Methodenartikel

Lumbale intrathecale injectie van gentherapievectoren voor targeting van het centrale zenuwstelsel bij muizen en ratten

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67138

⸱

16 mei 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UT Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een lumbale intrathecale injectie vertegenwoordigt een translationeel relevante toedieningsweg voor het toedienen van gentherapie aan het centrale zenuwstelsel. Dit uitgebreide gestandaardiseerde protocol voor lumbale intrathecale injecties bij neonatale, juveniele en volwassen muizen en ratten is bedoeld om onderzoekers te begeleiden bij het toepassen van deze techniek voor preklinische gentherapiestudies.

Samenvatting

Een methode om het centrale zenuwstelsel aan te pakken voor de behandeling van neurologische aandoeningen is het gebruik van de lumbale intrathecale toedieningsweg. Deze benadering omzeilt de bloed-hersenbarrière om rechtstreeks toegang te krijgen tot het hersenvocht en zich bij voorkeur te richten op cellen in het centrale zenuwstelsel. Meerdere gepubliceerde preklinische studies waarbij gebruik wordt gemaakt van de lumbale intrathecale injectieroute hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van klinische onderzoeken naar gentherapie; De beschreven protocollen zijn echter variabel en verspreid over meerdere bronnen. Hier wordt een uitgebreide reeks protocollen voor lumbale intrathecale injecties bij neonatale, juveniele en volwassen muizen en ratten voor preklinische gentherapiestudies gepresenteerd. Met de juiste training kan deze injectietechniek snel en betrouwbaar worden uitgevoerd. Naast het detailleren van het injectieprotocol in elke ontwikkelingsfase, worden bijbehorende parameters, zoals het injectievolume, besproken die de onderzoeksresultaten kunnen beïnvloeden. Om de toepassing van lumbale intrathecale injecties voor het richten op het centrale zenuwstelsel aan te tonen, wordt de expressie van adeno-geassocieerd virus serotype 9 in de hersenen, het ruggenmerg en perifere weefsels gepresenteerd na een succesvolle of mislukte injectie.

Inleiding

Een uitdaging bij de behandeling van neurologische aandoeningen die een wereldwijde toediening van het centrale zenuwstelsel (CZS) vereisen, maar verder goede kandidaten zijn voor gentherapie, is grotendeels toegeschreven aan inefficiënte targeting van het CZS en relevante celtypen1. Er wordt een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gedaan naar het optimaliseren van de wereldwijde targeting van cellen en weefsels op het centrale zenuwstelsel door middel van technische leveringsvoertuigen 1,2. Een redelijk wijdverbreide vectorafgifte kan echter nog steeds worden bereikt met de huidige vectortechnologie voor gentherapie, met behulp van bepaalde combinaties van virale vectoren en toedieningsroutes 3,4. De huidige gouden standaard voor het verkrijgen van wijdverspreide CZS-toediening door een eenmalige behandeling is het gebruik van adeno-geassocieerd virus serotype 9 (AAV9) in combinatie met een directe injectie in het hersenvocht (CSF).

Er zijn drie typische toedieningsroutes voor directe CSF-injecties: lumbale intrathecale (IT), intracerebroventriculair (ICV) en intracisternale (ICM)5. Elk van deze toedieningsroutes resulteert in verschillende biodistributiepatronen in het CZS en perifere weefsels, maar ze hebben allemaal het voordeel dat ze de bloed-hersenbarrière (BBB) omzeilen om de cellen in het CZS te bereiken die bijdragen aan neurologische ziektepathologie en fenotypes6. De lumbale IT-injectie is de standaard voor klinisch gebruik van geneesmiddelen bij mensen, aangezien de klinische procedure routinematig en eenvoudig is, met minder invasiviteit in vergelijking met ICV- en ICM-injecties.

De lumbale IT-injectie is een gevestigde techniek die gemakkelijk wordt gebruikt op het gebied van anesthetica en pijnstillers, met het eerste artikel gepubliceerd in 18857. Het eerste protocol voor lumbale IT-injecties bij volwassen muizen werd gepubliceerd in 19808 en is sindsdien op grote schaal aangenomen en herzien9. Er zijn kleine aanpassingen of verbeteringen aan deze protocollen aangebracht 10,11,12, waaronder een productconserveringstechniek 13. Protocollen voor lumbale IT-injecties bij volwassen ratten werden ook voor het eerst gepubliceerd in 1976, met katheterisatie voor chronische toediening14 en directe injectie voor eenmalige behandelingen15. Meer recentelijk hebben groepen protocollen gepubliceerd voor lumbale IT-injecties bij neonatale of juveniele muizen en ratten16,17.

