-protease26,36.
  2. Transformeer voor elk lichteketeneiwit BL21 E. coli-competente cellen (zie Materiaaltabel) met het plasmide en start een nachtelijke vloeibare cultuur van 5 ml met de getransformeerde cellen.
  3. Inoculeer de volgende dag de 5 ml nachtcultuur in 1 L Luria-Bertani (LB) bouillon met 50 μg/ml kanamycine. Laat de cultuur groeien bij 37 °C met continu schudden bij 270 tpm totdat de optische dichtheid (OD) 0,6 - 1,0 bereikt.
    OPMERKING: De OD-waarde verdubbelt ongeveer elke 20 minuten zodra deze 0.2 bereikt. Controleer de O.D. regelmatig.
  4. Start eiwitexpressie door 250 μM isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan de cultuur toe te voegen. Incubeer gedurende 3-5 uur bij 37 °C of 16 °C 's nachts met continu schudden bij 270 tpm.
  5. Pelleteer de E. coli door de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 4.347 x g . Gooi het supernatant weg.
  6. Bereid een resuspensiebuffer voor die 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 5 mM imidazool en 10% glycerol bevat, pH 7,4 (zie Materiaaltabel). Blijf op het ijs.
  7. Resuspendeer de pellet in 15-25 ml resuspensiebuffer en breng de suspensie over in een schoon bekerglas, waarbij het totale volume wordt aangepast aan 35 ml. Voeg DNase en RNase toe aan de suspensie in een verhouding van 1:1000 (v/v) voor een eindconcentratie van respectievelijk 1 μg/ml en 2 μg/ml. Voeg één EDTA-vrije proteaseremmertablet, 4 mM 2-mercaptoethanol en 1% Triton X toe aan de suspensie (zie Materiaaltabel). Blijf 20 minuten op het ijs staan.
  8. Sonificeer de pelletsuspensie in ijswater met 1 s aan en 1 s uit gedurende in totaal 1 minuut bij 100% amplitude. Laat het gehomogeniseerde lysaat 2 uur continu draaien op 4 °C.
    OPMERKING: De toevoeging van Triton X helpt bij het lyseren van de cellen ter voorbereiding op sonicatie.
  9. Centrifugeer de lysaten bij 26.900 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Terwijl dit gebeurt, begint u met het voorbereiden van de kobalthars (zie Tabel met materialen). Gebruik 500 μL kobalthars voor 1 L E. coli-cultuur . Was de hars 2x met ultrapuur water en eenmaal met Suspension Buffer door te centrifugeren op 4.347 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
  10. Na het centrifugeren met lysaat het supernatans mengen met de gewassen hars en 30 minuten zachtjes schudden bij 4 °C.
  11. Centrifugeer de lysaatharssuspensie bij 4.347 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. De hars wordt op de bodem van de buis verpakt. Zonder de hars te verstoren, verwijdert u het supernatant.
  12. Was de hars met resuspensiebuffer door te centrifugeren bij 4.347 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Herhaal wasbeurten totdat het supernatans kleurloos is.
  13. Bereid elutiebuffer voor die 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 5 mM imidazool, 10% glycerol, 4 mM 2-mercaptoethanol en 0,25 μM SENP2-protease bevat (zie Materiaaltabel). Bewaar het op ijs.
  14. Resuspendeer de hars in 1 ml Resuspensiebuffer en incubeer deze een nacht bij 4 °C met continue rotatie.
  15. Centrifugeer de volgende dag gedurende 2 minuten op 4.347 x g om de hars te pelleteren. Verzamel het supernatant, dat het gespleten lichte keteneiwit en het protease bevat.
  16. Voeg 1 ml Elution Buffer toe aan de hars. Herhaal de centrifugatie en verzamel het supernatant.
  17. Verwijder de protease door middel van snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC). Bereid in het kort de kolom voor het uitsluiten van de grootte voor (zie Materiaaltabel) met een buffer die 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% glycerol en 5 mM DTT (pH 7,4) bevat. Concentreer het supernatans tot 500 μL met behulp van een concentreerbuis van 10.000 MWCO. Laad het geconcentreerde monster met behulp van een injectiespuit op een kolom die is aangesloten op een geautomatiseerd chromatografiesysteem en giet door met een buffer die 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% glycerol en 5 mM DTT (pH 7,4) bevat. Bewaak de verzamelde fracties met behulp van een ultraviolette spectrofotometrie. Verzamel de eiwitfracties met een molecuulgewicht dat overeenkomt met de lichte ketens.
    OPMERKING: De protease kan ook worden verwijderd door affiniteitschromatografie als een zuiveringstag (bijv. GST-tag) in de protease is ingebouwd.
