Ontwikkeling en toepassing van rapamycine-gereguleerde tyrosinefosfatasen

Summary

Dit protocol beschrijft het ontwerp, de creatie en de toepassing van rapamycine-gereguleerde fosfatasen. Deze methode zorgt voor een hoge specificiteit en strakke temporele controle van de activering van fosfatase in levende cellen.

Abstract

Tyrosinefosfatasen zijn een belangrijke familie van enzymen die kritieke fysiologische functies reguleren. Ze zijn vaak ontregeld bij ziekten bij de mens, waardoor ze belangrijke doelwitten zijn van biologische studies. Instrumenten die de regulatie van de fosfatase-activiteit mogelijk maken, zijn van groot belang bij de ontleding van hun functie. Traditionele benaderingen, zoals overexpressie van constitutief actieve of dominante negatieve mutanten, of downregulatie met behulp van siRNA, missen temporele controle. Fosfataseremmers hebben vaak een slechte specificiteit en stellen onderzoekers alleen in staat om te bepalen welke processen worden beïnvloed door de remming van de fosfatase.

We ontwikkelden een chemogenetische benadering, het Rapamycine-gereguleerde (RapR) systeem, dat allosterische regulatie van een fosfatase-katalytisch domein mogelijk maakt dat een strakke temporele controle van de fosfatase-activering mogelijk maakt. Het RapR-systeem bestaat uit een iFKBP-domein dat in een allosterische plaats in de fosfatase wordt ingevoegd. De intrinsieke structurele dynamiek van het RapR-domein verstoort het katalytische domein, wat leidt tot de inactivatie van het enzym. De toevoeging van rapamycine bemiddelt bij de vorming van een complex tussen iFKBP en een gezamenlijk tot expressie gebracht FRB-eiwit, dat iFKBP stabiliseert en de activiteit in het katalytische domein van de fosfatase herstelt.

Dit systeem zorgt voor een hoge specificiteit en strakke temporele controle van de activering van fosfatase in levende cellen. De unieke mogelijkheden van dit systeem maken de identificatie van voorbijgaande gebeurtenissen en het ondervragen van individuele signaalroutes stroomafwaarts van een fosfatase mogelijk. Dit protocol beschrijft richtlijnen voor de ontwikkeling van een RapR-fosfatase, de biochemische karakterisering ervan en de analyse van de effecten ervan op stroomafwaartse signalering en regulatie van celmorfodynamiek. Het biedt ook een gedetailleerde beschrijving van een strategie voor eiwitengineering, in vitro-assays die de fosfatase-activiteit analyseren en live celbeeldvormingsexperimenten die veranderingen in de celmorfologie identificeren.

Introduction

Eiwittyrosinefosfatasen zijn een cruciale familie van eiwitten die betrokken zijn bij een overvloed aan celsignaleringsgebeurtenissen. Het is aangetoond dat ze een sleutelrol spelen bij de regulatie van celproliferatie, migratie en apoptose ^1,2,3. Bijgevolg leidt de ontregeling van eiwittyrosinefosfatasen tot een verscheidenheid aan slopende ziekten en aandoeningen 4,5,6,7. Het bestuderen van de fysiologische functie van tyrosinefosfatasen en hun rol in de ontwikkeling van deze pathologieën is van oudsher belemmerd door een gebrek aan hulpmiddelen die nodig zijn om de fijne kneepjes van fosfatasesignalering te onderzoeken⁸.

Traditioneel worden fosfatasen bestudeerd met behulp van methoden die niet de gewenste specificiteit hebben en/of geen temporele controle van hun activiteit bieden. Deze kritische beperkingen van de beschikbare instrumenten maken het een uitdaging om specifieke rollen van fosfatasen in signaalroutes te ontleden. Overexpressie van constitutief actieve en dominante negatieve mutanten of neerwaartse regulatie van de expressie van de fosfatase zorgen voor specificiteit, maar missen temporele controle en kunnen vaak compensatiemechanismen in gang zetten die de ware functie van het enzym maskeren.

Farmacologische remmers zorgen voor de temporele regulatie van fosfatasen. Veel fosfataseremmers zijn echter notoir niet-specifiek vanwege de goed geconserveerde samenstelling van de actieve plaats in tyrosinefosfatasen⁹. Bovendien vertonen remmers die zich op de katalytische plaats richten vanwege ontwerpbeperkingen een slechte permeabiliteit van het celmembraan¹⁰. Een andere beperking van remmers is dat ze alleen het onderzoek naar de effecten van fosfatase-inactivatie mogelijk maken¹¹. Er is dus nood aan instrumenten die een specifieke, temporeel regelbare activatie van fosfatasen mogelijk maken. Deze tools zullen onderzoekers in staat stellen om de directe effecten van fosfatase-activering te identificeren, door ze te scheiden van meerdere parallelle signaalcascades die vaak worden geactiveerd door biologische stimuli. Belangrijk is dat een strakke temporele controle van de activiteit de identificatie van voorbijgaande gebeurtenissen die door een fosfatase worden geïnduceerd, mogelijk maakt en de effecten van acute en langdurige fosfatase-activiteit scheidt. De combinatie van temporele regulatie met mutatieanalyse zal een gedetailleerde ontleding van specifieke rollen van individuele domeinen van de fosfatase mogelijk maken en de stroomafwaartse signalering ervan ondervragen¹².

Om het gebrek aan gewenste mogelijkheden in de bestaande tools aan te pakken, heeft de Karginov-groep het Rapamycine Regulated (RapR) -systeem 13,14,15 ontwikkeld. Het RapR-systeem maakt gebruik van een speciaal ontwikkeld schakeldomein, iFKBP, dat allosterische regulatie van het eiwit van belang (POI) mogelijk maakt. De insertie van het iFKBP-domein op een positie die allosterisch gekoppeld is aan de katalytische plaats van de POI, maakt het vatbaar voor regulatie door rapamycine. Bij afwezigheid van rapamycine verstoort iFKBP de katalytische plaats als gevolg van de intrinsiek hoge structurele dynamiek van iFKBP en inactiveert zo de POI. De toevoeging van rapamycine induceert de interactie van iFKBP met het co-expressie eiwit FRB (Figuur 1). Dit zorgt voor stabilisatie van het switchdomein, waardoor de structuur en functie van het katalytische domein van de POI wordt hersteld. Als zodanig maakt de tool een specifieke en in de tijd regelbare activering van de POI mogelijk.

