Dit protocol biedt een methode voor het volgen van geautomatiseerde oogloensen bij knaagdieren in de loop van de tijd op een manier die compatibel is met tijdvergrendeling voor neurofysiologische metingen. Dit protocol zal naar verwachting nuttig zijn voor onderzoekers die mechanismen van pijnstoornissen zoals migraine bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een geautomatiseerde loensmethode voor tijdsynchroniserend gedrag en hersendynamiek in pijnstudies bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Spontane pijn is een uitdaging om in realtime te volgen en te kwantificeren op een manier die menselijke vooringenomenheid voorkomt. Dit geldt met name voor metrieken van hoofdpijn, zoals bij aandoeningen zoals migraine. Oogscheel kijken is naar voren gekomen als een continue variabele metriek die in de loop van de tijd kan worden gemeten en effectief is voor het voorspellen van pijntoestanden in dergelijke onderzoeken. Dit artikel biedt een protocol voor het gebruik van DeepLabCut (DLC) om oogscheelzien (Euclidische afstand tussen oogleden) te automatiseren en te kwantificeren bij ingetogen muizen met vrij roterende hoofdbewegingen. Dit protocol maakt het mogelijk om onbevooroordeelde kwantificering van oogscheel kijken te koppelen aan en direct te vergelijken met mechanistische metingen zoals neurofysiologie. We bieden een beoordeling van AI-trainingsparameters die nodig zijn voor het behalen van succes, zoals gedefinieerd door het onderscheiden van loensen en niet-scheelzien. We tonen het vermogen aan om scheelzien in een CGRP-geïnduceerd migraine-achtig fenotype betrouwbaar te volgen en te differentiëren met een resolutie van minder dan een seconde.
Inleiding
Migraine is wereldwijd een van de meest voorkomende hersenaandoeningen en treft meer dan een miljardmensen1. Preklinische muismodellen van migraine zijn naar voren gekomen als een informatieve manier om de mechanismen van migraine te bestuderen, aangezien deze onderzoeken gemakkelijker kunnen worden gecontroleerd dan studies bij mensen, waardoor causale studie van migraine-gerelateerd gedrag mogelijk wordt. Dergelijke modellen hebben een sterke en herhaalbare fenotypische respons aangetoond op migraine-inducerende verbindingen, zoals calcitonine-gen-gerelateerd peptide (CGRP). De behoefte aan robuuste metingen van migraine-relevant gedrag in knaagdiermodellen blijft bestaan, vooral die welke kunnen worden gekoppeld aan mechanistische metrieken zoals beeldvorming en elektrofysiologische benaderingen.
Migraine-achtige hersentoestanden zijn fenotypisch gekenmerkt door de aanwezigheid van lichtaversie, pootallodynie, hyperalgesie van het gezicht voor schadelijke stimuli en gezichtsgrimas3. Dergelijk gedrag wordt gemeten aan de hand van de totale tijd die in licht wordt doorgebracht (lichtaversie) en gevoeligheidsdrempels voor poot- of gezichtsaanraking (pootallodynie en gezichtshyperalgesie) en is beperkt tot een enkele uitlezing gedurende lange perioden (minuten of langer). Migraine-achtig gedrag kan bij dieren worden uitgelokt door te doseren met migraine-inducerende verbindingen zoals CGRP, die de symptomen nabootsen die worden ervaren door menselijke patiënten met migraine3 (d.w.z. gezichtsvaliditeit aantonen). Dergelijke verbindingen veroorzaken ook migrainesymptomen wanneer ze bij mensen worden toegediend, wat de constructvaliditeit vandeze modellen aantoont. Studies waarin gedragsfenotypes farmacologisch werden verzwakt, hebben geleid tot ontdekkingen met betrekking tot de behandeling van migraine en bieden verdere onderbouwing van deze modellen (d.w.z. het aantonen van voorspellende validiteit)5,6.
Van een monoklonaal anti-CGRP-antilichaam (ALD405) werd bijvoorbeeld aangetoond dat het lichtaversief gedrag5 en gezichtsgrimas vermindert bij muizen6 die met CGRP werden behandeld, en andere onderzoeken hebben aangetoond dat CGRP-antagonisten door lachgas geïnduceerd migraine-achtig gedrag bij dieren verminderen 7,8. Recente klinische onderzoeken hebben succes aangetoond bij de behandeling van migraine door CGRP 9,10 te blokkeren, wat heeft geleid tot meerdere door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen die gericht zijn op CGRP of zijn receptor. Preklinische beoordeling van migraine-gerelateerde fenotypes heeft geleid tot doorbraken in klinische bevindingen en is daarom essentieel voor het begrijpen van enkele van de meer complexe aspecten van migraine die moeilijk direct bij mensen te testen zijn.
