Methodenartikel

Structuurgeleid ontwerp en ontwikkeling van nieuwe cyclophiline A-remmers en ganoderiol-F-derivaten: een in-silico-benadering

DOI:

10.3791/67145

⸱

23 juni 2026

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het structuurgestuurde ontwerp van eiwit-ligandbindingsinteractie tussen Sanglifehrin A en Cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentieel voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen. De stabiliteit van het ligand-receptorcomplex werd geëvalueerd met behulp van moleculaire dynamica-simulatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cycline Ds-CDK-as (Cyclophiline A (Cyp /Ganoderiol F)) speelt een cruciale rol bij kanker via verschillende processen, zoals het beheersen van proliferatie en het remmen van kankercellen. Ganoderiol F-derivaten kunnen dienen als oncogene doelen voor meerdere kankertypen. Deze studie toonde aan dat het structuurgestuurde ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe Cyp A-remmers en Ganoderiol F-derivaten kunnen worden gebruikt om berekende posities te selecteren voor verhoogde effectiviteit in chemische remmers en hun interactie met de gekozen receptoren. Voor deze aanpak werden talrijke softwaretoepassingen gebruikt om optimale moleculaire interacties te bereiken. In totaal werden 117 nieuwe cyclofiline-inhibitor ligandmoleculen geconstrueerd met behulp van Chemsketch-software. De geconverteerde PDB-bestanden van de nieuwe Cyp A-remmerliganden werden voorbereid voor introductie in de Sanglifehrin A-enzymreceptor. Interacties tussen liganden en eiwitkoppelingen werden uitgevoerd met AutoDock 4.2.6-software om de beste geometrische interacties te onthullen. De bevestigingen van het koppelen werden uitgevoerd met PyMOL 2.5-software. Ten slotte werden waterstofbruggen gedetecteerd met behulp van Chimera- en Maestro-software. Het geselecteerde ligandreceptor-gekoppelde complex werd onderworpen aan een simulatie van moleculaire dynamica. Het MD-simulatieproces toonde de stabiliteit van het complex aan en gaf aan dat de gekozen ligand kan worden gebruikt als medicijnremmer voor kankercellen. In de resultaten werden de actieve aminozuren in de bindplaats geïdentificeerd als Arginine 55 die in beweging 1,53Å, Asparagine (Asn), Glycine (Gly), Threonine (Thr), Lysine (Lys), Isoleucine (Iso), Histidine (Hid), Phenylalanine (Phe) en Cysteïne (Cys) met het hoogste aantal waterstofbindingsliganden van 45 hydroxymangiferon. Die verbonden was met de 1nmk-receptor in de grid box-coördinaat van X 38,86, Y van 10,987 en Z van 40,734. De evaluatie van de 1nmk receptor-ligand complex in moleculaire dynamica (MD) simulatie in het krachtveld van Gromacs versie CHARMM 36 heeft optimale graden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyclophiline A is een sterke remmer van humaan Cyp A. Cyclophiline is een robuuste remmer die het immuunsysteem niet aantast, betere farmacologische eigenschappen heeft en de remming van de transporter vermindert. Slechte prognose is in verband gebracht met de overexpressie van cyclophilines, een eiwitfamilie met peptidyl-prolyl isomerase activiteit1. Cyclofilien zijn overgedrukt in tal van kankers, waaronder hepatocellulair carcinoom. Bij hepatocellulair carcinoom (HCC) zijn cyclophilines cruciaal voor zowel kankerresistentie als proliferatie2. De inhibitie verwerft essentiële informatie om nieuwe immunosuppressoren te identificeren op basis van quinoxaline-derivaten door gebruik te maken van moleculaire koppeling op atomair niveau en MD-simulatie om de precieze bindplaats van DC838 aan Cyp A3 te bepalen.

Daarnaast toonde in vivo onderzoek aan dat cyclophiline DC838 de door concanavaline geïnduceerde miltcelproliferatie van muizen voorkomt. Verschillende studies hebben een reeks macrocyclische cyclofiline-remmers gerapporteerd, gesynthetiseerd op basis van Sanglifehrin A (SFA), een natuurlijke stof4. Initiële compoundoptimalisatie toonde aan dat de hydroxylgroep van het m5-tyrosineresidu, de stereocentra op C14 en C15, en het valine5m5tyrosine5piperazinezuurtripeptide in de Sanglifehrin-kern essentiële factoren waren die de potentievan de verbinding beïnvloedden. De C185C21 dieneenheid van SFA zou vervangen kunnen worden door een styrylgroep om krachtige verbindingen te creëren die een nieuwe bindingsmodus vertonen, waarbij de styreengroep interageert met arginine (Arg)556 van Cyp A via een stapelinteractie. Niet-immunosuppressieve cyclophiline-remmers zijn effectief bij de behandeling van hepatitis C-virus. Cyclosporine A1, alisporivir en de meeste andere cyclosporinen zijn sterke remmers van MRP2, MDR1, OATP1B1 en andere cruciale medicijntransporters 7,8.