Figuur 1: Schema van het RapR-Shp2 rapamycine-gereguleerde systeem. RapR zorgt voor allosterische activering van het betreffende eiwit met de toevoeging van rapamycine. Dit cijfer is aangepast van Fauser et ^al.12. Afkortingen: iFKBP = invoegbaar FKBP12; FRB = FKBP-rapamycine-bindend domein; R = rapamycine; Shp2 = Src homologie-2 domein-bevattend eiwit tyrosinefosfatase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De RapR-tool kan worden toegepast op verschillende eiwitfamilies. Het kan worden gebruikt om zowel eiwitkinasen als fosfatasen te reguleren^12,14. Dit protocol zal zich richten op de toepassing van de RapR-tool om Shp2-fosfatase te beheersen. Shp2 is een alomtegenwoordig tot expressie gebracht eiwit tyrosinefosfatase dat betrokken is bij signaleringsprocessen zoals proliferatie, migratie, immunomodulatie en differentiatie 1,16,17,18. Ontregeling van Shp2 is in verband gebracht met een aantal solide kankers, myeloïde leukemie en ontwikkelingsstoornissen ^5,7. Shp2 is echter het slachtoffer geworden van dezelfde tekortkomingen in de tool als hierboven beschreven. Om deze beperkingen tegen te gaan, werd RapR-Shp2, een specifiek en tijdelijk reguleerbaar Shp2-construct, ontwikkeld en gekarakteriseerd¹².

Voorafgaand aan de ontwikkeling van RapR-Shp2 was bekend dat Shp2 betrokken was bij celmigratie 19,20,21. De specifieke rol ervan in de signalering die bij dit proces betrokken was, was echter onbekend. Het was ook onbekend op welke tijdschaal Shp2 de migratie van cellen reguleert en welke specifieke morfodynamische veranderingen het induceert op verschillende tijdstippen van zijn activering. Verder was het onduidelijk of acute en langdurige activering van Shp2 verschillende effecten zal veroorzaken. Met behulp van RapR-Shp2 werd vastgesteld dat acute activering van Shp2 voorbijgaande celverspreiding, een toename van uitsteeksels, celpolarisatie en migratie induceert. Specifieke routes stroomafwaarts van Shp2 die verschillende morfodynamische veranderingen reguleren, werden ook geïdentificeerd¹². Dit protocol biedt details voor het ontwerp en de karakterisering van RapR-Shp2, die kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling en toepassing van andere RapR-fosfatasen te begeleiden.

Protocol

1. Ontwerp van RapR-fosfatasen

1. Planning
   OPMERKING: Met RapR-Shp2 als voorbeeld, beschrijft dit protocol de belangrijke stappen voor het maken van een rapamycine-gereguleerde tyrosinefosfatase. Het beschreven protocol is geoptimaliseerd voor Shp2 en er kunnen aanvullende aanpassingen nodig zijn om aan specifieke eigenschappen van individuele fosfatasen te voldoen.
   1. Om ervoor te zorgen dat de katalytische activiteit van Shp2 uitsluitend wordt gecontroleerd door rapamycine en niet door endogene mechanismen, introduceert u een mutatie in de fosfatase om deze in een constitutief actieve conformatie te houden. Introduceer in het geval van Shp2 de D61A-mutatie.
      OPMERKING: Als er geen activerende mutatie wordt geïntroduceerd voor een specifieke PTPase, dan zal de RapR-variant functioneren als een AND-gated systeem dat wordt gereguleerd door endogene signalen en rapamycine.
   2. Identificeer iFKBP-insertieplaatsen in het katalytische domein van de fosfatase met behulp van de kristalstructuur om de selectie te sturen, zoals eerder beschreven¹³. Als er geen structuur beschikbaar is, voer dan de aminozuursequentie uit op uitlijning met het katalytische domein van Shp2-fosfatase om de insertieplaatsen te identificeren (Figuur 2A). Zorg ervoor dat de inbrengplaats zich in een flexibele lus bevindt die structureel is gekoppeld aan de katalytische pocket, maar weg van de pocket is geplaatst om sterische belemmering van de substraatbinding door iFKBP te voorkomen.
      OPMERKING: Verdere details van het invoegen worden besproken in de Discussie.
   3. Beschouw het type linkersequentie dat moet worden gebruikt tussen het ingevoegde iFKBP-domein en de fosfatase van belang. Het kiezen van de optimale linkersequentie is uiterst belangrijk voor het succes van de RapR-tool en wordt verder besproken in de discussie (Figuur 2B).

Figuur 2: Schema van overwegingen bij het ontwerpen van RapR-fosfatase. (A) Uitlijning van Shp2 (paars), PTP1B (groen) en PTP-PEST (roze) met de geconserveerde invoegplaatsen gemarkeerd. (B) Weergave van linker-insertie tussen Shp2 en iFKBP. (C) Fosfatasedomein van Shp2 in beige met invoegplaatsen aangegeven in blauw. Dit cijfer is aangepast van Fauser et ^al.12. Afkortingen: Shp2 = Src homologie-2 domein-bevattend eiwit tyrosinefosfatase; iFKBP = invoegbare FKBP12; PTP = eiwit tyrosinefosfatase; RapR = Rapamycine-gereguleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Ontstaan van de RapR-fosfatase