Brede acceptatie en validatie van deze techniek om de BBB en doelcellen in het CZS te omzeilen, heeft geleid tot meerdere succesvolle preklinische en klinische onderzoeken naar gentherapie voor de behandeling van neurologische aandoeningen. Positieve werkzaamheids- en veiligheidsgegevens bij muizen, ratten en niet-menselijke primaten die neurologische aandoeningen modelleren, hebben opwinding en interesse gewekt over het potentieel van klinisch voordeel voor deze ziekten 18,19,20,21,22,23. Een handvol van deze onderzoeken bevindt zich nu in klinische onderzoeken (bijvoorbeeld clinicaltrials.gov identifiers NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 en NCT05518188)3,6. In dit artikel wordt een eenvoudig protocol beschreven voor lumbale IT-injecties bij muizen en ratten van verschillende leeftijden, zonder CSF te verwijderen, dat kan worden toegepast voor translationele gentherapieprojecten. Dit protocol is vergelijkbaar met reeds beschikbare protocollen die op grote schaal worden toegepast; Het is echter waardevol om deze relevante protocollen op één plek te citeren voor gemakkelijke toegang en referentie, samen met de bijbehorende videobeelden. Dit protocol verklaart de injectie voor neonatale muizen en ratten op postnatale dag (P) 0-1 en juveniele muizen en ratten P21, met representatieve resultaten van een succesvolle en niet-succesvolle lumbale IT-injectie op P1 bij muizen. In de bespreking worden veelvoorkomende misstappen en specifieke details die zorgvuldige aandacht vereisen tijdens het uitvoeren van deze procedure, evenals aanbevelingen over hoe deze injecties moeten worden toegepast voordat een preklinische studie wordt gestart, behandeld.

Protocol

De hierin beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas. Wild-type C57BL6/J mannelijke en vrouwelijke muizen, oud P1-P28, werden gebruikt voor protocollen met muizen. Wildtype Sprague-Dawley mannelijke en vrouwelijke ratten, oud P1-P56, werden gebruikt voor protocollen met ratten. Afgezien van de overlevingsoperatie beschreven in sectie 3, worden alle andere procedures geacht slechts tijdelijk ongemak te veroorzaken en vereisen ze geen gebruik van anesthetica of pijnstillers. Individuen moeten proefdieren controleren op meer dan kortstondig ongemak en advies inwinnen bij hun IACUC- en veterinair personeel over de noodzaak van anesthetica en pijnstillers. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Lumbale IT-injectie van muizen >P21