Aan de andere kant vertraagt Ganoderiol F, gezuiverd van Ganoderma leucocontextum, de celcyclusprogressie door het remmen van CDK4/CDK69 cyclines, en cycline-afhankelijke kinasen (CDK's) zijn cruciaal voor het reguleren van de zoogdiercelcyclus. Cyclin D-CDK4/CDK6 en Cyclin E-CDK2 zijn de cruciale spelers in de controle van de celcyclusprogressie door Ganoderiol F. Daarom kan Ganoderiol F worden gebruikt als een potentiële CDK4/CDK6-remmer bij de behandeling van borstkanker10,11. FA remt de G1-fase van de celcyclus, wat de groei van M-CSF-afhankelijke macrofagen voorkomt zonder de cellevensvatbaarheidte beïnvloeden. De immunosuppressor remt proliferatie door de activiteit van CDK2 te deactiveren. In de context van kanker is de rol van Cycline D-CDK4/6, samen met andere cyclines en CDK's, goed vastgesteld. Kanker wordt gekenmerkt door de abnormale deregulatie van de cycline-CDK-route. Specifiek, wanneer de cel klaar is om DNA-synthese te starten, mediteert CDK4 de passage door de G1-fase in combinatie met de D-type cyclines. Dit proces is cruciaal verbonden met de ontwikkeling en progressie van kanker9.

De actieve plaats van Cyp A wordt gekenmerkt door de invariante katalytische arginine (Arg55) en een sterk geconserveerde mix van hydrofobe, aromatische en polaire residuen, zoals Arg55, glutamine (Gln), glycine (Gly) en threonine (Thr)1,13,14. De actieve locatie van de cyclofilinefamilie bestaat ook uit Alanine (Ala) en Asparagine (Asn)1. Ondertussen bestaat de SFA-actieve plaats uit de aminozuren Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala en Asn, die een hydrofobe pocket vormen die de piperazinezuurgroep van SFA omsluit. In tegenstelling tot de niet-liganded Cyp A dwingt de verbinding tussen de macrocycle en de spin cycle van SFA Trp121 om zijn zijketens16 opnieuw uit te lijnen.

1nmk is geselecteerd als een specifieke PDB-code van Sanglifehrin A, zoals vermeld in eerdere studies17. SFA, een immunosuppressieve natuurlijke stof, werd voor het eerst ontdekt in Streptomyces sp. A92-3081 5,18. SFA vertoont een hoge affiniteit voor Cyp A en heeft een aparte structuur vergeleken met CsA, waarbij een unieke methode wordt gebruikt om het immuunsysteem te onderdrukken. De complexe moleculaire structuur van SFA bestaat uit een 22-lid macrocyclus met een negen-koolstof lijn op positie 23, die eindigt in een sterk gesubstitueerde spiro-bicyclische groep. In vitro studies met fibrotische humane longfibroblasten en monsters van patiënten met idiopathische pulmonale fibrose toonden aan dat SFA de productie van cyclophiline B verhoogt en de secretie van collageen type I19,20 remt. In totaal werden 20 verschillende sanglifehrins gebruikt om SFA (C16) te isoleren. De affiniteit voor cyclofilines is ongeveer 60 keer hoger dan die van de andere leden van de SFA-groep in een celvrij competitief bindingsexperiment15. Zo vermindert SFA aanzienlijk de hoeveelheid bioactieve IL-12p70, de primaire bron van IL-12 die door dendritische cellen wordt vrijgegeven, waardoor de activiteit van dendritische cellen wordt geremd. Deze studie suggereert dat SFA een krachtig nieuw immunosuppressief medicijn is.

In dit protocol werden nieuwe ligandstructuren voor Ganoderiol F/Cyp A gegenereerd met behulp van in silico-methoden met Chemsketch-software en vervolgens omgezet naar PDB-bestanden met compatibele software. De conceptie van eiwit-ligandbinding is een belangrijk onderwerp in het proces van geneesmiddelenontdekking en -ontwerp21,22. De ligand-receptorinteracties werden gekoppeld met AutoDock 4.2.6-software. Computationele koppelingssystemen genereren doorgaans meerdere potentiële eiwit-ligandencomplexconfiguraties. Een of enkele kandidaten met de laagste energiebinding aan de 1nmk-receptor kunnen worden geselecteerd voor de volgende fase van geneesmiddelontwerp om effectief te zijn in silico geneesmiddelontwerpproeven. Chimera-software werd gebruikt om de optimale waterstofbindende ligand te identificeren. Ten slotte werden moleculaire dynamica (MD) simulaties uitgevoerd op het ligand-receptorcomplex om de stabiliteit ervan te meten. Deze methode wordt beschreven in het onderstaande protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In silico generatie van liganden en ligandpreparaten in ChemSketch-software

OPMERKING: Deze software zal worden gebruikt om de structuur van een ligand/molecuul te tekenen, oftewel moleculaire bewerking.

  1. Teken de ligand/structuur zoals aangegeven in het tekenproces dat in de software wordt gevolgd, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 1).
  2. Druk op f9 om de constructie schoon te maken nadat je de volledige constructie hebt getekend.
  3. Klik op Bestand en sla dan op als. (Navigeer naar de map, bijvoorbeeld wordt molecuul 1 opgeslagen in map 1, enzovoort).
  4. Verander het Save As-type naar mdl molfiles, klik dan op Save (geen bestandsnaam hoeven op te geven; gebruik de standaard bestandsnaam die door de software wordt gegeven, bijvoorbeeld noname).
    OPMERKING: Er wordt één bestand aangemaakt in de map, en elk bestand heeft het mdl-formaat van een 2D-structuurligand.
  5. Herhaal bovenstaande stappen voor alle moleculen.