  18. Laat een SDS-PAGE-gel uit met de elutiefracties om de zuiverheid en relatieve concentraties van de lichte keteneiwitten in elke fractie te bepalen. Gewenste fracties zijn die welke geconcentreerde lichte keteneiwitten bevatten zonder zichtbare proteasebanden. Combineer de gewenste eiwitfracties en concentreer ze met behulp van een 10.000 MWCO concentreerbuis35.
  19. Vries aliquots van eiwitten in vloeibare stikstof snel in en breng ze onmiddellijk over naar -80 °C voor langdurige opslag (figuur 3B).
    OPMERKING: De opbrengst van RLC en CALML4 met behulp van het E. coli His6-SUMO-systeem is ongeveer 1-2 mg/L.

3. Myosine-7a-op maat gemaakte actinefilament glijdende test (3 uur)

OPMERKING: De methoden die in deze sectie worden gebruikt, zijn vergelijkbaar met die beschreven voor andere myosines31 , met als belangrijkste wijzigingen de incubatie en toepassing van myosine in een buffer met hoge ionische sterkte en het lange interval dat nodig is om nauwkeurige metingen van frame-tot-frame verplaatsingen te bereiken.

  1. Bereid 20 μM filamenteuze actine (F-actine) voor door bolvormig actine (G-actine) te polymeriseren in polymerisatiebuffer (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0)) bij 4 °C 's nachts. Label F-actine door 1,2x molaire overmaat rhodamine-phalloidine toe te voegen (zie Materiaaltabel). Dek af met aluminiumfolie en incubeer minimaal 2 uur op ijs.
    OPMERKING: G-actine kan worden gekocht bij commerciële verkopers (zie Materiaaltabel) of worden gezuiverd uit konijnenspieracetonpoeder31,37. Het geëtiketteerde F-actine kan bij deze concentratie tot 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
  2. Bereid een stroomkamer voor zoals eerder beschreven31. Plaats kort twee stroken dubbelzijdige tape met een onderlinge afstand van 2-3 mm op een gereinigd en met nitrocellulose behandeld microscoopglaasje (zie Materiaaltabel). Leg het dekglaasje met de nitrocellulosekant naar beneden op de strips, zodat een stroomkamer ontstaat met een volume van ongeveer 10 μl (figuur 4).
  3. Uitvoeren van actine filament glijdende assay
    1. Voeg aan de stroomkamer een kamervolume van 0,2 mg/ml gezuiverd humaan myosine-7a-eiwit toe in 500 mM NaCl Motiliteitsbuffer (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Laat 5 minuten op kamertemperatuur incuberen.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om myosine-7a toe te voegen aan een buffer met veel zout, omdat dit de auto-geremde toestand verlicht en myosine-7a in staat stelt zich te hechten aan het oppervlak in de geactiveerde conformatie.
    2. Was de stroomkamer met driekamervolumes van 1 mg/ml BSA (zie materiaaltabel) in 150 mM NaCl Motiliteitsbuffer (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)) en trek de vloeistof erdoor met een schoon doekje aan de uitlaat om overtollige vloeistof te absorberen. Incubeer gedurende 1 minuut na de 3ewasbeurt .
    3. Laat één kamervolume van 10 nM rhodamine phalloidine-gelabeld F-actine in 150 mM NaCl Motiliteitsbuffer door de stroomkamer stromen. Bewaak de binding van actinefilamenten aan het oppervlak onder een fluorescerende microscoop met 100x objectief. De dichtheid van actinefilamenten moet optimaal zijn (Figuur 5A), zodat er voldoende filamenten in het gezichtsveld zijn om te kunnen volgen, maar schaars genoeg om overlapping van meerdere filamenten te voorkomen, wat het volgen bemoeilijkt.
    4. Was de stroomkamer met driekamervolumes van 150 mM NaCl Motility Buffer om ongebonden actinefilamenten en overtollig rhodamine-falloidine te verwijderen.
    5. Start de beweeglijkheid door één kamervolume van de uiteindelijke buffer toe te voegen (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2,5 mg/ml glucose, 100 μg/ml glucose-oxidase, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
    6. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met behulp van 561 nm excitatie om rhodamine-falloidine-gelabelde actine te visualiseren. Zoek een gebied op de dia met de gewenste actinedichtheid (Figuur 5A) en maak gedurende 30 minuten elke 30 s beelden.
      OPMERKING: De snelheid van zoogdiermyosine-7a is ongeveer 5 nm/s. Bij het instellen van de acquisitieframesnelheid is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de verplaatsingen van de filamenten tussen frames lang genoeg zijn (meer dan één pixel) om nauwkeurige tracking mogelijk te maken. Subpixelbewegingen tussen frames kunnen zorgen voor een overschatting van de snelheid. Dankzij de framesnelheid van 30 s kunnen de actinefilamenten ongeveer 150 nm tussen frames verplaatsen, wat overeenkomt met meer dan twee pixels op de microscoop. Er moet echter voor worden gezorgd dat er een aanzienlijke verplaatsing kan worden waargenomen op de gebruikte microscoop. Indien beschikbaar, kan opname in meerdere posities worden gebruikt om tegelijkertijd meerdere gezichtsvelden te verzamelen voor analyse.