  1. Voorbereiding
    1. Bereid de injectieoplossingen, inclusief de gentherapievector in de gewenste concentratie(s) en een controleoplossing (meestal de formuleringsbuffer die wordt gebruikt bij de productie van vectoren). De injectieoplossingen moeten steriel zijn en moeten gedurende de hele procedure steriel blijven.
      OPMERKING: Alle oplossingen moeten tijdens de procedure in de ijskast worden bewaard.
    2. Verzamel en ontsmet alle materialen, inclusief spuit en naald, pipet en injectieoplossing. Volg de richtlijnen van de instelling met betrekking tot het gebruik van bioveiligheidskasten en blootstelling aan injectanten. De hier beschreven procedures werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse 2.
    3. Meet met een microliterpipet het gewenste volume injectieoplossing af en breng dit over op een steriele paraffinefilm. Een injectievolume van 5 μl wordt vaak gebruikt en wordt behandeld als het streefvolume voor volwassen muizen >P21 (tabel 1).
      OPMERKING: Het volume kan indien nodig worden verhoogd; Dieren moeten echter nauwlettend worden gecontroleerd op bijwerkingen van grotere injectievolumes. Zie de sectie Discussie voor meer informatie over het injectievolume en bijwerkingen. De oplossing kan ook rechtstreeks van de pipetpunt naar een spuit worden overgebracht, of gekalibreerde gasdichte microliterspuiten kunnen worden gebruikt om het volume van de injectieoplossing direct te meten.
    4. Zuig de oplossing op in een spuit van microliter met een naald van 30 G 0,5" en zorg ervoor dat er geen luchtbellen opzuigen.
      OPMERKING: Naalddikte en lengte kunnen de penetratie van de huid beïnvloeden. Bij het overwegen van de grootte van de te gebruiken spuit mag het injectievolume niet minder zijn dan 10% van de inhoud van de spuit. Voor volumes van meer dan 50% van de spuitcapaciteit moet u ervoor zorgen dat de zuiger gemakkelijk met uw wijsvinger kan worden ingedrukt. Als de zuiger niet gemakkelijk kan worden ingedrukt, gebruik dan een spuit met een grotere capaciteit.
  2. Beperking
    1. Houd met de dominante hand de bewuste (onverdoofde) muis bij de staart vast op een papieren handdoek. De papieren handdoek helpt de muis in bedwang te houden, te kalmeren en te voorkomen dat hij bijt. De muis moet zich in de neutrale buikligging bevinden met het laterale aspect van het lichaam naar u toe.
      OPMERKING: Het is niet nodig om muizen voorafgaand aan de procedure te trainen of te laten wennen aan deze fixatie. Muizen kunnen moeite hebben als gevolg van terughoudendheid, maar zouden geen specifieke pijnreactie moeten uitlokken. Als er meer dan kortstondige pijnreacties worden waargenomen, kan toediening van pijnstillers nodig zijn; Zoek veterinaire begeleiding.
    2. Vouw met de niet-dominante hand een deel van de papieren handdoek over het hoofd en het bovenlichaam van de muis en pak de bekkengordel stevig vast tussen de niet-dominante duim en wijsvinger. Zorg ervoor dat de handpalm naar voren is gevormd en rond het hoofd van de muis rust. De darmbeenkam van de muis moet voelbaar zijn en zich in het midden van de distale falanx van elke vinger bevinden (Figuur 1A,B).
      OPMERKING: Fixatie van een hand of papieren handdoek mag de ademhaling niet belemmeren.
    3. Draai voorzichtig de basis van de staart om ervoor te zorgen dat de wervelkolom goed uitgelijnd is. Het bekken van de muis moet vierkant zijn, zodat de werveluitsteeksels van de lumbale wervelkolom loodrecht op het werkoppervlak staan.
    4. Veeg het dorsale lumbale gebied van de muis af met een 70% alcohol prep pad.
    5. Deel het haar ~2-6 mm craniaal naar de bekkenkam om de injectieplaats te visualiseren.
    6. Voel voor de L4-L5 of L5-L6 tussenwervelruimte, ~2-6 mm craniaal ten opzichte van de darmbeenkam.
      OPMERKING: De exacte afstand is variabel, afhankelijk van de grootte en leeftijd van de muis.
  3. Injectie
    1. Houd met de dominante hand het midden van de microliterspuit vast en plaats deze loodrecht op de wervelkolom van de muis in de tussenwervelruimte L4-L5 of L5-L6. Zorg ervoor dat de zuiger van de spuit met uw wijsvinger kan worden ingedrukt zonder overmatige beweging van uw hand. Met de afschuining van de naald naar het hoofd van de muis gericht, prikt u de huid over de tussenwervelruimte.
    2. Wanneer de randen van het bot rond de tussenwervelruimte aan de punt van de naald worden gevoeld, verkleint u de hoek van de spuit tot 30-45 graden (Figuur 1A).
    3. De naald moet in de tussenwervelruimte glijden en een plotselinge staartbeweging veroorzaken, en moet stevig tussen de wervels worden geklemd.
    4. Zorg ervoor dat de spuit niet wordt verplaatst en druk de zuiger gestaag in om de oplossing binnen 10 s af te geven.
    5. Houd de spuit 15-30 s op zijn plaats nadat u de zuiger volledig hebt ingedrukt om de oplossing te laten verdwijnen en terugstroming te voorkomen.
    6. Trek de spuit soepel en langzaam uit de muis in dezelfde invoerhoek van 30-45 graden. Terwijl de naald wordt teruggetrokken, draait u de spuit om terugstromen te voorkomen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u de naald niet naar voren beweegt bij het draaien van de spuit, aangezien dit fysieke schade aan het ruggenmerg kan veroorzaken.
    7. Maak de muis los van het veiligheidssysteem en plaats hem terug in de kooi thuis.
    8. Controleer de muis na injectie op abnormale looptijd, motorische stoornissen, ademhalingsafwijkingen en coördinatie. Zie de Discussie voor meer informatie over bijwerkingen.
    9. Reinig de apparatuur volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voor meerdere injecties worden verschillende spuiten aanbevolen voor elke gentherapievector en controleoplossing.
      OPMERKING: Verwijderbare naalden kunnen meerdere keren worden gereinigd, gesteriliseerd en hergebruikt; Doffe naalden mogen echter niet worden gebruikt, omdat deze het dier kunnen schaden en de kans op gemiste injecties kunnen vergroten. Een botte naald doorboort de huid niet gemakkelijk en moet op de juiste manier worden weggegooid. Als het aantal spuiten beperkt is, is het raadzaam om alle vehiculuminjecties te voltooien voordat u overgaat tot de gentherapievector en om de laagste dosis gentherapie te injecteren voordat hogere doses worden toegediend.
    10. Volg de richtlijnen van de instelling voor sterilisatie van apparatuur tussen dieren.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema van de plaatsing van de vinger en spuit voor lumbale intrathecale injectie bij muizen en ratten. (A) Zijaanzicht van een muis >P21 met de plaatsing van de naald en de overgang van de spuithoek tijdens een lumbale IT-injectie. Het gestippelde rode ovaal geeft de plaatsing van de vinger over de darmbeenkam van de muis aan. Een vergrote weergave van de wervelkolom toont de intrathecale ruimte (blauw) met geschatte plaatsing van de naald (groene pijl) en het ruggenmerg (roze). Dorsaal aanzicht van (B) een muis >P21, (C) een muis D) een rat >P21, met referentiepunten voor de plaatsing van de naald (groene cirkel), bekkengordel (geel ovaal gestippeld) en plaatsing van de vingers (rood ovaal gestippeld). De incisieplaats en retractors zijn ook afgebeeld in (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Lumbale IT-injectie van muizen en ratten