2. Omzetting van bestandsformaat (Open Babel-software)

OPMERKING: De software converteert bestandsformaten. Hier wordt het .mol-bestand omgezet naar .pdb-formaat, zoals getoond in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 2).

  1. Selecteer links, in het invoerformaat, mol--mdl mol formaat in het keuzemenu. Evenzo selecteert u aan de rechterkant, in het uitvoerformaat, pdb--eiwitdatabankformaat.
  2. Onder het invoerformaat (links), klik op ... (de bladerknop).
  3. Navigeer naar de map (bijvoorbeeld map 1), klik op het net getekende Chemsketch-bestand en open het.
  4. Klik onder het uitvoerformaat op ....
  5. Een standaardvenster opent. Typ hier 1.pdb om het bestand te benoemen. Voor structuur 1 typ je 1.pdb en klik je op Opslaan. Herhaal deze stap voor molecuul/structuur 2, typt 2.pdb , enzovoort.
  6. Klik tenslotte vanaf het midden van de software-interface op Converteren. Dit zal de coördinaten van het mdl mol-formaat naar het PDB-formaat converteren.
    OPMERKING: Nu wordt er nog een bestand aan de map toegevoegd. Elk bestand heeft één ligand pdb-bestand dat in de volgende stappen wordt gebruikt.
  7. Klik met de rechtermuisknop op het nieuw aangemaakte bestand, selecteer Openen Met, en kies vervolgens Kladdblok.
  8. Herhaal dezelfde stappen voor alle moleculen.
    OPMERKING: AutoDock 4.2.6 verschijnt op het bureaublad na installatie van de MGL 1.5.7-tools.
  9. Bereid het invoerbestand 1nmk.pdb voor zoals hieronder beschreven.
  10. In het 1nmk.pdb-bestand verwijder je alle externe liganden door de pdb.org-website te bezoeken en de 1nmk-structuur te selecteren. Zoek naar de liganden onder de titel van het kleine molecuul op de 1nmk-structuur, zoals getoond in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 3).
  11. Zoek de ligand genaamd SFM, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 4), en open het 1nmk-bestand. Download het 1nmk PDB-bestand van de PDB-website. Zoek het beëindigingsresidu (TER.), zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 5).
  12. Verwijder de residuen van de externe liganden (SFM) in de 1nmk-structuur, beginnend bij het residu na TER en eindigend vóór het residu dat voor het einde werd vermeld. Sla het aangepaste 1nmk PDB-bestand op het systeem op.
    OPMERKING: Het 1nmk PDB-bestand zal klaar zijn, en de voorbereiding van het receptor actieve coördinatensitebestand staat in Tabel 1.
  13. Open het 1nmk-bestand en vind Arg op aminozuur nummer 55.
  14. Vind de coördinaten van x, y en z, zoals getoond in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 6).

3. Voorbereiding van de koppelparameters met behulp van AutoDock 4.2.6-software.

  1. Open de AutoDock 4.2.6 tools-software vanaf het bureaublad.
  2. Selecteer AutoDock 4.2.6 4.0 voor 1nmk receptorvoorbereiding, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 7).
  3. Open het Bestandsmenu , selecteer Moleculen lezen, navigeer naar de map, selecteer 1nmk en druk op Open.
  4. Druk op Bewerken, kies Waterstof en klik op Toevoegen. Selecteer alleen Polair en druk op OK. (Aanvullend Bestand 1, Screenshot 8).
  5. Druk op Bewerken, kies Charges en selecteer vervolgens Kollman Charges.
  6. Druk op Bewerken, kies Atomen en selecteer vervolgens Assign ad4 type (kies één van hen).
  7. Open het Bestandsmenu , kies Opslaan en typ pdbqt. Er zal een raam opengaan. Blader door map 1, typ de bestandsnaam 1nmk.pdbqt en klik op Opslaan.
  8. Selecteer uit Atom en voeg vervolgens toe zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 9). Vink de vakjes aan voor sorteerknooppunten, sla transformatiecoördinaten op, schrijf alle records en klik dan op OK.
  9. Open Ligand, selecteer invoer, en dan Open. Ga naar map 1, verander het bestandstype naar alle bestanden, selecteer 1.pdb en klik op Openen. Er verschijnt een klein venster met informatie over de geselecteerde Ligand, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 10).
  10. Open de ligand, vervolgens de torsieboom, en vervolgens Detecteer de wortel, zoals getoond in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 11).
  11. Open Ligand, dan Output, en sla dan op als pdbqt. Ga naar map 1, typ de bestandsnaam 1. pdbqt in en klik op Opslaan, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 12).
    OPMERKING: Alle ligand pdbqt-bestanden worden voorbereid.
  12. Open Grid, selecteer Macromolecule, kies 1nmk, en selecteer dan Molecule. Er zal een waarschuwing verschijnen; klik op OK, zoals getoond in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 13). Ga naar map 1, typ de bestandsnaam 1nmk.pdbqt, klik op Opslaan, en wanneer een vervangen-venster opent, klik je op Ja, zoals te zien is in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 14).
  13. Open Grid en stel vervolgens kaarttypes in, kies Ligand, klik op 1 en selecteer Ligand, zoals getoond in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 15).
  14. Bereid het GPF-receptor actieve coördinatensitesbestand voor zoals weergegeven in Tabel 1.
    OPMERKING: Het bestand GPF stelt de actieve coördinatenplaats van de receptor weer (Tabel 1).
  15. Klik op Raster, ga dan naar Rastervak, kies Centrum, kies een atoom en voer het Middenrastervak in (Aanvullend Bestand 1, Screenshot 16).
    1. Kies Bestand, dan Sluiten, en sla de huidige instellingen op.
    2. Kies Grid, dan Output, en sla op als GPF. Ga naar map 1 en typ de bestandsnaam 1nmk.gpf.
    3. Kies Docking > Macromolecule > Stel Rigid File Name in, ga naar map 1 en klik op 1nmk.pdbqt, daarna Open, zoals getoond in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 17).
    4. Kies Docking, zoek 1, en selecteer Ligand (Aanvullend Bestand 1, Screenshot 18). Er opent een venster met standaardparameters. Accepteer de standaardparameters, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 19).
    5. Kies dan Docking, ga naar Zoekparameters, selecteer Genetisch Algoritme, dat een venster opent met standaardparameters, en kies vervolgens Accepteren, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 20).
    6. Kies Docking, dan Output, Lamarckian GA, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 21).
    7. Ga naar map 1, typ de bestandsnaam " 1nmk.dpf" en klik op Opslaan, zoals te zien is in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 22).
      OPMERKING: Sluit het AutoDock 4.2.6 softwarevenster, open het opnieuw en herhaal het proces voor het volgende molecuul. Daarnaast zijn de 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf en 1nmk.dpf klaar voor de dockingprocesstap.

