Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van 16α-[18F]-fluor-17β-oestradiol PET om de expressie van oestrogeenreceptor α visualiseren in xenotransplantaten van borstkanker bij vrouwelijke ovariëctomische muizen

709 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67151

⸱

7 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health, 4Faculty of Medicine, The University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Hier demonstreren we een protocol om 16α-[18F]-fluor-17β-oestradiol (18F-FES) positronemissietomografie (PET) te gebruiken als een hulpmiddel om ERα-expressie in ERα-positieve borstxenotransplantaten te visualiseren.

Samenvatting

Om aan te tonen hoe oestrogeenreceptor-alfa (ERα) positieve borstkankerxenotransplantaten kunnen worden gevisualiseerd in BALB/c naakte muizen met behulp van 16α-[18F]-fluor-17β-oestradiol (18F-FES) positronemissietomografie (PET), werden ovariëctomiseerde BALB/c naakte muizen geïnjecteerd met ERα-positieve borstkankercellen (MCF-7, 3 × 106 cellen; schouder [n = 10] of 4e inguinale borstvetkussen [n = 10]) of ERα-negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231, 1 × 106 cellen; borstvet kussen [n = 5]). Muizen met MCF-7-cellen kregen 2 dagen voorafgaand aan de celinjectie subcutane injecties van 20 μg 17β-oestradiol (20 μg/20 μl; maïsolie: ethanol, 9:1) in hun nek, gevolgd door dagelijkse injecties vijf keer per week gedurende 5 weken. Tumorvolumes werden gemeten volgens de formule: (L*W2)/2 (L; lengte, W; breedte). Zodra het tumorvolume ongeveer 100 mm3 bereikte, werden de injecties met 17β-oestradiol 2 dagen voordat muizen 18F-FES kregen voor PET-beeldvorming stopgezet om competitieve binding met ERα te voorkomen. Bij toediening van 18F-FES via de laterale staartader werd PET/MRI uitgevoerd gedurende 15 minuten 1 uur tot 1,5 uur na de injectie. 18 ZoekertjesF-FES-opname werd niet waargenomen bij ERα-negatieve, MDA-MB-231 tumordragende muizen. 18 ZoekertjesDe opname van F-FES was het meest uitgesproken bij muizen met MCF-7-tumoren in de schouder. In MCF-7-tumoren die in het inguinale borstvetkussen werden gekweekt, was de opname van 18F-FES minder zichtbaar, omdat het intestinale uitscheidingspatroon van 18F-FES de radioactiviteit die in deze tumoren detecteerbaar was, verdoezelde. Om 18F-FES PET te gebruiken als een hulpmiddel om ERα-expressie te visualiseren in ERα-positieve borstxenotransplantaten, tonen we aan dat de zichtbaarheid van 18F-FES-opname duidelijk is in tumoren die zich buiten de buikstreek van muizen bevinden, zoals in de schouder.

Inleiding

Borstkanker (BC) kan worden gestratificeerd in verschillende moleculaire subtypes1. Borsttumoren die zijn geclassificeerd als het luminale subtype brengen oestrogeenreceptor-alfa (ERα) tot overexpressie. Als zodanig wordt dit subtype van BC ook wel ERα-positief (ERα+) genoemd. Gelukkig ervaren degenen bij wie de diagnose ERα+ BC is gesteld de hoogste 10-jaarsoverleving in combinatie met lage percentages metastasen op afstand 2,3. Vanwege ERα-expressie hebben dergelijke patiënten toegang tot een verzameling hormoontherapie-opties, waaronder selectieve oestrogeenreceptormodulatoren (SERM's), anti-oestrogeengeneesmiddelen en aromataseremmers4.

Om te beoordelen of een borstkankerpatiënt in aanmerking komt voor hormoontherapie, moeten de expressieniveaus van ERα in borsttumoren worden bepaald 5,6,7. Hoewel de gouden standaard voor testen wordt uitgevoerd met behulp van immunohistochemie (IHC)-methoden, benadrukken veel rapporten het probleem van zowel de reproduceerbaarheid als de betrouwbaarheid van de verkregen resultaten 6,8,9. IHC kan aanleiding geven tot discordantie in de resultaten, aangezien de techniek semi-kwantitatief van aard is, waarbij verschillen in weefselverwerking en daaropvolgende interpretatie kunnen leiden tot variabiliteit6. Om dit terugkerende probleem op te lossen, werden in 2010 richtlijnen opgesteld en in 2020 bijgewerkt door de American Society of Clinical Oncology met de bedoeling de variatie tussen waarnemers10 te verminderen. Momenteel ligt de klinisch gevalideerde grenswaarde op ≥1%, waarbij ERα-expressie zelfs bij zeer kleine expressieniveaus klinisch betekenisvolle voordelen aantoont met behulp van endocriene therapie11.

In gevorderd BC kan de expressie van ERα verschillen tussen metastasen en de primaire tumor. Sommige waarnemingen rapporteren een discrepantie van 18%-55% in ERα-expressieniveaus tussen gemetastaseerde laesies en de primaire tumor, wat wijst op het belang van het bepalen van de ERα-status van BC-metastasen12. Om dit aan te pakken, benadrukken richtlijnen het belang van het bevestigen van de hormoonreceptorstatus in gemetastaseerde laesies om weloverwogen behandelplannen te maken13,14. De haalbaarheid hiervan is echter twijfelachtig, met name door middel van IHC-methoden, aangezien metastasen kunnen bestaan op plaatsen waar moeilijk biopsieën kunnen worden genomen.