  1. Voorbereiding
    1. Volg stap 1.1. De enige uitzondering is het injectievolume in stap 1.1.3.
      OPMERKING: De aanbevolen injectievolumes voor neonatale muizen (P0-P1) mogen niet hoger zijn dan 3 μl, voor jonge muizen (P5-P7) mogen niet hoger zijn dan 5 μl en voor jonge muizen (P10) mogen niet hoger zijn dan 10 μl. De aanbevolen injectievolumes voor neonatale ratten (P0-P1) mogen niet hoger zijn dan 5 μl, voor jonge ratten (P5-P7) mogen niet hoger zijn dan 10 μl en voor jonge ratten (P10) mogen niet hoger zijn dan 30 μl (tabel 1).
  2. Beperking
    1. Houd met de dominante hand de muis/rat bij de staart vast op een papieren handdoek. De muis/rat moet zich in de neutrale buikligging bevinden met het laterale aspect van het lichaam naar u toe.
      OPMERKING: Muizen/ratten kunnen moeite hebben als gevolg van terughoudendheid, maar mogen geen specifieke pijnreactie uitlokken. Als er meer dan kortstondige pijnreacties worden waargenomen, kan toediening van pijnstillers nodig zijn; Zoek veterinaire begeleiding.
    2. Pak de bekkengordel voorzichtig maar stevig vast tussen de niet-dominante duim en wijsvinger. De darmbeenkam moet voelbaar zijn en in het midden van de distale falanx van elke vinger liggen (Figuur 1C).
      OPMERKING: Op deze leeftijd hoef je je geen zorgen te maken om gebeten te worden, dus het is niet nodig om de papieren handdoek over de muis/rat te wikkelen. Het kan nodig zijn om bij P5-10 ratten een papieren handdoek te gebruiken om de grotere rattenpups stil te houden.
    3. Draai voorzichtig de basis van de staart om ervoor te zorgen dat de wervelkolom goed uitgelijnd is. Het bekken van de muis/rat moet vierkant zijn, zodat de werveluitsteeksels van de lumbale wervelkolom loodrecht op het werkoppervlak staan.
    4. Veeg het dorsale lumbale gebied van de muis/rat af met een 70% alcohol prep pad.
    5. Maak een scheiding van het haar, indien van toepassing, ~1-3 mm schedel ten opzichte van de bekkenkam om de injectieplaats te helpen visualiseren. Visualisatie van het doelgebied is gemakkelijker bij jongere muizen/ratten. Bij haarloze pasgeborenen kan een inkeping in de tussenwervelruimte worden gezien.
    6. Voel of visualiseer de L4-L5 of L5-L6 tussenwervelruimte, ~1-3 mm craniaal ten opzichte van de darmbeenkam.
      OPMERKING: De exacte afstand is variabel, afhankelijk van de grootte en leeftijd van de muis/rat.
  3. Injectie
    1. Houd met de dominante hand het midden van de microliterspuit vast en plaats deze in een hoek van 30-45 graden ten opzichte van de ruggengraat van de muis/rat. Met de schuine kant van de naald naar het hoofd van de muis/rat gericht, prikt u de huid ongeveer 1-3 mm met de tussenwervelruimte door. Door de schuine oriëntatie van de spuit is het inbrengpunt op de huid iets caudaal ten opzichte van de tussenwervelruimte.
      OPMERKING: Deze afstand kan veranderen met de leeftijd en grootte van de muis/rat.
    2. De rest van de stappen zijn identiek aan de stappen 1.3.3-1.3.10 van muizen >P21.

3. Lumbale IT-injectie van ratten >P21

OPMERKING: Er zijn meerdere IT-injectieprocedures beschreven in de literatuur, variërend van onverdoofde technieken tot uitgebreidere chirurgische benaderingen14,15. Een procedure voor directe injectie met behulp van een minimaal invasieve techniek wordt beschreven met behulp van lichte anesthesie en een kleine incisie in de huid. Het gebruik van anesthesie, zoals isofluraangas, kan helpen bij het terughouden, het spierstelsel ontspannen en beweging tijdens de injectie voorkomen. Het maken van een kleine incisie in de huid over de injectieplaats verbetert de nauwkeurigheid van de injectie door visualisatie van de tussenwervelruimte mogelijk te maken en de noodzaak om door dikke huid te prikken te elimineren. Vanwege de incisie is het gebruik van anesthetica en pijnstillers vereist. Met wat oefening is het mogelijk om lumbale IT-injecties uit te voeren bij ratten ouder dan P21 zonder verdoving of incisie naar goeddunken van de gebruiker en in afwachting van institutionele vereisten15. Volg de richtlijnen en overwegingen van de instelling met betrekking tot anesthesie, geschikte pijnstillers en overlevingschirurgie voor proefdieren.