4. Cygwin-I (Dockingproces)

OPMERKING: Om GLG- en DLG-bestanden te maken, voer je het algoritme uit. Het algoritme (AutoGrid) draait in deze Cygwin-terminal. Navigeer in Cygwin naar de map. Als bijvoorbeeld map 1 zich op de C-schijf bevindt, zou deze één map moeten bevatten met de naam "project", gevolgd door een andere map genaamd "molecules," en vervolgens alle mappen daarin. Volg deze stappen.

  1. Open de Cygwin-terminal .
  2. Typ cd c:/ en druk op Enter. Typ dan cd project en druk op Enter.
  3. Typ cd-moleculen en druk op Enter, typ dan cd 1 en druk op Enter. Nu bevindt map 1 zich in de Cygwin-terminal.
  4. Typ ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & en druk op Enter, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 23).
    OPMERKING: In "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &" is -l een min kleine l.
  5. Typ tail -f 1nmk.glg en druk op Enter, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 4).
  6. Als AutoGrid succesvol wordt voltooid, sluit dan dit Cygwin-venster, open een nieuw Cygwin-venster en herhaal het bovenstaande proces voor molecuul 2.
  7. Herhaal deze stap voor alle moleculen en voer het algoritme uit (AutoDock 4.2.6).
    OPMERKING: Voor AutoDock 4.2.6 herhaal je het navigatieproces naar de map, en wanneer de map wordt geopend, typ dan de en druk op Enter voor AutoDock 4.2.6.
  8. Typ ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & en druk op Enter, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 24).
    OPMERKING: In bovenstaande stap is "-l" een kleine letter "L" met een negatief teken.
  9. Type staart -f 1nmk.dlg
    OPMERKING: Als AutoDock 4.2.6 voltooid is, sluit dan het Cygwin-venster en herhaal het proces voor molecuul 2.
  10. Volg deze Cygwin-procedure voor alle moleculen.
  11. Na het aanmaken van DLG-bestanden voor moleculen, ga je naar map 1 en open je het DLG-bestand in WordPad. Druk drie keer op Ctrl + F, typ en druk Enter om bij de RMSD-tabel te komen, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 25).
  12. Open een Microsoft Excel-venster of noteer de pagina en maak drie kolommen: Nee, Min. Bindingsenergie en Run.
  13. Schrijf de gegevens op volgens de RMSD-tabel in het logbestand. De bindingsenergie staat bovenaan de tabel, samen met de reeks waarin deze werd waargenomen. Doe dit voor alle moleculen.
    OPMERKING: Het molecuul met de lagere bindingsenergie wordt als beter beschouwd dan de andere.
  14. Maak een nieuw spreadsheet met de details (serienummer, minimale bindingsenergie en uitvoering) van de top 20 moleculen.
    OPMERKING: De volgende procedure zal alleen worden uitgevoerd voor de top 20 moleculen.

5. Cygwin-ii

  1. Open de Cygwin-terminal, typ cd c:/ en druk op Enter.
  2. Typ cd project en druk op Enter, typ cd molecules en druk op Enter.
  3. Typ cd (mapnummer van het bovenste molecuul dat is geselecteerd) en druk op Enter.
    OPMERKING: Het nummer moet overeenkomen met de map in de Cygwin-terminal.
  4. Typ grep '^docked' 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt en druk op Enter. In tegenstelling tot AutoGrid en AutoDock verschijnt er geen bericht van succesvolle voltooiing voor dit bericht en druk op Enter, zoals te zien is in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 26).
  5. Druk op Enter en het bestand wordt aangemaakt.
  6. Typ cut -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb en druk op Enter. Het bestand wordt aangemaakt, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 27).
  7. Sluit het Cygwin-venster.
    OPMERKING: Om de interactie tussen liganden en receptoren na het koppelen te visualiseren met behulp van PyMOL 2.5-software
    1. Open de PyMOL 2.5-software, open dan het bestand, selecteer vervolgens de receptor.
    2. Open het bestand en selecteer vervolgens de gekozen ligandconfiguratie, zoals getoond in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 28).
    3. Selecteer in PyMOL 2.5 Hide Molecule en Hide Receptor. Selecteer in het Receptormenu 'Oppervlakte weergeven', zoals weergegeven in Figuur 1A.
      OPMERKING: Om de waterstofbinding in het ligand-1nmk-receptorcomplex te visualiseren, zal UCSF Chimera Software worden gebruikt in 20 liganden met de laagste bindingsenergie.