1. Invoeging van iFKBP in de betreffende fosfatase met behulp van gemodificeerde plaatsgerichte mutagenese
   1. Genereer een iFKBP-codering "megaprimer" via PCR.
      1. Ontwerp primers voor "megaprimer"-synthese die 20-25 nucleotiden bevatten die gloeien naar het 5' of 3' uiteinde van iFKPB, een linkersequentie die iFKPB verbindt met de fosfatase van belang, en 28-32 nucleotiden die overeenkomen met de insertieplaats (Figuur 3). Controleer of het resulterende product de iFKPB bevat, geflankeerd door fragmenten die voor en na de inbrengplaats in de betreffende fosfatase zijn gegloeid.
      2. Synthese de iFKBP-bevattende "megaprimer" via PCR (10 μL 5x polymerasebuffer, 1 μL 50 ng/μL sjabloon-DNA dat iFKBP bevat, 2 μL 10 mM dNTP, 0,5 μL van een 100 μM-voorraad van elke "megaprimer"-primer [vooruit en achteruit], 35 μL water, 1 μL DNA-polymerase). Splits deze PCR-reactie in 2 afzonderlijke reacties van 25 μL voordat u de PCR uitvoert. Voer de PCR-cyclus uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant van DNA-polymerase of de volgende standaard PCR-cyclus: (i) 98 °C gedurende 2 min, (ii) 98 °C gedurende 30 s, (iii) 55-70 °C gedurende 30 s, (iv) 72 °C gedurende 30 s, (v) herhaal stap ii-iv 25x, (vi) 72 °C gedurende 2 min.
      3. Zuiver de "megaprimer" met behulp van agarosegelelektroforese. Laad de PCR-inhoud van de vorige stap in een 1% agarosegel en breng 120 V aan gedurende ongeveer 30 minuten. Zoek naar de 400 nucleotide-lange "megaprimer" in de gel, snijd het fragment weg en zuiver met behulp van een gelextractiekit (zie Tabel met materialen).
         OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
   2. Gemodificeerde plaatsgerichte mutagenese
      1. Bereid de gemodificeerde plaatsgerichte mutagenesereactie voor met behulp van een plasmide dat het gen van de betreffende fosfatase als sjabloon bevat (5 μL 5x polymerasebuffer, 2 μL 50 ng/μL sjabloon, 2 μL 10 mM dNTP, 10 μL geëxtraheerde "megaprimer", 2,5 μL water, 2,5 μL DMSO, 1 μL DNA-polymerase).
         OPMERKING: De toevoeging van DMSO aan het reactiemengsel verlaagt de gloeitemperatuur²².
      2. Voer de volgende PCR-cyclus uit: eerste denaturatiestap bij 98 °C gedurende 3 min, gevolgd door 18 cycli van opeenvolgende incubatiestappen bij 98 °C gedurende 30 s, 65 °C gedurende 20 s, 60 °C gedurende 20 s, 55 °C gedurende 20 s, 50 °C gedurende 20 s, 72 °C gedurende 18 min. Voer de cyclus een nacht uit (cyclustijd is 7 uur). Zodra de cyclus is voltooid, bewaart u de PCR-reactie bij 4 °C.
         OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
      3. Voeg na voltooiing van de cyclus 1 μL DpnI-enzym toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
         OPMERKING: DpnI zal het resterende sjabloon verteren, waardoor de opbrengst van het nieuw gesynthetiseerde product toeneemt.
      4. Transformeer het verteerde product in DH5α competente cellen volgens de instructies van de fabrikant. Bekleed de transformatie op LB-agarplaten met het juiste antibioticum voor selectie (carbenicilline voor het pcDNA RapR-Shp2-construct). 's Nachts incuberen bij 37 °C. Zodra de kolonies zijn gegroeid, bewaart u de LB-platen maximaal 1 maand bij 4 °C.
         OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. Isolatie van het gewenste DNA-construct dat RapR-fosfatase bevat
   1. Voer een PCR-screening uit van bacteriekolonies²³. Aangezien niet alle kolonies die op een LB-plaat worden gekweekt het gewenste plasmide bevatten, moet u ervoor zorgen dat u het plasmide-DNA isoleert voordat het wordt geïsoleerd.
      OPMERKING: Gebruik primers voor het scherm die zullen gloeien naar de sjabloon en in het iFKBP-gen. De zeef kan worden gedaan met behulp van Taq polymerase mastermix (zie Tabel met materialen).
   2. Zodra positieve kolonies zijn geïdentificeerd, inoculeert u één positieve kolonie in 3 ml LB-bouillon inclusief het juiste antibioticum, incubeert u en schudt u 's nachts bij 37 °C.
   3. Extraheer plasmide-DNA uit de vloeibare cultuur volgens de instructies van de fabrikant voor de plasmide-DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel)
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de sequentie van het nieuw gecreëerde RapR PTPase-construct te bepalen voordat u doorgaat met in-vitro-evaluatie .

Figuur 3: Schema van het ontwerp van de primer en de gewijzigde strategie voor het klonen van plaatsgerichte mutagenese. Stap 1 is de synthese van de iFKBP bevattende "megaprimer" met "kleverige uiteinden" die uitgloeien naar de inbrengplaats van de betreffende fosfatase, en stap 2 is het inbrengen van de "megaprimer" in de fosfatase van belang. Dit cijfer is aangepast van Karginov et ^al.13. Afkorting: iFKBP = invoegbaar FKBP12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Evaluatie van RapR-PTPase door middel van in vitro activiteitstest

OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt om de regulatie van de activiteit van gemanipuleerd RapR-PTPase te beoordelen. Hieronder wordt de analyse van immunoprecipiteerd Shp2 beschreven met behulp van een gefosforyleerd N-terminaal fragment van paxilline als substraat. Het kan nodig zijn een ander substraat te selecteren voor een specifiek PTPase dat van belang is.

