Methodenartikel

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67141

⸱

12 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

Samenvatting

Calcium is een belangrijk signaalmolecuul tijdens de overgang van eicel naar embryo (OET) en vroege embryogenese. De hermafrodiete nematode Caenorhabditis elegans biedt verschillende unieke voordelen voor de studie van de OET, omdat deze transparant is en een geordende geslachtsklier heeft die elke ~23 minuten bij 20 °C één rijpe eicel produceert. We hebben de genetisch gecodeerde calciumindicator jGCaMP7s aangepast om fluorescerend het moment van bevruchting in een levend organisme aan te geven. We hebben deze reporter "CaFE" genoemd voor calcium tijdens de bevruchting in C. elegans. De CaFE-reporter is in één kopie ontworpen tot een veilige havenlocus, heeft geen significante invloed op de fysiologie of vruchtbaarheid en produceert een robuust signaal bij bevruchting. Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het gebruik van de CaFE-reporter als een in vivo hulpmiddel voor het ontleden van de OET en embryogenese. We bevatten methoden om wormen te synchroniseren, de effecten van RNAi-knockdown te onderzoeken, wormen te monteren voor beeldvorming en om calcium in eicellen en embryo's te visualiseren. Daarnaast presenteren we het genereren van extra wormstammen om te helpen bij dit soort analyse. Om het nut van de CaFE-reporter aan te tonen om de timing van de bevruchting te visualiseren, melden we dat dubbele ovulatie optreedt wanneer ipp-5 het doelwit is van RNAi en dat alleen de eerste eicel onmiddellijke bevruchting ondergaat. Bovendien wordt hier de ontdekking van eencellige calciumtransiënten tijdens de vroege embryogenese gerapporteerd, wat aantoont dat de CaFE-reporter tot in de vroege ontwikkeling voortduurt. Belangrijk is dat de CaFE-reporter in wormen eenvoudig genoeg is om te gebruiken voor opname in cursusgebaseerde laboratoriumklassen voor niet-gegradueerd onderzoek (CURE). De CaFE-reporter, in combinatie met de geordende geslachtsklieren en het gemak van RNAi in wormen, vergemakkelijkt het onderzoek naar de cel-celdynamiek die nodig is om interne bevruchting en vroege embryogenese te reguleren.

Inleiding

Bemesting markeert het begin van een nieuwe levenscyclus, maar het bepalen van het precieze moment van bevruchting is een uitdaging. Een geconserveerd kenmerk van bevruchting is een golf van calcium over de eicel onmiddellijk na spermafusie1. Hoewel de aard van de calciumgolf, in termen van frequentie en snelheid, verschilt tussen soorten, vertonen bijna alle organismen een tijdelijke toename van intracellulair calcium na bevruchting. De calciumgolf speelt een cruciale rol in een blokkade voor polyspermie, eicelactivering en andere belangrijke cellulaire gebeurtenissen2. Omdat de calciumgolf begint op de plaats van spermafusie, dient calcium als een marker voor bevruchting3.

Caenorhabditis elegans is een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van vroege ontwikkeling. De wormen zijn transparante hermafrodieten die genetisch handelbaar zijn4. Het belangrijkste voor de studie van bevruchting is dat C . elegans volwassenen continu eicellen produceren met behulp van een strikt geordende geslachtsklier5. In feite zijn eicellen de enige nieuwe cellen die worden geproduceerd, aangezien de soma postmitotisch is op volwassen leeftijd6. Figuur 1 markeert de geslachtsklieren, die bestaat uit 2 symmetrische U-vormige buisjes van zich ontwikkelende eicellen. De eicel die zich het dichtst bij de spermatheca (opslagorgaan voor sperma) bevindt, wordt de -1 eicel genoemd. Dit lopende bandontwerp van de wormgonaden ovuleert elke ~23 minuten bij 20 °C bij jonge volwassenen een rijpe eicel in de spermatheca7. Het pas bevruchte embryo gaat vervolgens naar een gedeelde baarmoeder voordat het door een enkele vulva wordt gelegd.

Eerdere technieken om calcium tijdens de bevruchting in C. elegans te visualiseren, waren gebaseerd op micro-injectie van calciumgevoelige kleurstoffen 3,8. Om de calciumgolf bij sperma-eicelfusie gemakkelijker te kunnen zien, werd een genetisch gecodeerde calciumindicator op basis van jGCaMP7s in één kopie ingevoegd op een veilige havenlocus met behulp van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)7,9. De reporter werd CaFE genoemd voor calcium tijdens bevruchting in C. elegans. De melder vertoont geen significante defecten in fysiologie of vruchtbaarheid.

Hier worden protocollen gepresenteerd voor visualisatie van de calciumgolf in de eicellen en embryo's van C. elegans met behulp van de CaFE-reporter. In combinatie met de talloze hulpmiddelen die beschikbaar zijn in de wormgemeenschap, zoals RNA-interferentie (RNAi) en mCherry gonadenmarkers, vergemakkelijkt de CaFE-reporter het onderzoek naar de regulatie van interne bevruchtingsgebeurtenissen, met name bevruchtingscompetentie en de timing van bevruchting. Bovendien blijft de CaFE-reporter tot in de vroege ontwikkeling bestaan en is het een uniek hulpmiddel om embryogenese te onderzoeken.

