Methodenartikel

Identificatie van EcoHIV-geïnfecteerde cellen in microglia-gemanipuleerde transgene muizen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67150

⸱

20 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cognitive and Neural Sciences, Department of Psychology, University of South Carolina, 2Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe de combinatie van EcoHIV-infectie met Tmem119-EGFP-muizen een waardevol biologisch systeem biedt voor het onderzoeken van microgliale veranderingen en virale reservoirs in knaagdiermodellen van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen.

Samenvatting

Gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) heeft de kwaliteit van leven van mensen met hiv (PLWH) drastisch verbeterd. Meer dan 4 miljoen mensen met een handicap zijn echter ouder dan vijftig jaar en ervaren begeleidende hiv-geassocieerde neurocognitieve stoornissen (HAND). Om te begrijpen hoe hiv het centrale zenuwstelsel beïnvloedt, is een betrouwbaar en haalbaar model van hiv noodzakelijk. Eerder werd een nieuw biologisch systeem ontwikkeld met behulp van chimere HIV (EcoHIV) inoculatie in een rattenmodel om neurocognitieve stoornissen en synaptische disfunctie te onderzoeken. Desalniettemin blijft er een belangrijke uitdaging om de neuroanatomische verdeling van EcoHIV te verduidelijken, met name de differentiële expressie in verschillende celtypen in de hersenen. In de huidige studie werd EcoHIV met mScarlet-fluorescentielabeling gemodificeerd en retro-orbitaal geïnjecteerd in Tmem119-EGFP knock-in-muizen (die verbeterd groen fluorescentie-eiwit voornamelijk in microglia tot expressie brengen) om te bepalen of microglia het belangrijkste celtype zijn dat verantwoordelijk is voor virale expressie en reservoirs van HIV in de hersenen. De huidige gegevens tonen aan dat: (1) in vitro EcoHIV-mScarlet fluorescentiesignalen voornamelijk gelokaliseerd waren in microglia-achtige cellen tussen primaire hersencellen van knaagdieren; (2) in vivo induceerde injectie van EcoHIV-mScarlet in Tmem119-EGFP-muizen significante HIV-expressie in de hersenen van muizen. De co-lokalisatie van mScarlet- en EGFP-signalen suggereert dat microglia het belangrijkste celtype zijn dat HIV in de hersenen herbergt. Over het algemeen biedt EcoHIV bij knaagdieren een waardevol biologisch systeem om microgliale veranderingen, virale reservoirs in de hersenen en de neurologische mechanismen van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen te bestuderen.

Inleiding

Ondanks de grote voordelen van antiretrovirale therapie, ervaren mensen met hiv (PLWH) nog steeds neurocognitieve stoornissen. Om de neuronale mechanismen van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornis (HAND) beter te begrijpen, is er een cruciale behoefte aan HIV-modellen om de specifieke betrokkenheid van het celtype bij NeuroHIV verder op te helderen.

De HIV-1 transgene rat, die constitutieve blootstelling heeft aan HIV-1 virale eiwitten, is een populair knaagdiermodel dat wordt gebruikt om neurocognitieve stoornissen 1,2,3,4 en neuroanatomische veranderingen 5,6,7 geassocieerd met HAND te onderzoeken. De functionele deletie van de gag- en pol-domeinen voorkomt virale replicatie, waardoor de HIV-1 transgene rat niet-infectieus wordt 8,9. Onlangs werd een chimeer HIV (EcoHIV) infectiemodel bij muizen aanvankelijk gerapporteerd door Potash et al.10 en later uitgebreid naar ratten, wat nuttig kan zijn voor verder onderzoek naar HAND- en middelengebruiksstoornissen11. In dit nieuwe biologische systeem werd systemische HIV-1-infectie waargenomen samen met vele klinische kenmerken van HIV-1 bij mensen, waaronder betrokkenheid van lymfocyten en macrofagen, antivirale immuunresponsen, neuro-invasiviteit en hersenontsteking.

Microglia spelen een cruciale rol als gespecialiseerde macrofagen in de hersenen bij het handhaven van de hersenfunctie en homeostase. Om microglia te onderscheiden van nauw verwante celtypen (bijv. Bloedmonocyten, perivasculaire macrofagen, meningeale macrofagen), gebruikte de huidige studie de Tmem119-EGFP knock-in muislijn. Eerdere studies hebben gemeld dat transmembraaneiwit 119 (Tmem119) een uitsluitend microglia-specifiek expressiepatroon vertoont in knaagdier- en menselijk hersenweefsel 12,13,14,15. Het EGFP-signaal in Tmem119-EGFP knock-in muizen werd door de hele hersenen waargenomen en specifiek gelokaliseerd in microgliale cellen.