Moleculaire beeldvormingsmethoden zijn uitgegroeid tot essentiële hulpmiddelen voor de detectie en visualisatie van tumorlaesies bij kankerpatiënten. In het bijzonder vereist beeldvorming met positronemissietomografie (PET) het gebruik van tracers of, meer specifiek, radiofarmaceutica, die zijn ontworpen om bepaalde kenmerken van tumoren te benutten met de bedoeling deze laesies niet-invasief te visualiseren. De meest voorkomende PET-tracer die in de oncologie wordt gebruikt, is 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG)15. In deze studie onderzoeken we het gebruik van een radioactief gelabelde vorm van oestradiol, 18F-fluoroestradiol (18F-FES). Estradiol - een ligand voor ERα - is een hormoon dat voornamelijk wordt geproduceerd door de eierstokken bij vrouwen16. 18 ZoekertjesF-FES heeft onlangs goedkeuring gekregen van de Food and Drug Administration (FDA) en wordt op de markt gebracht als CeriannaTM. Dit beeldvormende middel is ontworpen om te worden gebruikt als aanvulling op biopsieën bij patiënten met recidiverende of gemetastaseerde BC17. PET-beeldvorming van het hele lichaam met 18F-FES kan worden gebruikt als een niet-invasieve methode om ERα-niveaus te detecteren, zowel in de primaire tumor als in metastasen op afstand in regio's waar biopsieën moeilijk te verkrijgen zijn18. De voorspelling van ERα-niveaus met behulp van 18F-FES PET-beeldvorming correleert met IHC-resultaten, en bovendien is weinig tot geen detectie van ERα met behulp van 18F-FES PET-beeldvorming een betrouwbare voorspeller van tumoren die waarschijnlijk niet zullen reageren op hormoontherapie18. Om het juiste gebruik van 18F-FES in de kliniek te garanderen, zijn richtlijnen geformuleerd door experts in het veld19. In deze studie evalueren we het gebruik van 18F-FES PET in preklinische modellen van borstkanker bij muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierstudies zijn goedgekeurd door de Austin Hospital Animal Ethics Committee (A2023/05812) en uitgevoerd in overeenstemming met de Australische code voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden.

1. Voorbereiding van de cellen

  1. Gebruik routinematige celkweekprocedures om MDA-MB-231- en MCF-7-cellen in DMEM/F-12 te onderhouden aangevuld met penicilline/streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS) in T175-weefselkweekkolven. Voorafgaand aan het voorbereiden van cellen voor injectie, moeten cellen ten minste 3x na heropleving uit vloeibare stikstofvoorraden worden gepasseerd. Kweek de cellen in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 .
  2. Vermeerder cellen zodanig dat er op de dag van het voorbereiden van cellen voor injectie 3 × 106 MCF-7-cellen per injectie per muis zijn voor 15 muizen (d.w.z. ten minste 45 × 106 MCF-7-cellen) en 1 × 106 MDA-MB-231-cellen per injectie per muis voor 5 muizen (d.w.z. ten minste 5 × 106 MDA-MB-231-cellen).
    OPMERKING: Om een gelijk aantal cellen in elke muis toe te staan, moet u voldoende cellen voorbereiden voor vijf extra injecties (bijv. bereid voldoende cellen voor 10 injecties voor het injecteren van vijf muizen).
  3. Verwijder op de dag van de celinjectie de media uit alle kolven en plaats ongeveer 5 ml trypsine-EDTA (0,25% trypsine en 0,05% EDTA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4) op de cellen om de celloslating te vergemakkelijken.
  4. Zodra de cellen zijn losgekomen, doet u ongeveer 10 ml volledig medium in kolven om de trypsineactiviteit te remmen. Resuspendeer de cellen en breng de eencellige suspensie over in een buis van 50 ml. Centrifugeer bij ~300 × g gedurende 2 minuten tot pelletcellen.
  5. Resuspendeer de celpellet in een geschikt volume media en tel de cellen om het totale aantal geoogste cellen te bepalen.
    OPMERKING: Probeer oplossingen van ongeveer 1 × 106 cellen per ml te tellen (50-100 cellen per 16 vierkanten bij gebruik van een telkamer). Voor cellen die groeien met 5 × 106 per volle kolf, oogst de cellen in 5 ml media. Gebruik voor cellijnen met een hogere dichtheid 10 ml media per kolf.
  6. Voer deze stap uit op ijs in een steriele laminaire stromingskast. Zodra dit aantal is bereikt, centrifugeert u de celsuspensie opnieuw bij 300 × g gedurende 2 minuten tot pelletcellen. Resuspendeer de pellet in koude PBS en ijskoude basaalmembraanmatrixoplossing, zodat er per 3 × 106 MCF-7-cellen 40 μL PBS en 10 μL basaalmembraanmatrixoplossing is.
  7. Resuspendeer de MDA-MB-231-celpellet met dezelfde bestanddelen, zodat er per 1 × 106 cellen 40 μL PBS en 10 μL basaalmembraanmatrixoplossing is. Breng het cel-PBS-basaalmembraanmatrixmengsel over van de buis van 50 ml in kleinere buisjes van 1,5 ml met een koude pipetpunt en bewaar het celmengsel op ijs vlak voor de celinjectie in muizen.
    OPMERKING: De basaalmembraanmatrix die in dit onderzoek wordt gebruikt, wordt bewaard bij -20 °C. De dag voordat de basaalmembraanmatrixoplossing nodig is, wordt een hoeveelheid van de oplossing bij 4 °C geplaatst om 's nachts te ontdooien. De volgende dag is het klaar voor gebruik bij koude temperaturen (op ijs). Zorg er bij het pipetteren van de oplossing voor dat de gebruikte pipetpunten koud zijn om te voorkomen dat de basaalmembraanmatrixoplossing stolt. Het is een goede gewoonte om een doosje steriele pipetpunten in de koelkast te bewaren vóór de dag van de celvoorbereiding voor injectie. Bij het opnieuw suspenderen van de celpellet in ijskoude PBS en basaalmembraanmatrixoplossing wordt eerst PBS toegevoegd, gevolgd door de benodigde hoeveelheid basaalmembraanmatrixoplossing.

