Methodenartikel

Gebruik makend van thermische verschuivingstest om substraatbinding aan selenoproteïne O te sonden

DOI:

10.3791/67139

⸱

9 augustus 2024

 , 
1Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we de thermische verschuivingstest, een op fluorescentie gebaseerde techniek met hoge doorvoer die wordt gebruikt om de binding van kleine moleculen aan interessante eiwitten te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het definiëren van het biologische belang van eiwitten met onbekende functies vormt een belangrijk obstakel bij het begrijpen van cellulaire processen. Hoewel bio-informatica en structurele voorspellingen hebben bijgedragen aan de studie van onbekende eiwitten, worden in vitro experimentele validaties vaak belemmerd door de optimale omstandigheden en cofactoren die nodig zijn voor biochemische activiteit. Cofactorbinding is niet alleen essentieel voor de activiteit van sommige enzymen, maar kan ook de thermische stabiliteit van het eiwit verbeteren. Een praktische toepassing van dit fenomeen ligt in het gebruik van de verandering in thermische stabiliteit, zoals gemeten door veranderingen in de smelttemperatuur van het eiwit, om ligandbinding te onderzoeken.

Thermische verschuivingstest (TSA) kan worden gebruikt om de binding van verschillende liganden aan het eiwit van belang te analyseren of om een stabiliserende toestand te vinden om experimenten uit te voeren, zoals röntgenkristallografie. Hier zullen we een protocol voor TSA beschrijven met behulp van het pseudokinase, Selenoproteïne O (SelO), voor een eenvoudige en high-throughput methode voor het testen van metaal- en nucleotidebinding. In tegenstelling tot canonieke kinasen bindt SelO ATP in een omgekeerde oriëntatie om de overdracht van AMP naar de hydroxylzijketens van eiwitten te katalyseren in een posttranslationele modificatie die bekend staat als eiwit-AMPylering. Door gebruik te maken van de verschuiving in de smelttemperaturen, bieden we cruciale inzichten in de moleculaire interacties die ten grondslag liggen aan de SelO-functie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een groot deel van het menselijke proteoom blijft slecht gekarakteriseerd. Het door Dunham en Kustatscher et al. beschreven "straatlantaarneffect" verwijst naar het fenomeen waarbij uitgebreid onderzochte eiwitten meer aandacht krijgen, waardoor onderbelichte eiwitten over het hoofd worden gezien 1,2. Factoren die bijdragen aan dit effect zijn onder meer het biologische belang en de relevantie voor de ziekte van bepaalde eiwitten. Bovendien stimuleert eerder onderzoek dat fundamentele kennis biedt, evenals de beschikbaarheid van instrumenten voor functionele analyse, het onderzoek naar hoogbestudeerde eiwitten verder 1,2. Projecten zoals het Understudy Proteins Initiative, het Structural Genomics Consortium en het Enzyme Function Initiative hebben tot doel onderbestudeerde eiwitten te karakteriseren met behulp van structurele en functionele proteomics 2,3,4. Een aanvullende benadering voor het identificeren van de moleculaire functies van onderbelichte eiwitten is het onderzoeken van de interacties van deze eiwitten met kleine moleculen om waardevolle inzichten te verkrijgen in de regulatie en substraatspecificiteit.

De binding van kleine moleculen kan de thermische stabiliteit van een eiwit verhogen5. Dit fenomeen, bekend als ligand-geïnduceerde conformatiestabilisatie, resulteert vaak in een verhoging van de smelttemperatuur van een eiwit, wat een meetbare indicatie geeft van ligandbinding6. De thermische stabiliteit van een eiwit kan worden gemeten met behulp van Differential Scanning Fluorimetry (DSF), ook bekend als Thermofluor, of Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. Bij TSA wordt een eiwitmonster blootgesteld aan stijgende temperaturen in aanwezigheid van een milieugevoelige kleurstof6. Terwijl het eiwit zich ontvouwt en denatureert, bindt de kleurstof zich aan de blootgestelde hydrofobe gebieden van het eiwit en zendt fluorescentie uit. Extrinsieke fluorescerende kleurstoffen, of milieugevoelige kleurstoffen, missen intrinsieke fluorescentie en fluoresceren in plaats daarvan bij interactie met hun doelmolecuul 9,11,12. De meest gebruikte kleurstof, SYPRO Orange, biedt verschillende voordelen zoals verbeterde stabiliteit en minimale achtergrondfluorescentie 8,9,12. SYPRO Orange is met name compatibel met Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)-systemen, gezien de excitatie- en emissiegolflengten rond respectievelijk 470 nm en 570 nm. Deze unieke functie maakt nauwkeurige en gevoelige metingen met een hoge doorvoer mogelijk die compatibel zijn met fluorescentiedetectiesystemen die vaak worden gebruikt in RT-PCR-systemen8.