In de huidige studie werden Tmem119-EGFP knock-in muizen geïnoculeerd met het EcoHIV-mScarlet-virus en werden cellen geïdentificeerd die positief waren voor EcoHIV in het centrale zenuwstelsel. Hier presenteren we een protocol voor EcoHIV-mScarlet-inoculatie bij Tmem119-EGFP knock-in muizen, dat een betrouwbaar model biedt voor het therapeutisch aanpakken van microgliale veranderingen bij HIV.

Protocol

Het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina heeft alle dierprotocollen goedgekeurd (federaal garantienummer: D16-00028). Alle experimenten volgden strikt de richtlijnen die zijn opgesteld door de National Institutes of Health in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Tmem119-EGFP knock-in muizen (30 dagen oud, mannetje, 23-26 g lichaamsgewicht) werden verkregen uit een commerciële bron en gehuisvest in AAALAC-geaccrediteerde faciliteiten. Alle dieren werden gehuisvest onder een licht-donkercyclus van 12/12 uur met vrije toegang tot voedsel en water. De details van de dieren, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. EcoHIV-mScarlet verpakking in 293FT cellen

  1. Incubeer de 293 FT-cellen in een met gelatine voorgecoate kolf van 75 cm2 . Houd cellen die tot 30% confluent bij transfectie groeien.
  2. Voer de transfectie van plasmide-DNA (15 μg) van EcoHIV-mScarlet (aanvullend bestand 1) uit met behulp van Lipofectamine 3000 (22,5 μL) volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaalopgave).
  3. Kweek de cellen in DMEM-medium met 10% FBS-serum gedurende 3 dagen bij 37 °C.
  4. Verzamel het voorwaardelijke medium met virale suspensie. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Breng het bovenstaande met een pipet van 10 ml over in een steriel buisje van 50 ml.
  5. Voeg een bepaalde hoeveelheid Lenti-x-concentrator (verhouding 1:3) toe aan het virale mengsel (bijvoorbeeld 8 ml concentrator met 24 ml viraal mengsel). Keer de tube vijf keer voorzichtig om.
  6. Bewaar het virus-Lenti concentratormengsel gedurende 2 dagen bij 4 °C. Centrifugeren bij 1.500 × g, 45 min, 4 °C. Verwijder het bovenstaande middel zo veel mogelijk voorzichtig met behulp van een pipet.
  7. Resuspendeer de pellet met voorgekoelde 200 μL 100 mM PBS. Bewaar het virus bij -80 °C.
    OPMERKING: De details van EcoHIV-mScarlet-verpakkingen in 293FT-cellen werden beschreven in onze vorige studie16. Draaikolken niet en introduceer geen luchtbellen in de virale oplossing.

2. EcoHIV-mScarlet-infectie in primaire hersencellen van ratten

  1. Voer de primaire hersencelisolatie uit van rattenfoetussen (18 dagen) volgens het eerder gepubliceerde rapport16.
  2. Breng gedissocieerde cellen over naar poly-L-Lysine voorgecoate platen met 12 putjes met glazen inzetstukken die 1 ml DMEM/F12-medium plus 10% FBS bevatten. Vervang het medium de volgende dag door het Neurobasale medium door het B27-supplement.
  3. Kweek primaire foetale hersencellen in een 5% CO2 -incubator gedurende 3 weken.
  4. Voeg EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/ml) toe aan het kweekmedium. Incubeer de gekweekte hersencellen met EcoHIV-mScarlet gedurende 6 dagen.
  5. Fixeer de cellen met 4% PFA en voer immunokleuring uit op geïnfecteerde hersencellen met behulp van specifieke primaire antilichamen (CD11b/c, Iba1).
  6. Verkrijg beelden met behulp van 40× objectief onder een confocaal microscopiesysteem.