Protocol

1. C. elegans onderhoud

  1. Nematoden Groeimedium (NGM) plaat voorbereiding
    1. Combineer 3 g natriumchloride (NaCl), 2,5 g Bacto-Pepton, 20 g agar en 1 l gedeïoniseerd water in een kolf van 4 l (zie materiaaltabel). Bedek de bovenkant van de kolf met aluminiumfolie voordat u de kolf in de autoclaaf zet.
    2. Autoclaaf om te steriliseren met behulp van de instellingen van de vloeistofsterilisatiecyclus. Een sterilisatiecyclus van 121 °C gedurende 30 minuten wordt aanbevolen.
    3. Laat het mengsel afkoelen tot ~50 °C, ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Voeg 25 ml steriel 1 M KH2PO4 (opgelost in water, pH = 6), 1 ml steriel 1 M CaCl2 (opgelost in water), 1 ml steriel 1 M MgSO4 (opgelost in water) en 1 ml 5 mg/ml cholesterol (opgelost in 100% ethanol) toe, zachtjes ronddraaiend na elke toevoeging (zie materiaaltabel).
    5. Breng met behulp van een steriele techniek een deel van het mengsel over in een steriel bekerglas van 300 ml om het gieten te vergemakkelijken. Giet de warme media om de bodem van het bord te bedekken.
      OPMERKING: Ongeveer 10 ml per plaat in steriele petriplaten van 60 mm x 15 mm (zie materiaaltabel) levert 100 platen op. Als alternatief kunnen steriele petrischalen van 35 mm x 10 mm worden gebruikt, waarbij ~4 ml per plaat ~250 platen oplevert.
    6. Laat de NGM-platen minimaal 1 dag drogen bij RT voordat u ze met bacteriën bezaait. Bewaar borden ondersteboven bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
  2. OP50 bacterieel gazon preparaat
    1. Maak Luria-bouillon (LB) door 5 g gistextract, 10 g Bacto-Trypton, 5 g NaCl en 1 L gedeïoniseerd water te combineren in een kolf van 2 L (zie Materiaaltabel). Gebruik een roerplaat en roerstaaf en meng tot het is opgelost.
    2. Aliquot LB in flessen en autoclaaf met behulp van de instellingen van de vloeistofsterilisatiecyclus. Een sterilisatiecyclus van 121 °C gedurende 30 minuten wordt aanbevolen. Als u een container met een schroefdop gebruikt, draait u de schroefdop een kwart slag los voor een goede ventilatie tijdens de autoclaafcyclus.
    3. Laat de bouillon afkoelen tot RT voor gebruik.
    4. Inoculeer met behulp van een steriele techniek 50 ml LB in een erlenmeyer van 250 ml met OP50-bacteriën en laat 's nachts bij 37 °C groeien door te schudden.
    5. Breng met behulp van een steriele techniek 300 μl verzadigde cultuur over op het midden van een NGM-plaat van 60 mm x 15 mm. Voor platen van 35 mm x 10 mm wordt 100 μL verzadigde cultuur aanbevolen.
    6. Laat de platen 1-3 dagen drogen bij RT totdat de OP50 bacterieplek niet meer vloeibaar is. Zorg ervoor dat de platen droog en vrij van verontreiniging zijn voor gebruik. Bewaar de platen bij 4 °C voor toekomstig gebruik. Door platen ondersteboven te bewaren, wordt condensatie op het plaatoppervlak verminderd.
  3. Worm pick constructie
    1. Maak de zilveren kraag los naar de kop van het handvat van de wormplectrum (zie Materiaaltabel) door voorzichtig los te schroeven zodat de vier secties uit elkaar vallen.
    2. Knip 1,5 inch (ongeveer de lengte van de duim) platinadraad (zie Materiaaltabel) met een schaar en plaats deze in het midden van de vier secties; Er steekt ongeveer een centimeter uit het handvat.
    3. Houd de draad in het midden terwijl u de halsband aanspant; De vier secties komen in het midden samen en houden de platinadraad op zijn plaats.
    4. Vorm de draad voorzichtig met een platbektang. Een regenboog- of boogvorm heeft de neiging om het beste te werken om te plukken.
    5. Creëer ongeveer een "voet" van 2-3 mm aan het uiteinde van de draad door herhaaldelijk vast te klemmen met de platbektang. Gebruik deze "voet" om de wormen op te pakken en houd de "voet" plat op het oppervlak van de plaat.
      OPMERKING: Als u te hard klemt, wordt de platinadraad doorgesneden. Vermijd het maken van scherpe randen met behulp van de platbektang (of gelijkwaardig) om te voorkomen dat de wormen of de platen worden doorboord.
  4. Behandeling van wormen
    1. Houd de wormstoker vast als een potlood en steriliseer de "voet" door de draad in de vlam van een 95% ethanollamp te plaatsen totdat deze fel oranje is.
    2. Plaats een OP50 gezaaide plaat op het podium van een snijscoop en verwijder het deksel. Raak voorzichtig met de "voet" van de plectrum een deel van het bacteriële gazon aan en gebruik een zachte veegbeweging om bacteriën op de bodem te verzamelen. De bacteriën die aan de plectrum vastzitten (ook wel "goo" genoemd) fungeren als een lijm om wormen op te pikken.
    3. Verplaats een bord met wormen naar de fase van de snijscoop en verwijder het deksel terwijl u voorkomt dat de plectrum andere oppervlakken raakt. Raak snel en voorzichtig de "voet" van de pikhouweel aan op een worm om deze op te pakken. Met deze techniek kunnen meerdere wormen tegelijk tussen de platen worden verplaatst.
    4. Raak voorzichtig de "voet" van de plectrum aan op het niet-gezaaide deel van een nieuwe plaat om de wormen over te brengen; Meestal is dit dezelfde plaat waar de bacteriën uit zijn gehaald in paragraaf 1.4.2.
    5. Steriliseer de plectrum tussen elke plaat en/of wormstam om besmetting te voorkomen en laat de plectrum na het steriliseren afkoelen.
      OPMERKING: Het aanraken van een hete pikhouweel op een worm zal het dier stress bezorgen of doden. De wormprikker zal afkoelen na het aanraken van het bacteriële gazon om "goo" op te nemen voor wormoverdracht.
  5. Houd de wormen bij 20 °C op NGM-platen (stap 1.1) die zijn ontzaaid met OP50 Escherichia coli-bacteriën (stap 1.2). Passage wormen 2 - 3 keer per week door meerdere volwassenen over te brengen naar verse platen (60 mm x 15 mm) met behulp van een wormprikker (stappen 1.3-1.4) om uithongering te voorkomen, wat de fysiologie kan veranderen.
    OPMERKING: C. elegans-stammen en OP50-bacteriën zijn verkrijgbaar via het Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

2. C. elegans ontwikkelingssynchronisatie

  1. Leeftijdssynchronisatie wormen met behulp van een getimede eierleg (hier beschreven). Als er een groot aantal wormen nodig is voor een klaslokaal of ander doel, voer dan bleekmiddelsynchronisatie uit zoals beschreven in Golden et al.10.
  2. Breng volwassen wormen over op een nieuwe OP50-plaat met behulp van een platina draadplectrum (beschreven in sectie 1). Het aantal wormen wordt bepaald door de experimentele behoefte. Dag 1 wormen leggen ongeveer 3 eieren per uur. Daarom zullen 10 wormen ongeveer 30 eieren genereren in 1 uur. Gebruik wormen bij voorkeur op de eerste dag van de volwassenheid (dag 1).
  3. Verwijder na ongeveer 1 uur de volwassen wormen van de plaat en laat alleen de eieren over.
    OPMERKING: Het per ongeluk achterlaten van een worm is een veelgemaakte fout. Wormen die overblijven, zullen eieren blijven leggen en de synchronisatie verstoren. Wormen rijpen tot volwassen dieren op dag 1 ongeveer 72 uur na het leggen wanneer ze worden uitgebroed bij 20°C.