6. UCSF Chimera-software voor visualisatie van H-binding en analyse van resultaten

  1. Open UCSF Chimera, selecteer dan Bestand, dan Open, en navigeer naar schijf c:/, vervolgens Project, Molecules), selecteer 1nmk.pdb, en open het.
  2. Selecteer de drive waar de moleculen zich bevinden en open vervolgens het eiwit in het UCSF-programma.
  3. Selecteer Residue, daarna UNL Zoom.
  4. Selecteer Zone, druk dan op OK, selecteer dan Actie, kies vervolgens Label, selecteer Residu en kies Naam + Specificatie.
  5. Selecteer Tools, kies vervolgens Structuuranalyse, en kies vervolgens Find H-Bond, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 29).
  6. Open het standaardvenster en vink de vakjes aan voor kleur-H-bonds die niet aan de precieze criteria voldoen, en vind alleen H-bonds met geselecteerd.
  7. Selecteer Selectie verwijderen om een nieuwe survey te starten, zoom dan in en zoek naar de blauwe/oranje kleurlijnen die H-bindingen vertegenwoordigen, zoals weergegeven in Figuur 3.
  8. Controleer hoeveel obligaties er geteld moeten worden.
    OPMERKING: De zoom zou de H-bindingsinteracties met Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, Isoleucine 15623, Histidine 5424, fenylalanine (Phe)53, cysteïne (Cys)52, Gly72, Asn71 en Hid70 moeten tonen, en aangeven of ze zich binnen de actieve plaats van het eiwit bevinden, zoals weergegeven in Figuur 3A - D.
  9. Let op het aantal H-bindingen en het aantal moleculen.
  10. Leg de muis over de lijn die de H-binding toont, wat interacties aangeeft met Arg55 en Methionine, Gln, Gly en Thr.
  11. Druk op de Print Screen-toets .
  12. Open de Paint-applicatie , plak de aanvullende figuur en sla deze op in de genoemde map.
    OPMERKING: Om H-bindingen en aminozuren in de actieve site duidelijk te tonen, moet de 2D-structuur van de gekozen liganden en receptoren als volgt zijn:

7. Het voorbereiden van het ligandinteractiediagram voor koppelbevestiging en het tonen van de H-binding

  1. Open AutoDock 4.2.6 software.
    1. Selecteer Analyse en open Macromolecule, kies vervolgens 1nmk, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 30).
    2. Selecteer Analyse en open Docking, kies dan Open, navigeer naar het dlg.pdb-bestand en selecteer het, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 31).
    3. Selecteer Analyse en open Docking, kies vervolgens om AutoDock Virtual Screening Ligand te schrijven en sla het op als een PDB-bestand, zoals getoond in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 32).
  2. Open de PyMOL 2.5-software zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 33).
    1. Open het opgeslagen dlg.pdb-bestand en vervolgens het 1nmk.pdb-bestand.
    2. Open bestand, selecteer Molecuul exporteren en vervolgens opslaan, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 34).
    3. Open Maestro-software, open Bestand en kies vervolgens Import Structuur zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1 (Screenshot 35).
    4. Importeer het ligandinteractiediagram, sla de 2D-structuur op, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 2.

8. MD-simulatie

OPMERKING: Om GROMACS in Linux te openen, volg deze stappen

  1. Download Ubuntu 20.04.6.
    1. Zet de Windows-functie-applicatie op de pc aan. En kies dan Windows Subsystem voor Linux en druk op OK.
    2. Volg deze en druk Enter om GROMACS te installeren:
      1. Typ sudo apt-get update en druk op Enter, dan sudo apt-get upgrade en druk op Enter.
      2. Typ sudo apt-get install gcc en druk op Enter, en typ sudo apt-get install cmake en druk op Enter.
      3. Typ sudo apt-get install built-essential en druk op Enter, vervolgens sudo apt-get install liDevfftw3-d en druk op Enter.
      4. Typ sudo apt-get install GROMACS en druk op Enter, daarna shift + Ctrl + T.
    3. Open de map op de pc van de pc en noem deze GROMACS, zoals weergegeven in Supplementair Bestand 1 (Screenshot 36).
    4. Open de GROMACS-map en druk op Shift + Ctrl + rechter om Linux te openen.
      OPMERKING: De simulaties gebruikten het watermodel en GROMACS versie 4.0, Win64-multicore versie, die het CHARMM 36 krachtveld bevatte. De tijdstap werd ingesteld op 2 fs, de afkapafstand van 1,0 tot 1,2 nm werd gekozen.