3. EcoHIV-mScarlet virusinfectie in primaire gliacellen van volwassen muizen

  1. Verdoof volwassen muizen met 5% sevofluraan gedurende 5 minuten (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Steriliseer de huid van het hoofd met 70% EtOH.
  2. Nadat u hebt bevestigd dat de muis niet langer reageert op schadelijke stimuli, gebruikt u een gesteriliseerde geslepen schaar om de onthoofding uit te voeren. Breng de kop over naar een nieuw petrischaaltje gevuld met 5 ml HBSS.
  3. Open de hoofdhuid en breng hersenweefsel over in een ander petrischaaltje met 5 ml gesteriliseerde HBSS. Verwijder de hersenvliezen en breng de frontale cortex over naar 2 ml HBSS.
  4. Voeg 20 μL 0,25% Trypsine-EDTA toe aan het mengsel. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur; Draai de tube om de paar minuten voorzichtig rond.
  5. Breng de gedissocieerde cellen over in een poly-L-lysine voorgecoate kolf van 75 cm2 die 10 ml DMEM/F12-medium en 10 % FBS bevat.
  6. Kweekcellen bij 37 °C, 5% CO2 incubator, tot 90% samenvloeiing. Verwerk hersencellen met 2 ml 0,25% trypsine-EDTA.
  7. Subcultuur hersencellen in 35 mm schaaltjes met glazen bodem die 5 ml DMEM/F12 groeimedium bevatten tot 80% confluentie.
  8. Voeg EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/ml) toe aan het kweekmedium. Incubeer de gliacellen van muizen gedurende 2 dagen.
  9. Controleer dagelijks rode (mScarlet) fluorescentiesignalen onder een fluorescentiemicroscoop.

4. EcoHIV-mScarlet virus retroorbitale injectie in Tmem119-EGFP-muizen

  1. Gebruik 3% sevofluraan om de Tmem119-EGFP-muizen (zowel mannelijke als vrouwelijke muizen op de leeftijd van 30 dagen) te verdoven totdat ze niet langer reageren op schadelijke stimuli.
  2. Zet de muizen vast in een zijligging met het injectieoog naar boven gericht en de ademhaling door de neuskegel, die is gekoppeld aan een anesthesiesysteem. Gebruik een geschikte grootte van de neuskegel om continue anesthesie te bieden.
  3. Ontdooi de EcoHIV-mScarlet op ijs. Vul de virale oplossing in een intraoculaire injectiespuit met een stompe naald van 33 G.
  4. Plaats de muis in de rechter zijdelingse lighouding en houd de kop naar links gericht. Identificeer de locatie van de mediale canthus als de injectieplaats.
  5. Nadat u het oog hebt geproptoiseerd, steekt u langzaam en voorzichtig een naald (hoek van 45 graden) in de mediale canthus van het oog. Steek de naald voorzichtig naar voren in de bloedvaten achter de oogbol (retro-orbitale sinus).
  6. Injecteer voorzichtig 6,5 μL EcoHIV-mScarlet (1,26 × 106 TU/ml, bilaterale ooginoculatie) in de retro-orbitale sinus. Verwijder voorzichtig de naald uit de retro-orbitale sinus en oefen voorzichtig druk uit op de oogleden om hemostase te veroorzaken.
  7. Breng glijmiddel aan op het oog om te voorkomen dat het hoornvlies uitdroogt of gewond raakt.
  8. Laat de muizen herstellen in een herstelkamer met een verwarmingskussen totdat ze wakker zijn geworden.
    OPMERKING: De afschuining van de naald mag niet te diep worden geplaatst, zodat de slagaders niet worden gescheurd of de botten worden gebroken. De virale infusietijd is afhankelijk van meerdere factoren (bijv. injectievolume, titer, diergrootte). Voor EcoHIV-virale infusie is een week na retro-orbitale injecties significante expressie waargenomen 11,16,17.

5. Visualisatie van plakjes hersenweefsel

  1. Verdoof muizen diep met 5% sevofluraan. Ga verder met stap 5.2 wanneer de muizen niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.
  2. Houd de muizen in rugligging in een chemische zuurkast.
  3. Open de huid langs de thoracale middellijn. Haal het middenrif uit elkaar en open de kist met een schaar.
  4. Steek een 22 G1 1/2 naald in de linker hartkamer. Open het rechter atrium met een schaar.
  5. Perfuseer 50 ml voorgekoelde 100 mM PBS. Samensmelten 100 ml voorgekoelde 4% paraformaldehyde buffer16.
  6. Verwijder het hele muizenbrein16.
  7. Fixeer 's nachts met 4% paraformaldehyde.
  8. Zet het hersenweefsel vast met weefsellijm op het metalen platform van de Vibratome. Snijd 50 μm dikte van coronale secties met koolstofstalen messen.
  9. Plaats de hersenplakjes met een borstel op glazen dia's. Voeg onmiddellijk 0,1 ml van het antifade-montagemedium toe aan elke sectie.
  10. Plaats een dekglaasje van 22 mm x 50 mm over de hersensecties. Droog de super-frost dia's 1 dag in het donker.
  11. Configureer het confocale microscoopsysteem op een vergroting van 60× (A/1.4, olie) en stel een Z-vlakinterval in van 0,15 μm, met een gaatjesgrootte van 30 μm en een teruggeprojecteerde gaatjesstraal van 167 nm.
  12. Gebruik de golflengten van 488 nm en 594 nm om meerkanaalsbeelden van interessante hersengebieden te verkrijgen.