3. Montage van wormen voor beeldvorming

  1. Gebruik bij het in beeld brengen van bevruchtingsgebeurtenissen volwassenen op dag 1 om de visualisatiemogelijkheden te maximaliseren.
    OPMERKING: Bij volwassenen op dag 1 wordt elke ~23 minuten een eicel bevrucht. De eisprong vertraagt echter met de leeftijd en een typische hermafrodiet stopt na dag 4 met het leggen van eieren.
  2. Bereid een oplossing van 3% agarose in water door 3 g agarose te mengen in 100 ml water. Verwarm de agaroseoplossing met behulp van een magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Om een gestolde oplossing opnieuw te gebruiken, verwarmt u tot deze volledig is opgelost. Genereer na verschillende keren gebruik een nieuwe oplossing.
  3. Plaats een leeg microscoopglaasje voor beeldvorming tussen twee andere microscoopglaasjes met een enkele laag laboratoriumtape over de lange as van het objectglaasje (zie Materiaaltabel). De tape creëert een afstandhouder voor het agarosepad, waardoor een gelijkmatige verdeling en een uniforme breedte mogelijk is. Zorg ervoor dat de drie dia's op een rij staan met de lange zijden tegen elkaar: twee dia's met tape die een leeg microscoopglaasje flankeren.
    1. Laat de verwarmde 3% agarose-oplossing (~100-150 μL) met behulp van een pipet van 1 ml op het midden van het microscoopglaasje tussen de afgeplakte objectglaasjes vallen.
    2. Plaats snel een nieuw microscoopglaasje op de agarosedruppel en zorg ervoor dat het nieuwe objectglaasje loodrecht op het objectglaasje met de agarosedruppel staat en over de aangrenzende afgeplakte objectglaasjes rust.
    3. Scheid de dia's voorzichtig. Scheur het kussen niet.
    4. Bereid de agarosepads elke dag vers voor op de beeldvorming. Het wordt aanbevolen om meerdere pads te maken bij de voorbereiding op beeldvorming, maar onthoud u ervan om meer dan één pad tegelijkertijd bloot te leggen. Blootgestelde pads drogen snel uit.
  4. Voeg met behulp van een pipet van 20 μL een kleine druppel (~7 μL) van 1 mM levamisol in M9-buffer toe aan het midden van het agarosekussen om de wormen te verlammen. Gebruik een met een filter gesteriliseerde 100 mM stockoplossing van levamisol om de 1 mM werkende oplossing te maken.
    1. Om een M9-buffer te maken, combineert u 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, 1 g NH4Cl en 1 l gedeïoniseerd water in een geschikte container (zie materiaaltabel).
    2. Autoclaveer de oplossing met behulp van de instellingen van de vloeistofsterilisatiecyclus en laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot RT. Als u een container met een schroefdop gebruikt, draait u de schroefdop ongeveer een kwartslag los voor een goede ventilatie. Een sterilisatiecyclus van 121 °C gedurende 30 minuten wordt aanbevolen.
  5. Pluk minstens 5 gesynchroniseerde wormen en raak voorzichtig de "voet" aan op de levamisoldruppel om alle wormen over te brengen. Gebruik minimaal 5 wormen per objectglaasje, omdat de oriëntatie van het lichaam ervoor kan zorgen dat de darm de kiembaan verduistert, waardoor de visualisatie van de calciumgolf in de eicel wordt geblokkeerd.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de wormen snel worden overgebracht, aangezien de levamisol zal verdampen als deze langer dan 5 minuten op het agarosekussen blijft staan.
  6. Bedek het agarosekussen voorzichtig met een dekglaasje. Controleer de locatie van de wormen, aangezien het dekglaasje de verspreiding van de wormen vanaf de eerste plaatsing kan veroorzaken. Label het objectglaasje met de juiste details, zoals de naam van de wormstam (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de beeldvorming zo snel mogelijk na het monteren van wormen wordt uitgevoerd, aangezien langdurige blootstelling aan levamisol giftig is.