TSA is een veelzijdig hulpmiddel voor het onderzoeken van eiwitinteracties met potentiële cofactoren of geneesmiddelen en voor het identificeren van stabiliserende omstandigheden voor kristallografie. Enkele van de voordelen ten opzichte van andere zeefmethoden zijn de relatieve eenvoud van installatie en de hoge doorvoer met platen met 96 of 384 putjes 13,14,15. De ontwikkeling van deze techniek is transformerend geweest voor studies naar het ontdekken van geneesmiddelen, biedt gemak en maakt de studie van diverse additieven zoals ionen, liganden en geneesmiddelen mogelijk 6,16. Bovendien heeft het aanpassingsvermogen van TSA wetenschappers aangemoedigd om het nut ervan uit te breiden, waardoor het meten van bindingsaffiniteiten naast de screeningstests17,18 wordt vergemakkelijkt. TSA is een effectief hulpmiddel in structurele biologiestudies om omstandigheden te identificeren die de stabilisatie van het eiwit dat van belang is voor kristallisatie bevorderen19. De flexibiliteit en het relatieve gemak hebben TSA dus gepositioneerd als een hoeksteentechniek bij het karakteriseren van eiwitten. Hier zullen we TSA gebruiken om de binding van metalen en nucleotide aan het onderbestudeerde pseudokinase, Selenoproteïne O (SelO), als voorbeeld te analyseren.

Kinasen zijn een van de meest gerichte eiwitfamilies bij de ontdekking van geneesmiddelen20. Er wordt voorspeld dat ongeveer 10% van de menselijke kinasen inactief is en pseudokinasen wordt genoemd omdat ze belangrijke katalytische residuen missen die nodig zijn voor katalyse21,22. Selenoproteïne O (SelO) is een evolutionair geconserveerd pseudokinase dat het geconserveerde aspartaat mist in het katalytische HRD-motief23. In eukaryoten lokaliseert SelO zich in de mitochondriën en beschermt het cellen tegen oxidatieve stress 24,25. Structurele en biochemische analyses tonen aan dat SelO adenosinemonofosfaat (AMP) overbrengt van ATP naar eiwitsubstraten in een posttranslationele modificatie die bekend staat als AMPylatie25. Recente studies geven aan dat enzymen die AMPylatie katalyseren, alternatieve nucleotiden zoals UTP in vitro kunnen binden 26,27. Studies hebben met name aangetoond dat de SelO-homoloog van Salmonella typhimurium eiwit-UMPylatie, of de overdracht van UMP, op een mangaanafhankelijke manier katalyseert28. Gezien deze intrigerende waarnemingen testen we de binding van SelO aan ATP en UTP in aanwezigheid van magnesium en mangaan, en dienen we als een representatief voorbeeld van de toepassingen van TSA. Het volgende protocol kan gemakkelijk worden aangepast om de interacties van andere eiwitten en interessante additieven te optimaliseren en te onderzoeken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Experimentele opzet