2. Celinjectie in muizen die ovariëctomie hebben ondergaan

  1. Laat 6-8 weken oude vrouwelijke ovariëctomische BALB/c naakte muizen acclimatiseren in de dierenhuisvesting gedurende ten minste 1 week voorafgaand aan de celinjectie.
    OPMERKING: Deze studie had toegang tot oudere muizen van 12-14 weken oud. Ovariëctomie zorgt voor lage niveaus van endogeen oestradiol en vermindert de concurrentie met het 18F-FES-ligand. Afhankelijk van het model dat wordt bestudeerd, hoeven jongere muizen (bijv. 4-8 weken) mogelijk geen ovariëctomie te ondergaan vanwege lagere niveaus van endogeen oestradiol20,21.
  2. Induceer anesthesie bij een muis met 4% isofluraan en zuurstof met een snelheid van 4 l/min met behulp van een anesthesie-inductiekamer. Observeer de muis en controleer of de oprichtreflex verloren is gegaan. Zodra ze niet meer bewegen, brengt u de muis over in een steriele laminaire flowkast, plaatst u de snuit in het neusmasker en handhaaft u de anesthesie door de isofluraan aan te passen aan 2% en zuurstof aan te passen aan een snelheid van 2 l/min.
    OPMERKING: Verdoof één muis tegelijk voor een optimale verzorging.
  3. Voor injecties met intramammaire vetkussentjes (IMF) veegt u de huid over de 4einguinale borstklier met alcohol. Gebruik een voorgekoelde (op ijs) spuit van 27 G om de koudecelsuspensie op te zuigen en laat de spuit op ijs liggen om te voorkomen dat de basaalmembraanmatrixoplossing vóór de injectie opwarmt/stolt.
  4. Til met de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand voorzichtig de 4eborstklier op en breng een injectienaald van 27 G in met de dominante hand, waarbij u ervoor zorgt dat de afschuining van de naald naar boven wijst. Injecteer langzaam 50 μl van de celsuspensie met het cel-PBS-basaalmembraanmatrixoplossingsmengsel in het borstvetkussentje.
    OPMERKING: Er moet een luchtbel tussen de vingers worden gevoeld wanneer de cellen worden geïnjecteerd. Controleer op eventuele lekken op de injectieplaats.
  5. Zodra de injectie is voltooid, schakelt u het isofluraan uit en houdt u de snuit van de muis in de neuskegel om zuurstof in te ademen en weer bij bewustzijn te komen (dit duurt ongeveer een minuut). Plaats de muis terug in een kooi op een warmtekussen voor optimaal herstel.
  6. Gebruik voor schouderinjecties de bovenstaande procedure die is beschreven voor IMF-injectie, met als enige verschil de locatie van de celinjectie.
    OPMERKING: Als alternatief kan de schouderinjectie zonder verdoving worden voltooid (zie stap 2.7 hieronder).
  7. Voor schouderinjectie zonder verdoving houdt u de huid vast en tilt u de huid over de schouder van de muis met behulp van de niet-dominante hand tussen duim en wijsvinger, zodat u een 'tent' in de huid vormt. Injecteer langzaam 50 μl celsuspensie met de cel-PBS-basaalmembraanmatrixoplossing met behulp van een injectienaald van 27 G. Trek de naald voorzichtig terug en controleer op lekkage.
    OPMERKING: Als alternatief kan een Hamilton-spuit worden gebruikt voor injecties met kleine volumes om de nauwkeurigheid van de volumeafgifte te garanderen. Tussen de injecties door wordt 80% v/v ethanol gebruikt om de spuit te spoelen bij gebruik van verschillende cellijnen, en PBS wordt gebruikt om resterende ethanol te spoelen en uit de spuit te verwijderen.

3. Bereiding van de oestradioloplossing

  1. Gebruik een weegschaal die milligrammen van een stof nauwkeurig kan afmeten en weeg 7 mg oestradiolpoeder af in een tube van 1,5 ml.
  2. Voeg 700 μL 100% ethanol toe aan 7 mg oestradiolpoeder. Plaats de tube van 1.5 ml gedurende ongeveer 1 uur op een zachte shaker bij kamertemperatuur (RT) of totdat het oestradiolpoeder volledig is opgelost.
  3. Verdeel de oplossing over tien buisjes van 1,5 ml, die elk 70 μl ethanol-oestradioloplossing bevatten. Plaats de tubes bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
    OPMERKING: Estradiol-ethanolvoorraden kunnen ongeveer 2 weken bij -20 °C worden bewaard.