Ondanks tal van voordelen zijn experimenten met behulp van deze knaagdiergedragsuitlezingen van migraine vaak beperkt in hun vermogen om op het tijdstip te bemonsteren en kunnen ze subjectief zijn en vatbaar voor menselijke experimentele fouten. Veel gedragstesten zijn beperkt in het vermogen om activiteit vast te leggen met fijnere temporele resoluties, waardoor het vaak moeilijk is om meer dynamische elementen vast te leggen die zich voordoen op een tijdschaal van minder dan een seconde, zoals op het niveau van hersenactiviteit. Het is moeilijk gebleken om de meer spontane, natuurlijk voorkomende elementen van gedrag in de loop van de tijd te kwantificeren met een zinvolle temporele resolutie voor het bestuderen van neurofysiologische mechanismen. Het creëren van een manier om migraine-achtige activiteit op snellere tijdschalen te identificeren, zou het mogelijk maken om migraine-achtige hersentoestanden extern te valideren. Dit kan op zijn beurt worden gesynchroniseerd met hersenactiviteit om robuustere hersenactiviteitsprofielen van migraine te creëren.
Een van die migraine-gerelateerde fenotypes, gezichtsgrimas, wordt in verschillende contexten gebruikt als een meting van pijn bij dieren die onmiddellijk kan worden gemeten en in de loop van de tijd kan worden gevolgd. Gezichtsgrimas wordt vaak gebruikt als een indicator van spontane pijn, gebaseerd op het idee dat mensen (vooral non-verbale mensen) en andere zoogdiersoorten natuurlijke veranderingen in gezichtsuitdrukking vertonen bij het ervarenvan pijn. Studies die gezichtsgrimas meten als een indicatie van pijn bij muizen in het afgelopen decennium hebben schalen zoals de Mouse Grimace Scale (MGS) gebruikt om de karakterisering van pijn bij knaagdieren te standaardiseren. De gezichtsuitdrukkingsvariabelen van de MGS zijn onder meer orbitale verstrakking (scheelzien), neusuitstulping, wanguitstulping, oorpositie en verandering van snorharen. Hoewel is aangetoond dat de MGS pijn bij dieren betrouwbaar karakteriseert13, is het notoir subjectief en berust het op nauwkeurige scores, die kunnen variëren tussen experimentatoren. Bovendien is de MGS beperkt in die zin dat het een niet-continue schaal gebruikt en niet de temporele resolutie heeft die nodig is om natuurlijk voorkomend gedrag in de loop van de tijd te volgen.
Een manier om dit tegen te gaan is door een consistent gelaatskenmerk objectief te kwantificeren. Scheel kijken is het meest consistent traceerbare gelaatskenmerk6. Scheel kijken is verantwoordelijk voor het grootste deel van de totale variabiliteit in de gegevens wanneer rekening wordt gehouden met alle MGS-variabelen (scheelzien, neusuitstulping, wanguitstulping, oorpositie en verandering van snorharen)6. Omdat scheelzien het meest bijdraagt aan de algehele score die wordt verkregen met behulp van de MGS en de respons op CGRP 6,14 betrouwbaar bijhoudt, is het de meest betrouwbare manier om spontane pijn in migrainemuismodellen te volgen. Dit maakt scheelzien een kwantificeerbaar niet-homeostatisch gedrag dat wordt geïnduceerd door CGRP. Verschillende laboratoria hebben gezichtsuitdrukkingskenmerken gebruikt, waaronder scheelzien, om mogelijke spontane pijn geassocieerd met migraine weer te geven 6,15.