4. Beeldvorming van calcium tijdens de bevruchting in  C. elegans

  1. Lokaliseer de wormen met behulp van een objectief met een laag vermogen, zoals 4x, op de microscoop van uw keuze. Gebruik helderveldverlichting.
  2. Gebruik minimaal een 20x luchtobjectief om de calciumgolf in eicellen duidelijk zichtbaar te maken. Gebruik een onderdompelingsobjectief van 40x of meer.
  3. Afhankelijk van het systeem dat men gebruikt, is de excitatie-intensiteit meestal een vaste waarde. Voor een optimale visualisatie van de fluorescerende reporters past u de versterkings- of belichtingstijd aan.
    OPMERKING: Continu licht met hoge intensiteit beschadigt het monster en is schadelijk voor de gezondheid van wormen. Schakel desgewenst de laser uit in afwachting van een bevruchtingsgebeurtenis om continue GFP-verlichting te voorkomen. Zie de kenmerken van een bevruchting in de paragrafen 4.8 - 4.9.
  4. Zorg ervoor dat het GFP-kanaal van 488 nm is ingesteld op een laservermogen waarbij het CaFE-reportersignaal goed zichtbaar is.
    1. Voor een Nikon ECLIPSE Ti2-laserscanconfocal detecteert u de CaFE-reporter met een laservermogen van 30% voor het GFP-kanaal en een versterking van 75. De pinhole grootte voor de Nikon ECLIPSE Ti2 laserscanning confocaal is 30 μm.
    2. Voor de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met behulp van de Zyla-camera, detecteert u de CaFE-reporter met een laservermogen van 30% voor het GFP-kanaal. De pinhole-grootte voor de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal is 40 μm.
    3. Pas de laserinstellingen en belichtingstijd aan voor elk onderzocht monster.
  5. Bij gebruik van de EAG28 (CaFE; PH-mCherry) of EAG25 (CaFE; H2B-mCherry) zeef, zorg er dan voor dat het rode kanaal is ingesteld op een laservermogen waarbij het mCherry-signaal naast het GFP-kanaal goed zichtbaar is.
    1. Voor het Nikon ECLIPSE Ti2 laserscanapparaat detecteert u de mCherry-reporter met een laservermogen van 15 voor het RFP-kanaal en een versterking van 130.
    2. Voor de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met behulp van de Zyla-camera, detecteert u de mCherry-reporter met een laservermogen van 30% voor het RFP-kanaal.
    3. Pas de laserinstellingen en belichtingstijd aan voor elk onderzocht monster.
  6. Stel de framesnelheid of frames per seconde (fps) zo snel in als het systeem toelaat.
    OPMERKING: De CaFE-reporter wordt doorgaans waargenomen met ongeveer 1 fps voor de Nikon ECLIPSE Ti2-laserscanning confocaal en 10 fps voor de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met de Zyla-camera.
  7. Selecteer het time-lapse- of tijdreeksprotocol en pas de gewenste instellingen aan. Maak time-lapse-beelden van 30 minuten of minder, met de herhalingsoptie ingesteld op '1'.
    OPMERKING: Als de bevruchting plaatsvindt voordat het tijdsinterval is voltooid, stop dan de video om de bestandsgrootte te behouden.
  8. Zoek de wormen op de dia en selecteer een worm waar de proximale geslachtsklier zichtbaar is. De darm en de geslachtsklier draaien om elkaar heen in de worm. Als zodanig wordt een geslachtsklierarm vaak verduisterd door de darm, waardoor visualisatie van de bevruchting wordt voorkomen. Als de -1 eicel verborgen is, selecteert u een andere worm voor visualisatie. Om de kans te vergroten dat de geselecteerde worm een zichtbare geslachtsklierarm heeft, monteert u minimaal 5 wormen per objectglaas. Gebruik volwassenen op de eerste dag 1 om de bevruchting te visualiseren.
  9. Onderzoek elke -1 eicel in de geslachtsklierarmen van de worm om te bepalen of er een bevruchting op handen is.
    OPMERKING: Voorafgaand aan de bevruchting, tijdens de meiotische rijping, zal de kern in de -1 eicel naar de achterkant van de eicel migreren en zal de nucleaire envelop oplossen. Deze gebeurtenissen zijn zichtbaar in zowel Nomarksi- als GFP-kanalen met behulp van de CaFE-reporter, en dergelijke gebeurtenissen geven aan dat de eisprong binnen de komende ~10 minuten zal plaatsvinden.
  10. Na afbraak van de nucleaire envelop zal het cytoskelet van de meest proximale -1 eicel herschikken, een afgerond uiterlijk aannemen en zich scheiden van de -2 eicel. Op dit punt zal de eisprong op korte termijn plaatsvinden. Begin onmiddellijk met het opnemen van de video als deze gebeurtenissen worden waargenomen. Maak video's in een widefield-omgeving.
    OPMERKING: Als de beweging van de kern of de afronding van de eicel na 20 minuten niet zichtbaar is, is het onwaarschijnlijk dat er een ovulatie optreedt. Richt je op een andere worm en/of bereid een nieuwe dia voor.

5. Kwantificering van calciumtransiënten bij bemesting met C. elegans

  1. Kwantificeer calciumtransiënten uit bemestingsvideo's met behulp van de microscoopsysteemsoftware zoals Nikon NIS Elements (hier beschreven). ImageJ/FIJI zijn ook geschikt voor beeldanalyse11.
  2. Om de verandering in fluorescentie van bemestingsvideo's te kwantificeren, gebruikt u de volgende signaalwaarden: het signaal op tijdstip 0, het signaal van het interessekader en het basislijnsignaal.
  3. Identificeer de tijd en het tijdsbestek die de eerste uitbarsting van fluorescentie vastleggen die optreedt in de -1 eicel. Definieer dit frame als tijd 0.
  4. Om het signaal van het interessekader te verkrijgen, tekent u het interessegebied (ROI) dat de volgende gebieden omvat: de -1 eicel voorafgaand aan de bevruchting, de spermatheca en de pas bevruchte eicel in de baarmoeder. Het signaal dat in de ROI wordt weergegeven, wordt F1 genoemd.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de ROI het hele gebied bestrijkt dat door de eicel wordt verhandeld. De ROI moet identiek zijn in elk frame van de time-lapse-opname die wordt geanalyseerd.
  5. Definieer een leeg gebied van de afbeelding zonder fluorescentie met dezelfde afmetingen als de ROI die in stap 5.4 is gedefinieerd om het achtergrondsignaal in elk frame te berekenen. Trek het achtergrondsignaal van elk frame af.
  6. Om het basislijnsignaal (F0) te verkrijgen, plaatst u het frame in minimaal 15 frames vóór tijd 0. Gebruik dezelfde ROI als in stap 5.4 en noteer het signaal bij elk frame tot tijd 0. Gemiddelde van de signalen (met achtergrondaftrekking) vanaf het startframe tot tijd 0 om het basissignaal te berekenen.
  7. Bereken de verandering in fluorescentie (ΔF) met behulp van de volgende formule: figure-protocol-1. F1 wordt in elk frame gedefinieerd als het signaal in de ROI zonder het achtergrondsignaal. De F0 is het gemiddelde fluorescerende basissignaal van ≥15 frames vóór tijd 0, zoals berekend in paragraaf 5.6.
  8. Bepaal de snelheid van verandering tussen frames door de verandering in fluorescentie tussen 2 frames af te trekken en te delen door de tijd.

