Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Infectie van in vivo en in vitro dennen met de dennenhoutnematode Bursaphelenchus xylophilus en isolatie van geïnduceerde vluchtige stoffen

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67149

⸱

27 september 2024

 ,  ,  , 
1INIAV, I.P., National Institute for Agrarian and Veterinary Research, I.P., 2GREEN-IT Bioresources for Sustainability, Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa (ITQB NOVA), 3Centre for Environmental and Marine Studies (CESAM Lisboa), Biotecnologia Vegetal (BV), DBV, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 4Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes (CE3C), Biotecnologia Vegetal (BV), DBV, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 5Hercules Laboratory & Chemistry and Biochemistry Department of Science and Technology School, University of Évora

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol beschrijft de in vivo en in vitro dennenhoutnematodeninfectie van Pinus pinaster en hun vluchtige-analyse door middel van gaschromatografie (GC) en GC gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS).

Samenvatting

Het dennenaaltje (PWN) is een fytoparasiet die pijnboomverwelkingsziekte (PWD) veroorzaakt bij coniferensoorten. Deze plantparasitaire nematode heeft sterk bijgedragen aan de ontbossing van dennen in Aziatische landen, zoals Japan, China en Korea. In de afgelopen twee decennia zijn Portugal en Spanje in Europa zwaar getroffen. Onderzoek naar de mechanismen van PWN-infectie en/of PWD-progressie in vatbare gastheersoorten is gebaseerd op de gecontroleerde infectie van dennenzaailingen onder kasomstandigheden. Deze techniek is arbeidsintensief en mobiliseert aanzienlijke economische en menselijke hulpbronnen. Bovendien kan het vatbaar zijn voor variabiliteit die het gevolg is van de genetische diversiteit die verband houdt met sommige dennensoorten, maar ook van de interferentie van externe factoren. Als alternatief bieden in vitro co-culturen van dennen met PWN's een voordeliger systeem voor het bestuderen van biochemische veranderingen, omdat ze a) het mogelijk maken om afzonderlijke milieu- of voedingsvariabelen te beheersen, b) minder ruimte innemen, c) minder tijd nodig hebben om te verkrijgen, en d) vrij zijn van contaminatie of van genetische variatie van de gastheer. Het volgende protocol beschrijft de standaard in vivo PWN-infectie van Pinus pinaster, de zeeden, en de oprichting van de nieuwe in vitro co-culturen van dennenscheuten met het PWN als een verbeterde methodologie om deze invloed van fytoparasieten op vluchtige stoffen van dennen te bestuderen. PWN-geïnduceerde vluchtige stoffen worden geëxtraheerd uit in vivo en in vitro geïnfecteerde dennen door hydrodistillatie en destillatie-extractie, en de uitgestoten vluchtige stoffen worden opgevangen door vastefase-micro-extractie (SPME), met behulp van vezel- of verpakte kolomtechnieken.

Inleiding

Het dennenaaltje ( PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, is een plantparasitair aaltje dat voornamelijk parasiteert op Pinus-soorten . Deze fytoparasiet wordt door insecten van het geslacht Monochamus overgebracht naar bomen van vatbare dennensoorten tijdens de rijping van het insect. Het PWN doodt de boom door zijn harskanalen aan te vallen en de harsstroom te verminderen, en door zijn vaatweefsel te beschadigen, waardoor onderbrekingen in de waterkolom ontstaan. Gebrek aan water in het bladerdak van de boom veroorzaakt de eerste zichtbare symptomen van dennenverwelkingsziekte (PWD), d.w.z. de dennennaalden worden chlorotisch na het stoppen van de fotosynthese en hangen als gevolg van uitdroging. Dennen reageren over het algemeen op biotische en abiotische stress door de productie van hars en vluchtige stoffen1. Het begrijpen van de mechanismen van de verdediging van dennen is dus belangrijk om de specifieke effecten van PWN-aanvallen te bepalen en om alternatieve methoden voor ongediertebestrijding te vinden2.