  1. Voorbereiding
    1. Volg stap 1.1. De enige uitzonderingen zijn het injectievolume in stap 1.1.3 en de naalddikte in stap 1.1.4. Injectievolumes voor ratten kunnen sterk variëren afhankelijk van leeftijd en lichaamsgrootte. Zie de sectie Discussie voor meer informatie over het injectievolume op verschillende leeftijden (Tabel 1).
      OPMERKING: Een naald van 27 G x 1" wordt aanbevolen voor volwassen ratten, omdat naalden met een kleinere dikte kunnen buigen en kortere naalden mogelijk niet voldoende in de intrathecale ruimte doordringen. Indien gewenst kan een langere (1,25-1,5") naald worden gebruikt.
    2. Verdoof de rat met behulp van het gewenste en goedgekeurde anestheticum (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
      OPMERKING: Voor de hier beschreven procedures werden ratten verdoofd met isofluraangas en een 1:1 mengsel van lidocaïne: bupivacaïne werd gebruikt als lokaal verdovingsmiddel. De lichaamstemperatuur moet tijdens de procedure en het herstel op peil worden gehouden met behulp van een goedgekeurde externe warmtebron.
    3. Volg de standaard aseptische voorbereiding op de operatieplaats voor elk dier. Scheer kort het dorsale lumbale gebied en bereid de huid voor met een chirurgische scrub, betadine en 70% isopropylalcohol.
  2. Chirurgische ingreep
    1. Plaats de rat in de neutrale buikligging met het laterale aspect van het lichaam naar je toe.
    2. Palpeer de bekkengordel en identificeer de bekkenkam en de lumbosacrale overgang. Bij ratten >P21 kunnen de wervelprocessen gemakkelijk worden geïdentificeerd.
    3. Maak met behulp van een scalpel een incisie van 1 cm over de tussenwervelruimte L4-L5 of L5-L6. De incisie mag alleen de huid en de onderliggende fascia betreffen, waarbij de spier intact blijft.
      OPMERKING: Het is handig om retractors te gebruiken om de huid open te houden tijdens de rest van de procedure.
    4. Pak de bekkengordel voorzichtig maar stevig vast tussen de niet-dominante duim en wijsvinger. De bekkenkam moet voelbaar zijn en in het midden van de distale falanx van elke vinger liggen (Figuur 1D). Gebruik een muggentang om langs de middellijn van de rug te peilen om de tussenwervelruimte te lokaliseren.
  3. Injectie
    1. Houd met de dominante hand het midden van de microliterspuit vast en plaats deze loodrecht op de wervelkolom van de rat in de tussenwervelruimte L4-L5 of L5-L6. Zorg ervoor dat de zuiger van de spuit met de wijsvinger kan worden ingedrukt zonder overmatige beweging van de hand. Met de afschuining van de naald naar de kop van de rat gericht, prikt u de spier met de naald over de tussenwervelruimte.
    2. Steek de naald in de tussenwervelruimte.
      OPMERKING: De naald kan een lichte weerstand hebben als deze tussen de wervelprocessen passeert, en het kan zijn dat de hoek van de spuit enigszins moet worden aangepast om door deze opening te gaan. Het moet echter ongeveer 90 graden blijven, loodrecht op de wervelkolom. Er zal een plop worden gevoeld als de naald de intrathecale ruimte binnenkomt. Afhankelijk van de anesthesieparameters kan een staart- of beenbeweging al dan niet merkbaar zijn. De naald moet stevig tussen de wervels worden geklemd.
    3. Zorg ervoor dat de spuit niet uit positie raakt en druk de zuiger in om de oplossing binnen 30 s af te geven.
      OPMERKING: In tegenstelling tot de injecties bij muizen, is het met deze methode mogelijk niet mogelijk om de spuithoek bij ratten >P21 te verkleinen. Grotere volumes moeten langzamer worden geïnjecteerd om overmatige drukopbouw te voorkomen.
    4. Houd de spuit 30-60 s op zijn plaats nadat u de zuiger volledig hebt ingedrukt om de oplossing te laten verdwijnen en terugstroming te voorkomen.
    5. Trek de spuit soepel uit de rat. Terwijl de naald wordt teruggetrokken, draait u de spuit om terugstromen te voorkomen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u de naald niet naar voren beweegt bij het draaien van de spuit, aangezien dit fysieke schade aan het ruggenmerg kan veroorzaken.
    6. Sluit de huidincisie met behulp van een goedgekeurde methode, zoals hecht- of wondclips. Voor de ratten die in dit protocol werden gebruikt, werd de huid gesloten in een continu intradermaal of eenvoudig onderbroken patroon met behulp van een 5-0 PDS II-hechtdraad.
    7. Haal de rat uit de narcose.
    8. Volg stap 1.3.9-1.3.10 en alle richtlijnen voor postoperatieve zorg.

Resultaten

Hoewel veel factoren de vectortransductie van gentherapie kunnen beïnvloeden, blijft histologische kleuring van weefsel de meest nauwkeurige methode om het succes van lumbale intrathecale (IT) injecties te bepalen. Een brede en gelijkmatige verdeling van de gentherapievector in het centrale zenuwstelsel (CZS) na injectie is een indicatie van een succesvolle procedure. Figuur 2C vertegenwoordigt een succesvolle injectie van een zelfcomplementaire AAV9-gemedieerde gentherapie die zwakke alomtegenwoordige transgenexpressie onder de JeT-promotor veroorzaakt in een dosis van 1,3 × 1011 vg/muis bij neonatale (P1) muizen, 4 maanden na injectie. RNAscope-analyse, met behulp van een sonde die gericht is op het transgen dat door de gentherapie wordt afgeleverd, onthult een brede verspreiding in het lumbale ruggenmerg, het cervicale ruggenmerg en de hersenen. Een deel van de lever en het hart is opgenomen om te benadrukken dat, zelfs met directe injectie van cerebrospinale vloeistof (CSF), de gentherapievector nog steeds kan worden gedistribueerd naar perifere weefsels.

figure-results-1
Figuur 2: Gekleurd 5-micron weefsel doorsneden van het CZS en perifeer weefsel van de muis 4 maanden na injectie op P1. Rode kleuring geeft transgenexpressie aan via RNAscope en blauwe tegenkleuring van kernen wordt gedaan via hematoxyline. (A) Injectie met een buffer voor de controleformulering. (B) Mislukte intraparenchymale injectie met een AAV9-vector (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Succesvolle lumbale IT-injectie met een AAV9-vector (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). De gentherapievector die wordt gebruikt in (B) en (C) werd toegediend in een translationeel relevante dosis van 1,3E11 vg/muis. Schaalbalk: bovenpaneel (5 mm); Bodempaneel (1 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Geconcentreerde expressie in het lumbale ruggenmerg in combinatie met een gebrek aan expressie in de hersenen, zoals weergegeven in figuur 2B, kan duiden op een intraparenchymale injectie van het ruggenmerg en moet worden beschouwd als een mislukte injectie. Dit gebeurt wanneer de naald te ver in de wervelkolom wordt ingebracht, voorbij de intrathecale ruimte en in het ruggenmerg. Bovendien moet een zeer lage of geen expressie in het ruggenmerg en de hersenen (niet afgebeeld) ook worden beschouwd als een mislukte off-target injectie, ervan uitgaande dat een vector en dosis worden gebruikt waarbij een brede distributie van het CZS wordt verwacht. Dit kan te wijten zijn aan het niet ver genoeg inbrengen van de naald of aan de zijlijn van de middellijn.