Resultaten

Een fragment van mScarlet (1858 bp) met enzymplaatsen van "Cla1" aan het 3'-uiteinde en "Not1" aan het 5'-uiteinde werd ingevoegd in de pNL4-3-EcoHIV-lentivirale vector (Figuur 1). Om de expressie van EcoHIV-mScarlet te valideren, werden primaire hersencellen geïsoleerd uit de cortex van E18-embryo's van ratten behandeld met EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/ml) gedurende 6 dagen in vitro. De gegevens in figuur 2 toonden aan dat rode fluorescerende signalen van mScarlet voornamelijk gelokaliseerd waren in gliale celtypen op basis van de verschillende celmorfologie. Bovendien toonde CD11b/c- en Iba1-labeling (celmarkers voor microglia) aan dat mScarlet-signalen co-gelokaliseerd waren met CD11b/c + en/of Iba1 + cellen. De gegevens gaven aan dat microglia het belangrijkste celtype waren van EcoHIV-mScarlet-distributie in vitro. Er was geen significante neuronale infectie in de gekweekte cellen (aanvullende figuur 1).

Vervolgens werd de infectie van EcoHIV-mScarlet getest op primaire gemengde gliacellen van volwassen muizen. Om dit te doen, werden gemengde gliacellen eerst geïsoleerd en gezuiverd van volwassen muizen (2 maanden) en gedurende 2 dagen geïnfecteerd met EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/ml). De afbeeldingen in figuur 3 toonden aan dat EcoHIV-mScarlet met succes volwassen muizenglia infecteerde.

Om het distributiepatroon van EcoHIV-mScarlet in de hersenen van muizen verder aan te pakken, specifiek voor het identificeren van het geïnfecteerde celtype, werd EcoHIV-mScarlet retro-orbitaal geïnjecteerd in de Tmem119-EGFP knock-in muislijn waarin microglia specifiek werden gelabeld met EGFP-signalen zonder andere macrofaagtypen conflicten5. De resultaten in Figuur 4 (ook in Aanvullende Figuur 2) tonen aan dat mScarlet rode fluorescentiesignalen werden waargenomen in EGFP-positieve cellen, wat suggereert dat microglia het belangrijkste celtype van EcoHIV-expressie in muizenhersenen zijn.

figure-results-1
Figuur 1: De vectorkaart van EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De EcoHIV-mScarlet-infectie in primaire hersencellen van ratten. (A,E) Representatieve beelden van CD11b/c-kleuring bij primaire hersencellen. De hersencellen werden geïsoleerd uit E18-rattenembryo's en gedurende 6 dagen geïnfecteerd met het EcoHIV-mScarlet-virus. (B,F) Representatieve beelden van mScarlet fluorescerende signalen van in vitro hersencellen. (C,G) Representatieve beelden van Iba1-kleuring bij primaire hersencellen. (D,H) Samengevoegde afbeeldingen van drievoudige labeling van CD11b/c, mScarlet en Iba1. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: EcoHIV-mScarlet-infectie in primaire gemengde gliacellen van muizen. (A,B) Representatieve confocale beelden van mScarlet-distributie in vitro. De primaire gemengde gliacellen werden geïsoleerd uit volwassen C57BL6-muizen (2 maanden oud) en gedurende 2 weken vóór virale infectie gekweekt. De EcoHIV-mScarlet werd gedurende twee dagen aan het kweekmedium toegevoegd en legde de beelden vast onder het 60× doel van de confocale microscoop. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: EcoHIV-mScarlet-verdeling in Tmem119-EGFP knock-in muislijn. (een, b) Samengevoegde afbeeldingen van mScarlet/EGFP/ToPro3-signalen in hersensecties. Het gele kader geeft het doelgebied van (B) aan. Schaalbalk: 300 μm. (C) Representatief beeld van de mScarlet-verdeling in de externe plexiforme laag van het olfactorische gebied van de Tmem119-EGFP knock-in muislijn. (D) Representatief beeld van de distributie van EGFP's. De fluorescerende signalen werden gelokaliseerd in microgliacellen in de Tmem119-EGFP knock-in muislijn. (E) Representatief beeld van TO-PRO-3-kernkleuring. Schaalbalken: 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: MAP2- en MOG-kleuring van primaire hersencellen van ratten geïnfecteerd met EcoHIV-mScarlet-virus. Schaal balken: 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Confocale beelden van EcoHIV-mScarlet-infectie in de knock-in muislijn van Tmem119-EGFP . Schaalbalken: 75 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: EcoHIV-mScarlet plasmide DNA-sequentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In de huidige studie werd vastgesteld dat (1) de nieuwe EcoHIV-mScarlet met succes primaire hersencellen van ratten in vitro heeft geïnfecteerd; (2) de drievoudige labeling van mScarlet, CD11b/c en Iba1 identificeerde microglia als het overheersende celtype voor deze EcoHIV-expressie in hersencellen van ratten in vitro; (3) primaire hersencellen van muizen van volwassenen in vitro bewijs voor de EcoHIV-mScarlet-infectie; (4) de EcoHIV-mScarlet-distributie in de Tmem119-EGFP knock-in muislijn toonde een microglia-specifiek distributiepatroon van EcoHIV-infectie aan.