Momenteel zijn experimenten onder veldomstandigheden afhankelijk van de beschikbaarheid van geïnfecteerde dennen, de bevestiging van PWN-infectie en variabele omgevingsomstandigheden. Onder kasomstandigheden kunnen deze parameters gemakkelijker worden gecontroleerd; De genetische diversiteit van de gastheer wordt echter een sterke bron van variabiliteit3. In een onderzoek naar de resistentierespons van Pinus pinaster werd bijvoorbeeld de aanmaak van het terpeen limoneen en harszuren in verband gebracht met een PWN-infectie4. Vanwege het kleine aantal monsters en de variabiliteit van de natuurlijke omstandigheden werden echter slechts voor de helft van de monsters waarneembare veranderingen geregistreerd. In een ander onderzoek met in de kas gekweekte dennenzaailingen, hoewel de omgevingsomstandigheden gemakkelijker konden worden gecontroleerd, veroorzaakte de natuurlijke genetische diversiteit van dennen een grote variabiliteit in de geëxtraheerde vluchtige stoffen5. Aangezien door ziekte veroorzaakte vluchtige dennen sterk kunnen worden beïnvloed door omgevings- en genetische variatie, is het gebruik van in vitro schietculturen een goed alternatief voor studies naar de chemische en biochemische respons van dennenweefsel op PWN-infectie 5,6. Door een plantengenotype in vitro te vermeerderen, kan de genetische samenstelling ervan voor onbepaalde tijd worden behouden en gekloond, wat leidt tot de vestiging van een groter aantal genetisch identieke individuen in minder ruimte en in minder tijd dan in vivo-omstandigheden. Deze culturen zijn een eenvoudig werkend systeem onder gemakkelijk te manipuleren voedings- en omgevingsomstandigheden, dus ze bieden extra voordelen ten opzichte van conventionele systemen bij de evaluatie van de productie en emissie van vluchtige stoffen 7,8. Deze systemen zijn vooral voordelig voor onderzoek naar houtachtige soorten, die meestal aanzienlijke middelen vereisen, d.w.z. doelbomen bevinden zich soms op moeilijk bereikbare locaties, vereisen dure apparatuur, een toegewijd personeelsbestand en langere perioden van analyse8. In vitro maken co-culturen van dennen met het PWN het mogelijk om metabole interacties tussen de nematode en de plant in verschillende stadia te beoordelen9. Voor de analyse van vluchtige stoffen is dit erg belangrijk, aangezien profileringstechnieken zeer nauwkeurig zijn geworden en minieme variaties in de bemonstering kunnen leiden tot substantiële veranderingen in vluchtige profielen. Gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie (GC-MS) is een krachtige techniek voor de analyse van vluchtige stoffen en maakt een snelle en gestroomlijnde profilering van vluchtige stoffen mogelijk10. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft technieken voor het infecteren van in vivo dennenzaailingen onder kasomstandigheden en in vitro schietculturen van genetisch identieke dennen die zijn geoptimaliseerd voor de extractie en profilering van geïnduceerde vluchtige stoffen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. In vitro dennenhoutaaltje kweken

OPMERKING: Dennenhoutaaltjes worden gekweekt door zich te voeden met het schimmelmycelium van een niet-sporulerende stam van Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel11.

  1. Breng voor routinematige subcultuur een kweekprop (0,5 cm diameter) van de buitenste rand van de schimmelkolonie over op een bord met steriele aardappeldextrose-agar (PDA) en houd deze 7 tot 10 dagen op 25 ± 1 °C, of totdat de schimmelkolonie de rand van de plaat bereikt.
    OPMERKING: Andere soorten algemeen schimmelgroeimedium kunnen worden gebruikt voor schimmelgroei.
  2. Om grotere hoeveelheden PWN's te verkrijgen, gebruikt u B. cinerea die in vitro is gekweekt op met stoom gesteriliseerde, gehydrateerde, gecertificeerde biologische gerstkorrels (Hordeum vulgare L.). Voeg 15 g ontbijtgranen toe aan 15 ml ultrapuur water, in afgedekte erlenmeyers van 250 ml met wijde hals en steriliseer. Enoculeer vervolgens met een B. cinerea-cultuurplug en bewaar op 25 ± 1 °C gedurende 7 tot 10 dagen of totdat het oppervlak van het graan volledig is gekoloniseerd12.
    OPMERKING: Nematoden voor onderzoeksdoeleinden kunnen worden aangevraagd bij nationale referentielaboratoria voor plantparasitaire nematoden.
  3. Start PWN-culturen door B. cinerea in vitro culturen te inoculeren met een PWN-waterige suspensie (met minimaal 20 mannetjes en 30 vrouwtjes) en houd deze in het donker onder de eerder beschreven omstandigheden gedurende 7 tot 10 dagen of totdat de schimmelkolonie volledig is geconsumeerd en de PWN-populatie de wanden van de plaat of kolf begint te beklimmen (Figuur 1). Sluit de platen of kolven af met plastic folie om uitdroging te voorkomen.
    OPMERKING: Vrouwtjes kunnen worden onderscheiden door de vulvaflap, lange post-uteriene zak en een over het algemeen rond staarteindpunt; Mannetjes hebben een ventaal gebogen puntige staart met karakteristieke spicules13. Bij het pipetteren van PWN-suspensies moet u de schimmelkolonie strelen zodat de gepipeteerde suspensie geen druppeltjes op het schimmeloppervlak vormt, waardoor de PWN's door de oppervlaktespanning worden opgesloten.
  4. Isoleer PWN's door de wanden van de kolf af te spoelen met kraanwater, de inhoud op een papieren handdoek in een Baermann-trechter of -bak te gieten en onder te dompelen in water14. Na 24 tot 48 uur zouden de levende nematoden van het besmette materiaal in het water zijn overgebracht. Recupereer ze door ze te zeven met een zeef van 38 μm15. Was de opgehoopte PWN's in een bak met kraanwater.
    OPMERKING: Al het materiaal dat in contact komt met het dennenaaltje moet op de juiste manier worden ontsmet, aangezien het een quarantaineorganisme is; Onderdompeling in ethanol gedurende 10 tot 20 minuten is meestal voldoende. Afgekeurde waterige suspensies moeten worden gesteriliseerd of gedurende ten minste 35 minuten tot 60 °C worden verwarmd.
  5. Gebruik de waterige suspensie met de PWN's onmiddellijk of bewaar deze bij 11 °C voor een langere bewaarperiode (maximaal 2 maanden).