  1. Gebruik een thermische cycler die fluorescentie kan detecteren, zoals een RT-PCR-instrument, om het beschreven protocol uit te voeren. Als u SYPRO Orange gebruikt, zoals beschreven in dit protocol, gebruik dan een scanmodus die excitatie rond 470 nm en emissiedetectie rond 570 nm mogelijk maakt. Programmeer de thermocycler om het monster gedurende 2 minuten op 20 °C te houden, gevolgd door een temperatuurverhoging van 0,5 °C/1 minuut tot 95 °C; meet de fluorescentie-intensiteit elke 1 °C.
    OPMERKING: We raden een optionele stap aan het einde van de cyclus aan om het monsterblok terug te brengen naar 20 °C (Figuur 1).
  2. Elke reactie bevat vier componenten: buffer, interessant eiwit, additief en extrinsieke fluorescerende kleurstof. Ontwerp het experiment om controles op te nemen zoals geen eiwit, geen kleurstof, eiwit zonder additieven en alleen additieven om eventuele achtergrondfluorescentie te bepalen die de interpretatie van de resultaten kan beïnvloeden. Indien beschikbaar, voeg dan een positieve controle toe, zoals een additief waarvan bekend is dat het het betreffende eiwit bindt en stabiliseert.
  3. Gebruik gezuiverd eiwit voor de analyse. Om dit voorbeeld te volgen, gebruikt u E. coli SelO, uitgedrukt en gezuiverd zoals eerder beschreven25,29. Kort gezegd, druk His-sumo gelabeld SelO (E. coli SelO ppSumo) uit in Rosetta DE3-cellen en zuiver het met behulp van Ni2+-NTA-affiniteit. Splits de His-sumo-tag met behulp van Ulp-protease en zuiver SelO verder door middel van gelfiltratiechromatografie.
  4. De fluorescentie van SYPRO Orange hangt af van de interactie met het betreffende eiwit. Aangezien deze interacties van eiwit tot eiwit verschillen, optimaliseert u de eiwit- en kleurstofconcentratie voor het verkrijgen van het maximale signaal-ruissignaal van fluorescentie.
    LET OP: SYPRO Oranje is niet compatibel met sommige eiwitten en additieven zoals wasmiddelen11,30. Aanvullende extrinsieke kleurstoffen vermeld in 12 kunnen indien nodig worden gescreend.

2. Bepaling van de optimale kleurstofconcentratie (figuur 2A)

  1. Bereid verdunningen van 20 μl van 50x, 40x, 30x, 20x en 10x SYPRO Orange uit de voorraadoplossing, die wordt geleverd in 5.000x in DMSO.
  2. Doseer 8 μL 6,25 μM eiwit verdund in TSA-buffer in zes afzonderlijke putjes van een PCR-plaat met 384 putjes.
    OPMERKING: In ons voorbeeld hebben we de volgende TSA-buffer gebruikt om de verdunningen uit te voeren: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl en 1 mM DTT. Steekproeven kunnen in drievoud worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van de resultaten te verbeteren.
  3. Voeg 1 μL TSA-buffer toe aan elk putje.
    OPMERKING: Dit volume buffer wordt vervangen door de toevoeging van kleine moleculen na optimalisatie van de kleurstof- en eiwitconcentratie.
  4. Voeg 1 μL van elke seriële verdunning van SYPRO Orange kleurstofoplossing toe aan elk putje. Voeg 1 μL buffer zonder kleurstof toe aan het uiteindelijke putje voor de controle zonder kleurstof.
  5. Dek de plaat af met optisch doorzichtige zelfklevende folie.
  6. Draai de plaat kort rond bij 1.000 × g gedurende 1 minuut in een centrifuge die is uitgerust met een PCR-plaatadapter.
  7. Plaats de plaat in een RT-PCR-machine en start het thermocycling-protocol beschreven in stap 1.1.

3. Bepaling van de optimale eiwitconcentratie (figuur 2B)

  1. Bereid 20 μL seriële verdunningen van 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM en 1,56 μM eiwit met behulp van TSA-buffer (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl en 1 mM DTT).
  2. Doseer 8 μL seriële verdunningen van het eiwit in vijf afzonderlijke putjes van een plaat met 384 putjes.
  3. Doseer de buffer alleen in de6e en een controle zonder eiwitten.
  4. Voeg 1 μL TSA-buffer toe aan elk putje.
    OPMERKING: Dit volume buffer wordt vervangen door de toevoeging van kleine moleculen na optimalisatie van de kleurstof- en eiwitconcentratie.
  5. Voeg 1 μL van elke 50x SYPRO Orange verfoplossing toe aan elk putje.
  6. Dek de plaat af met optisch doorzichtige zelfklevende folie.
  7. Draai de plaat kort rond bij 1.000 × g gedurende 1 minuut in een centrifuge die is uitgerust met een PCR-plaatadapter.
  8. Plaats de plaat in een RT-PCR-machine en start het thermocycling-protocol beschreven in stap 1.1.

4. Opzetten van een TSA-experiment (Figuur 3A)

OPMERKING: Na optimalisatie van de eiwit- en SYPRO Orange-kleurstofconcentraties, kan de test worden uitgevoerd met de toevoeging van de gewenste kleine moleculen om de binding te analyseren.