4. Subcutane injectie van oestradioloplossing

  1. Op de dag dat een injectie met oestradiol nodig is, moet het volgende mengsel vers worden aangevuld. Combineer 630 μl maïsolie als vehikel in de buis van 1,5 ml met 70 μl ethanol-oestradioloplossing. Draai de oplossing tot deze homogeen is, zodat de ethanol niet afscheidt en een laag vormt aan de bovenkant van de voertuigolie.
    OPMERKING: Dit levert 700 μL van een 20 μg/20 μL maïsolie:ethanol, 9:1 oplossing. Elke muis krijgt 20 μL van deze oplossing. Maak altijd extra oplossing, omdat de olie in het mengsel de neiging heeft om zich aan de buitenkant van de spuit en aan de zijkanten van een tube van 1,5 ml te hechten vanwege de viscositeit (bijv. voor 20 muizen, hoewel 400 μL voldoende zou zijn, bijna het dubbele van de hoeveelheid (700 μL) biedt voldoende ruimte voor fouten).
  2. Zuig met een naald van 29 G die aan een insulinespuit is bevestigd langzaam 20 μl oestradioloplossing op.
    OPMERKING: Aangezien de oplossing 9 delen olie op 1 deel oestradiol-ethanol bevat, heeft het even nodig om het mengsel in de spuit te trekken.
  3. Muizen die met oestradioloplossing moeten worden geïnjecteerd, zijn muizen die tumoren herbergen die ERα tot expressie brengen en daarom afhankelijk zijn van oestrogeen om te groeien (MCF-7 in deze studie). Muizen met tumoren die geen ERα tot expressie brengen (MDA-MB-231 in deze studie) krijgen geen oestradioloplossing. Plaats de te injecteren muis voorzichtig vooraan, bij voorkeur op een handdoek, om te voorkomen dat hij zijn ledematen bezeert tijdens het in bedwang houden.
  4. Gebruik de niet-dominante hand om de muis in bedwang te houden door het bovenste deel van zijn staart tussen de ring en de pink te houden. Gebruik de duim en wijsvinger om de losse huid bij de nek van de muis op te tillen om een 'tent' in de huid te vormen voor subcutane injectie van de oestradioloplossing.
  5. Terwijl u de muis in deze beperking houdt, gebruikt u de dominante hand om de muis te injecteren met de oestradioloplossing. Met de afschuining van de naald naar boven duwt u de naald onder de 'tent' van de huid totdat minder dan de helft van de naald zichtbaar is.
    OPMERKING: Terwijl de oplossing wordt geïnjecteerd, moet de huid zichtbaar uitbollen.
  6. Om terugstroming van de oplossing te voorkomen, houdt u de naald enkele seconden onder de huid. Als er een terugstroming optreedt, dep het gebied dan voorzichtig droog met een tissue om de resterende oplossing te verwijderen.
    OPMERKING: In sommige experimenten werd oestradiol in combinatie met sesamolie gebruikt om het hormoon toe te dienen. Het gebruik van sesamolie als middel leidt tot lokale ontsteking onder de huid op de plaatsen van oestradiolinjectie. Als zodanig werd maïsolie gekozen als het voertuig voor latere experimenten, waarbij tekenen van ontsteking op de plaatsen van oestradiolinjectie afwezig of minimaal waren22. Zie de discussie voor meer details.
  7. Nadat u de naald hebt verwijderd, veegt u de injectieplaats voorzichtig af met een actueel antisepticum met behulp van een wattenstaafje. Dit is om ontsteking op het oppervlak op de injectieplaats te voorkomen als gevolg van het inbrengen/verwijderen van de naald door de huid van de muis.
  8. Injecteer de muizen met tumoren die ERα (MCF-7) tot expressie brengen 3 dagen voorafgaand aan de celinjectie subcutaan met oestradiolinjecties, gevolgd door 5 keer per week gedurende 5 weken (Figuur 1). Stop de injecties met oestradiol 2 dagen voorafgaand aan de beeldvormingsdag om te voorkomen dat de 18F-FES-sonde concurrerend bindt aan zijn doelwit, ERα.
    OPMERKING: In deze studie werden muizen met MCF-7-tumoren dagelijks van maandag tot en met vrijdag geïnjecteerd met oestradiol. Als ze de volgende week op een woensdag zouden worden afgebeeld, gingen de oestradiolinjecties op zaterdag en zondag door. Estradiol werd niet toegediend op maandag en dinsdag voordat de muizen op woensdag werden afgebeeld.

5. 18F-FES PET- en MRI-beeldvorming van ovariëctomische muizen

LET OP: Gebruik beschermende uitrusting bij het hanteren van radioactiviteit. Volg alle toepasselijke regelgevingsprocedures bij het omgaan met radioactiviteit.