Er zijn nog verschillende uitdagingen met betrekking tot het uitvoeren van geautomatiseerde loensen op een manier die kan worden gekoppeld aan mechanistische studies van migraine. Het was bijvoorbeeld moeilijk om scheelzien betrouwbaar te volgen zonder te vertrouwen op een vaste positie die tijdens sessies op dezelfde manier moet worden gekalibreerd. Een andere uitdaging is de mogelijkheid om dit type analyse op continue schaal uit te voeren in plaats van discrete schalen zoals de MGS. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, wilden we machine learning, in de vorm van DeepLabCut (DLC), integreren in onze pijplijn voor data-analyse. DLC is een machine learning-model voor het schatten van poses, ontwikkeld door Mathis en collega's en is toegepast op een breed scala aan gedragingen16. Met behulp van hun software voor het schatten van poses konden we modellen trainen die punten op een muizenoog nauwkeurig konden voorspellen met bijna menselijke nauwkeurigheid. Dit lost de problemen van repetitief handmatig scoren op, terwijl ook de temporele resolutie drastisch wordt verhoogd. Verder hebben we, door het maken van deze modellen, een herhaalbare manier gemaakt om scheel te scoren en migraine-achtige hersenactiviteit te schatten over grotere experimentele groepen. Hier presenteren we de ontwikkeling en validatie van deze methode voor het volgen van scheelziend gedrag op een manier die kan worden gekoppeld aan andere mechanistische metingen zoals neurofysiologie. Het overkoepelende doel is om mechanistische studies te katalyseren die tijdgebonden loensengedrag in knaagdiermodellen vereisen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle dieren die in deze experimenten werden gebruikt, werden behandeld volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Iowa.
1. Bereid apparatuur voor op gegevensverzameling
- Zorg voor de beschikbaarheid van alle benodigde apparatuur: zorg ervoor dat de aanbevolen hardware voor het uitvoeren van DLC ten minste 8 GB geheugen heeft. Zie de Tabel met materialen voor informatie met betrekking tot hardware en software.
OPMERKING: Gegevens kunnen in elk formaat worden verzameld, maar moeten vóór de analyse worden geconverteerd naar een formaat dat door DLC kan worden gelezen. De meest voorkomende formaten zijn AVI en MP4. - Configureer ten minste één camera zodat één oog van een dier kan worden gedetecteerd. Als beide ogen zichtbaar zijn, voer dan extra filtering uit, omdat dit interferentie kan veroorzaken bij het volgen. Zie sectie 10 voor een voorbeeld van een dergelijke filtering voor de hier verstrekte gegevens.
- Installeer DLC met behulp van het pakket dat je op Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
- Neem in de camera-instellingen een enkele camera op in een zijhoek (~90°) ten opzichte van de muis. Om dit voorbeeld te volgen, neemt u een monster op 10 Hz, waarbij de muizen beperkt zijn maar vrij zijn om toegang te krijgen tot hun volledige scala aan hoofdbewegingen ten opzichte van het lichaam. Houd tussen de 2 en 4 inch van de camera tot het dier.
2. DLC instellen
- Creëer na het installeren van DLC de omgeving om vanuit te werken. Om dit te doen, navigeert u naar de map waarin de DLC-software is gedownload met behulp van de wijzigingsmap met de volgende opdracht.
cd folder_name
OPMERKING: Dit is waar het bestand DEEPLABCUT.yaml zich bevindt. - Voer de eerste opdracht uit om de omgeving te maken en schakel deze in door de tweede opdracht te typen.
conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
conda activeren Deeplabcut
OPMERKING: Zorg ervoor dat de omgeving is geactiveerd voor elk gebruik van DLC.
Nadat u de omgeving hebt geactiveerd, opent u de grafische gebruikersinterface (GUI) met de volgende opdracht en begint u met het maken van het model.
python -m deeplabcut
3. Creëer het model
- Nadat de GUI is geopend, begint u met het maken van een model door onderaan op Nieuw project maken te klikken.
- Noem het project iets zinvols en unieks om het later te identificeren en voer een naam in als experimentator. Controleer het gedeelte Locatie om te zien waar het project wordt opgeslagen.
- Selecteer Bladeren door mappen en zoek de video's om het model te trainen. Selecteer Video's naar projectmap kopiëren als de video's niet uit de oorspronkelijke map moeten worden verplaatst.
- Selecteer Maken om een nieuw project op de computer te genereren.
OPMERKING: De video's moeten het volledige bereik van het gedrag dat u zult waarnemen bestrijken (d.w.z. loensen, niet-scheelzien en al het gedrag daartussenin). Het model kan alleen gedrag herkennen dat lijkt op dat in de trainingsgegevens, en als sommige componenten van het gedrag ontbreken, kan het model moeite hebben om het te herkennen.
4. Configureer de instellingen
OPMERKING: Hier kunnen details worden gedefinieerd, zoals welke punten moeten worden bijgehouden, hoeveel frames uit elke trainingsvideo moeten worden geëxtraheerd, de standaard labelgrootte van de stippen en variabelen met betrekking tot de manier waarop het model zal trainen.
- Nadat u het model hebt gemaakt, bewerkt u de configuratie-instellingen door Bewerken config.yml te selecteren. Selecteer bewerken om het bestand met configuratie-instellingen te openen om de belangrijkste instellingen met betrekking tot het model op te geven.