Opkomende studies suggereerden dat verschillende soorten hersencellen die in het centrale zenuwstelsel zijn geïdentificeerd (neuronen, astrocyten, microglia, oligodendrocyten, enz.) functionele en transcriptomische veranderingen vertonen tijdens HIV en HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen18,19. Astrocyten dragen bijvoorbeeld 30%-70% van de hersenen bij en voeren bewaking uit om de hersenhomeostase20 te behouden. Astrocyten moduleren ook de immuunfunctie en reguleren de secretie van multi-cytokines en chemokines, vooral in de situatie van hersenontsteking en neurodegeneratie bij HIV21,22. HIV-infectie van microglia resulteert niet alleen in een continue afgifte van virale eiwitten en pro-inflammatoire cytokines en chemokines, maar biedt ook overheersende bronnen voor HIV-virale reservoirs 23,24,25,26. Bovendien dragen geactiveerde microglia bij aan een kritische immunologische functie in het CZS; langdurige activering kan echter ook neurodegeneratie bij HIV-progressie verergeren10,27. Oligodendrocyten spelen ook een belangrijke functie, waaronder het vrijgeven van verschillende neurotrofines (zoals zenuwgroeifactor, van de hersenen afgeleide neurotrofe factor, enz.)28. Uit een eerdere studie bleek dat het aantal oligodendrocyten in de hersenen van AIDS-patiënten aanzienlijk afnam, wat kan duiden op directe schade aan oligodendrocyten door HIV-virale eiwitten29. Daarom zou een specifiek type celgemanipuleerd infectiemodel van HIV fundamentele middelen moeten bieden om de differentiële functies van verschillende hersencellen na infectie te identificeren. In de huidige studie werd een biologisch systeem ontwikkeld om kenmerken van HIV-1 na te bootsen door chimere HIV (EcoHIV) inoculatie. Deze HIV-inoculatie werd ook gecombineerd met de Tmem119-EGFP knock-in muislijn om een microglia-gemanipuleerd knaagdiermodel van HIV te genereren en te valideren.