1. Dag 1
   1. Plaat 800.000 HEK293T cellen/putje in een weefselkweekplaat met 6 putjes in DMEM-media aangevuld met L-glutaminesupplement (eindconcentratie van 2 mM) en 10% FBS per volume. Zet een nacht in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ .
2. Dag 2
   1. Zodra de cellen ~60-80% samenvloeien, transfecteer je ze volgens het protocol van de voorkeursfabrikant van de transfectieregent (zie Materiaaltabel).
      1. Voorbeeld van een transfectieprotocol: Voeg 1 μg plasmide-DNA (pcDNA-mCherry-FRB en pcDNA-flag-RapR-Shp2, elk) toe aan 200 μl serumvrije DMEM en 6 μl transfectiereagens en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 100 μL transfectiemengsel toe per putje cellen. Neem monsters op die zijn getransfecteerd met constitutief actieve en dominante negatieve Shp2-constructen als controles. 's Nachts incuberen in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ .
3. Dag 3
   1. Bereiding van Protein-G Sepharose
      OPMERKING: Bereid gesneden pipetpunten voor voordat u Sepharose aanraakt. Snijpunten moeten worden gebruikt in elke stap waar Sepharose wordt gehanteerd. Sepharose moet in elke stap voorafgaand aan het pipetteren grondig worden geresuspendeerd.
      1. Resuspendeer en neem de juiste hoeveelheid Protein-G Sepharose in een buisje van 1,5 ml. Gebruik voor elk putje in een plaat met 6 putjes 10 μL Protein-G Sepharose. Gebruik voor een volle plaat met 6 putjes 60 μL Sepharose.
      2. Was de sepharose met 1 ml Lysis Buffer (zie Materiaaltabel). Microcentrifugeer gedurende 1 minuut op 2.000 × g en verwijder voorzichtig de lysisbuffer. Herhaal 2x.
      3. Resuspendeer de sepharose in 380 μL lysisbuffer. Voeg BSA toe aan een eindconcentratie van 1 mg/ml en antilichaam (0,5 μl voor elk IP-monster, anti-vlagantilichaam [zie materiaaltabel]). Keer om op een rotator bij 4 °C gedurende 1,5 uur.
         OPMERKING: De optimale hoeveelheid antilichaam moet experimenteel worden bepaald voor elk gebruikt antilichaam.
   2. Bereid cellen voor op immunoprecipitatie.
      1. Voeg een geschikte hoeveelheid rapamycine (1 mM stockoplossing in ethanol) toe tot een eindconcentratie van 1 μM of voeg hetzelfde volume ethanol (negatieve controle) toe aan de monsters. Incubeer gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ .
      2. Leg de plaat met 6 putjes met cellen op ijs en was de cellen voorzichtig met 3 ml koude PBS. Aspireer de PBS en voeg 300 μL lysisbuffer toe (met 1 μM rapamycine voor het geactiveerde fosfatasemonster of een equivalent volume ethanol in het negatieve controlemonster) en schraap met een celschraper. Breng de monsters over in buisjes van 1,5 ml en microcentrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C.
      3. Breng 20 μl van het supernatans over in een nieuw buisje van 1,5 ml om te controleren op expressieniveaus. Voeg 20 μl 2x Laemmli-buffer met 5% β-mercaptoethanol toe aan elke buis om de expressie te controleren en te incuberen bij 95-100 °C gedurende 5 minuten. Gebruik het resterende supernatans voor de immunoprecipitatie in stap 3.3.3.3.
   3. Immunoprecipitatie van RapR-Shp2
      1. Was de Protein-G Sepharose uit stap 3.3.1.3. met 1 ml Lysis Buffer. Microcentrifugeer gedurende 1 minuut bij 2.000 × g bij 4 °C elke keer en zuig de lysisbuffer voorzichtig op. Herhaal deze stap 2x.
      2. Resuspendeer de sepharose met behulp van afgesneden tips in lysisbuffer (50 μl per monster, dus voor een plaat met 6 putjes, resuspendeer in 300 μl lysisbuffer). Pipette 50 μl van het gesuspendeerde sepharosemengsel in een apart nieuw buisje van 1,5 ml voor elk monster.
         OPMERKING: Er zal geresuspendeerde sepharose in Lysis Buffer-oplossing overblijven als gevolg van het volume van de sepharose.
      3. Voeg het resterende supernatans van de voorbereide cellen van stap 3.3.2.3 toe aan elk buisje sefarijs. Draai op 4 °C gedurende 1,5-2 uur.
   4. Bepaling van de fosfatase-activiteit
      OPMERKING: Het Shp2-substraat moet worden bereid door gezuiverd N-terminaal fragment van paxilline te fosforyleren met behulp van constitutief actief Src-kinase volgens het eerder beschreven kinasereactieprotocol¹².
      1. Bereid tegen het einde van stap 3.3.3.3 de fosfo-paxillinoplossing voor. Voeg per monster fosfo-paxillineoplossing (eindconcentratie van 3 μg/ml) toe aan 40 μl totale imidazoolbuffer (zie materiaaltabel). Voeg rapamycine toe tot de eindconcentratie van 1 μM aan het aliquot fosfo-paxillineoplossing voor geactiveerde RapR-Shp2-monsters en een equivalent volume ethanol aan de oplossing voor niet-geactiveerde monsters.
      2. Stel de verwarmingsschudder in op 32 °C.
         OPMERKING: Andere fosfatasen hebben mogelijk een andere temperatuur nodig voor een optimale activiteit.
      3. Was Sepharose met monsters uit stap 3.3.3.3 2x met 0,5 ml Lysis Buffer (zie Materiaaltabel). Was de monsters 2x met 0,5 ml wasbuffer. Elke buffer moet ofwel rapamycine van 1 μM bevatten voor geactiveerde monsters of een equivalent volume ethanol voor niet-geactiveerde monsters. Verwijder zoveel mogelijk buffer na de laatste wasbeurt.
         OPMERKING: Zodra deze stap is bereikt, kan het nuttig zijn om een pipet te gebruiken om langzaam en voorzichtig de laatste hoeveelheden buffer te verwijderen om er zeker van te zijn dat er geen van de Sepharose wordt opgezogen. Elke overgebleven buffer zal de concentratie van fosfo-paxilline beïnvloeden en leiden tot onnauwkeurige uitlezing.
      4. Voeg 40 μl van het bereide fosfo-paxilline imidazoolbuffermengsel toe aan elk monster, met of zonder rapamycine (afhankelijk van het monster). Veeg heel voorzichtig om te mengen en plaats onmiddellijk in de verwarmingsshaker en incubeer gedurende 40 minuten bij 32 °C. Stel de verwarmingsshaker in op minimaal 1,000 tpm om ervoor te zorgen dat het monster volledig wordt geschud voor de duur van de incubatie.
      5. Stop de reactie door 40 μL 2x Laemmli Buffer toe te voegen aan elk monster. Incubeer de monsters bij 95-100 °C gedurende 5 minuten. Koel de monsters.
      6. Laad 15 μl van elk monster (inclusief de lysaatmonsters uit stap 3.3.2.3.) op een SDS-polyacrylamidegel met een gradiënt van 4-15% en voer een standaard western blot-protocol uit met behulp van PVDF-membranen.
      7. Dep met een anti-vlag-antilichaam om het RapR-Shp2-construct te detecteren, anti-mCherry om mCherry-FRB te detecteren en anti-pY118 of anti-pY31 paxilline om paxillinefosforylering te detecteren.
         OPMERKING: De resulterende westelijke vlekken moeten er ongeveer zo uitzien als in figuur 4.

4. Analyse van RapR-Shp2 activiteit in levende cellen

OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt om het vermogen van RapR-Shp2 te bepalen om endogene substraten te defosforylaten en stroomafwaartse signalering te induceren. Andere RapR-PTPases vereisen analyse van hun specifieke substraten en routes.