  1. Weeg de muis en noteer het gewicht.
  2. Voor deze studie werd 18F-FES gesynthetiseerd en geformuleerd op een klinische graad23 (verkregen van het Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health) voor gebruik in diermodellen. Verdun 18F-FES (109 min radioactieve halfwaardetijd) in 10% m/v ethanol-zoutoplossing bij een aangepaste vervalgecorrigeerde injectieconcentratie van ongeveer 150-300 μCi/100 μL.
    OPMERKING: Een specifieke activiteit van 1000 Ci/mmol is voldoende voor in vivo PET-beeldvorming van ERα24, en de ontvangen 18F-FES had een specifieke activiteit boven deze basislijnwaarde.
  3. Zuig 100 μL op met een insulinespuit met een naald van 29 G. Gebruik een dosiskalibrator om de radioactiviteitsdosis en -tijd te meten en te registreren. Plaats de spuit achter een loden beschermkap tot het moment van injectie.
    OPMERKING: Meet de hoeveelheid 18F-FES-radioactiviteit in elke dosis met een dosiskalibrator. De dosiskalibrator moet worden gekalibreerd tegen een standaard referentiemateriaal, zoals cesium-137, volgens het protocol van de fabrikant. Het tijdstip van de meting is belangrijk om te registreren om de vervalcorrectie te bepalen. Zorg ervoor dat de tijd die op de kalibrator wordt weergegeven, overeenkomt met de tijd op de computer die wordt gebruikt voor PET-acquisitie.
  4. Om de staartaders te verwijden voor intraveneuze injectie, plaatst u de muis gedurende 2 minuten onder een verwarmingselement op een afstand van 30 cm. Veeg de staart af met 70% w/v ethanol om het gebied te desinfecteren voor injectie.
  5. Dien 100 μl 18F-FES (het volledige volume in de spuit) toe met een bolusinjectie via de laterale staartader en noteer het tijdstip van injectie. Druk met een tissue op de injectieplaats om te voorkomen dat de staartader gaat bloeden.
  6. Meet de resterende dosis in de spuit plus het weefsel af met behulp van de dosiskalibrator en noteer de meting en tijd. Injecteer muizen verspringend in batches van twee om beeldvorming mogelijk te maken met behulp van de meerkamer.
    OPMERKING: Er blijft een sonde in de spuit achter. Het gebruik van insulinespuiten heeft de voorkeur boven spuiten die via Luer-sloten op naalden zijn aangesloten vanwege het verminderde dosisvolume dat na toediening van de injectie in de spuit/naald zit. Bovendien wordt de radioactiviteit in het weefsel gemeten die wordt gebruikt om eventuele bloedingen te stoppen die kunnen optreden na intraveneuze injectie van de sonde. Dit komt omdat de terugstroom van bloed die door het weefsel wordt geabsorbeerd, enige radioactiviteit van 18F-FES kan bevatten. Bovendien hangt de tijd die nodig is om de laterale staartaders op te warmen af van variabelen zoals de intensiteit van de warmtebron en hoe dicht deze bij de muizen is. Bij standaard warmtelampen kan het tot 15 minuten duren voordat de aderen zijn verwijd. Muizen moeten nauwlettend worden gecontroleerd op tekenen van oververhitting en indien nodig tussen de injecties door uit de verwarmingsbron worden verwijderd.
  7. Voor muizen die na de injectie moeten slapen, plaatst u de geïnjecteerde muis in de anesthesiekamer die gedurende 1 uur op een verwarmingskussen onder een onderhoudsniveau van isofluraan (2%-2,5%) en zuurstof (2 l/min) wordt gehouden, zodat de sonde kan worden gedistribueerd via de systemische circulatie van de muis voorafgaand aan de PET-scan. Laat de andere muizen in de groep 1-1,5 uur vrij in hun kooi rondlopen tot de PET-scan.
  8. Plaats de muis na 1-1,5 uur in een beeldvormingskamer onder isofluraan-narcose met neuskegel. Zet de bedverwarmer aan op 32 °C, selecteer een opstelling met meerdere kamers en schakel het ademhalingsbewakingssysteem in. Plaats de twee muizen die moeten worden afgebeeld in buikligging. Plaats de beeldvormingskamer in de PET/MRI-machine.
  9. Bewaak de ademhaling van de muis tijdens het verzamelen van afbeeldingen. Gebruik een ademhalingskaart om op elk moment tijdens de scan 60-80 ademhalingen per minuut te garanderen. Als de ademhalingsfrequentie onder of boven het gewenste bereik daalt, pas dan de isofluraandosis aan als dat nodig is.
    OPMERKING: De ademhaling van het dier kan worden gecontroleerd door de aanwezigheid van een sensor in de beeldkamer.
  10. Combineer een statische PET-acquisitie van 15 minuten met een Gradient Echo (GRE) 3D axiale MRI-scan. Zie hieronder voor acquisitieparameters:
    1. Om het PET-protocol in te stellen, opent u het venster Radiopharmaceutical Editor in de betreffende software. Vermeld de gebruikte isotoop, de activiteit van de spuit (MBq), de injectietijd en de toegepaste activiteit (MBq) en het lichaamsgewicht. Al deze parameters zijn essentieel om de opname van de sonde in het weefsel van belang te helpen berekenen en kwantificeren.
    2. Om ervoor te zorgen dat de muis correct is gepositioneerd voor beeldvorming, gebruikt u een 2D Scout-reeks (voor- en achterkant) om het PET-gezichtsveld te bepalen. Ga verder met een statische PET-acquisitie van 15 minuten met een energievenster van 400-600 keV, toevalsmodus van 1-5, 5 ns. Voer hierna een GRE3D axiale MRI-scan uit gedurende ongeveer 27 minuten.
  11. Reconstrueer de verkregen beelden met behulp van relevante software.
    1. Voer een statische reconstructie uit van het PET/MRI-beeld en gebruik de geometrische planner om het reconstructiegebied aan te passen om ervoor te zorgen dat het de hele muis beslaat, waardoor een optimale reconstructietijd wordt gegarandeerd.
    2. Schakel in het venster Resultaatidentificatie willekeurige correcties, verzwakkingscorrectie (AC) + verstrooiing, positiebereik om op Aan. Stel de vervalreferentietijd in op ADMIN. Stel de lichaamsluchtdrempel in op 30% en baseer de dempingscorrectie op de materiaalkaart.
  12. Gebruik relevante software voor het scheiden van afbeeldingen met meerdere kamers, co-registratie en het tekenen van interessegebieden (ROI's). Voor co-registratie richt u de MRI opnieuw op de PET en reconstrueert u het PET-beeld.
  13. Om de afbeeldingen met meerdere kamers te scheiden, klikt u op Beeldverwerking > segmentatie > Hotelscheider. Schakel de wetenschappelijke modus in en pas de drempel- en volumeparameters naar behoefte aan totdat er 2 objecten zijn gevonden.
  14. Voer de dosis in op het moment van injectie na rekening te hebben gehouden met de resterende dosis die nog in de spuit zit om de PET-gegevens om te zetten in de eenheid van het percentage geïnjecteerde dosis per gram (%ID/g) of voer bovendien het gewicht van de proefpersoon in om de PET-gegevens om te zetten in de eenheid van gestandaardiseerde opnamewaarde (SUV). Voer deze conversie uit door met de rechtermuisknop op de PET-gegevensset te klikken en het veld %ID/g op het tabblad Basisinformatie te zoeken. Voer de eerder opgenomen %ID/g in.
  15. Als u ROI's wilt tekenen voor de tumorsecties, klikt u op het tabblad Metingen aan de linkerkant van het programmavenster. Teken de ROI met de veelhoek of het gereedschap uit de vrije hand . Teken voorzichtig rond de omtrek van de tumor en zorg ervoor dat de actie wordt uitgevoerd terwijl de PET-afbeelding zich in het actieve venster bevindt (controleer met Fn-A). Het resultaat geeft een waarde van de ROI als %ID/g.
    OPMERKING: ROI-analyse geeft een goede schatting van de %ID/g. Een goed gekalibreerde camera moet een nauwkeurigheid van ±5% geven in vergelijking met ex vivo biodistributiegegevens.