De expressiepatronen die worden waargenomen bij succesvolle injecties kunnen verschillen als gevolg van de volgende acht factoren als voorbeelden: (1) leeftijd bij injectie, (2) reeds bestaande immuniteit, (3) infusiesnelheid, (4) gentherapievector, (5) dosis gentherapie, (6) celoppervlakte-eiwitten, (7) tropisme, en (8) indien van toepassing, een geschikte promotorkeuze om transgenexpressie te stimuleren6. Hoewel expressiepatronen kunnen verschillen, zal de brede, gelijkmatige, wijdverbreide verdeling universeel zijn zolang de dosis voldoende hoog is met een effectieve vector, zoals AAV9.

Belangrijke beperkingen van het gebruik van histologische analyse om het succes van lumbale IT-injecties te bevestigen, zijn de lange wachttijden - wachten tot het einde van een onderzoek, nadat necropsieën zijn uitgevoerd en weefsel is verzameld - en uitgebreide middelen die nodig zijn bij het verwerken van weefsel van alle muizen in een groot gentherapieonderzoek. Helaas is onze ervaring dat onmiddellijke en directe indicatoren van een positieve of negatieve injectie onbetrouwbaar kunnen zijn; De reflex van de staartbeweging wanneer de naald de intrathecale ruimte binnengaat, is echter een goede indicator voor succesvolle positionering in realtime en duidt waarschijnlijk op een succesvolle injectie. Verwar een spiertrekking, aangezien de naald de huid van een onverdoofde muis/rat doorboort, niet met een staartbeweging als reactie op de naald die de intrathecale ruimte binnenkomt. Er is gemeld dat het gebruik van farmacologische middelen zoals NMDA, stof P en lidocaïne, hetzij tijdens training of gemengd met de experimentele injectieoplossing, een directere indicatie geeft van het succes van de injectie 9,11,24. Als u deze middelen overweegt, is het belangrijk om hun compatibiliteit met de gentherapievector te evalueren.

Discussie

De lumbale IT-injectie is een snelle en minimaal invasieve procedure die op betrouwbare wijze een gentherapievector in het CSF aflevert voor de behandeling van CZS-ziekten 5,6. De procedure is translationeel relevant en het hier beschreven protocol beschrijft hoe deze toedieningsweg moet worden uitgevoerd bij muizen en ratten van alle leeftijden, van pasgeborenen tot volwassenen. Het is belangrijk om dit protocol voor muizen en ratten van alle leeftijden te definiëren, samen met het verstrekken van ondersteunende video's, om onderzoekers te helpen bij het toepassen van deze methode voor de toediening van gentherapie. De ervaring van ons laboratorium is dat dit protocol consistent kan worden geïmplementeerd bij meerdere gebruikers en dat onderzoeken in de loop van de tijd 18,25,26,27,28,29,30.

Er zijn belangrijke verschillen bij het uitvoeren van de lumbale IT-injectie bij jongere muizen/ratten in vergelijking met oudere muizen/ratten, met name de hoek waaronder de naald in de wervelkolom wordt ingebracht en het aanbevolen volume dat wordt geïnjecteerd. De gerapporteerde volumes van lumbale IT-injecties variëren aanzienlijk tussen studies en tussen soorten31. Overweging van het injectievolume is belangrijk om langdurige verhogingen van de intracraniale druk (ICP) te voorkomen, die de stroom van CSF en hersenbloed in gevaar kunnen brengen, ongemak kunnen veroorzaken en kunnen leiden tot chronische neurologische complicaties, waaronder hydrocefalie, ischemie, cellulair letsel en overlijden 32,33. ICP wordt bepaald door het volume van het CSF, het hersenbloed en het CZS-weefsel, dat niet direct kan worden gecorreleerd aan het lichaamsgewicht. Bij normaal functioneren wordt de ICP automatisch gereguleerd door vele factoren, waaronder het volume van het hersenvocht, het cerebrale bloedvolume, de ademhaling, de lichaamshouding, de productiesnelheid van het lisvocht en de snelheid van de afvoer van lisévocht in het bloed33,34. IT-injectievolumes moeten daarom worden bepaald op basis van de eigenschappen van het CSF (tabel 1) in plaats van op basis van het lichaamsgewicht 25,27,28,30. De aanbevolen hoeveelheden om op elke leeftijd in elke soort te injecteren, zijn vetgedrukt aangegeven.

IT-injectie volumeVolwassen CSF-waarden
P0-1 (μL)P5-7 (μl)P10 (μL)>P21 (μL)Totaal volume (μL)Productiesnelheid (μL/min)Omzet (h)Intracraniële druk (mm Hg)
Muizen355-10 uur5-20 uur30-4025,300,32-0,3525,301,7-225,305.0 +/- 0.528
Ratten55-1010-3010-200 (20-75)150251,7-2,8252-2.66258,6 +/- 1,7,27

Tabel 1: Overzicht van de lumbale IT-injectievolumes voor muizen en ratten op verschillende leeftijden. Gedurfde waarden worden aanbevolen en zijn veilig geleverd. De maximaal mogelijke volumes zijn nog niet formeel geëvalueerd. Aanvullende informatie over bekende CSF-parameters - totaal volume, productiesnelheid, omzet en intracraniale druk - bij muizen en ratten is ter referentie opgenomen.