1. Dag 1
   1. Plaat 198.000 A431 cellen/putje in een weefselkweekplaat met 6 putjes in DMEM-media aangevuld met 10% FBS en L-glutamine (eindconcentratie van 2 mM). Zet een nacht in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ .
2. Dag 2
   1. Infecteer cellen met adenovirale constructen die RapR-Shp2 en FRB tot expressie brengen door het adenovirus rechtstreeks toe te voegen aan de media die al in de schaal zitten. Laat het adenovirus een nacht op de cellen in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ . Gebruik cellen die besmet zijn met FRB alleen als negatieve controle.
      OPMERKING: De hoeveelheden adenovirus moeten van geval tot geval worden bepaald, afhankelijk van de titer.
3. Dag 3
   1. Verhonger A431-cellen door 4 uur voor het experiment te incuberen in DMEM met 0,5% FBS.
   2. Voeg rapamycine toe aan de cellen in een eindconcentratie van 1 μM of hetzelfde volume ethanol (negatieve controle) gedurende 2-4 uur.
      OPMERKING: De incubatie kan anders zijn voor andere fosfatasen.
   3. Leg de plaat met 6 putjes met cellen op ijs en was de cellen voorzichtig met 3 ml koude PBS. Zuig de PBS op, voeg 300 μL lysisbuffer toe (zie materiaaltabel) en schraap krachtig met een celschraper. Breng de monsters over in buisjes van 1,5 ml en microcentrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.000 × g bij 4 °C.
   4. Breng 250 μl van elk monster over in een nieuw buisje van 1,5 ml. Voeg 250 μL 2x Laemmli-buffer met 5% β-mercaptoethanol toe en incubeer bij 95-100 °C gedurende 5 min.
   5. Laad 25 μL van elk monster op een SDS-PAGE-gel met een gradiënt van 4-15% en voer een standaard western blot-protocol uit met behulp van PVDF-membranen.
   6. Evalueer RapR-Shp2 gemedieerde defosforylering van EGFR en PLCγ met behulp van anti-pY992 EGFR en anti-pY783 PLCγ antilichamen. Beoordeel de stroomafwaartse activering van MAP-kinase Erk1/2 door de fosforylering ervan op de pT202/pY204-residuen te evalueren.
      OPMERKING: De resulterende westelijke vlekken moeten er ongeveer zo uitzien als in figuur 5.

5. Analyse van morfodynamische veranderingen geïnduceerd door RapR-Shp2-activering in HeLa-cellen met behulp van live celbeeldvorming

OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt om het effect van RapR-Shp2-activering op de vorming van celuitsteeksels, celverspreiding en migratie te bepalen.

1. Dag 1
   1. Plaat 700.000 HeLa-cellen in een celkweekschaaltje van 35 mm en plaats ze in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ . Laat de cellen zich aan de schaal hechten (~2-3 uur).
   2. Transfecteer de cellen volgens het protocol van de fabrikant van de voorkeur voor transfectiereagens (zie Materiaaltabel).
      1. Voorbeeld transfectieprotocol: Voeg 0,5 μg DNA (pcDNA-mCherry-FRB en pcDNA-Venus-RapR-Shp2 plasmiden, elk) toe aan 100 μL serumvrije DMEM en 6 μL transfectiereagens. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Voeg het transfectiemengsel toe aan de cellen en incubeer een nacht in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ . Gebruik cellen getransfecteerd met pcDNA-mCherry-FRB alleen als negatieve controle.
   3. Smeer een live imaging #1.5 25 mm rond glazen dekglaasje in met fibronectine (5 mg/L) door gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen.
2. Dag 2
   1. Was het gecoate glazen dekglaasje met PBS.
   2. Plaat de getransfecteerde HeLa-cellen op de gecoate glazen dekglaasje in DMEM-media aangevuld met 10% FBS en L-glutamine (eindconcentratie van 2 mM) om 30% confluentie te bereiken 4 uur voorafgaand aan de beeldvorming.
   3. Twee uur na het plateren schakelt u het medium in de plaat voorzichtig over naar voorverwarmd serumvrij Leibovitz L-15-media gedurende 2 uur.
   4. Kleuring de cellen met CellMask Deep Red plasmamembraan kleuring volgens het protocol van de fabrikant.
   5. Plaats het dekglaasje in een schone beeldvormingscelkamer (zie Tabel met materialen). Voeg 1 ml voorverwarmd L-15 media toe en bedek met 1 ml voorverwarmde minerale olie om verdamping te voorkomen. Houd de kamer op 37 °C tot de beeldvorming.
   6. Beeld de cellen af bij 37 °C met behulp van een verwarmde fase.
      1. Selecteer de juiste kanalen voor beeldvorming van het RapR-construct en CellMask voor epifluorescentiebeeldvorming. Om dit protocol te volgen, gebruikt u het 40x-objectief waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel) en de volgende filtersets: 514/10 excitatie- en 540/21 emissiefilters voor Venus-RapR-Shp2-beeldvorming, 561/10 excitatie- en 595/40-emissiefilters voor mCherry-FRB-beeldvorming, en 640/20 excitatie- en 655LP-emissiefilters voor CellMask Deep Red-beeldvorming. Gebruik een multiband polychroïsche spiegel voor alle fluorescerende kanalen (zie Tabel met materialen).
      2. Maak elke 2 minuten foto's gedurende 4-4,5 uur.
         OPMERKING: Snellere morfodynamische veranderingen vereisen frequentere acquisitie.
      3. Voeg na 1 uur beeldvorming rapamycine toe aan een eindconcentratie van 1 μM om RapR-Shp2 te stimuleren.

6. Analyse van het beeld

OPMERKING: Dit protocol beschrijft het maken van celmaskers op basis van . TIF-stapelbestanden die zijn verzameld uit live beeldvormingsexperimenten. Vervolgens wordt beschreven hoe u een macro in ImageJ kunt maken om de maskers te analyseren, wat zal resulteren in een spreadsheet met het celgebied dat vervolgens wordt geanalyseerd op veranderingen in de loop van de tijd. Ten slotte zal de protrusieve en intrekkingsactiviteit van cellen worden geanalyseerd met behulp van Metamorph.