9. Het creëren van ligandtopologie met behulp van GROMACS pdb2gmx-modules (Aanvullend Bestand 1, Screenshot 37)

  1. Maak een lig.gro-bestand aan, haal de ligand uit de eiwitstructuur door grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb te typen en Enter in te drukken, en hernoem vervolgens "UNL" naar "LIG" in het bestand.
  2. Open lig.pdb in PyMOL 2.5, verwijder ongewenste atomen door op selecteer de atomen te drukken en op delete the atoom te drukken. Klik op opslaan om de opgeschoonde versie op te slaan als lig_clean.pdb.
  3. Open het schoongemaakte bestand in Avogadro om waterstof toe te voegen met de Build-tool en sla het op als lig.mol2. Bewerk de bovenkant van het bestand in een teksteditor om ervoor te zorgen dat de residunaam op LIG is gezet.
  4. Typ perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 en druk op Enter.
  5. Genereer de ligandtopologie met CGenFF: upload lig_fix. mol2, verwerk de invoer en download lig_fix.pdb. Activeer de Python-omgeving en voer python uit cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff en druk op Enter.
    OPMERKING: Deze stap genereert vier ligandbestanden (lig.prm, lig.itp, lig.top en lig_ini.pdb).
  6. Genereer het ligand.gro-bestand , typ gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro en druk op Enter.
  7. Scheid het eiwit door alleen de niet-ligandatomen in prot_clean.pdb op te slaan en zorg ervoor dat UNL-atomen bovenaan het gecombineerde complex staan.

10. Het creëren van eiwittopologie in GROMACS pdb2gmx-modules (Supplementair Bestand 1, Screenshot 38).

  1. Bereid de eiwittopologie voor, typ gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter en druk Enter .
  2. Maak het complex van eiwit en ligand nadat je het lig.gro-bestand aan het einde van pro.gro-bestand hebt toegevoegd. Typ dan gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic en druk op Enter.
  3. Genereer solvate met behulp van het specifieke puntladingswatermodel om evenwicht te behouden, typ gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top en druk op Enter.
  4. Maak ionenbestanden aan, typ gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr en druk op Enter. Typ gmx genion -s ion.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral, druk op Enter, kies vervolgens groep 15 om ionen toe te voegen.
  5. Genereer energieminimalisatie em.gro.
  6. Typ gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr en druk op Enter, en typ gmx mdrun -v -deffnm em en druk op Enter.
    OPMERKING: Het gesolveerde systeem zal energie-geminimaliseerd worden met maximaal 50.000 stappen met een krachtconvergentiecriterium van 1.000,0 kJ/mol/nm.
  7. Maak de indexbestanden aan, typ gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, druk op Enter.
  8. Typ gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 en druk op Enter.
  9. Genereer het index.ndx-bestand , typ gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx en druk op Enter.
  10. Genereer NVT-equilibratie nvt.gro-bestand , typ gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr en druk op Enter. Typ vervolgens gmx mdrun -deffnm nvt en druk op Enter.
    OPMERKING: De evenwicht van het systeem werd uitgevoerd bij een temperatuur van 27,35 °C (300,5 K) voor het ensemble van het aantal atomen (N), volume (V) en temperatuur (V) (NVT) van het systeem voor 100 ps.
  11. Werk het topologiebestand topol.top bij met ligandtopologie en parameters om NPT te maken.
  12. NPT-evenwicht genereren.
  13. Maak tweede fase NPT-evenwicht aan, typ gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr en druk op Enter, typ gmx mdrun -deffnm npt en druk op Enter.
    OPMERKING: Evenwichtige NVT verwijst naar het aantal deeltjes, volume en temperatuur, terwijl geëlibreerde NPT verwijst naar stabiliteit voor het aantal deeltjes, druk en temperatuur. De NVT.mdp- en NPT.mdp-bestanden zijn nodig om de resultaten van de MD-simulatie als volgt te produceren.

11. Het loslaten van de positiebeperkingen en het uitvoeren van de productie moleculaire dynamica-simulatie om gegevens te verzamelen

  1. Typ gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr en druk op Enter. Typ vervolgens gmx mdrun -deffnm md_0_10 en druk op Enter.
  2. Onderwerp het systeem aan een 1 ns MD-simulatie om de stabiliteit van het complex te testen.
    OPMERKING: Root mean square deviation (RMSD) kwantificeert de gemiddelde structurele deviatie van atomen ten opzichte van een referentiestructuur, en fluctuation mean square deviation (FMSD) meet de tijdgemiddelde atomaire fluctuaties rond hun gemiddelde posities. De twee waarden zijn nodig om de MD-simulatieruns af te ronden.
  3. Voer structurele analyses uit, waaronder RMSD, FMSD, H-bindingen en vrije energie.
  4. Teken de analysegrafieken met qtgrace_v026_win7 software en md_0_10.gro-bestand om het trajectograafje te tonen met VMD-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals vermeld in de inleiding, tonen in vivo en in vitro studies het belang van cyclophiline-remmers aan bij het vereenvoudigen van de structuur van Sanglifehrin, waardoor de proliferatie van de milt van de muis verminderd wordt door te interfereren met demuiscelcyclus 5. Daarnaast speelt Cyclophiline A, samen met Ganoderiol F-derivaten, een vitale rol in eiwitvouwing, immuunresponsen en celsignalering via zijn PPIASE-activiteit. De upregulatie e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nieuwe immunosuppressieve natuurlijke stof genaamd SFA of 1nmk moleculaire receptor werd geëxtraheerd uit Streptomyces. Moleculaire koppelingsanalyse werd gebruikt om de bindingsenergieën van de geconstrueerde liganden met het doeleiwit te bepalen. De resultaten toonden aan dat, van alle ontworpen liganden, SFA structureel verschilt van CsA en een aanzienlijke affiniteit vertoont met Cyp A16. Cyp A, dat peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activiteit h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen enkele