6. RNAi in C. elegans

  1. Bereid RNAi-platen voor
    1. Bereid de platen voor volgens stap 1.1 en voeg de volgende aanvullende reagentia toe om genuitschakeling via RNAi mogelijk te maken bij stap 6.1.4.
    2. Voeg 1 ml 1 M steriel gefilterd isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (opgelost in gedeïoniseerd water) toe voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM IPTG in de media (zie materiaaltabel).
    3. Voeg 1 ml steriel gefilterde ampicilline van 100 mg/ml toe (opgelost in gedeïoniseerd water) voor een eindconcentratie van 100 μg/ml ampicilline in de media (zie materiaaltabel). U kunt ook 40 μg/ml carbenicilline12 gebruiken.
    4. Zwenk voorzichtig maar grondig om de platen te mengen en te gieten zoals beschreven in de stappen 1.1.4 - 1.1.5.
  2. Bereiding van met RNAi verzadigde cultuur
    1. Bereken de hoeveelheid verzadigde cultuur door het benodigde aantal gezaaide RNAi-platen te vermenigvuldigen met 300 μL bij gebruik van platen van 60 mm x 15 mm of met 100 μL bij gebruik van platen van 35 mm x 10 mm.
    2. Kweek met behulp van een steriele techniek de gewenste RNAi-bacteriën in LB (beschreven in de stappen 1.2.1-1.2.3) met 100 μg/ml ampicilline 's nachts bij 37 °C tot ze verzadigd zijn. Neem een bacteriestam op die de lege L4440-vector bevat als negatieve controle en een bacteriestam die een RNAi-positieve controle bevat (bijv. ei-5) om te controleren of het RNAi werkt. Voeg bovendien een "lege" voorwaarde toe die alleen LB bevat om te controleren of er geen verontreiniging is in de voorraad LB.
    3. Voeg steriel gefilterd IPTG tot een eindconcentratie van 1 mM toe aan de verzadigde nachtcultuur voor inductie van dsRNA-expressie en incubeer gedurende ten minste 2 uur en 30 minuten bij 37 °C alvorens te zaaien. U kunt de verzadigde nachtcultuur ook uit de logfase verdunnen voordat u met IPTG wordt geïnduceerd.
      OPMERKING: IPTG is opgenomen in zowel de platen als de verzadigde cultuur voor optimale dsRNA-expressie.
    4. Breng met behulp van een steriele techniek 300 μL van de geïnduceerde cultuur over op het midden van een RNAi-plaat van 60 mm x 15 mm (gestold). U kunt ook 100 μL verzadigde cultuur gebruiken voor een plaat van 35 mm x 10 mm.
    5. Laat de platen 1-3 dagen drogen bij RT totdat de RNAi-bacteriële plek niet meer vloeibaar is. Zorg ervoor dat de platen droog en vrij van verontreiniging zijn voor gebruik. Bewaar borden bij 4 °C ondersteboven voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: Gebruik RNAi-platen zo snel mogelijk voor een optimale knockdown, aangezien de werkzaamheid van RNAi na verloop van tijd afneemt. Weggooien als >1 maand oud is.
  3. Zoals beschreven in sectie 2, synchroniseert u de wormen met RNAi-platen.
    1. Controleer wormen 1-2 dagen na de synchronisatie van eieren en leg op ontwikkelingsachterstanden.
    2. Sommige RNAi kunnen ontwikkelingsstoornissen veroorzaken wanneer de knockdown begint bij het leggen van eieren. Plaats indien nodig in een later stadium wormen op de RNAi-platen, zoals L3.
  4. Zoals beschreven in secties 3 en 4, monteert u de wormen en bereidt u zich voor op beeldvorming met behulp van een microscoopsysteem dat is uitgerust om GFP-fluorescentie te detecteren.

7. Beeldvorming van calcium tijdens de vroege embryogenese in C. elegans

  1. Synchroniseer wormen zoals beschreven in sectie 2. Gebruik de EAG28-stam, die de CaFE-reporter combineert met een pleckstrin-homologiedomein-mCherry-marker die de plasmamembraangrens markeert. Als alternatief, om bevruchte embryo's ex utero te visualiseren, snijdt u de worm voorzichtig langs de baarmoeder open met behulp van een steriele spuitnaald om de embryo's vrij te geven.
  2. Bereid wormen of embryo's voor op beeldvorming zoals beschreven in sectie 3 en volg dezelfde instructies als beschreven in sectie 4 voor het instellen van beeldvormingsparameters.
  3. Centreer het interessegebied op de baarmoeder van de worm om embryo's of een gelegd ei te visualiseren.
    1. Zorg er bij embryo's in de baarmoeder voor dat de baarmoeder zich niet achter de darm bevindt, dat de baarmoeder niet overvol is en dat de afzonderlijke cellen in het embryo vrij zijn in het brandpuntsvlak.
    2. Zorg er voor eieren ex utero voor dat de stadia van de cellen niet voorbij het kommastadium van de levenscyclus van de worm zijn.
  4. Selecteer het time-lapse- of tijdreeksprotocol en pas de gewenste instellingen aan.
    1. Voor een optimale visualisatie van embryonale calciumtransiënten verhoogt u de tijdinstellingen voor langdurige films. Houd er rekening mee dat constante blootstelling aan de laser het embryo gedurende lange tijd zal schaden.
  5. Leg video's of afbeeldingen vast door te focussen op cellen in embryo's in het gewenste celstadium.
  6. Gebruik een 40x onderdompelingsobjectief of meer voor beeldvorming, hoewel de transiënten gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd met behulp van een 20x luchtobjectief.

Resultaten

Met behulp van de protocollen die in dit manuscript worden beschreven, werden de dynamische patronen van calciumsignalering bij bevruchting en embryogenese waargenomen in C. elegans.

Een typische bevruchtingssequentie in wormen die de CaFE-reporter bevatten, wordt weergegeven in figuur 2. Om de analyse te vergemakkelijken, werd de EAG28-stam gebruikt die de CaFE-reporter combineert met een pleckstrin homologiedomein (PH-mCherry) transgen13. De PH-mCherry-marker lokaliseert zich in het plasmamembraan en maakt het mogelijk om celgrenzen gemakkelijker te visualiseren, met name in de gonadenarm. De EAG28-stam is ontstaan door de EAG16-stam met de CaFE-reporter te kruisen met de OD70 PH-mCherry reporter-stam13. Bij C. elegans vinden ovulatie en bevruchting gelijktijdig plaats. Tijd 0 van de bevruchting wordt beschouwd als het eerste frame waarin een fluorescentiesignaal wordt gedetecteerd in de ovulerende eicel (Figuur 2). Een heldere uitbarsting van fluorescentie treedt op op de plaats van spermafusie zodra de voorrand van de eicel de spermatheca, het opslagorgaan voor sperma7, binnengaat. Het signaal verschijnt voordat de eisprong is voltooid. De calciumgolf is bifasisch, met een snelle eerste uitbarsting gevolgd door een golf van fluorescentie van het beginpunt naar de tegenoverliggende pool. De hele eicel wordt fluorescerend in <30 s.

Merk op dat de CaFE-reporter in een enkele kopie zit en dat het signaal daarom niet zo helder is als andere transgenen. Z-stack time-lapse wordt niet aanbevolen tijdens de eisprong, tenzij een confocale draaiende schijf beschikbaar is en geoptimaliseerd is. Z-stack-beelden kunnen voor of na een film worden verkregen om 3D-veranderingen in de morfologie van de geslachtsklieren vast te leggen. Hoewel de beelden hier zijn gemaakt met een confocale microscoop, zijn de transiënten ook waargenomen met behulp van breedveldfluorescentiemicroscopie, die gebruikelijker en betaalbaarder is dan confocaal. Met behulp van een laserscanconfocal is de framerate ongeveer 1 fps. Met behulp van een confocal van een draaiende schijf is de framesnelheid 10 fps of sneller. Het achtergrondsignaal van de CaFE-reporter is voldoende om de rijpende eicellen in de geslachtsklierarm te belichten. Bij bevruchting wordt doorgaans een 1,5-2x toename van de GFP-signaalintensiteit waargenomen.