1. Genereer een binair masker van CellMask-afbeeldingen met behulp van de MovThresh-functie van CellGeo-softwarepakket²⁴.
2. Kopieer de map MovThresh naar de map voor afbeeldingsanalyse.
3. Kopieer de afbeeldingen van het CellMask- of andere membraanmarkeringskanaal naar de map MovThresh.
   1. Als er meerdere cellen op één positie zijn afgebeeld, snijdt u de afbeeldingen bij om bestanden te genereren die slechts één cel bevatten voordat u het masker in MatLab maakt.
4. Zorg ervoor dat de map correct is ingesteld op de map MovThresh in MatLab.
5. Voer MovThresh uit.
6. Importeer afbeeldingsstapels één voor één.
7. Selecteer Afgevlakte curve en voer vervolgens Rethreshold uit.
8. Sla op als Mask_Image nummer in een nieuwe map met het label Maskers.
9. Zodra alle afbeeldingsstapels zijn geconverteerd naar maskers, opent u de afbeeldingsstapels in de ImageJ-software²⁵.
   1. Analyse van celgebieden in ImageJ
      1. Open alle stapels Maskerafbeeldingen in ImageJ.
      2. Pas de ingestelde afmetingen aan het gebied aan.
      3. Klik op Plug-ins | Macro's | Record.
      4. Klik op Verwerken | Binair | Binair maken.
         1. Selecteer de standaardoptie .
            OPMERKING: Klik niet op iets extra's tijdens het opnemen van de macro. Als er extra stappen zijn opgenomen, wordt aanbevolen om opnieuw te starten vanaf stap 6.9.1.3.
      5. Klik op Analyseren | Analyseer deeltjes.
         1. Schakel alle vakjes uit, behalve Samenvatting.
      6. Voltooi de opname en klik op Maak de macro maken.
      7. Druk op Uitvoeren voor elke afbeeldingsstapel nadat u deze hebt geselecteerd en sla de resultatentabel voor elke afbeeldingsstapel op. De standaardoptie wordt opgeslagen als een csv-bestand.
      8. Sla de macro op en hergebruik deze voor toekomstige analyses (optioneel).
   2. Gebiedsgegevens verwerken in een spreadsheet
      1. Gemiddeld voor elke geanalyseerde cel het gemiddelde van de oppervlakte van de cel van foto's die zijn gemaakt vóór activering met rapamycine.
      2. Deel alle oppervlaktewaarden door de gemiddelde oppervlakte van de cel voorafgaand aan de toevoeging van rapamycine.
      3. Bereken de gemiddelde waarde voor elk tijdstip voor alle afgebeelde cellen en bepaal de 90%-betrouwbaarheidsintervallen. Plot de gegevens.
   3. Analyse van uitsteekselactiviteit van cellen
      1. Kopieer de ProActive-map naar de map voor beeldanalyse.
      2. Kopieer de gemaskeerde afbeeldingsstapels van MovThresh naar de nieuw gemaakte ProActive-map.
      3. Open MatLab en stel de directory in op de ProActive-map.
      4. Voer ProActive uit.
      5. Importeer de stapelbestanden van de gemaskeerde celafbeeldingen in de ProActive GUI.
      6. Definieer het type activiteit. Analyse van uitsteeksels zal gegevens over het gebied winnen ; Analyse van intrekkingsactiviteiten genereert gegevens over het gebied dat verloren is gegaan ; en de totale activiteit genereert gegevens over de algehele gebiedsverandering (zowel verloren als gewonnen).
      7. Stel het gebied in om normalisatie te definiëren.
      8. Vloeiende curve met behulp van de voorgestelde drempelwaarden of met behulp van het gemiddelde om elk tijdstip opnieuw te drempelen. Hiermee wordt het gemiddelde genomen van de drempels over een specifiek venster, waardoor inconsistenties in de drempels tussen tijdstippen worden geminimaliseerd.
      9. Klik op Bestand | Opslaan als | Resultaten (.mat)
         1. Als u alle drie de typen gebiedsactiviteit verwerkt, geeft u de verwerkte gegevensbestanden de volgende naam: ProResultData #, RetResultData # of ResultData #.
            OPMERKING: Voeg de spatie voor het nummer toe en nummer de gegevens vanaf 1.
      10. Herhaal vanaf stap 6.9.3.6. voor alle gemaskeerde afbeeldingsstapels die zijn geïmporteerd.
      11. Zodra alle cellen zijn verwerkt, sluit u de ProActive GUI.
      12. Open DataToFileTotalArea in de Matlab-editor om "ResultData"-bestanden met totale activiteit te verwerken.
      13. Wijzig het aantal cellen dat overeenkomt met het aantal resultaatbestanden dat is gegenereerd. Als er 7 cellen zijn verwerkt in de stappen 6.9.3.5–6.9.3.10, zorg er dan voor dat de eerste drie regels van het script als volgt zijn:
          filename='Resultaat Gegevens ';
          cellen=1:7;
          vertraging=1;
      14. Druk op Uitvoeren en herhaal dit voor DataToFileProtArea en DataToFileRetArea om respectievelijk uitsteeksels en intrekbare gegevens te verwerken. Deze analyse levert drie tekstbestanden op: "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" en "AllCellsRet.txt"
      15. Open de .txt bestanden in een spreadsheet en normaliseer zoals in paragraaf 6.9.2. Bereken de gemiddelde waarde voor elk tijdstip voor alle afgebeelde cellen en bepaal 90% betrouwbaarheidsintervallen. Plot de gegevens.
          OPMERKING: De resulterende grafieken van de bovenstaande stappen moeten er ongeveer zo uitzien als in afbeelding 6.

Results

Figuur 4 toont de resultaten die kunnen worden verwacht van de op paxilline gebaseerde fosfatase-activiteitstest. In dit experiment werd constitutief actieve en dominante negatieve Shp2-fosfatase-activiteit vergeleken met die van actief en inactief RapR-Shp2 met fosfo-paxillin als uitlezing. De Shp2-constructen werden immunoprecipiteerd en onderworpen aan de activiteitstest zoals beschreven in het protocol. De fosfo-paxilline-uitlezingen voor constitutief actieve Shp2 en actieve RapR-Shp2 waren vergelijkbaar, wat aangeeft dat de actieve RapR-Shp2 niet negatief was beïnvloed door de introductie van het RapR-domein en dat het zijn volledige activiteit behield zodra het was geactiveerd. Dominant negatieve Shp2 en inactieve RapR-Shp2 waren ook vergelijkbaar, wat aangeeft dat het RapR-Shp2-construct geen activiteit heeft wanneer het inactief is. Dit wijst op het succesvolle ontwerp van een RapR-fosfatase. Het fosfosubstraat dat voor deze test wordt gebruikt, kan verschillen afhankelijk van de fosfatase die van belang is.