  1. Definieer het aantal voorwaarden door rekening te houden met de replicaten en adequate controles.
    OPMERKING: We zullen bijvoorbeeld de binding van SelO aan acht voorwaarden in drievoud testen. Inclusief de controles (geen additief, geen eiwit en geen kleurstof) hebben we 11 reacties x 3 (drievoud) = 33 reacties in totaal.
  2. Op basis van de optimale concentratie van eiwit en kleurstof die is waargenomen voor SelO, moet u ervoor zorgen dat elke reactie 8 μL 6,25 μM eiwit, 1 μL additief en 1 μL 50x SYPRO Orange kleurstof bevat voor een totaal van 10 μL reactievolume. De uiteindelijke gebruikte concentratie is dus 5 μM eiwit en 5x SYPRO Orange kleurstof.
  3. Bereid 288 μL 6,25 μM eiwitoplossing met behulp van TSA-buffer. Dit volume eiwitoplossing is goed voor 36 reacties (33 reacties met een extra 10% voor variaties in pipetteren).
  4. Doseer 8 μL 6,25 μM eiwit in aparte putjes van een plaat met 384 putjes. Doseer de buffer alleen voor de controle zonder eiwit.
  5. Voeg 1 μL kleine moleculen toe met een concentratie van 10x om de uiteindelijke 1x te bereiken. Om dit voorbeeld te volgen, voegt u 1 μL van 20 mM MgCl2 toe om een eindconcentratie van 2 mM te bereiken. Doseerbuffer alleen voor de controle zonder additief.
  6. Voeg 1 μL van elke 50x SYPRO Orange verfoplossing toe aan elk putje.
  7. Dek de plaat af met optisch doorzichtige zelfklevende folie.
  8. Draai de plaat kort rond bij 1.000 × g gedurende 1 minuut in een centrifuge die is uitgerust met een PCR-plaatadapter.
  9. Plaats de plaat in een RT-PCR-machine en start het thermocycling-protocol beschreven in stap 1.1.

5. Gegevensanalyse

  1. Exporteer gegevens van de RT-PCR-machine voor relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) met betrekking tot temperatuur (°C).
  2. Gebruik de software van uw keuze om gegevenspunten te extraheren en uit te zetten tot de hoogste intensiteit die voor elke smeltcurve is gemeten. Belangrijk is dat wordt bevestigd dat de controles zonder eiwit en geen kleurstof een lage achtergrondfluorescentie vertonen zonder temperatuurafhankelijke toename van de fluorescentie (Figuur 3A,B en aanvullende tabel S1). Voer data-analyse uit met behulp van vrij toegankelijke software zoals MoltenProt31 of DSFWorld32.
  3. Bepaal de smelttemperatuur met behulp van Boltzmann Sigmoidal Fit voor de gegevens. De smelttemperatuur (Tm) wordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij 50% denaturatie of de helft van de maximale intensiteit wordt waargenomen (Figuur 3C).
  4. Een thermische verschuiving in de smeltcurve kan stabiliserende of destabiliserende additieven suggereren. Om de verandering van de smelttemperatuur (Tm) te berekenen, gebruikt u de formule: Tm= Tm additief- Tm buffer. Een positieve waarde beschrijft een stabiliserende aandoening of een op elkaar inwerkend additief; een negatieve waarde beschrijft een destabiliserende toestand (Figuur 3D).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryotisch SelO bestaat uit een N-terminale mitochondriale targetingsequentie, een kinase-achtig domein en een sterk geconserveerd selenocysteïne aan de C-terminus van het eiwit23. Dit mitochondriaal-residente enzym codeert voor een pseudokinasedomein dat geconserveerd is van bacteriën tot mensen23. Structurele analyse van de SelO-homoloog van Pseudomonas syringae onthulde aminozuurveranderingen in de actieve plaats die de binding van ATP in een omgekeerde oriëntatie vergemakkelijken in vergelijking met canonieke kinasen25. Dienovereenkomstig katalyseert SelO AMPylering, in plaats van fosforylering, van meerdere eiwitten die betrokken zijn bij antioxidantsignalering om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade en celdood25. Naast AMPylatie is aangetoond dat sommige prokaryote en eukaryote AMPylasen UMPylatie katalyseren27,28.