Er bestaan verschillende alternatieve methoden voor kwantificering. De Imaris-beeldanalysesoftware bijvoorbeeld, gemaakt door Oxford Instruments (hetzelfde moederbedrijf als de Andor Dragonfly confocale microscoop), heeft de mogelijkheid om het signaal in elk frame te kwantificeren van alleen de transiterende eicel in plaats van een grotere ROI. De Imaris-software is echter niet gratis. Bovendien is een gedetailleerde beeldanalysestrategie voor het meten van calciumgolven in de eicel in uitstekend detail beschreven door Takayama, Fujita en Onami en maakt gebruik van ImageJ, dat vrij beschikbaar is14. Als alternatief vereisen kymografen om de golf van fluorescerend signaal over een enkele eicel te illustreren uitgebreidere beeldmanipulatie dan hier beschreven, maar worden beschreven in Takayama en Onami3.

Een duidelijk voordeel van C. elegans is het vermogen om de expressie van bijna elk gen neer te halen door de wormen te voeden met bacteriën die dsRNA tot expressie brengen om endogeen RNAi te activeren15,16. Voor een optimale dsRNA-expressie bevatten zowel de RNAi-platen als de verzadigde RNAi-cultuur IPTG. Het dsRNA wordt geproduceerd door het gen van belang tot expressie te brengen met flankerende promotors. Hier hebben we de Ahringer-bibliotheek gebruikt die zich richt op het grootste deel van het wormgenoom door het gebruik van 16.256 bacteriestammen17. Als alternatief is een ORFeome van ~11.000 RNAi-klonen gemaakt door het Vidal-lab met behulp van het Gateway-systeem en is deze te koop via Horizon Discovery18.

Om het nut van de CaFE-reporter in combinatie met RNAi aan te tonen, hebben we vroegtijdige ovulatie onderzocht. Een gedeeltelijke deletie in ipp-5 induceert een dubbele ovulatie waarbij zowel de -1 eicel als de -2 eicel de spermatheca binnenkomen tijdens dezelfde eisprong19. IPP-5 is een fosfatase die inwerkt op IP3 en de niveaus van de IP3 tweede boodschapper effectief verlaagt. We ontdekten dat RNAi-knockdown van ipp-5 een dubbel ovulatiefenotype uitlokt dat vergelijkbaar is met de mutant.

Analyse van de CaFE-reporter tijdens de dubbele ovulatie geïnduceerd door ipp-5 RNAi-knockdown onthulde nieuwe aspecten van de OET. Ten eerste werd een calciumsignaal waargenomen onmiddellijk bij binnenkomst in de spermatheca in de voorste -1 eicel, maar niet in de achterblijvende -2 eicel (Figuur 3). Hoewel 2 eicellen worden geovuleerd, is de -1 eicel nog steeds de enige eicel die tekenen van een goede rijping vertoont, met name de afbraak van de nucleaire envelop (NEBD). Deze gegevens suggereren dat, hoewel de -2 eicel zich in de aanwezigheid van sperma bevindt, deze niet bekwaam is om bevrucht te worden omdat deze nog niet goed is gerijpt. Ten tweede vertoont de -2 eicel een vertraagde calciumgolf, meestal wanneer de eicel de spermatheca verlaat voor de baarmoeder. Hoewel de rijping van de eicel normaal gesproken een voorwaarde is voor de eisprong, suggereren deze gegevens dat de rijping van de eicel en de bekwaamheid voor bevruchting nog steeds kunnen plaatsvinden na de eisprong. De visualisatie van de vertraagde calciumgolf tijdens ipp-5 knockdown benadrukt de voordelen van de CaFE-reporter om de bevruchtingscompetentie en timing te ondervragen.

Verder hebben we ontdekt dat de CaFE-reporter detecteerbaar is in gelegde eieren en eencellige calciumtransiënten onthult tijdens de vroege embryogenese in C. elegans. Embryo's van gesynchroniseerde dag 1 volwassen EAG28 (CaFE; PH-mCherry) wormen werden afgebeeld met behulp van de protocollen uit secties 1-5 met de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met behulp van de Zyla-camera (Figuur 4). De calciumtransiënten zijn beperkt tot afzonderlijke cellen en hebben minder tijd nodig dan de bevruchtingscalciumgolf (~9 s, n=11). De calciumgolf tijdens de embryogenese lijkt echter niet bifasisch te zijn. Calciumtransiënten werden niet waargenomen vóór het 8-cellige stadium. Calcium lokaliseert zich met name niet in de splijtingsgroef in C. elegans, zoals wordt gezien in veel andere organismen, waaronder mensen en Xenopus 20,21,22. Eencellige calciumtransiënten werden ruim na gastrulatie (~200 minuten na bevruchting) en in gelegde eieren waargenomen. Een enkel embryo vertoont in de loop van de tijd meerdere calciumtransiënten, maar in verschillende cellen en meestal één cel tegelijk. Merk op dat continue blootstelling aan laserstimulatie de embryo's zal beschadigen. Een lager LED-/laservermogen of discontinue belichting wordt aanbevolen. Aangezien de calciumgolven echter relatief kort zijn met ~9 s, raden we niet aan om langzamer te zijn dan 2 s tussen LED-/laserstimulatiegebeurtenissen.