6. Tumorweefsel oogsten en fixeren voor immunohistochemie

  1. Euthanaseer de muis op het experimentele eindpunt met behulp van dodelijke inademing van isofluraan bij 4%-5% of overmatige inademing van CO2.
  2. Maak met een chirurgische schaar en pincet voorzichtig een kleine incisie nabij het oppervlak van de tumor en verwijder het tumorweefsel. Als de huid aan het tumorweefsel vastzit, gebruik dan een scalpelmes om de huid voorzichtig van de tumor te scheiden.
  3. Plaats het tumorweefsel in een injectieflacon van 5 ml met ongeveer 3 ml 10% neutraal gebufferde formaline. Zorg ervoor dat het hele weefsel bedekt is met oplossing om weefselfixatie te vergemakkelijken. Houd het weefsel 24 uur ondergedompeld in formaline.
  4. Breng de volgende dag het gefixeerde tumorweefsel over in een injectieflacon van 5 ml met 70% ethanol. Label een weefselcassette die specifiek is voor het tumorweefsel ter voorbereiding op paraffine-inbedding.
  5. Plaats het tumorweefsel in een weefselcassette en bewaar het in een 70% ethanoloplossing tot paraffine-inbedding.
    OPMERKING: In deze studie werd paraffine-inbedding uitgevoerd door anatomische pathologen van Austin Health.