We gebruikten gezuiverd recombinant E. coli SelO in TSA om de binding van ATP- en UTP-nucleotiden aan SelO te onderzoeken in aanwezigheid van tweewaardige kationen. Net als bij canonieke kinasen, herbergt SelO het DFG-motief waarin het aspartaat het metaalion bindt om nucleotide op de actieve plaats te coördineren. Eerst optimaliseerden we de concentratie van eiwit en kleurstof voor robuuste fluorescentiemetingen in TSA, waarbij we vaststelden dat 5 μM tot 10 μM E. coli SelO optimaal was met 5x SYPRO Orange (Figuur 2). Verder toonden we aan dat de controles zonder eiwit, evenals de controles zonder kleurstof, een laag fluorescentiesignaal hadden dat niet reageerde op de temperatuurstijging. We detecteerden ongeveer +4 °C en +12 °C verhogingen in de thermische stabiliteit van E. coli SelO in aanwezigheid van respectievelijk ATP-Mg2+ en ATP-Mn2+ (Figuur 3). We hebben echter geen verschuiving in thermische stabiliteit waargenomen bij incubatie met UTP, wat aangeeft dat E. coli SelO mogelijk geen detecteerbare binding aan UTP vertoont.

figure-results-1
Figuur 1: Thermocycler instellen. Een voorbeeld van het thermocycler-programma dat wordt gebruikt om de monstertemperatuur met +0,5 °C/min te verhogen tijdens het meten van SYPRO Orange-fluorescentie met behulp van het FRET-kanaal. De aanbeveling omvat ook een incubatie van de omgevingstemperatuur aan het begin en einde van het protocol. Afkorting: FRET = Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Optimalisatie van eiwit- en kleurstofconcentraties. (A) Representatieve resultaten van het optimaliseren van de SYPRO Orange kleurstofconcentratie met behulp van 5 μM Escherichia coli SelO. (B) Representatieve resultaten van het optimaliseren van de E. coli SelO-concentratie met behulp van 5x SYPRO Orange-kleurstof. De thermische denaturatiecurve geeft de relatieve fluorescentie-eenheden (y-as) weer ten opzichte van de temperatuur (x-as). De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drievoud (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Thermische denaturatiecurven en ΔTm analyses van SelO in aanwezigheid van nucleotide en tweewaardige kationen. (A) Ruwe gegevens van thermische denaturatiecurven van monsters (5 μM Escherichia coli SelO in aanwezigheid van 200 μM ATP of UTP en 2 mM tweewaardige kationen, 5x SYPRO Orange) die uit de RT-PCR-machine zijn geëxporteerd en in kaart zijn gebracht. SelO ATP-Mg vertegenwoordigt monsters met SelO, ATP en MgCl2, SelO ATP-Mn vertegenwoordigt monsters met SelO, ATP en MnCl2, SelO UTP-Mg vertegenwoordigt monsters met SelO, UTP en MgCl2, SelO UTP-Mn vertegenwoordigt monsters met SelO, UTP en MnCl2. Merk op dat de controles zonder kleurstof en geen eiwit een lage fluorescentie vertonen. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drievoud (n = 3). (B) Thermische denaturatiecurven uitgezet met de hoogste intensiteit en passend bij de sigmoïdale vergelijking van Boltzmann. Hoewel de thermische denaturatie van SelO niet werd beïnvloed door UTP, zagen we een duidelijke verschuiving in thermische denaturatie in aanwezigheid van ATP (paarse curves). De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drievoud (n = 3). (C) Histogram van de Tm-waarden zoals afgeleid van de Boltzmann-sigmoïdale fit van de gegevens weergegeven in figuur 3B. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drievoud (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-MG 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-MN 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-MN 39,9 °C ± 0,087. (D) Histogram van de verandering in de smelttemperatuur ΔTm (Tm additief - Tm buffer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: Voorbeeldgegevens voor TSA van SelO in aanwezigheid van metalen en nucleotiden. Spreadsheet met onbewerkte gegevens die zijn geëxporteerd vanuit de RT-PCR-machine en gegevens die zijn verwerkt om waarden te verwijderen na maximale RFU-intensiteit zoals beschreven in protocolstappen 5.1 en 5.2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Thermal Shift Assay (TSA) dient als een efficiënte methode voor het screenen van eiwit-ligandinteracties, inclusief die met cofactoren en remmers. In dit protocol gebruikten we TSA om de binding van het pseudokinase SelO aan nucleotiden en tweewaardige kationen te meten. Onze bevindingen tonen aan dat SelO een verhoogde thermische stabiliteit vertoont in aanwezigheid van ATP en Mg2+/Mn2+. Deze observatie komt overeen met eerdere rapporten die aangeven dat SelO-homologen van E. coli, S. cerevisiae en H. sapiens de overdracht van AMP van ATP naar de hydroxylzijketen van eiwitsubstraten katalyseren25,29. Hoewel TSA waardevolle inzichten biedt in nucleotidebinding, is het mogelijk dat het in vivo substraat niet wordt geïdentificeerd. Ook andere moleculen, niet alleen het substraat, kunnen de thermische stabiliteit van een eiwit beïnvloeden. Om een substraat nauwkeurig te identificeren, moet rekening worden gehouden met factoren zoals cellulaire concentratie en bindingsaffiniteit. Desalniettemin is TSA een uitstekend hulpmiddel voor het screenen van een groot aantal aandoeningen, zoals de binding van kleine moleculen, met behulp van thermische stabilisatie als uitlezing.