- Wijzig lichaamsdelen om alle delen van het oog op te nemen om te volgen en wijzig vervolgens numframes2pick in het aantal frames dat nodig is per trainingsvideo om in totaal 400 frames te krijgen. Wijzig ten slotte de puntgrootte in zes , zodat de standaardgrootte bij het labelen klein genoeg is om nauwkeurig rond de randen van het oog te worden geplaatst.
5. Trainingsframes extraheren
- Navigeer na de configuratie naar het tabblad Frames extraheren bovenaan de GUI en selecteer Frames extraheren rechtsonder op de pagina.
- Bewaak de voortgang met behulp van de laadbalk onder aan de GUI.
6. Label trainingsframes
- Navigeer naar het tabblad Label Frames in de GUI en selecteer Label Frames. Zoek het nieuwe venster met mappen voor elk van de geselecteerde trainingsvideo's. Selecteer de eerste map en er wordt een nieuwe labeling-GUI geopend.
- Label de punten die tijdens de configuratie zijn gedefinieerd voor elk frame van de geselecteerde video. Nadat alle frames zijn gelabeld, slaat u ze op en herhaalt u het proces voor de volgende video.
- Voor een adequate etikettering van scheelzien, gebruikt u twee punten zo dicht mogelijk bij de grootste piek van het oog (midden) en geeft u de omhoog/omlaag-posities voor elk punt aan. Squint bij benadering als het gemiddelde van deze twee lengtes.
OPMERKING: Bij het labelen slaat DLC de voortgang niet automatisch op. Periodiek opslaan wordt aanbevolen om verlies van gelabelde gegevens te voorkomen.
7. Maak een trainingsdataset
- Navigeer na het handmatig labelen naar het tabblad Treinnetwerk en selecteer Netwerk trainen om de software te vragen het model te trainen.
- Bewaak de voortgang in het opdrachtvenster.
8. Evalueer het netwerk
- Nadat de netwerktraining is voltooid, navigeert u naar het tabblad Netwerk evalueren en selecteert u Netwerk evalueren. Wacht even totdat de blauwe laadcirkel verdwijnt om aan te geven dat de zelfevaluatie is voltooid en het model klaar is voor gebruik.
9. Analyseer gegevens/genereer gelabelde video's
- Als u video's wilt analyseren, navigeert u naar het tabblad Video's analyseren . Selecteer Meer video's toevoegen en selecteer de video's die u wilt analyseren.
- Selecteer Resultaat(en) opslaan als csv als een csv-uitvoer van de gegevens voldoende is.
- Wanneer de video's allemaal zijn verkregen, selecteert u onderaan Video's analyseren om de analyse van de video's te starten.
OPMERKING: Deze stap moet worden voltooid voordat u gelabelde video's genereert in stap 9.5 - Nadat de video's zijn geanalyseerd, navigeert u naar het tabblad Video's maken en selecteert u de geanalyseerde video's.
- Selecteer Video's maken en de software begint met het genereren van gelabelde video's die de gegevens vertegenwoordigen die worden weergegeven in de bijbehorende .csv.
10. Eindgegevens verwerken
- Pas de macro's toe die u https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc vindt om onbewerkte gegevens te converteren naar het formaat dat voor deze analyse wordt gebruikt (d.w.z. de Euclidische afstand).
- Importeer macro's met het label Stap 1 en Stap 2 en pas ze toe op het csv om alle suboptimale gegevenspunten uit te filteren en de gegevens te converteren naar een gemiddelde Euclidische afstand voor de middelste punten aan de boven- en onderkant van het oog.
- Voer een macro met de naam Stap 3 uit om elk punt te markeren als een 0 geen scheelzien en 1 scheelzien op basis van de drempelwaarde in het script, die is ingesteld op 75 pixels.
OPMERKING: De parameters voor deze macro's moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de experimentele opstelling (zie discussie). De drempel voor scheelzien en het automatische filter voor de maximale waarde van het oog zijn parameters die kunnen worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van het dier en de afstand tot de camera. U kunt ook de waarden aanpassen die worden gebruikt voor het verwijderen van suboptimale punten, afhankelijk van hoe selectief de gegevens moeten worden gefilterd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier bieden we een methode voor de betrouwbare detectie van scheelzien bij hoge temporele resolutie met behulp van DeepLabCut. We hebben de trainingsparameters geoptimaliseerd en we geven een evaluatie van de sterke en zwakke punten van deze methode (Figuur 1).