7. Immunohistochemie voor de detectie van oestrogeenreceptor-alfa (ERα)

  1. Snijd met behulp van een microtoom 4 μm dikke secties van het tumorweefsel dat nodig is voor kleuring, volgens de standaardprocedures.
  2. Plaats de glazen microscoopglaasjes met gesneden tumorsecties in een glaasjesrek en plaats het rek in een oven van 37 °C om een nacht te drogen en ervoor te zorgen dat weefsels aan de objectglaasjes hechten voordat ze worden gekleurd.
  3. Plaats de volgende ochtend het rek met dia's met gesneden tumorsecties gedurende 30 minuten in een oven van 60 °C om het ontwaxen te vergemakkelijken.
    OPMERKING: De glasdia's moeten tijdens het bakken naar boven wijzen. Dit zorgt voor hechting van het weefsel, en elke was die smelt, smelt op zijn eigen objectglaasje in plaats van op aangrenzende objectglaasjes.
  4. Om de secties te rehydrateren, dompelt u de gebakken secties twee keer onder in xyleen, elk 5 minuten (2x 5 min) 100% ethanol gedurende 2x 5 minuten en vervolgens 70% ethanol gedurende 1x 5 minuten. Was de dia's 5 minuten in gedestilleerd water.
  5. Dompel de glaasjes voor het ophalen van het antigeen 25-30 minuten onder in een bak met 1x EDTA-buffer, pH 8, in een waterbad van 100 °C. Verwijder de dia's uit het waterbad en laat de dia's minimaal 1 uur op RT staan. Zodra de dia's zijn afgekoeld, was je ze 2 minuten in stromend kraanwater en daarna 2x 5 minuten TBST (TBS met 0,01% Tween20).
  6. Teken met een hydrofobe barrièrepen een cirkel rond de secties op de dia's.
  7. Blus de endogene peroxidasen af door ongeveer 100 μl 3% H2O2-oplossing (verdund in gedestilleerd water) gedurende 10 minuten bij RT op secties te brengen. Was de dia's 2 minuten in stromend kraanwater en vervolgens 2x 5 minuten TBST.
  8. Blokkeer coupes met ongeveer 100 μl/sectie blokkeerbuffer (5% runderserumalbumine (BSA) in TBST) gedurende 30 minuten bij RT.
  9. Laat de blokkeerbuffer weglopen door de overtollige oplossing voorzichtig in de incubatiebak te vegen. Voeg ongeveer 100 μl primair antilichaam (humaan anti-ERα gekweekt bij konijnen) toe aan secties in een verdunning van 1:300 (of bij een vooraf bepaalde optimale verdunning die specifiek is voor het gebruikte antilichaam). Maak antilichaamverdunningen aan in 1% BSA TBST en plaats dia's om 's nachts bij 4 °C met het antilichaam te incuberen.
    OPMERKING: De incubatiebak moet aan de onderkant met water worden gevuld om ervoor te zorgen dat de secties niet 's nachts drogen.
  10. Was de volgende ochtend de dia's 3x 5 minuten met TBST. Voeg ongeveer 100 μL anti-konijn secundair antilichaam toe aan de secties en laat 45 minuten intrekken bij RT. Was de glaasjes 3x 5 minuten met TBST.
  11. Voeg in een zuurkast ongeveer 100 μl 3,3'-diaminobenzidine (DAB)-reagens toe aan secties en houd de oplossing ongeveer 3 minuten per sectie aan. Rem de DAB-reactie door dia's gedurende 10 minuten te wassen met stromend kraanwater.
  12. Tegenvlekken met hematoxyline gedurende 1 minuut en 2 minuten afspoelen in stromend kraanwater. Dompel de dia's 1 minuut onder in Scott's water en spoel ze daarna nog 2 minuten af in stromend kraanwater.
  13. Om secties te dehydrateren, dompelt u de secties onder in 70% ethanol gedurende 2 minuten, 100% ethanol gedurende 2x 2 minuten en vervolgens xyleen gedurende 2x 2 minuten.
  14. Monteer in een zuurkast voorzichtig secties in dibutylftalaatpolystyreenxyleen (DPX) en plaats een dekglaasje over de secties, zorg ervoor dat er geen luchtbellen vast komen te zitten over het weefsel van belang. Laat de dia's een nacht drogen in de zuurkast.
  15. Gebruik de volgende dag een diascanner om afbeeldingen vast te leggen en de vlekken te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de locatie te bepalen waarvoor ERα-positieve tumoren duidelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van 18F-FES PET, werden in deze studie drie cohorten van ovariëctomische muizen gebruikt (Figuur 1). Twee groepen muizen werden geïnjecteerd met MCF-7-cellen - een ERα-positieve borstkankercellijn - ofwel IMF of in de schouder. Als negatieve controle werd een ander cohort muizen geïnjecteerd met MDA-MB-231-cellen, een veelgebruikte triple-nega...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we het nut van 18F-FES PET/MRI bij de detectie van borsttumoren die worden gekenmerkt door ERα-expressie. Als voorbeeld tonen we aan dat een locatie waar ERα-positieve tumoren kunnen worden gevisualiseerd, zich in de schouder van muizen bevindt - deze tumoren kunnen duidelijk worden geïdentificeerd door 18F-FES-opname, vergeleken met tumoren die zich bevinden in het 4eliesverband van het borstvet (Figuur 4). ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Breast Cancer Foundation (IIRS-22-071). We erkennen het Operational Infrastructure Support-programma van de Victoriaanse deelstaatregering. Dit onderzoek werd ook uitgevoerd met behulp van het Solid Target Laboratory, een ANSTO-Austin-LICR-partnerschap, ook ondersteund door de National Imaging Facility en de Victoriaanse regering. De auteurs erkennen de wetenschappelijke en technische assistentie van de National Imaging Facility, een National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS) -capaciteit, op het La Trobe-ONJCRI-knooppunt, Olivia Newton-John Cancer Research Institute (ONJCRI). Figuur 1 en 3 zijn gemaakt met BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2.5% Trypsin (10x)Gibco15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2713KAVoor celinjecties
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2913KAVoor estradiol injecties
30% H2O2Chem-SupplyHA154Verdund tot een 3% werkoplossing met gedistilleerd water
Corn oilSigmaC8267
DAB Substrate KitAbcamab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mLAligent-DakoK4003Secundaire antilichaam gebruikt voor IHC
DMEM/F-12 MediumGibco11320033
Dose calibratorCapintec5130-3216
Estradiol SigmaE2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAbCell Signalling Technology#8644Primair antilichaam gebruikt voor IHC
FBSBovogenSFBS
Heat element (Infra Red Lamp)Amcal12400Voor dilatatie van de staartader
MatrigelCorning356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit voor triple- of quadruple-muisbeeldkamerMedisoPR-MC900200Voor monitoring van muizenademhaling
NanoScan PET/MRI 3T SysteemMedisoPR-RD000000Voor PET/MRI acquisitie
PBS (1x)Gibco14190-144
TBSTThermoFisher#28360Wasbuffer voor IHC
Imagingkamer voor drie muizenMedisoPR-MC407300Voor PET/MRI acquisitie