Er is een gebrek aan kennis in het veld over de bovengrens voor eenmalige bolus-IT-injectievolumes. Bij volwassen mensen, ratten en muizen waarvan het CSF-volume bekend is, lijkt een toename van 30% van het totale CSF-volume geen chronisch letsel of kwalen te veroorzaken 31,33,35,36. Het ontbreken van bekende CSF-volumes bij juveniele of neonatale muizen maakt een vergelijkbare extrapolatie onmogelijk. Sommige groepen beginnen te kijken naar het volume en de productie van KVP bij jongere dieren37. Totdat aanvullend onderzoek op deze gebieden is onderbouwd, zal het injectievolume onderhevig blijven aan door de onderzoeker gerapporteerde waarden.

Muizen en ratten kunnen, vooral wanneer ze op jongere leeftijd worden behandeld of met hoge injectievolumes, spierverbuiging, extensie van ledematen, snelle ademhaling of tijdelijke verlamming van de achterpoten uitlokken die binnen enkele minuten vanzelf zou moeten verdwijnen. In extreme gevallen kunnen acute ICP-verhogingen cardiovasculaire en respiratoire afwijkingen veroorzaken, die dodelijk kunnen zijn32,33. Als er na 24 uur nog steeds afwijkingen na de procedure zijn, moeten de muizen/ratten uit het onderzoek worden verwijderd en op humane wijze worden geëuthanaseerd. Aanhoudende verlamming van de achterpoten kan optreden als de naald te ver wordt ingebracht, waardoor het ruggenmerg wordt beïnvloed. Dit kan te wijten zijn aan een veelgemaakte fout bij het uitvoeren van de lumbale IT-injectie: beweging van de spuit na het tikken van de staart terwijl de zuiger wordt ingedrukt. Het bewegen van de spuit en de naald moet worden vermeden. Als de juiste positie niet kan worden verkregen met de eerste lekke band, kan een tweede poging op dezelfde plaats worden gedaan. Als de tweede poging ook niet succesvol is, probeer dan de positie van de naald te veranderen om de volgende tussenwervelruimte te bereiken. Houd er rekening mee dat meerdere naaldprikken kunnen leiden tot lekkage van een vervolgens succesvolle injectie.

Het kan enige tijd duren om bekwaam te worden in de lumbale IT-injectie. Om de injecties als terminale procedure te oefenen, volgt u het bovenstaande protocol met behulp van een goedgekeurde kleurstofoplossing, zoals Evans blauwe of 0,2 micron gefilterde McCormick groene kleurstof (Figuur 3) of met de farmacologische middelen die worden behandeld in de sectie Representatieve resultaten. Het gebruik van kleurstof wordt aanbevolen om problemen met de injectie op te lossen en onder de knie te krijgen, omdat het gemakkelijk is om binnen 1 minuut te zien of een injectie een succes of een mislukking was. Oefenen met kleurstof is alleen voor niet-overlevingsprocedures, omdat dieren een reactie op de kleurstof kunnen ontwikkelen wanneer ze rechtstreeks aan het CZS worden toegediend. Deze reactie kan binnen een minuut na een succesvolle injectie optreden en wordt gekenmerkt door snelle jeuk en kronkelende bewegingen. De dieren moeten onmiddellijk worden geëuthanaseerd zodra deze reactie is waargenomen om ongemak te minimaliseren. Na een succesvolle injectie van de kleurstof, blijft de kleurstof gelokaliseerd in de wervelkolom (geen kleurstof in het nabijgelegen perifere weefsel) en gaat het langs de wervelkolom omhoog naar het cerebellum, de grote hersenen en de bulbus olfactorius. Bij P1 is de huid transparant genoeg om de kleurstof langs de wervelkolom in de staart te zien bewegen. Als de kleurstof de hersenen niet binnen enkele minuten bereikt, mislukt de injectie.