  4. Analyse van de beweging van de actinefilamenten met behulp van het FAST-programma (geïnstalleerd op een Mac)38.
    OPMERKING: Het FAST-programma dat hier wordt gebruikt, is slechts een van de vele opties voor het kwantificeren van de beweging van het filament. We hebben ervoor gekozen om FAST te gebruiken omdat het geautomatiseerd en snel is en er geen betaalde software voor nodig is. Andere opties zijn onder meer op MATLAB gebaseerde algoritmen zoals FIESTA, op ImageJ/FIJI gebaseerde methoden zoals MTrack2 en Manual Tracking, en op Python gebaseerde methoden zoals Philament39.
    1. Download en installeer het FAST-programma (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3-compatibele versie met een extra module voor. nd2-bestandsconversie. NB: De originele versie van python2 is te vinden op github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. Voer het FAST-programma uit zoals beschreven in38 met een tolerantiewaarde van 33 om alleen soepel bewegende filamenten te behouden.
      OPMERKING: Als afbeeldingen drift bevatten door mechanische problemen met het podium of door het gelijktijdig verzamelen van meerdere series, moeten de films eerst worden gestabiliseerd. Hiervoor raden we de FIJI-plug-in Image Stabilizer aan, die kan worden gedownload op het volgende adres - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. Gebruik het FAST-programma om de nieuw gemaakte .tif afbeeldingen te analyseren door eerst de waarden -xmax en -ymax in te stellen. Deze stellen de parameters in voor de output van het scatterplot door het programma en vertegenwoordigen de langste filamentlengte (in nm) en de maximale filamentsnelheid (in nm/s). We gebruikten in dit voorbeeld 20.000 nm voor -xmax en 20 nm/s voor -ymax om ervoor te zorgen dat alle gegevens worden vastgelegd (Figuur 5D).
    4. Gebruik -px om de pixelgrootte van het verkregen beeld in te stellen, die hier 65 nm zal zijn, en -minv om de minimale snelheid (in nm/s) in te stellen die nodig is voor een filament om in de analyse te worden opgenomen. Voor de lage snelheid van myosine-7a in dit voorbeeld gebruik je 0,1 nm/s.
    5. Gebruik -maxd om de maximaal toegestane afstand tussen frames in te stellen voor filamenten die moeten worden gekoppeld. Dit is ingesteld om te voorkomen dat er afzonderlijke filamenten tussen frames worden gekoppeld en in dit voorbeeld gebruiken we de standaard 2000 nm.
    6. Gebruik-pt om de tolerantie voor fluctuaties in filamentsnelheden in te stellen en neem alleen filamenten op met vloeiende bewegingen. In dit voorbeeld wordt een tolerantiedrempel van 33% gebruikt. Dit betekent dat filamenten met een standaarddeviatie van de snelheid groter dan 33% van het snelheidsgemiddelde worden uitgesloten van verdere analyse.
    7. Gebruik ten slotte -d om de map aan te geven met de .tif stapels voor analyse. De volledige opdrachtreeks met de gegeven parameters en waarden is: snel -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [mapnaam met films].