De beperkingen van de huidige studie moeten echter worden erkend. Er waren een paar Iba1/CD11b/c-negatieve cellen die in vitro mScarlet fluorescerende signalen vertoonden. Andere soorten hersencellen, zoals hersenmacrofagen of pericyten, kunnen betrokken zijn bij EcoHIV-infectie, of als alternatief kan de celkweekomgeving afwijkende infectiepatronen bevorderen ten opzichte van in vivo inoculatie. Toekomstige studies met hele dieren moeten de functie van mScarlet+ microglia in het proces van EcoHIV-infectie verder verduidelijken en de regionale verspreiding van mScarlet+EcoHIV microglia in de hersenen verder definiëren. Bovendien kunnen neurocognitieve veranderingen die optreden als gevolg van microgliale infecties ook worden aangepakt in dit knaagdiermodel. Gezamenlijk biedt de EcoHIV-mScarlet-inoculatie van Tmem119-EGFP knock-in muizen een nieuw model en onderzoeksstrategie voor het onderzoeken van de microglia-gedreven mechanismen van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DA059310, DA058586, AG082539 en GM109091. We waarderen de genereuze gift van de EcoHIV-NL4-3-EGFP van Dr. Potash van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
293FT cellenThermoFisher ScientificR70007
33 G, kleine hub RN-naald, (puntstijl: 3, naaldlengte: 19,25 mm)Hamilton7803-05
Antibioticum-antimycoticum oplossingCellgro30004CI100x
C57BL/6-Tmem119em2Gfng/JThe Jackson LaboratoryStrain #:031823
Corning BioCoat Gelatine 75 cm² Rechthoekige kante hals celcultuurkolf met geventileerde dopLife Technologies354488
Corning DMEM met L-Glutamine, 4,5 g/L glucose en natriumpyruvaatLife Technologies10013CV
DekglasVWR637-137
Dumont #5 PincetWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 PincetWorld Precision Instruments14097
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock buizenLife Technologies22600028
Feather dubbelzijdige koolstofstalen mesjesTed Pella, inc.121-9
Fisher BioReagents Microbiologie Media: LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426-500
Menselijke recombinante anti-CD11b-antilichaamMiltenyi Biotec130-120-2141:50 verdunning
Intraoculaire injector spuit (6,5 micro;L), verwisselbare naaldHamilton6609071-01
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfectiereagens Life TechnologiesL3000015
Invitrogen One Shot TOP10 Electrocomp E. coliFisher ScientificC404052
Iris pincetWorld Precision Instruments15914
Iris schaarWorld Precision Instruments500216
Lentivirus-geassocieerde p24 ELISA KitCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X ConcentratorTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife Technologies11058021
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
Paraformaldehyde SigmaP6148
PELCO easiSlicer Vibratieweefsel SnijderTed Pella, inc.11000
PELCO Pro CA44 weefselkleefstofTed Pella, inc.10033
PELCO Pro specimen retrieversTed Pella, inc.101-33
ProLong GoldFisher ScientificP36930
Konijn monoklonaal anti-Iba1-antilichaamAbcamab1788471:500 verdunning
RN Compressiefitting 1 mmHamilton55750-01
SevofluraanMerritt Veterinary Supply347075
Sprague Dawley zwangere ratInotiv
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
To-Pro-3ThermoFisher ScientificT3605Kernkleuringskit
Trypsine-EDTA (0,25%), fenolroodThermoFisher Scientific25200-056
Vannas schaarWorld Precision Instruments500086

Referenties

  1. Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats. J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).
  2. Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat. J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).
  3. Repunte-Canonigo,, et al. Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats. Mol Neurodegener. 9, 26(2014).
  4. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).
  5. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era. Sci Rep. 9, 827(2019).
  6. Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).
  7. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).
  8. Peng, J., et al. The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART. J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).
  9. Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging. PLoS ONE. 9, e105256(2014).
  10. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  11. Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders. Viruses. 13 (5), 924(2021).
  12. Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. eNeuro. 6 (4), (2019).
  13. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  14. Satoh, J., et al. TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain. Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).
  15. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. J Vis Exp. (108), e53697(2016).
  16. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A rat model of EcoHIV brain infection. J Vis Exp. (167), e62137(2021).
  17. Alfar, H. R., et al. Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions. STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).
  18. Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage. Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).
  19. Parpura, V., et al. Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling. Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).
  20. Wahl, A., Al-Harthi, L. HIV infection of non-classical cells in the brain. Retrovirology. 20 (1), 1(2023).
  21. Pandey, H. S., Seth, P. Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS. J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).
  22. Minagar, A., et al. The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis. J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).
  23. Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis. Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).
  24. González-Scarano, F., Martín-García, J. The neuropathogenesis of AIDS. Nat Rev Immunol. 5 (1), 69-81 (2005).
  25. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations. J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).
  26. Kim, B. H., et al. EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis. Viruses. 16 (5), 693(2024).
  27. Réu, P., et al. The lifespan and turnover of microglia in the human brain. Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).
  28. Jones, J. D. Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders. CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).
  29. Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells. Front Neurosci. 13, 1398(2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

EcoHIV infectiemanipulatie van microgliaTmem119 EGFP muizenHIV neurocognitieve stoornissenvirale reservoirs in de hersenenconfocale microscopieimmunovleking van hersencellenmScarlet fluorescentiehersencelcultuurmicrogliale veranderingen
Identificatie van EcoHIV-geïnfecteerde cellen in microglia-gemanipuleerde transgene muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.