2. Steriliseren van gemengde dennenhoutaaltjes in de levensfase

  1. Pipetteer in een flowkap een hoeveelheid PWN-suspensie met ongeveer 5000 PWN's in een steriele zeef van 38 μm en was deze met steriel water.
    OPMERKING: Tel nematoden onder een binoculaire microscoop (40x).
  2. Dompel de onderste helft van de zeef met de PWN's onder in een oplossing van 20% waterstofperoxide (H2O2) en meng handmatig gedurende 15 minuten.
  3. Was de steriele PWN's door steriel water door de zeef te doseren. Herhaal deze stap 3x. Kantel bij de laatste wasbeurt de zeef zodat PWN's zich verzamelen bij de zeefrand. Recupereer de steriele nematodensuspensie door 1 ml steriel water in de zeefrand te pipetteren en bewaar bij 11 °C of gebruik het onmiddellijk.
    OPMERKING: Het succes van de sterilisatie kan worden beoordeeld door een aliquot van 100 μL van de PWN-suspensie in een PDA-medium te plateren en gedurende ongeveer 1 week regelmatig te controleren op verontreinigingen.

3. Infectie van in vivo Pinus pinaster zaailingen

OPMERKING: Inoculatieproeven worden uitgevoerd in ≥ 2-jarige P. pinaster-zaailingen . Bomen kunnen worden gekocht bij gecertificeerde commerciële retailers, maar kunnen ook in een kas worden gekweekt uit gecertificeerde zaden.

  1. Verkrijg PWN-inoculum zoals beschreven in stap 1 en stel suspensies van gemengde PWN's in de levensfase in op 1000 PWN's/ml door water aan de suspensie toe te voegen of te wachten tot de nematoden zijn bezonken (ca. 60 min) en het volume te verlagen door het oppervlaktewater te decanteren. Voer de telling uit bij kamertemperatuur in een concaaf objectglaasje onder de binoculaire microscoop op 40x.
  2. Om met de inoculatie te beginnen, verwijdert u handmatig de naalden uit een gedeelte onder de bovenste 5 cm van de dennenstam en maakt u een oppervlakkige incisie in de lengterichting (0,5 tot 1 cm lengte) met een gesteriliseerde scalpel16.
    OPMERKING: De incisie wordt uitgevoerd om de nematode toegang te geven tot de binnenste dennenweefsels.
  3. Plaats bij de wondzone een stuk gesteriliseerd katoen om 0,5 ml van de gepipeteerde PWN-suspensie vast te houden en bevestig het met een transparante strip om de vochtigheid op peil te houden.
    LET OP: Meng de PWN-suspensie krachtig tussen elke inoculatie, omdat nematoden snel zullen bezinken. Als de suspensie op de inoculatieplaats droogt, kan nematodeninfectie niet succesvol zijn, dus bedek het vochtige katoen voldoende.
  4. Vervang voor de bestrijding van dennen de PWN-suspensie door steriel water.
  5. Volg de progressie van PWD regelmatig en scoor symptomatologie door het percentage verkleurde en verwelkte naalden te kwantificeren. Scoor 0 voor geen uitwendige symptomen, 1 voor maximaal 25% naaldverkleuring, 2 voor 25% tot 50% naaldverkleuring, 3 voor 50% tot 75% naaldverkleuring en 4 voor dennen met volledig bruine naalden (Figuur 2).
  6. Onderhoud de kas in vochtige omstandigheden (60%-80%) en geef regelmatig water (houd het maximale watervasthoudend vermogen van de grond op 70% van de grond), vermijd extreme temperaturen, aangezien nematoden metabolisch inactief worden onder 10 °C en de ontwikkeling kan worden beïnvloed boven 30 °C.
  7. Oogst 20 dagen na inoculatie plantaardig materiaal voor de extractie van vluchtige stoffen door de zaailingen aan de basis van de stengel af te snijden en in te vriezen (-20 °C) in bruine papieren zakken. Voor uitgestoten vluchtige stoffen (SMPE-vezels of verpakte buizen) moet u de dennenzaailingen onmiddellijk bemonsteren bij kamertemperatuur 5,17.