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, X., et al. Inhibitors of cyclophilin A:Current and anticipated pharmaceutical agents for inflammatory diseases and cancers. Molecules. 29 (6), 1235(2024).
  2. Jin, S., Zhang, M., Qiao, X. Cyclophilin A:promising target in cancer therapy. Cancer Biol Ther. 25 (1), 2425127(2024).
  3. Nigro, P., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. Cyclophilin A:a key player for human disease. Cell Death Dis. 4 (10), e888(2013).
  4. Mahgoub, E. O., Kulkarni, S. Structural analyses of an epidermal growth factor receptor-specific single-chain fragment variable via an in silico approach. J Vis Exp. (201), e65894(2023).
  5. Steadman, V. A., et al. Discovery of potent cyclophilin inhibitors based on the structural simplification of sanglifehrin A. J Med Chem. 60 (3), 1000-1017 (2017).
  6. Wang, S., Dong, G., Sheng, C. Structural simplification:an efficient strategy in lead optimization. Acta Pharm Sin B. 9 (5), 880-901 (2019).
  7. AbuQamar, S. F., El-Tarabily, K. A., Sham, A. Co-expression networks in predicting transcriptional gene regulation. Methods Mol Biol. 2328, 1-11 (2021).
  8. Mahgoub, E. O., Bolad, A. K. Construction, expression and characterisation of a single chain variable fragment in the Escherichia coli periplasmic that recognise MCF-7 breast cancer cell line. J Cancer Res Ther. 10 (2), 265-273 (2014).
  9. Li, X., et al. Ganoderiol F purified from Ganoderma leucocontextum retards cell cycle progression by inhibiting CDK4/CDK6. Cell Cycle. 18 (21), 3030-3043 (2019).
  10. Han, Z., et al. Targeted gadofullerene for sensitive magnetic resonance imaging and risk-stratification of breast cancer. Nat Commun. 8 (1), 692(2017).
  11. Mahgoub, E. O., et al. Identification of colorectal adenocarcinoma key genes to be validated as potential prognosis biomarkers. Int J Stem Cell Res Ther. , (2025).
  12. Sánchez-Tilló, E., et al. Cyclophilin A is required for M-CSF-dependent macrophage proliferation. Eur J Immunol. 36 (9), 2515-2524 (2006).
  13. Schmetzer, O., Florcken, A. Sex differences in the drug therapy for oncologic diseases. Handb Exp Pharmacol. 214, 411-442 (2012).
  14. Ke, H., et al. Crystal structures of cyclophilin A complexed with cyclosporin A and N-methyl-4-[(E)-2-butenyl]-4,4-dimethylthreonine cyclosporin A. Structure. 2 (1), 33-44 (1994).
  15. Kallen, J., et al. Structure of human cyclophilin A in complex with the novel immunosuppressant sanglifehrin A at 1.6 Å resolution. J Biol Chem. 280 (23), 21965-21971 (2005).
  16. Sedrani, R., et al. Sanglifehrin−cyclophilin interaction:degradation work, synthetic macrocyclic analogues, X-ray crystal structure, and binding data. J Am Chem Soc. 125 (13), 3849-3859 (2003).
  17. Paulsen, J. L., et al. Evaluation of free energy calculations for the prioritization of macrocycle synthesis. J Chem Inf Model. 60 (7), 3489-3498 (2020).
  18. Shore, E. S. Selective inhibitors of cyclophilin D to treat pancreatitis. , University of Liverpool. United Kingdom. (2016).
  19. Flaxman, H. A., et al. Sanglifehrin A mitigates multi-organ fibrosis by targeting the collagen chaperone cyclophilin B. JCI Insight. , (2024).
  20. Flaxman, H. A. Structural and Mechanistic Studies of Molecular Glues and Their Targets [Doctoral dissertation]. , Harvard University Graduate School of Arts and Sciences. (2022).
  21. Mahgoub, E. O. Single chain fragment variables antibody binding to EGF receptor in the surface of MCF7 breast cancer cell line:application and production review. Open J Genet. 7 (2), 84-103 (2017).
  22. Mahgoub, E. O. The role of exosomes in cancer drug resistance, a review. J Clin Med Images Case Rep. 4 (1), 1632(2024).
  23. Lu, W., et al. DynamicBind:predicting ligand-specific protein-ligand complex structure with a deep equivariant generative model. Nat Commun. 15 (1), 1071(2024).
  24. Shinji, S., et al. Recent advances in the treatment of colorectal cancer:a review. J Nippon Med Sch. 89 (3), 246-254 (2022).
  25. Hyun, S., et al. One-bead-one-compound screening approach to the identification of cyclic peptoid inhibitors of cyclophilin D as neuroprotective agents from mitochondrial dysfunction. Chem Commun (Camb). 57 (19), 2388-2391 (2021).
  26. Hermosilla, P., et al. High quality illustrative effects for molecular rendering. Comput Graph. 54, 113-120 (2016).
  27. Comte, A., et al. Accelerating ligand discovery for insect odorant receptors. Int J Biol Sci. 21 (5), 2101(2025).
  28. Yang, X., et al. Molecular mechanism of allosteric modulation for the cannabinoid receptor CB1. Nat Chem Biol. 18 (8), 831-840 (2022).