Figuur 5, vergelijkbaar met figuur 4, vergelijkt constitutief actief, dominant negatief en actief en inactief RapR-Shp2. Dit experiment werd uitgevoerd zonder immunoprecipitatie van de constructen. In plaats daarvan werd het ontworpen om de stroomafwaartse signaaleffecten van het RapR-Shp2-construct in cellen te karakteriseren. Hier werden de Shp2-constructen tot expressie gebracht in HEK293T cellen. Stroomafwaartse effector ERK1/2 bleek toe te nemen in fosforylering als reactie op RapR-Shp2-activering, net als in het constitutief actieve monster. De inactieve RapR-Shp2 heeft deze verandering niet teweeggebracht. Dit geeft aan dat de stroomafwaartse signalering van Shp2 behouden blijft met de integratie van het RapR-domein. Evenzo werden bekende fosfosubstraten EGFR en PLCγ gedefosforyleerd als reactie op RapR-Shp2-activering in A431-cellen.

Ten slotte presenteert figuur 6 de resultaten van RapR-Shp2-activering op de morfodynamica van HeLa-cellen. Zodra RapR-Shp2 was geactiveerd, vertoonden de cellen een toename van de uitsteekselactiviteit en het celgebied. Dit geeft aan dat RapR-Shp2-activering voldoende is om morfodynamische veranderingen in HeLa-cellen te induceren en onderzoekers in staat kan stellen specifieke stroomafwaartse signaalroutes te onderzoeken die verantwoordelijk zijn voor dit effect.

Figuur 4: Resultaten van de op paxilline gebaseerde activiteitstest: constitutief actief, dominant negatief en RapR-Shp2 werden immunoprecipiteerd en onderworpen aan de activiteitstest met behulp van het geschetste protocol. De niveaus van pY31-paxilline in zowel CA als RapR-Shp2 waren vergelijkbaar, wat aangeeft dat het RapR-Shp2-construct een vergelijkbare activiteit had in vergelijking met CA Shp2 zodra het was geactiveerd. Het niet-geactiveerde RapR-Shp2-monster had geen activiteit, vergelijkbaar met het DN-monster, wat aangeeft dat het niet "lek" was. Dit cijfer is aangepast van Fauser et ^al.12. Afkortingen: RapR = Rapamycin-gereguleerd; Shp2 = Src homologie-2 domein-bevattend eiwit tyrosinefosfatase; DN = dominant negatief; CA = constitutief actief; FRB = FKBP-rapamycine-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Resultaten van de hele-cellysaattest: Constitutief actieve, dominant-negatieve en RapR-Shp2 werden in HEK293T cellen tot expressie gebracht en het hele-cellysaatprotocol werd voltooid. Wanneer RapR-Shp2 inactief was, activeerde het ERK1/2 niet door fosforylering, vergelijkbaar met het DN Shp2-monster. Dit geeft aan dat RapR-Shp2 geen activiteit heeft wanneer het inactief is. Eenmaal geactiveerd, was het niveau van ERK1/2-fosforylering vergelijkbaar met dat van het CA Shp2-monster, wat wijst op succesvolle activering en stroomafwaartse signalering van Shp2. Evenzo vertoonden A431-cellen die RapR-Shp2 tot expressie brachten een afname van de fosforylering van zowel EGFR als PLCγ, beide bekende substraten van Shp2. Dit cijfer is aangepast van Fauser et ^al.12. Afkortingen: RapR = Rapamycin-gereguleerd; Shp2 = Src homologie-2 domein-bevattend eiwit tyrosinefosfatase; DN = dominant negatief; CA = constitutief actief; ERK = extracellulair signaalgereguleerd kinase; GAPDH = glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase; EGFR = epidermale groeifactorreceptor; PLCγ = fosfolipase C gamma; FRB = FKBP-rapamycine-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Analyse van celgebied en uitsteekselactiviteit op basis van live beeldvorming: HeLa-cellen werden getransfecteerd met RapR-Shp2 en onderworpen aan het geschetste protocol voor live beeldvorming. Gegevens werden geanalyseerd zoals beschreven in het protocol voor gegevensanalyse. Eenmaal geactiveerd (aangegeven door de verticale grijze lijn), vertoonden HeLa-cellen een toename van zowel de uitsteekselactiviteit van de cel als het celgebied. In de negatieve monsters die alleen FRB tot expressie brachten, was deze activiteit niet aanwezig. Dit geeft aan dat RapR-Shp2-activering snelle morfodynamische veranderingen in HeLa-cellen induceert en celverspreiding en uitsteeksel stimuleert. Dit cijfer is aangepast van Fauser et ^al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol biedt gedetailleerde stappen voor de ontwikkeling, karakterisering en toepassing van chemogenetisch gecontroleerde fosfatasen. De RapR-Shp2-tool is gebaseerd op een rapamycine-gereguleerde schakelaar die in het Shp2-katalytische domein is ingevoegd. De kracht van deze tool is de specificiteit en strakke temporele controle van de fosfatase-activiteit. De tool is toepasbaar op andere fosfatasen en maakt, in combinatie met de eerder beschreven RapR-TAP-technologie, de reconstructie van individuele stroomafwaartse signaalroutes mogelijk²⁶. De unieke mogelijkheden van de RapR-benadering stelden onderzoekers in staat om voorbijgaande gebeurtenissen te identificeren die werden veroorzaakt door activering van Shp2 en specifieke stroomafwaartse signaalroutes te ontleden die individuele morfodynamische processen reguleren.

Verschillende kritische factoren zijn van invloed op het ontwerp van een RapR-fosfatase. Een goed opgeloste kristalstructuur van het katalytische domein van de betreffende fosfatase is zeer nuttig bij het begeleiden van de selectie van de insertieplaats voor iFKBP. Vanwege de hoge structurele gelijkenis tussen tyrosinefosfatasen zou uitlijning van de aminozuursequenties van de katalytische domeinen echter voldoende informatie kunnen opleveren voor de identificatie van de insertieplaats, zoals geïllustreerd door de uitlijning van Shp2 met PTP1B en PTPPest (Figuur 2). Voor RapR-Shp2 werd Val406, gelegen op de locatie die is gekoppeld aan de kritische katalytische WPD-lus door een β-streng, gekozen als de meest optimale invoegplaats. Dezelfde insertieplaats kan leiden tot een succesvolle regulatie van andere PTPases, zoals werd aangetoond voor PTP1B en PTP-PEST¹² (Figuur 2A).