Het nut van TSA gaat verder dan de toepassing ervan bij het analyseren van kleine molecuulbinding aan actieve of regulerende plaatsen van eiwitten. TSA heeft aanzienlijk bijgedragen aan de biofysische karakterisering van eiwitten door stabiliserende omstandigheden te bieden die het eiwit meer bevorderlijk maken voor kristallografie-experimenten. TSA biedt met name verschillende voordelen, waaronder de eenvoudige installatie en hoge doorvoermogelijkheden met behulp van algemeen verkrijgbare laboratoriummaterialen zoals PCR-platen en RT-PCR-machines. Deze voordelen maken het mogelijk om tal van omstandigheden te testen die misschien niet haalbaar of zo eenvoudig zijn met andere technieken. Meerdere studies hebben TSA gebruikt om de thermische stabiliteit van recombinante eiwitten te meten met een bibliotheek van verbindingen om de optimale omstandigheden voor eiwitkristallisatie te bepalen19,33.

Het opnemen van passende controles is noodzakelijk om verkeerde interpretatie van smeltcurves te voorkomen, waarbij autofluorescentie van de platen of additieven een veelvoorkomend probleem is. TSA is mogelijk niet geschikt voor verbindingen die autofluorescentie vertonen of de fluorescentie van SYPRO-oranje doven. Een mogelijke oplossing is het screenen van alternatieve kleurstoffen zoals beschreven in 12. Het TSA-protocol dat hier wordt beschreven, kan eenvoudig worden aangepast voor andere eiwitten en additieven die van belang zijn. De additieven beperken zich niet alleen tot wateroplosbare verbindingen, zoals blijkt uit ons protocol met nucleotiden en tweewaardige kationen. In plaats daarvan kunnen additieven een breed scala aan aandoeningen omvatten, zoals variërende pH, liganden of geneesmiddelen die zijn opgelost in DMSO8. Bovendien kan pre-incubatie van het ligand met het eiwit meer reproduceerbare resultaten opleveren door interferentie en artefacten van de kleurstof te verminderen. Additieven zoals lipiden en wasmiddelen kunnen leiden tot een hoge fluorescentie vanwege hun interacties met SYPRO Orange. Een voorbeeld van een denaturatiecurve wordt getoond in figuur 3A , die een lage achtergrondfluorescentie weergeeft in combinatie met een significante toename van de fluorescentie bij thermische denaturatie van het eiwit. De optimale concentratie van kleurstof en eiwit levert de maximale signaal-ruisverhouding op met behoud van een consistent fluorescentiesignaal over alle replicaten.

TSA biedt het voordeel van eenvoud met zijn minimale componenten, waardoor het aantal variabelen voor optimalisatie wordt verminderd. Cruciale stappen zijn onder meer het bepalen van de optimale concentraties van zowel de kleurstof als het eiwit. Het is belangrijk op te merken dat TSA gezuiverd, "goed gedragend" eiwit vereist. Het eiwit en het additief moeten stabiel zijn in de buffer bij de concentraties die in TSA worden gebruikt. Eiwitten of aandoeningen die vatbaar zijn voor aggregatie of oligomerisatie kunnen leiden tot foutieve fluorescentiemetingen. Geaggregeerde of ongevouwen eiwitten kunnen aanvankelijk een hoge fluorescentie vertonen met slechts een kleine toename bij denaturatie. Oligomerisatie van eiwitten kan ook resulteren in meerdere overgangstoestanden, wat de analyse bemoeilijkt10. De eiwitconcentratie kan worden verfijnd om aggregatie te voorkomen.