figure-results-1
Figuur 1: C. elegans geslachtsklier arm. Afbeelding van een gonadenarm van de EAG25-wormstam, met de CaFE-reporter GFP (groen) en de histon 2B-mCherry-marker (rood), die kernen in de kiembaan markeert. De proximale eicel wordt aangeduid met de -1 direct voor de spermatheca, waar het sperma wordt opgeslagen (pijl). Het embryo dat zich het dichtst bij de spermatheca bevindt, maar in de baarmoeder, is het meest recente embryo. De afbeelding is gemaakt met de Nikon ECLIPSE Ti2 laserscanning confocal. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Visualisatie van de calciumgolf tijdens de bevruchting. Tijdreeksbeelden van fluorescentie die intracellulair calcium weerspiegelt tijdens bevruchting in de EAG28-wormstam. De EAG28-stam bevat zowel de CaFE-reporter (groen) als een pleckstrin-homologiedomein-mCherry-fusie (geel), die plasmamembranen benadrukt. Tijd 0 geeft het eerste frame aan dat een duidelijke toename van het fluorescerende signaal in de eicel weergeeft. Tijd 24,4 s weerspiegelt het eerste frame dat fluorescentie van de hele eicel laat zien. Tijdreeksbeelden zijn gemaakt met behulp van de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met een Zyla-camera. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Calciumgolven tijdens een ipp-5 RNAi-geïnduceerde dubbele ovulatie. Time-lapse-beelden van sequentiële calciumgolven van de -1 eicel en -2 eicel in een EAG16-stam (CaFE in GFP-groen) blootgesteld aan ipp-5 RNAi. Het frame van -40.0 s bevat labels voor de -1 eicel (-1), -2 eicel (-2), spermatheca (*) en +1 embryo (+1). Tijd 0 s geeft de initiële toename van de fluorescentie van de calciumgolf van de -1 eicel weer. Tijd 4,5 s laat zien dat de calciumgolf zich naar de tegenoverliggende pool verspreidt in de -1 eicel. Tijd 70,5 s geeft fluorescentie van de hele cel weer in de -1 eicel, vergezeld van de -2 eicel bij het basislijn GFP-signaal; Beide eicellen bevinden zich in de spermatheca. De bevruchte -1 eicel en de onbevruchte -2 eicel komen de baarmoeder binnen op tijdstip 158,3 s. Bij 219,3 s vertoont de -2 eicel een late fluorescerende calciumgolf. Foto's zijn gemaakt met behulp van de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met een Zyla-camera. Schaalbalk = 30 μM Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Eencellige calciumtransiënten in de vroege embryogenese. (A) Embryo's in utero en (B) ex utero (gelegd ei) vertoonden een fluorescerend signaal in een enkele cel tijdens de embryogenese. Foto's zijn gemaakt met behulp van de Andor Dragonfly draaiende schijf confocaal met een Zyla-camera. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Een eenvoudig hulpmiddel met een robuust protocol is een krachtige combinatie om moeilijke wetenschappelijke vragen aan te pakken. Hier worden methoden gepresenteerd voor de visualisatie van calcium als een gemakkelijk detecteerbare proxy voor bemesting met behulp van de CaFE-reporter. Deze zelfde reporter blijft bestaan in de vroege embryogenese en maakt het ook mogelijk om calciumtransiënten verder in ontwikkeling te visualiseren. Calciumsignalering dient als een cruciale tweede boodschapper die grote verschuivingen in de cellulaire functie afbakent, met name voor ontwikkelingsbiologie. In de eicel markeert de eerste barstfase van de calciumgolf niet alleen de timing van de bevruchting, maar ook de plaats van spermafusie3. Bij C. elegans wordt de AP-as ook bepaald door de plaats van spermafusie23. Daarom maakt het vermogen om calcium in eicellen en embryo's te visualiseren het mogelijk om complexe vragen te onderzoeken die centraal staan in de cel- en ontwikkelingsbiologie.

De methode die hier wordt beschreven met de CaFE-reporter zou eenvoudig genoeg moeten zijn voor beginners op nematoden. Eerdere methoden om calciumgolven in eicellen van C. elegans te detecteren, waren gebaseerd op kleurstofinjectie 3,8,14. Hoewel deze onderzoeken belangrijk en verhelderend waren, is kleurstofinjectie arbeidsintensief en is injectieapparatuur niet in elk laboratorium beschikbaar.

De hier gepresenteerde protocollen zijn geoptimaliseerd voor gezonde wormen. Om de kans op succes te maximaliseren, moet u ervoor zorgen dat er geen besmetting is op de wormmedia of in het bacteriegazon waarop de wormen zich voeden. Stel de wormen niet bloot aan stressomstandigheden, zoals temperatuur, omdat deze de eisprong en bevruchting beïnvloeden. Bovendien moeten controles voor de werkzaamheid van RNAi bij elk experiment worden opgenomen, aangezien de werkzaamheid in de loop van de tijd afneemt. Gebruik een positieve controle voor de werkzaamheid van RNAi , zoals ei-5, dat embryo's genereert, maar geen levensvatbaar nageslacht, aangezien de vorming van eierschalen in het gedrang komt24. Bovendien moeten de parameters voor het vastleggen van beelden voor elk microscopiesysteem worden geoptimaliseerd. Onze specificaties zijn hier als referentie opgenomen, maar afwijkingen zijn te verwachten. Hoewel dit systeem gemakkelijk cytoplasmatisch calcium detecteert als een proxy voor bevruchting, vertegenwoordigt het niet noodzakelijkerwijs een bonafide sperma-eicelfusiegebeurtenis.

Het brede scala aan gereedschappen en mutanten die vrijelijk verspreid zijn binnen de wormengemeenschap vergroten het nut van de CaFE-reporter. De reporter is geïntegreerd in het wormgenoom en kan gemakkelijk worden gekruist met andere mutant- of reporterstammen C. elegans 25. Hier wordt de creatie van EAG25 gerapporteerd die de CaFE-reporter tot expressie brengt met een histon H2B-mCherry-marker om kernen te visualiseren (Figuur 1) en EAG28 met zowel de CaFE-reporter als een pleckstrin-homologie domein-mCherry-marker, die de celperiferie markeert (Figuur 2)13,26. Beide stammen helpen bij de visualisatie van cellen in de kiembaan en tijdens de embryogenese. Bovendien is de faciliteit van RNAi in
C. elegans heeft, wanneer gebruikt in combinatie met de CaFE-reporter, nieuwe inzichten opgeleverd in de bevruchtingscompetentie. Zoals blijkt uit de dubbele ovulatie geïnduceerd door ipp-5 RNAi-knockdown in figuur 3, is de aanwezigheid van sperma en een ovuleerde eicel onvoldoende om een bevruchting te stimuleren.