4. Vestiging en infectie van in vitro culturen van dennenscheuten

  1. Vóór sterilisatie van het oppervlak, was gecertificeerde P. pinaster-zaden in stromend kraanwater om het grootste vuil te verwijderen, en vervolgens met een gewone wasmiddeloplossing (1 druppel per 40 ml water), met krachtig schudden, om het fijnere vuil te wassen.
  2. Begin in een stroomkap met de sterilisatie van het zaadoppervlak door een in de handel verkrijgbare bleekoplossing toe te voegen (1:4, in de handel verkrijgbare bleekmiddel in kraanwater) totdat de gewassen zaden bedekt zijn en meng krachtig gedurende 15 minuten. Gooi de bleekoplossing weg en spoel de zaden 3x af met gesteriliseerd kraanwater.
  3. Dompel de zaden 15 minuten onder in een ethanoloplossing (80%, v/v) met krachtig roeren, gooi de ethanol weg en was 3x met gesteriliseerd ultrapuur water.
  4. Voor het ontkiemen van dennen breekt u de gesteriliseerde zaadhuiden met een steriele mechanische draaibank in een doorstroomkap, isoleert u de pijnboompitten en plaatst u ze in een gesloten container met gesteriliseerd nat filtreerpapier om de pijnboompitten een nacht te hydrateren6.
  5. Stratificeer gehydrateerde pijnboompitten bij 4 °C gedurende 7 dagen, om de kiemrust te doorbreken en de kieming te synchroniseren, en bewaar ze vervolgens in het donker bij 25 °C tot ze ontkiemen.
    OPMERKING: De stratificatiestap is optioneel.
  6. Breng de aseptisch ontkiemde dennen in de gesloten container over naar een 16 uur durende lichtfotoperiode bij 24 °C/ 18 °C thermoperiode en houd ze 2 weken vast of totdat de hoofdstam zich begint te ontwikkelen.
  7. Snijd in de stroomkap het bovengrondse gedeelte van de zaailing boven de wortel af met een scalpel en breng het over naar gesteriliseerd Schenk en Hildebrandt (SH)18 kweekmedium (pH = 5,8) aangevuld met 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 0,5 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP, een cytokinine) en 0,1 mg/l indol-3-boterzuur (IBA, een auxine)6, om microscheutvermenigvuldiging te induceren. Bewaar de culturen onder de hierboven beschreven omstandigheden in een in vitro kweekkamer.
  8. In de stroomkap subcultuur periodiek (ongeveer 4 weken) door het eeltweefsel aan de basis van de scheut (gedeelte dat in contact komt met het kweekmedium) af te snijden met een steriel scalpel en de scheutcluster met een steriel pincet over te brengen naar een vers vermenigvuldigingscultuurmedium.
  9. Voor de verlenging van de microsteel brengt u de microscheuten over naar het hierboven beschreven SH-kweekmedium, maar met 3 g/l actieve kool in plaats van fytohormonen.
    OPMERKING: Actieve kool adsorbeert giftige stoffen en voorkomt overmatige ophoping van geïnduceerde fytohormonen op het in plakjes gesneden weefsel19.
  10. Breng voor PWN-infectie langwerpige scheuten over naar SH-kweekmedium zonder fytohormonen of actieve kool en voeg 100-150 gemengde gesteriliseerde PWN's toe aan de onderkant van de microscheut. Blijf in de hierboven beschreven omstandigheden totdat de symptomen van PWD merkbaar beginnen te worden (Figuur 3)6.
  11. Om plantaardig materiaal te oogsten voor de extractie van vluchtige stoffen, gebruik in vitro explantaten onmiddellijk of vries het in (-20 °C) tot analyse. Voor uitgestoten vluchtige stoffen (SMPE-vezels of verpakte buizen) analyseert u microshoot-dozen onmiddellijk.

5. Isolatie van vluchtige stoffen

OPMERKING: Isolatie van vluchtige stoffen kan worden uitgevoerd door middel van verschillende technieken. Hier wordt vluchtige extractie gedaan door hydrodestillatie, met behulp van een Clevenger-apparaat20, destillatie-extractie met behulp van een Likens-Nickerson-apparaat21 en het opvangen van vluchtige stoffen in de hoofdruimte door middel van vastefase-micro-extractie (SPME) met behulp van gecoate vezels of verpakte buizen (poreus polymeersorptiemiddel)22.