Nadat we onze modellen hadden getraind, hebben we geverifieerd dat ze in staat waren om de bovenste en onderste punten van het ooglid correct te schatten (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een gemakkelijk toegankelijke, diepgaande methode voor het gebruik van op machine learning gebaseerde tools die scheel kijken met bijna menselijke nauwkeurigheid kunnen differentiëren, terwijl dezelfde (of betere) temporele resolutie van eerdere benaderingen behouden blijft. In de eerste plaats maakt het de evaluatie van geautomatiseerd loensen gemakkelijker beschikbaar voor een breder publiek. Onze nieuwe methode voor het evalueren van geautomatiseerd scheelzien heeft...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben geen belangenconflicten om bekend te maken. De standpunten in dit document zijn niet representatief voor de VA of de regering van de Verenigde Staten.
Dankbetuigingen
Met dank aan Rajyashree Sen voor inzichtelijke gesprekken. Dankzij de McKnight Foundation Neurobiology of Disease Award (RH), NIH 1DP2MH126377-01 (RH), de Roy J. Carver Charitable Trust (RH), NINDS T32NS007124 (MJ), Ramon D. Buckley Graduate Student Award (MJ) en VA-ORD (RR&D) MERIT 1 I01 RX003523-0 (LS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CUDA toolkit 11.8 | |||
| cuDNN SDK 8.6.0 | |||
| Intel computers met Windows 11, 13e generatie | |||
| LabFaceX 2D Eyelid Tracker Add-on Module voor een Free Roaming Muis: | FaceX LLC | NA | Elke camera die het oog van een dier kan opnemen is voldoende, maar dit is onze oogvolghardware. |
| NVIDIA GPU-stuurprogramma dat versie 450.80.02 of hoger is | |||
| NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6 | NVIDIA | [490-BHXV] | Elke GPU die voldoet aan de minimale vereisten gespecificeerd voor uw versie van DLC, momenteel 8 GB, is voldoende. We gebruikten de NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU |
| Python 3.9-3.11 | |||
| TensorFlow versie 2.10 |
Referenties
- Disease, G. B. D., Injury, I., Prevalence, C. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: A systematic analysis for the global burden of disease study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Russo, A. F. Cgrp as a neuropeptide in migraine: Lessons from mice. Br J Clin Pharmacol. 80 (3), 403-414 (2015).
- Wattiez, A. S., Wang, M., Russo, A. F. Cgrp in animal models of migraine. Handb Exp Pharmacol. 255, 85-107 (2019).
- Hansen, J. M., Hauge, A. W., Olesen, J., Ashina, M. Calcitonin gene-related peptide triggers migraine-like attacks in patients with migraine with aura. Cephalalgia. 30 (10), 1179-1186 (2010).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. J Neurosci. 37 (1), 204-216 (2017).
- Rea, B. J., et al. Peripherally administered cgrp induces spontaneous pain in mice: Implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).
- Kopruszinski, C. M., et al. Prevention of stress- or nitric oxide donor-induced medication overuse headache by a calcitonin gene-related peptide antibody in rodents. Cephalalgia. 37 (6), 560-570 (2017).
- Juhasz, G., et al. No-induced migraine attack: Strong increase in plasma calcitonin gene-related peptide (cgrp) concentration and negative correlation with platelet serotonin release. Pain. 106 (3), 461-470 (2003).
- Aditya, S., Rattan, A. Advances in cgrp monoclonal antibodies as migraine therapy: A narrative review. Saudi J Med Med Sci. 11 (1), 11-18 (2023).
- Goadsby, P. J., et al. A controlled trial of erenumab for episodic migraine. N Engl J Med. 377 (22), 2123-2132 (2017).
- Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neurosci Biobehav Rev. 116, 480-493 (2020).
- Whittaker, A. L., Liu, Y., Barker, T. H. Methods used and application of the mouse grimace scale in biomedical research 10 years on: A scoping review. Animals (Basel). 11 (3), 673(2021).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Rea, B. J., et al. Automated detection of squint as a sensitive assay of sex-dependent calcitonin gene-related peptide and amylin-induced pain in mice. Pain. 163 (8), 1511-1519 (2022).
- Tuttle, A. H., et al. A deep neural network to assess spontaneous pain from mouse facial expressions. Mol Pain. 14, 1744806918763658(2018).
- Mathis, A., et al. Deeplabcut: Markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Wattiez, A. S., et al. Different forms of traumatic brain injuries cause different tactile hypersensitivity profiles. Pain. 162 (4), 1163-1175 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