Deze resultaten geven aan dat er een ander signaal, of de afwezigheid van een remmer, moet bestaan waardoor de eicel bevrucht kan worden. De voortijdig ovuleerde eicel vertoont een vertraagde calciumtransiënt wanneer de eicel in de baarmoeder terechtkomt. Deze late calciumgolf suggereert dat de te vroeg ovuleerde -2 eicel na verloop van tijd bevruchtingscompetentie kan ontwikkelen. We verwachten dat studies naar de timing van bevruchting, in het bijzonder met betrekking tot cel-cel signalering en regulatie, zullen worden geholpen door het gebruik van de CaFE-reporter. Bovendien blijft de CaFE-reporter bestaan in de embryogenese en vertoont hij eencellige calciumtransiënten. Deze embryonale calciumsignalering werd ook gerapporteerd binnen de eerste 24 uur van de ontwikkeling van zebravissen27. De rol van de calciumtransiënten is onbekend, maar de aanwezigheid suggereert een celsignaleringsgebeurtenis tijdens de ontwikkeling die nog niet is onderzocht. Met name werden de calciumtransiënten niet waargenomen in pas bevruchte zygoten. Daarom lokaliseert calcium zich niet in de splijtingsgroef, zoals is gedocumenteerd in verschillende andere organismen, waaronder Xenopus en mensen 20,21,22.

Belangrijk is dat de CaFE-reporter eenvoudig genoeg is om te worden gebruikt door studenten met minimale training. We hebben een CURE-lab met 1 studiepunt (cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring) ontworpen en uitgevoerd voor biologiestudenten met de stammen en protocollen die hier worden beschreven. In de loop van een semester kwam de klas één keer per week 3 uur of twee keer per week 1 uur en 30 minuten bijeen. Studenten kregen de keuze om alleen of in groepjes van 2 te werken. Elke student/paar selecteerde een ander gen om te bestuderen uit een samengestelde lijst. Ze voerden RNAi uit tegen het door hen gekozen gen in de EAG28-stam en onderzochten wormen op effecten op vruchtbaarheid, bevruchting en/of groefandorfologie. Op basis van hun resultaten en hun achtergrondlectuur met behulp van primaire literatuur, ontwikkelden de studenten hypothesen die ze in volgende experimenten konden testen. Dit iteratieve ontwerp was van cruciaal belang om de betrokkenheid van studenten te vergroten28. De studenten deden authentieke onderzoekservaring op en verwierven vaardigheden op het gebied van modelorganismen, genetische screening en fluorescentiemicroscopie. Gezien het gebruiksgemak van de CaFE-reporter konden studenten zonder onderzoekservaring slagen. Daarna spraken de studenten overweldigend een voorkeur uit voor het CURE-formaat boven traditionele laboratoriumlessen, waarbij veel studenten de wens uitten om door te gaan met onderzoek. Samen helpen deze tools en protocollen bij zowel onderwijs als onderzoek naar vroege ontwikkelingsprocessen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen.

Dankbetuigingen

KSKG werd gefinancierd door een subsidie van het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R15HD111986). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD4010440). Wij danken WormBase.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgarFisher ScientificDF0140-07-42 kg; Poeder lost gemakkelijker op dan vlokken
AgaroseMidSciBE-A125500 g
Alcohol lampFisher ScientificS13475Gebruik met 95% ethanol
Ammonium chloride (NH4Cl)Fisher ScientificAAA1500030250 g
AmpicillinFisher ScientificBP1760-55 g
AMSCO 400 Series Small Steam SterilizerSteris HealthcareN/A
Bacto-peptoneFisher ScientificBP1420-500500 g
Bacto-tryptoneFisher ScientificDF0123-17-3500 g
Calcium chloride (CaCl2)Fisher ScientificC69-500500 g
CholesterolThermo ScientificA11470.1850 g
Dragonfly 200 spinning disk confocalOxford Instruments AndorN/AGebruikt met Leica microscoop
Fisherbrand Superfrost Cytogenics Microscope SlidesFisher Scientific22-035-900144 dia's per pak
Flat Nose Pliers, Smooth JawHome Depot305530604Zorg ervoor dat de pincetjes een gladde kaak hebben
Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Fisher ScientificBP1755-1010 g; vrij van dioxaan
Laboratory tapeFisher Scientific15-901-10R0,5 inch tape wordt gebruikt om microscoopglazen te lijmen
LevamisoleFisher ScientificAC18787010010 g
Magnesium sulfate (MgSO4)Fisher ScientificM63-500500 g
Microscope cover glassFisher Scientific125410161 oz pak
Nikon ECLIPSE Ti2 laser scanning confocalNikonN/A
Nikon NIS Elements softwareNikonN/AConfocal
OP50 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Platinum WireTriTechPT-9010
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificP288-500500 g
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificAA1159436500 g
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500500 g
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4)Fisher ScientificS471-33 kg
Stereo microscopeLeicaKL300 LED
Sterile Petri dish (35 mm x 10 mm)CellTreat229638960 petrischalen per doos
Sterile Petri dish (60 mm x 15 mm)CellTreat229665500 petrischalen per doos
Strain EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::pie-1uCaenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG16Gemaakt door Kim Guisbert Lab
Strain EAG25 spn-4p::jGCaMP7s::pie-1u; ujIs113 II.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG25Gemaakt door Kim Guisbert Lab
Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::pie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG28Gemaakt door Kim Guisbert Lab
Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::pie-1 3'UTR + nhr-2p::his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)JIM113Gemaakt door E. Preston - Murray Lab
Strain OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::PH(PLC1delta1) + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OD70Gemaakt door Audhya/Oegema - Greenstein Lab
Tritech Worm Pick HandleTriTechTWPH1
Yeast extractIBI ScientificIB49160500 g

Referenties

  1. Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. Modulators of calcium signalling at fertilization. Open Biol. 10 (7), 200118(2020).
  2. McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs. Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).
  3. Takayama, J., Onami, S. The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte. Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).
  4. Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans. Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).
  5. Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).
  6. Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans. Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).
  7. Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator. Biol Open. 12 (9), 059832(2023).
  8. Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. Calcium dynamics during fertilization in C. elegans. BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).
  9. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  10. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (161), e61030(2020).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Kamath, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  13. Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans. Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).
  14. Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans. Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).
  15. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  16. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).
  17. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  18. Reboul, J., et al. elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).
  19. Bui, Y. K., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation. Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).
  20. Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin. J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).
  21. Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease. Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).
  22. Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development. Biomolecules. 14 (1), 138(2024).
  23. Goldstein, B., Hird, S. N. Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans. Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).
  24. Johnston, W. L., Dennis, J. W. The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition. Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).
  25. Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans. G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).
  26. Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans. PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).
  27. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during zebrafish embryonic development. BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).
  28. Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills. J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

C elegans bevruchtingsprocesoocyte naar embryogenetisch gecodeerde indicatorcalciumimagingvroege embryogeneseRNAi knockdownfluorescerende reporterwormsynchronisatieagarosepad montage
In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.