  1. Hydrodistillatie
    1. Gebruik een Clevenger-apparaat voor de isolatie van etherische oliën. Het destillatiesysteem bestaat uit a) het Clevenger-apparaat, b) een kolf met ronde bodem of een erlenmeyer om water en het dennenmateriaal vast te houden, c) geschikte verwarmingsapparatuur en d) een steunframe om het systeem op zijn plaats te houden (figuur 4A).
    2. Reinig het glaswerk grondig voor gebruik. Gebruik laboratoriumframeklemmen om het Clevenger-apparaat aan het roosterframe te bevestigen. Koel de systeemcondensor door water te laten circuleren of gebruik een gekoelde circulatiepomp, indien beschikbaar.
    3. Registreer het gewicht van de dennenscheut en plaats het in de rondbodemkolf of erlenmeyer. Pas de hoeveelheid water aan om ervoor te zorgen dat de container niet meer dan halfvol is.
    4. Plaats de verwarmingsapparatuur onder de kolf, controleer of er geen lekken zijn en zorg ervoor dat alle onderdelen van het systeem zich in de juiste positie bevinden en aan het steunframe zijn bevestigd.
      NOTITIE: De geslepen glazen verbindingsdelen van de Clevenger en de kolf moeten grondig worden gereinigd, ontvet en gedroogd voordat ze worden aangesloten. Gebruik hiervoor een stuk filtreerpapier dat licht is bevochtigd met aceton. Vet mag in deze onderdelen niet worden gebruikt.
    5. Breng water door de vultrechter, die zich in de diagonale retourbuis in het middelste deel van het Clevenger-apparaat bevindt. Stel de positie van de driewegkraan zo af dat het water gelijkmatig in de twee buizen (de diagonale en de gegradueerde buis) stroomt totdat de kolf wordt gevuld, net voordat het van de diagonale retourbuis erin stroomt (zie afbeelding 4).
    6. Zet de warmtebron aan en stel deze in om het water aan de kook te brengen met een destillatiesnelheid van 2 - 3 ml/min.
    7. Start de destillatietijd wanneer de eerste druppel gedestilleerd water in de gegradueerde buis aan de rechterkant van het Clevenger-apparaat valt. De gemiddelde distillatietijd is 3 uuren 23 uur, maar kortere of langere distillatieperioden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de specifieke vereisten. Etherische oliën zitten meestal in de bovenliggende vloeistof, omdat ze meestal lichter zijn dan het gedestilleerde aromatische water eronder (hydrolaat).
      LET OP: Wanneer de destillatie in werking is, zal het Clevenger-apparaat heet aanvoelen.
    8. Zodra de destillatietijd voorbij is, stopt u het vuur en laat u het ongeveer 10 minuten staan om het destilleren en koken te laten stoppen. Draai na 10 minuten de kraan met de klok mee open om het hydrolaat eruit te laten stromen totdat de etherische olie het gegradueerde deel bereikt. Lees het volume van de geïsoleerde etherische olie af. Bereken de opbrengst als ml/g (vers of droog gewicht), uitgedrukt als een percentage (%, v/w).
    9. In het geval van etherische oliën met een volume van minder dan 0,05 ml, de laagste schaalverdeling in de gegradueerde buis, kan het rendement niet worden bepaald. Om de etherische olie terug te winnen, gebruikt u gedistilleerd n-pentaan om het Clevenger-apparaat te spoelen.
    10. Om de etherische olie terug te winnen met behulp van gedistilleerd n-pentaan, wacht u na de destillatie ongeveer 10 tot 15 minuten en opent u de driewegkraan tegen de klok in, zodat het hydrolaat uit de diagonale retourbuis stroomt tot net onder de vultrechter. Introduceer met een schone druppelaar gedistilleerd n-pentaan in de vultrechter tot aan de linkerbovenzijde van de diagonale retourbuis. Raak de vultrechter niet aan om kruisbesmetting te voorkomen.
    11. Breng met een wasfles met gedestilleerd water water in de vultrechter. n-Pentaan stroomt naar de destillatiekolf en verdampt met de restwarmte van het afkookwater. Op deze manier gaat het door het systeem, lost het op en sleept het de vluchtige stoffen naar het oppervlak van het hydrolaat, in de gegradueerde buis. Open de driewegkraan met de klok mee naar de normale positie.
    12. Ga te werk zoals in 5.1.8. om de etherische olie opgelost in n-pentaan op te vangen.
    13. Concentreer het mengsel van etherische olie en n-pentaan tot een minimumvolume van ongeveer 100 μL bij kamertemperatuur onder stikstofflux met behulp van een spuiverdampersysteem. Houd het op -20 °C tot analyse.
      OPMERKING: Concentreer u niet tot ze droog zijn om verlies van vluchtige stoffen te voorkomen.
  2. Destillatie-extractie
    1. Gebruik het Likens-Nickerson-apparaat om vluchtige stoffen uit planten te extraheren. Het destillatie-extractiesysteem bestaat uit a) het Likens-Nickerson-apparaat, b) een kolf met ronde bodem voor het vasthouden van water en het dennenmateriaal (rechterarm van de destillatie-eenheid), en een ander voor het bevatten van een niet-mengbaar organisch oplosmiddel, zoals gedistilleerd n-pentaan (linkerarm van de destillatie-eenheid), c) twee geschikte verwarmingsapparaten, d) een condensor, en e) een steunframe om het systeem vast te houden (Figuur 4B).
      OPMERKING: Gebruik in het laboratorium gedistilleerd n-pentaan om besmetting van het monster met stabilisatoren met oplosmiddel te voorkomen.
    2. Begin met het circuleren van water in de beveiligde condensor of gebruik een gekoelde circulatiepomp indien beschikbaar.
    3. Gebruik klemmen van het laboratoriumframe om de destillatie-extractie-eenheid aan het roosterframe te bevestigen. Vul de kolf met ronde bodem met het te extraoverheersen dennenmateriaal en voeg water toe tot de halfvolle capaciteit. De kleinere kolf van 100 ml met ronde bodem moet halfvol zijn met gedistilleerd n-pentaan.
      NOTITIE: Voorafgaand aan het aansluiten moeten de geslepen glazen verbindingsdelen van de glascomponenten goed worden gereinigd, ontvet en gedroogd. Een stuk filtreerpapier dat kort nat is gemaakt met aceton kan worden gebruikt voor het schoonmaken.