TSA is compatibel met een breed scala aan buffers en zouten, waardoor de stabiliserende omstandigheden voor het eiwit en het additief kunnen worden geoptimaliseerd11. De volumes van de eiwit- en additieve oplossingen kunnen worden aangepast om de beperkingen van eiwit- en additievenconcentraties te overwinnen. Lagere concentraties van additieven, zoals 5x, kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in plaats van de 10x-oplossing die in de representatieve resultaten wordt gebruikt. Met name de relatieve hoeveelheid eiwit en additief die nodig is om de test uit te voeren is laag, aangezien de PCR-platen met 384 putjes volumes van slechts 10 μL van het totale monster kunnen bevatten.

Gezien de sterke punten van TSA is het ideaal voor het onderzoeken van onderbelichte eiwitten zoals pseudokinasen. Pseudo-enzymen zijn katalytisch inactieve eiwitten die structureel homoloog zijn aan actieveenzymen 34. Recente structurele en biochemische studies hebben aangetoond dat een paar pseudo-enzymen actieve enzymen zijn, terwijl de meeste niet-katalytische functieshebben35,36. Hoewel ze katalytisch inactief zijn, zijn pseudo-enzymen betrokken bij verschillende ziekten en spelen ze een belangrijke rol, waaronder steigers en allosterische modulatie37. Het werkingsmechanisme en de functionele betekenis van veel pseudo-enzymen zijn echter onbekend. De activiteiten van sommige pseudo-enzymen worden gereguleerd door ligandbinding, wat resulteert in een verhoogde thermische stabiliteit die gepaard gaat met conformationele veranderingen van het eiwit14. We stellen voor dat TSA een waardevol hulpmiddel is voor het onderzoeken van de binding van liganden aan pseudo-enzymen om de optimale ligand voor functionele activiteit te bepalen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.S. is een W.W. Caruth, Jr. Scholar in Biomedical Research, Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Scholar, en Charles en Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research Faculty Scholar. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant K01DK123194 (A.S.), CPRIT Grant RR190106 (A.S.), Welch (I-2046-20200401) en Welch (I-2046-20230405).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzout hydraatSigma AldrichA2383-10Ggebruikt voor representatieve resultaten, maar niet vereist om TSA uit te voeren
Avanti J-15R met microplaatdragermontageBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 Real-time PCR-systeemBio-Rad12011452
Hard-Shell 384-Well PCR-platen, dunne wand, met rand, helder/witBio-RadHSP3805
MagnesiumchlorideSigma AldrichM8266-100Ggebruikt voor representatieve resultaten, maar niet vereist om TSA uit te voeren
Mangaan (II) chloride tetrahydraatSigma AldrichM3634-500Ggebruikt voor representatieve resultaten, maar niet vereist om TSA uit te voeren
Microseal 'B' PCR-platen afdichtingsfolie, kleefstof, optischBio-RadMSB1001
SYPRO Orange Proteïne Gel vlekSigma AldrichS5692-500UL
Uridine 5′-trifosfaat trinatriumzout hydraatSigma AldrichU6625-100MGgebruikt voor representatieve resultaten, maar niet vereist om TSA uit te voeren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
  3. Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).
  4. Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).
  5. Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
  6. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  7. Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).
  8. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  9. Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).
  10. Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).
  11. Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
  12. Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
  13. Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
  14. Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
  15. Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
  16. Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
  17. Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).
  18. Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), e51809(2014).
  19. Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
  20. Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).
  21. Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
  22. Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
  23. Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138(2012).
  24. Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518(2014).
  25. Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821 (2018).
  26. Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).
  27. Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
  28. Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).
  29. Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
  30. Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).
  31. Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
  32. Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).
  33. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).
  34. Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
  35. Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
  36. Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
  37. Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Thermal Shift AssaySelenoprotein OProtein AMPylationLigand BindingMelting TemperatureNucleotide BindingMetal BindingPseudokinase ActivityHigh Throughput ScreeningProtein Stability

Gerelateerde artikelen