figure-discussion-1
Figuur 3: McCormick groene kleurstof in de hersenen na succesvolle oefening lumbale IT-injecties. Alle hersenen zijn van P21-muizen die zijn geïnjecteerd met 5 μL kleurstof en worden weergegeven in de ventrale weergave. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor meer informatie over relevante bijbehorende parameters voor de opzet van preklinische onderzoeken, zoals virale titer en doses, zie eerder gepubliceerde beoordelingen 3,6,31.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We willen de UT Southwestern AAV Viral Vector Core Facility bedanken voor het vervaardigen van de AAV9-vector en Yuhui Hu, onderzoekswetenschapper in het Gray Lab, voor het verwerken en kleuren van het weefsel dat in figuur 2 wordt gepresenteerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 micron filterElectron Microscopy Sciences67005Wordt gebruikt om kleurstofoplossing te filteren
0.5 tot 10 µL PipetteEppendorfTI13690026Wordt gebruikt om injectieoplossing te meten
1.5 mL MicrotubeEppendorf22364111Wordt gebruikt om injectieoplossingen op te slaan
10 µL SpuitHamilton7635-01Injectievolume mag niet minder zijn dan 10% van de capaciteit van de spuit
10 tot 100 µL PipetteEppendorfTI13690029Wordt gebruikt om injectieoplossing te meten
10µl PipettipsUSA Scientific Inc11203810Wordt gebruikt om injectieoplossing te meten
100 µL SpuitHamilton7638-01Alleen voor rat >21. Injectievolume mag niet minder zijn dan 10% van de capaciteit van de spuit
100 µL PipettipsUSA Scientific Inc11231840Wordt gebruikt om injectieoplossing te meten
25 µL SpuitHamilton7636-01Ideaal voor injecties van 5-10 µL. Injectievolume mag niet minder zijn dan 10% van de capaciteit van de spuit
27 Gauge Naald(en)Hamilton7803-01Alleen voor rat >21. 27 gauge, Small Hub RN Naald, 1 inch, puntstijl 4 op 12°, 6/PK
30 Gauge Naald(en)Hamilton7803-1730 gauge, Small Hub RN Naald, 0,5 inch, puntstijl 4 op 12°, 6/PK
50 µL SpuitHamilton7637-01Alleen voor rat >21. Injectievolume mag niet minder zijn dan 10% van de capaciteit van de spuit
70% EthanolPharmco111000140Wordt gebruikt om werkruimte en apparatuur te ontsmetten
70% Isopropyl Alcohol Prep PadsPDIB60307Wordt gebruikt om injectieplaats voor te bereiden
AnalgeticumAlleen voor rat >21.
Anestheticum (Isofluran)Piramal Critical Care66794001725Alleen voor rat >21.
BetadinePurdue Products6906606Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt voor huidvoorbereiding
ControleoplossingInjectieoplossing
Kleurstofoplossing (groen)McCormickAlleen voor oefening, niet voor overleving
HandschoenenKimberly-Clark19-149-863BPVE
IJsemmer met ijsFisher Scientific03-395-150Virale vectoroplossing op ijs bewaren
Mosquitotang (gebogen of recht)Fine Science Tools13009-12Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt om intervertebrale ruimte te palperen.
NaaldhaakjesFine Science Tools12002-12Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt voor huidsluiting met hechting
PapierhanddoekBerkshire18-998-123Wordt gebruikt om volwassen muizen tijdens injectie te vastzetten
ParafilmStatLabPM996Wordt gebruikt om oplossing in spuit te trekken
RetractorsStoelting52124PAlleen voor rat >21. Wordt gebruikt om huidincisiew open te houden
ScalpelmesFine Science Tools10015-00Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt voor incisie
ScalpelmeshandgreepFine Science Tools10003-12Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt voor incisie
Steriele spuitFisher Scientific14-955-459Wordt gebruikt om kleurstofoplossing te filteren
Chirurgisch scrubben (huidvoorbereiding)Medline Industries Inc.MDS098720Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt voor huidvoorbereiding
Hechting of wondklemStoelting50483Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt voor huidsluiting.
Spuit/NaaldreinigingsoplossingHamilton18311Alternatieve reinigingsoplossing kan worden gebruikt
DuimtangFine Science Tools11019-12Alleen voor rat >21. Wordt gebruikt tijdens chirurgische benadering en sluiting
VectoroplossingInjectieoplossing

Referenties

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects. Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  3. Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders. Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).
  4. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).
  5. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
  6. Chen, X., et al. Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration. Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).
  7. Corning, J. L. Spinal anesthesia and local medication of the cord. NY Med. J. , 483-485 (1885).
  8. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: A new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  9. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  10. Choi, S. E., et al. High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery. J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).
  11. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. 144, e58565(2019).
  12. Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice. J Vis Exp. 85, e51229(2014).
  13. Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31(2010).
  14. Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).
  15. Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).
  16. Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. 205, e66463(2024).
  17. Lu, X., Jiang, Y. H. Intrathecal injection of newborn mouse for genome editing and drug delivery. J Vis Exp. 205, e65761(2024).
  18. Chen, X., et al. Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies. J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).
  19. Deschenes, N. M., et al. Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis. Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).
  20. Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice. Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).
  21. Kagiava, A., et al. Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).
  22. Wong, H., et al. CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice. JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).
  23. Laoharawee, K., et al. Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer. Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).
  24. Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice. Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).
  25. Bailey, R. M., Armao, D., Nagabhushan Kalburgi, S., Gray, S. J. Development of intrathecal AAV9 Gene therapy for giant axonal neuropathy. Mol Ther Methods Clin Dev. 9, 160-171 (2018).
  26. Bailey, R. M., Rozenberg, A., Gray, S. J. Comparison of high-dose intracisterna magna and lumbar puncture intrathecal delivery of AAV9 in mice to treat neuropathies. Brain Res. 1739, 146832(2020).
  27. Chen, X., et al. AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease. J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).
  28. Karumuthil-Melethil, S., et al. Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant. J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).
  29. Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).
  30. Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice. Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).
  31. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application. Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).
  32. Allen, C. H., Ward, J. D. An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure. Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).
  33. Belov, V., et al. Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications. Front Neurosci. 15, 604197(2021).
  34. Moazen, M., et al. Intracranial pressure changes during mouse development. J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).
  35. Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection. N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).
  36. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).
  37. Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation. Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Cerebrospinale vloeistofbloed-hersenbarrièreAAV-gentherapiepreklinische muismodellentargeting van het ruggenmergneurologische ziektemodelleninjectietechniek
Lumbale intrathecale injectie van gentherapievectoren voor targeting van het centrale zenuwstelsel bij muizen en ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.