    4. Plaats de verwarmingsmantels onder elke kolf. Controleer of er geen lekken zijn en of elk onderdeel van het systeem correct is gepositioneerd en bevestigd aan het roosterframe van het laboratorium. Zet de warmtebronnen aan en stel ze in op hun respectievelijke kookpunten. Water moet koken met een destillatiesnelheid van 2-3 ml/min.
      LET OP: Tijdens het proces van destillatie-extractie zal het Likens-Nickerson-apparaat heet aanvoelen.
    5. Zodra de destillatietijd voorbij is, stopt u de verwarming van de kolf met dennenmateriaal en laat u n-pentaan alleen destilleren gedurende 10 minuten. Nadat n-pentaan is veranderd in een transparante vloeistof, stopt u de verwarming en laat u deze ongeveer 10 minuten staan. De kleurverandering geeft aan dat er nu destillaat in de kolf zit met n-pentaan.
    6. Concentreer het n-pentaanextract onder verminderde druk (70 - 73 mmHg) op een roterende verdamper bij kamertemperatuur. Breng het gedeeltelijk geconcentreerde extract over in een injectieflacon en concentreer het tot ≈100 μl onder een stroom stikstof in een spuiverdamper bij kamertemperatuur. Bewaar de monsters na extractie bij -20 °C tot de analyse.
      OPMERKING: Het extract mag niet worden geconcentreerd tot het droog is, omdat dit verlies van vluchtige stoffen veroorzaakt.
  3. Headspace-bemonstering met een gecoate vezel
    1. De opstelling van micro-extractie in vaste fase (SPME) omvat a) een handmatig bediende SPME-houder, b) gecoate vezel en c) een geschikte standaard om de SPME-houder te ondersteunen (Figuur 4C). Gebruik voor het huidige protocol een handmatig SPME-headspace-systeem in de flacon met 100 μM polydimethylsiloxaan (PDMS) gecoate vezel voor het opvangen van vluchtige stoffen.
      OPMERKING: Andere in de handel verkrijgbare vezels hebben coatings met verschillende chemische eigenschappen en moeten worden gekozen op basis van het gewenste effect.
    2. Conditioneer elke SPME-vezel thermisch gedurende maximaal 20 minuten bij 250 °C voor gebruik, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    3. Plaats het grenen materiaal, of het grenen deel, in een doorzichtige glazen injectieflacon en sluit deze af met een schroefdop met een polytetrafluorethyleen (PTFE) voering (septum). Het materiaal moet zich ten minste 2 tot 3 cm van de bovenkant van de injectieflacon bevinden, zodat de vezel het monster niet raakt.
    4. Voer tegelijkertijd controle-experimenten uit met SPME-vezels door lege injectieflacons te bemonsteren om systeemverontreinigingen te identificeren of om de afwezigheid van overdracht door herhaald gebruik van de SPME-vezels te bevestigen.
    5. Bewaar het dennenmateriaal 1 uur in de injectieflacon voordat u vluchtige stoffen verzamelt voor een evenwicht in de atmosfeer.
      OPMERKING: Assays met SPME kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of bij een instelbare temperatuur door de injectieflacons in een steunrek te plaatsen en ze in een Bain Marie-bad te plaatsen.
    6. Pas de diepte van de septumpiercingnaald van de SPME-houder aan om het septum te doorboren, maar niet om in contact te komen met het materiaal wanneer de vezel wordt blootgesteld.
    7. Terwijl de vezel is teruggetrokken, steekt u de houdernaald door de PTFE-voering. Duw de zuiger naar beneden om de vezel bloot te leggen. Draai de zuiger met de klok mee en houd de bevestigingsschroef aan de horizontale linkerkant van de Z-sleuf24 vast. Stel de vezel 1 uur bloot.
    8. Trek de vezel in door de zuiger tegen de klok in te draaien totdat de zuiger de bovenkant van de Z-sleuf bereikt. De verzamelde vluchtige stoffen zijn nu klaar voor directe GC- en/of GC-MS-analyse.
      OPMERKING: Indien nodig kunnen vezels vóór analyse bij kamertemperatuur worden bewaard, maar niet langer dan een week.
  4. Headspace trapping met verpakte buizen
    1. Bereid een opstelling voor voor het opvangen van vluchtige stoffen in de vrije ruimte met verpakte roestvrijstalen sifons bestaande uit a) een massastroompompsysteem, b) PTFE-slangen, c) luchtfilters met actieve kool, d) met poreuze hars verpakte buizen met polymeer en e) glaswerk of polyethyleentereftalaat (PET) zakken (kookzakken) (Figuur 4D)25.
    2. Bewaar dennenmateriaal in afgedekt glaswerk of in PET-zakken om vluchtige stoffen in de vrije ruimte te verzamelen.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat vluchtige stoffen uit gewoon plastic overvloedig aanwezig zijn en in grote hoeveelheden kunnen worden gedetecteerd via GC-MS.
    3. Voor een gesloten lussysteem sluit u het circuit als volgt aan: a) de pompuitlaat op de PTFE-slang, b) de PTFE-slang op actieve koolluchtfilters, c) van de luchtfilters op extra slangen die zijn aangesloten op het glaswerk of de PET-zakken met het grenenmateriaal, d) de verpakte buis op de glaswerk- of PET-zakuitlaat, e) extra PTFE-slangen van de roestvrijstalen slanguitlaat naar de inlaat van de massastroompomp22.
      OPMERKING: Poreuze polymeer verpakte roestvrijstalen buizen moeten thermisch worden geconditioneerd in de thermische desorptie-eenheid volgens de aanbevelingen van de fabrikant, bijv. tot 15 minuten bij 100 °C, voor gebruik. Houd er rekening mee dat buizen een stroomrichting hebben die moet worden gerespecteerd.
    4. Verzamel vluchtige stoffen door 100 L gefilterde lucht door het grenen systeem te pompen met een snelheid van 0,6 L per minuut, waarbij de massastroompomp wordt gebruikt om de hoeveelheid en snelheid van gefilterde lucht te regelen.
      OPMERKING: De hoeveelheid en/of stroming van de headspace-lucht die door de kolom stroomt, kan van invloed zijn op de hoeveelheid ingesloten vluchtige stoffen en vervolgens op het verkregen chromatogram.
    5. Sluit na het verzamelen van vluchtige stoffen de verpakte buizen aan beide uiteinden af met luchtdichte opbergdoppen. Bewaar bij kamertemperatuur (maximaal 1 week) en analyseer zo snel mogelijk, aangezien vluchtige stoffen kunnen degraderen of ontsnappen.
    6. Spoel voor het wassen alle PTFE-slangen en glaswerk af met 70% ethanol en verwarm ze in een oven op 230 °C gedurende ten minste 2 uur25.