  29. Fiorani, A. Electrospun polymeric scaffolds with enhanced biomimetic properties for tissue engineering applications. , (2014).
  30. Torres, P. H., et al. Key topics in molecular docking for drug design. Int J Mol Sci. 20 (18), 4574(2019).
  31. Huang, S. -Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mol Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  32. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  33. Bello, M., Martínez-Archundia, M., Correa-Basurto, J. Automated docking for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 8 (7), 821-834 (2013).
  34. Saikia, S., Bordoloi, M. Molecular docking:challenges, advances and its use in drug discovery perspective. Curr Drug Targets. 20 (5), 501-521 (2019).
  35. Chen, D., et al. Regulation of protein-ligand binding affinity by hydrogen bond pairing. Sci Adv. 2 (3), e1501240(2016).
  36. Ormeño, F., General, I. J. Convergence and equilibrium in molecular dynamics simulations. Commun Chem. 7 (1), 26(2024).
  37. Bikadi, Z., Hazai, E. Application of the PM6 semi-empirical method to modeling proteins enhances docking accuracy of AutoDock. J Cheminform. 1, 15(2009).
  38. Mahgoub, E. O., et al. Role of functional genomics in identifying cancer drug resistance and overcoming cancer therapy relapse. Heliyon. 10 (1), e22095(2023).
  39. Mahgoub, E. O., Haik, Y., Qadri, S. Comparison study of exosomes molecules driven from (NCI1975) NSCLC cell culture supernatant isolation and characterization techniques. FASEB J. 33 (S1), 647.22(2019).
  40. Agu, P. C., et al. Molecular docking as a tool for the discovery of molecular targets of nutraceuticals in diseases management. Sci Rep. 13 (1), 13398(2023).
  41. Kotschy, J., et al. Microsecond timescale conformational dynamics of a small-molecule ligand within the active site of a protein. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (5), e202313947(2024).
  42. Roe, D. R., Brooks, B. R. A protocol for preparing explicitly solvated systems for stable molecular dynamics simulations. J Chem Phys. 153 (5), 054123(2020).
  43. Badar, M. S., et al. Molecular Dynamics Simulations: Concept, Methods, and Applications. Transdisciplinarity. , Springer. Cham. (2022).
  44. Garcia-Ortegon, M., et al. DOCKSTRING:easy molecular docking yields better benchmarks for ligand design. J Chem Inf Model. 62 (15), 3486-3502 (2022).
  45. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation:a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018 (1), 3502514(2018).
  46. Korlepara, D. B., et al. Plas-5k:dataset of protein-ligand affinities from molecular dynamics for machine learning applications. Sci Data. 9 (1), 548(2022).
  47. Ahamad, S., et al. Screening Malaria-box compounds to identify potential inhibitors against SARS-CoV-2 Mpro, using molecular docking and dynamics simulation studies. Eur J Pharmacol. 890, 173664(2021).
  48. Shukla, R., Tripathi, T. Molecular Dynamics Simulation of Protein and Protein-Ligand Complexes. Computer-Aided Drug Design. , Springer. Singapore, Singapore. (2020).
  49. Sharma, V., Panwar, A., Sharma, A. K. Molecular dynamic simulation study on chromones and flavonoids for the in silico designing of a potential ligand inhibiting mTOR pathway in breast cancer. Curr Pharmacol Rep. 6, 373-379 (2020).
  50. Patodia, S., Bagaria, A., Chopra, D. Molecular dynamics simulation of proteins:a brief overview. J Phys Chem Biophys. 4, 6(2014).
  51. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11, 320-328 (2019).
  52. Meng, X. -Y., et al. Molecular docking:a powerful approach for structure-based drug discovery. Curr Comput Aided Drug Des. 7 (2), 146-157 (2011).
  53. Hummel, M., Verestek, W., Schmauder, S. Molecular Dynamics Simulations-A Time and Length Scale Investigation. High Performance Computing in Science and Engineering'19. , Springer. Cham. (2021).
  54. Ocana, A., et al. Integrating artificial intelligence in drug discovery and early drug development:a transformative approach. Biomark Res. 13 (1), 45(2025).
  55. Mahgoub, E., et al. The therapeutic effects of tumor treating fields on cancer and noncancerous cells. Arab J Chem. 14 (10), 103386(2021).
  56. Islam, M. A., et al. Applications of molecular dynamics in nanomaterial design and characterization-a review. Chem Eng J Adv. 22, 100731(2025).
  57. Zelnik, I. D., et al. Computational design and molecular dynamics simulations suggest the mode of substrate binding in ceramide synthases. Nat Commun. 14, 2330(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Moleculaire dockingligand eiwitinteractieproliferatie van kankercellenmoleculaire dynamicasimulatiewaterstofbruganalyseAutoDock dockingeiwit ligandcomplex

Gerelateerde artikelen