      OPMERKING: Het FAST-programma voert spreidingsdiagrammen uit (Afbeelding 5D) met de bijbehorende onbewerkte gegevens, die kunnen worden geëxtraheerd voor analyse en visualisatie in andere programma's (Afbeelding 5C). Het zal ook een grafiek van de paden van de gevolgde filamenten opleveren (Figuur 5B), die moet worden gebruikt om te controleren of de tracering werkt zoals verwacht. Voorbeelden van de plots en andere mogelijke datavisualisaties zijn hieronder opgenomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gezuiverde myosine-7a-complex en de lichte keteneiwitten kunnen worden geëvalueerd door SDS-PAGE-gelelektroforese, zoals weergegeven in figuur 3. De band boven de 200 kDa-marker komt overeen met de zware myosine-7a-keten (255 kDa). De drie banden die tussen de 22 en 14 kDa-markers van boven naar beneden migreren, zijn respectievelijk RLC (20 kDa), calmoduline en CALML4. Hoewel calmoduline en CALML4 een vergelijkbaar molecuulgewicht hebben van ongeveer 17...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de productie van recombinant humaan myosine-7a-eiwit uit insectencellen. Hoewel het Sf9/baculovirus-systeem is gebruikt om een verscheidenheid aan myosines 40,41,42,43 te produceren, is het zoogdiermyosine-7a pas onlangs met succes gezuiverd met behulp van het MultiBac-baculovirussysteem 14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We danken de Microscopy Imaging Facility en Visual Function and Morphology Core aan de West Virginia University voor de discussie en hulp bij beeldanalyse. Dit werk wordt ondersteund door de tenure-track startup-fondsen van de West Virginia University School of Medicine aan R.L. Dit werk wordt ook ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), het Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence (Vs-CoBRE) (P20GM144230) en het NIGMS West Virginia Network of Biomedical Research Excellence (WV-INBRE) (P20GM103434).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL microcentrifuge tubesVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ACustom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslipsVWR48366-227
250 mL Conical Centrifuge TubesNunc376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker FlaskIntelixBioDBJ-SF250VP
2-MercaptoethanolVWRM131
75x25x1 mm Vistavision microscope slidesVWR16004-42
Actin Protein (>99% Pure)CytoskeletonAKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Disposable Chromatography ColumnBio-Rad732-6008
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher15519028
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
BstXI EnzymeNew England BiolabsR0113S
CalmodulinMillipore Sigma208694
CatalaseMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Expression SystemThermo FisherK30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Double-Sided TapeOffice Depot909955
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EthanolThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Transfection ReagentGibcoA38915
FAST programhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Fisherbrand Model 505 Sonic DismembratorFisher ScientificFB505110
Gentamicin Reagent SolutionGibco15710-06410 mg/mL in distilled water
GlucoseMillipore SigmaG5767
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
GlycerolInvitrogen15514-011
HisPur Cobalt ResinThermo Fisher89966
I-CeuI EnzymeNew England BiolabsR0699S
Image Stabilizer Pluginhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanolFisher ScientificA451SK
KanamycinFisher ScientificAAJ67354AD
Large Orifice Pipet TipsFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, Ready-Made PowderThermo FisherJ75851-A1
Leupeptin Protease InhibitorThermo Fisher78435
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Max Efficiency DH10Bac Competent CellsGibco10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope CameraORCA-Fusion BT
Microscope Laser UnitAndor iXon Ultra
Miller's LB BrothCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocelluloseLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (

Referenties

  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A. Myosin-driven intracellular transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972(2018).
  4. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).
  5. Peckham, M. Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).
  6. Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. To understand muscle you must take it apart. Front Physiol. 5, 90(2014).
  7. Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. Unconventional myosins and the genetics of hearing loss. Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).
  8. Geeves, M. A., Holmes, K. C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).
  9. Batters, C., Veigel, C. Mechanics and activation of unconventional myosins. Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).
  10. Houdusse, A., Sweeney, H. L. How myosin generates force on actin filaments. Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).
  11. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biol. 8 (9), R196(2007).
  12. Moreland, Z. G., Bird, J. E. Myosin motors in sensory hair bundle assembly. Curr Opin Cell Biol. 79, 102132(2022).
  13. Williams, D. S., Lopes, V. S. The many different cellular functions of MYO7A in the retina. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).
  14. Hollo, A., et al. Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a. J Biol Chem. 299 (10), 105243(2023).
  15. Choi, M. S., et al. The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex. J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).
  16. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nat Commun. 7, 10833(2016).
  17. Whatley, M., et al. Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy. Front Genet. 11, 565216(2020).
  18. Ahmed, Z. M., et al. USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23. Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).
  19. Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice. Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  21. Houdusse, A., Titus, M. A. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).
  22. Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. Review series: The cell biology of hearing. J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).
  23. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
  24. Fitzgerald, D. J., et al. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  25. Sari, D., et al. The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics. Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).
  26. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration. Nat Commun. 14 (1), 7761(2023).
  27. Courtney, K. C., et al. The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes. Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).
  28. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118(2021).
  29. Yu, I. M., et al. Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin. Nat Commun. 8, 15864(2017).
  30. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  31. Sellers, J. R. In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2(2001).
  32. Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays. J Vis Exp. (168), e62180(2021).
  33. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  34. Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions. Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).
  35. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Basic methods in cellular and molecular biology. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  36. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  37. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).
  38. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).
  39. Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays. Biophys Rep. 4 (1), 100147(2024).
  40. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  41. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  42. Billington, N., et al. Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments. Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).
  43. Lu, W., et al. Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination. Elife. 9, 54216(2020).
  44. Liu, R., et al. A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly. Nat Commun. 12 (1), 563(2021).
  45. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks. Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).
  46. Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus. Gene. 156 (2), 229-233 (1995).
  47. Li, J., et al. Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension. Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).
  48. Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin. Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Zuivering van Myosine-7aActin-gebaseerde motorUsher-syndroomproteïne-expressiein vitro motiliteitfluorescentiemicroscopiemotorproteïnecomplex
MultiBac-systeemgebaseerde zuivering en biofysische karakterisering van humaan myosine-7a
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.