6. Analyse van vluchtige profielen

  1. Voer analyse uit van vluchtige profielen door middel van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), of routinematig door middel van gaschromatografie met vlamionisatiedetectie (GC-FID) voor kwantificering van eerder geïdentificeerde vluchtige stoffen.
    OPMERKING: De beschrijving van de analysemethoden door GC-FID en GC-MS is uitgebreid en valt buiten het doel van dit werk. De lezer wordt geadviseerd om procedures of normen in het laboratorium te gebruiken, zoals ISO 760926, die relevante bedrijfsomstandigheden bieden voor de kwantificering van individuele bestanddelen en literatuurgegevens over de vergelijking van twee analytische methoden27.
  2. Gebruik analyten die zuiver zijn of in een oplosmiddel worden gedragen, bijv. n-pentaan of n-hexaan, en rechtstreeks in een vezel worden geïnjecteerd of geadsorbeerd in een vezel, bijv. SPME en rechtstreeks in de chromatograafinjector worden gedesorbeerd of met behulp van een thermische desorptie-eenheid (TD) die is gekoppeld aan de GC-eenheid.
    OPMERKING: Ondanks hun grotere gevoeligheid, hogere resolutie en kortere analysetijd hebben capillaire kolommen een lage monstercapaciteit. Hoewel bijna alle bedrijfsomstandigheden vergelijkbaar kunnen zijn, kan het type analyt (puur, in oplosmiddel, SPME, enz.) verschillende split/split less injectieprocedures vereisen.
  3. Voer de identificatie van vluchtige componenten uit door hun retentie-indices, geëvalueerd in overeenstemming met ISO 7609, te vergelijken met GC-MS-spectra uit een bibliotheek die in het laboratorium is gemaakt met behulp van referentiemonsters waarvan de identiteit van de componenten is vastgesteld door RI, GC-MS en 13C-NMR, in het laboratorium gesynthetiseerde en geïsoleerde verbindingen en in de handel verkrijgbare normen, of, bij gebrek daaraan, in de handel verkrijgbare massaspectrabibliotheken.
  4. Druk de resultaten uit met behulp van een grafische weergave (chromatogram) en een chromatografisch profiel waarin de relatieve hoeveelheden van alle geïdentificeerde verbindingen in het monster worden vermeld, waarbij hun elutievolgorde wordt aangegeven door hun retentie-indices in de gebruikte geschikte kolom.
  5. Voer voor een groot aantal monsters een geschikte statistische analyse uit op basis van de chemische samenstelling voor de interpretatie van de monsterindeling (groeperingen en/of scheidingen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het PWN plant zich snel voort onder optimale omstandigheden, en de generatietijden kunnen zo laag zijn als 4 dagen, waarbij elk vrouwtje tijdens haar leven ongeveer 80 eieren legt28. Met behulp van de hierboven beschreven methodologie kunnen grote hoeveelheden PWN's worden verkregen, afhankelijk van de schimmelgroei. Binnen een groeiperiode van 8 dagen kunnen PWN's een 100-voudige toename van het aantal populaties hebben (figuur 1). O...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol schetst een verbeterde methodologie voor het analyseren van vluchtige stoffen in zeeden die zijn geïnfecteerd door het PWN, waarbij milieu- en genetische variabiliteit wordt verminderd en de resultaten niet worden beïnvloed. Met behulp van zuivere lijnen van in vitro genotypen van maritieme dennen kunnen geëxtraheerde en uitgestoten vluchtige stoffen worden geanalyseerd als reactie van de gastheer op een van de meest schadelijke biotische bedreig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door de EU in het kader van het PurPest-project via subsidieovereenkomst 101060634, en door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), via projecten NemACT, DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002; NemaWAARS, DOI 10.54499/PTDC/ASP-PLA/1108/2021; CESAM UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020; CE3C, DOI 10.54499/UIDB/00329/2020; GREEN-IT, DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 en 10.54499/UIDP/04551/2020.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
38 mesh test sieveRetsch60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)Duchefa BiochemieB0904
Charcoal activatedDuchefa BiochemieC1302
Clevenger apparatusWINZER Laborglastechnik25-000-02
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)Duchefa BiochemieI0902
Likens-Nickerson apparatusVitriLab LDA.c/IN29/32
Microbox round containersSac O2O118/80+OD118
n-PentaneSigma-Aldrich1.00882
PARAFILM M sealing filmBRANDHS234526B-1EA
Phyto agarDuchefa BiochemieP1003
Potato Dextrose AgarBD DIFCO213400
Scalpel blade no. 24Romed HollandBLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt mediumDuchefa BiochemieS0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixtureDuchefa BiochemieS0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)Supelco57300-U
SPME Fiber HolderSupelco57330-U
SucroseDuchefa BiochemieS0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + cappedMarkes InternationalC1-AAXX-5003