Als de betreffende fosfatase een multidomeineiwit is, zal structurele informatie over de organisatie van de domeinen helpen voorkomen dat andere functies van het PTPase worden verstoord. Een andere factor die van invloed is op het ontwerp van optimaal RapR-PTPase is hoeveel aminozuren moeten worden vervangen door ingebracht iFKBP. Grotere en flexibelere invoeglussen in het PTPase kunnen extra verkorting vereisen om een strakke regulering van de katalytische activiteit door iFKBP te garanderen. Evenzo zullen de lengte en de samenstelling van de linkers die iFKBP met het PTPase verbinden, de efficiëntie van de regulatie beïnvloeden. Korte linkers die zijn samengesteld uit een enkel Gly-residu zorgen voor een strakkere regulatie, maar kunnen de maximale activiteit van het enzym verminderen als ze aanhoudende structurele vervorming veroorzaken, zelfs wanneer iFKBP is gebonden aan rapamycine en FRB. Middellange Gly-Ser-Gly-linkers bieden meer flexibiliteit, maar zijn mogelijk niet stijf genoeg voor sommige PTPases. Lange linkers bestaande uit Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly helpen de vorming van onbedoelde secundaire structuren te voorkomen die de PTPase-regulatie kunnen beïnvloeden. RapR-Shp2 is getest met alle drie de typen linkers; een Gly-Ser-Gly linker bleek het meest optimaal te zijn.

Een cruciaal aspect dat bepalend is voor de succesvolle ontwikkeling van RapR-tools is het opzetten van een robuuste fosfatasetest en de aanwezigheid van geschikte controles. Vergelijking van de activiteit van RapR-fosfatase met de activiteit van dominant-negatieve en constitutief actieve versies van de POI levert een beoordeling op van de lekheid van het RapR-construct en de mate van activering. Bovendien zal het ontbreken van defosforylering door de constitutief actieve fosfatase of verminderde fosforylering door de dominante negatieve mutant duiden op onjuiste reactieomstandigheden.

Voor de fosfatasetest moeten de reactieomstandigheden voor elk PTPase worden geoptimaliseerd. Het aanpassen van de temperatuur, reactietijd en buffercondities is afhankelijk van de PTPase die van belang is. Krachtige agitatie van monsters is van cruciaal belang om voldoende menging van het sefarrose-gebonden PTPase en zijn substraat te garanderen. Ten slotte, als de beschreven fosfatasetest niet optimaal is voor het specifieke PTPase van belang, kan een fosfatasereactie met p-nitrofenylfosfaat als substraat worden gebruikt als alternatieve test²⁷.

Bij experimenten met live cell imaging moet bij het voorbereiden van een monster rekening worden gehouden met verschillende criteria. Het geschetste protocol maakt gebruik van L-15-media op basis van HEPES-buffer, die niet gevoelig is voor CO₂ -concentratie. Als het gebruik van een medium op basis van bicarbonaat gewenst is, moet HEPES worden aangevuld om de pH van het monster te behouden of moet een omgevingsbeeldvormingskamer worden gebruikt die CO₂ aanvult. Het protocol beveelt aan om een laag minerale olie op het monster aan te brengen om verdamping te voorkomen en de toevoeging van rapamycine te vereenvoudigen. Andere opstellingen met behulp van een omgevingsbeeldvormingskamer of een gesloten kamer kunnen worden gebruikt, maar de toevoeging van rapamycine kan een grotere uitdaging zijn. Wanneer u rapamycine aan de cellen toevoegt tijdens de beeldvorming, zorg er dan voor dat het stadium niet verschuift en de cellen niet worden verstoord. Eventuele extra bewegingen van het monster tijdens het beeldvormingsproces zullen het verzamelen van gegevens belemmeren. De verlichtingsintensiteit en belichtingstijd moeten laag worden gehouden om de fototoxiciteit te verminderen, vooral voor beeldvorming op lange termijn. Adequate transfectie-efficiëntie van de cellen is ook van cruciaal belang. Een verhouding van 1:1 van FRB tot RapR-Shp2 DNA zorgt voor voldoende expressie, maar voor nieuwe constructies zal deze verhouding moeten worden aangepast. Om een efficiënte activering te garanderen, moet FRB op een hoger niveau tot expressie worden gebracht dan het RapR-fosfatase.

Een beperking van op RapR gebaseerde tools is het onvermogen om snel te deactiveren. Het veranderen van media verwijdert extracellulaire rapamycine, maar deactivering van RapR-constructen kan uren duren vanwege de zeer strakke binding van rapamycine aan het RapR-construct. Snelle inactivatie kan worden bereikt door de toevoeging van een actieve plaatsremmer van het PTPase. Mogelijke off-target effecten van de remmer kunnen de interpretatie van de resultaten echter uitdagend maken. Bovendien kan de RapR-benadering, zelfs in combinatie met een PTPaseremmer, niet worden gebruikt voor cyclische activerings-/inactiveringsexperimenten. Een andere beperking van het RapR-systeem is het gebrek aan ruimtelijke controle. RapR-constructen worden wereldwijd tot expressie gebracht en dus overal in de cel geactiveerd. Een mogelijke oplossing is de toepassing van rapamycine in een kooi die lokaal in de cel kan worden afgegeven door bijna UV-licht^28,29. Verder kan de RapR-tool worden aangepast om activering van de fosfatase van belang te bereiken in een specifiek eiwitcomplex of op een specifieke subcellulaire locatie. Door een bindingspartner of een subcellulaire tag aan FRB te hechten, wordt RapR-PTPase gericht op het specifieke eiwit of de specifieke locatie in de cel. Ten slotte is rapamycine een goed gekarakteriseerde immunosuppressivum via mTOR-remming en kan het de cellulaire signalering beïnvloeden, waardoor de signalering van het betreffende PTPase mogelijk wordt verstoord. Om deze bezorgdheid weg te nemen, vormen niet-immunosuppressieve analogen van rapamycine (iRap en AP21967) een goed alternatief. Van beide verbindingen is aangetoond dat ze RapR-constructies^{reguleren 14}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			Voor 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromofenolblauw, pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat geïnactiveerd Triple 0.1 µm sterieel gefilterd
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Gepubliceerd in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Clelands Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfectiereagens
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazol pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update werd gebruikt om CellGeo-functies uit te voeren
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objectief	Olympus	N/A
PBS zonder Ca en Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] natrium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetaat-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	voor elektroforese
Wasbuffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antilichamen
Anti-EGFR Antilichaam	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antilichaam	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antilichaam	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antilichaam	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antilichaam	Clontech	632380
Anti-mCherry Antilichaam	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antilichaam	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-fosfo-EGFR Y992 Antilichaam	Cell Signaling	2235
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202/Y204 Antilichaam	Cell Signaling	9101
Anti-