Referenties

  1. Back, M. A., Bonifácio, L., Inácio, M. L., Mota, M., Boa, E. Pine wilt disease: A global threat to forestry. Plant Pathol. 73 (5), 1026-1041 (2024).
  2. Mumm, R., Hilker, M. Direct and indirect chemical defence of pine against folivorous insects. Trend Plant Sci. 11 (7), 351-358 (2006).
  3. Carrasquinho, I., Lisboa, A., Inácio, M. L., Gonçalves, E. Genetic variation in susceptibility to pine wilt disease of maritime pine (Pinus pinaster Aiton) half-sib families. Annals Forest Sci. 75 (3), 85(2018).
  4. Gaspar, M. C., et al. Impact of the pinewood nematode on naturally-emitted volatiles and scCO2 extracts from Pinus pinaster branches: a comparison with P. pinea. J Supercritical Fluids. 159, 104784(2020).
  5. Rodrigues, A. M., et al. Pinus halepensis, Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus sylvestris essential oils chemotypes and monoterpene hydrocarbon enantiomers, before and after inoculation with the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Chem Biodiver. 14 (1), e1600153(2017).
  6. Faria, J. M. S., et al. In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).
  7. Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., García-Lara, S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta. 248 (1), 1-18 (2018).
  8. Bonga, J. M., von Aderkas, P. In Vitro Culture of Trees. , Springer. Netherlands, Dordrecht. (1992).
  9. Faria, J. M. S., et al. Nematotoxic and phytotoxic activity of Satureja montana and Ruta graveolens essential oils on Pinus pinaster shoot cultures and P. pinaster with Bursaphelenchus xylophilus in vitro co-cultures. Indus Crops Prod. 77, 59-65 (2015).
  10. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabol. Meth Mol Biol. , 225-239 (2018).
  11. Kikuchi, T., Aikawa, T., Oeda, Y., Karim, N., Kanzaki, N. A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 99 (12), 1365-1369 (2009).
  12. Faria, J. M. S., Barbosa, P., Bennett, R. N., Mota, M., Figueiredo, A. C. Bioactivity against Bursaphelenchus xylophilus: Nematotoxics from essential oils, essential oils fractions and decoction waters. Phytochemistry. 94, 220-228 (2013).
  13. Nickle, W. R., Golden, A. M., Mamiya, Y., Wergin, W. P. On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner &Buhrer 1934) Nickle 1970. J Nematol. 13 (3), 385-392 (1981).
  14. Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: baermann funnel modifications. J Nematol. 15 (3), 438-444 (1983).
  15. IPPC. IPPC DP 10: Bursaphelenchus xylophilus. Diagnostic protocols, International standard for phytosanitary measures. 27, 1-40 (2016).
  16. Rodrigues, A. M., Carrasquinho, I., António, C. Primary metabolite adjustments associated with pinewood nematode Resistance in Pinus pinaster. Front Plant Sci. 12, 10(2021).
  17. Gonçalves, E., et al. Effect of Monochamus galloprovincialis feeding on Pinus pinaster and Pinus pinea, oleoresin and insect volatiles. Phytochemistry. 169, September 2019 112159(2020).
  18. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).
  19. Tereso, S., et al. Improved axillary and adventitious bud regeneration from Portuguese genotypes of Pinus pinaster AIT. Propag Ornam Plants. 6 (1), 24-33 (2006).
  20. Council of Europe European Directorate for the Quality of Medicines. European Pharmacopoeia. , 241(2010).
  21. Likens, S. T., Nickerson, G. B. Detection of certain hop oil constituents in brewing products. Proc Ann Meet - Am Soc Brewing Chem. 22 (1), 5-13 (1964).
  22. Karimi, A., Gross, J. Development and validation of an innovative headspace collection technique: volatile organic compound patterns emitted by different developmental stages of Halyomorpha halys. Front Horti. 3, (2024).
  23. Koedam, A., Scheffer, J. J. C., Baerheim Svendsen, A. Comparison of isolation procedures for essential oils - II. Ajowan, Caraway, Coriander and Cumin. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. 168 (2), 106-111 (1979).
  24. Abdulra'uf, L. B., Hammed, W. A., Tan, G. H. SPME fibers for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables: A review. Crit Rev Anal Chem. 42 (2), 152-161 (2012).
  25. Gross, J., Gallinger, J., Rid, M. Collection, identification, and statistical analysis of volatile organic compound patterns emitted by phytoplasma infected plants. Methods Mol Biol. 1875, 333-343 (2019).
  26. ISO. ISO 7609:1985 Essential Oils-Analysis by Gas Chromatography on Capillary Columns-General Method. ISO: Geneva, Switzerland. , (1985).
  27. Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C. Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review. Flav Fragr J. 25 (5), 282-290 (2010).
  28. Fielding, N. J., Evans, H. F. The pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) nickle (= B. lignicolus Mamiya and Kiyohara): An assessment of the current position. Forestry. 69 (1), 34-46 (1996).
  29. Faria, J. M. S., et al. First report on the synergistic interaction between essential oils against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Plants. 12 (13), 2438(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Dennenverwelkingsziektein vitro co-cultuurin vivo infectiePinus pinastervluchtige extractiehydrodistillatievaste-fase micro-extractieheadspace-techniekenisolatie van nematoden
Infectie van in vivo en in vitro dennen met de dennenhoutnematode Bursaphelenchus xylophilus en isolatie van geïnduceerde vluchtige stoffen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.