Referenties

  1. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  2. Ignatov, A., Eggemann, H., Burger, E., Ignatov, T. Patterns of breast cancer relapse in accordance to biological subtype. J Cancer Res Clin Oncol. 144 (7), 1347-1355 (2018).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Gnant, M., Turner, N. C., Hernando, C. Managing a long and winding road: Estrogen receptor-positive breast cancer. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 43, e390922(2023).
  5. Thomsen, C., Nielsen, S., Nielsen, B. S., Pedersen, S. H., Vyberg, M. Estrogen receptor-α quantification in breast cancer: Concordance between immunohistochemical assays and mRNA-in situ hybridization for ESR1 gene. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (5), 347-353 (2020).
  6. Shafi, S., et al. Integrating and validating automated digital imaging analysis of estrogen receptor immunohistochemistry in a fully digital workflow for clinical use. J Pathol Inform. 13, 100122(2022).
  7. Harvey, J. M., Clark, G. M., Osborne, C. K., Allred, D. C. Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol. 17 (5), 1474-1474 (1999).
  8. Caruana, D., Wei, W., Martinez-Morilla, S., Rimm, D. L., Reisenbichler, E. S. Association between low estrogen receptor positive breast cancer and staining performance. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 5(2020).
  9. Goldstein, N. S., Ferkowicz, M., Odish, E., Mani, A., Hastah, F. Minimum formalin fixation time for consistent estrogen receptor immunohistochemical staining of invasive breast carcinoma. Am J Clin Pathol. 120 (1), 86-92 (2003).
  10. Hammond, M. E. H., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Allison, K. H., et al. Estrogen and progesterone receptor testing in breast cancer: ASCO/CAP guideline update. J Clin Oncol. 38 (12), 1346-1366 (2020).
  12. Amir, E., et al. Tissue confirmation of disease recurrence in breast cancer patients: Pooled analysis of multi-centre, multi-disciplinary prospective studies. Cancer Treat Rev. 38 (6), 708-714 (2012).
  13. Cardoso, F., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L., Costa, A., Castiglione, M. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 21 (Suppl 5), v15-v19 (2010).
  14. Cardoso, F., et al. 5th ESO-ESMO international consensus guidelines for advanced breast cancer (ABC 5). Ann Oncol. 31 (12), 1623-1649 (2020).
  15. James, W. F., et al. Recommendations on the use of 18F-FDG PET in oncology. J Nucl Med. 49 (3), 480-508 (2008).
  16. Pedersen, M. A., et al. Dynamic whole-body [18F]FES PET/CT increases lesion visibility in patients with metastatic breast cancer. EJNMMI Res. 14 (1), 24(2024).
  17. Grabher, B. J. 18F-FES whole-body imaging protocol for evaluating tumor estrogen receptor status in patients with recurrent or metastatic breast cancer. J Nucl Med Technol. 51 (3), 188-193 (2023).
  18. Van Kruchten, M., et al. PET imaging of estrogen receptors as a diagnostic tool for breast cancer patients presenting with a clinical dilemma. J Nucl Med. 53 (2), 182-190 (2012).
  19. Ulaner, G. A., et al. Summary: Appropriate use criteria for estrogen receptor-targeted pet imaging with 16α-18F-fluoro-17β-fluoroestradiol. J Nucl Med. 64 (3), 351-354 (2023).
  20. He, S., Wang, M., Zhang, Y., Luo, J., Zhang, Y. Monitoring the early response of fulvestrant plus tanshinone IIA combination therapy to estrogen receptor-positive breast cancer by longitudinal 18F-FES PET/CT. Contrast Media Mol Imaging. 2019 (1), 2374565(2019).
  21. Joseph, J. D., et al. The selective estrogen receptor downregulator GDC-0810 is efficacious in diverse models of ER+ breast cancer. eLife. 5, e15828(2016).
  22. Alsina-Sanchis, E., et al. Intraperitoneal oil application causes local inflammation with depletion of resident peritoneal macrophages. Mol Cancer Res. 19 (2), 288-300 (2021).
  23. Sluka, P., et al. Characterization of an estrogen receptor α-selective 18F-estradiol PET tracer. World J Nucl Med. 23 (03), 153-160 (2024).
  24. Katzenellenbogen, J. A. The quest for improving the management of breast cancer by functional imaging: The discovery and development of 16α-[18f]fluoroestradiol (fes), a pet radiotracer for the estrogen receptor, a historical review. Nucl Med Biol. 92, 24-37 (2021).
  25. Boers, J., et al. Image quality and interpretation of [18F]-FES-PET: Is there any effect of food intake. Diagnostics (Basel). 10 (10), 756(2020).
  26. Caceres, S., et al. Tumor growth progression in ectopic and orthotopic xenografts from inflammatory breast cancer cell lines. Vet Sci. 8 (9), 194(2021).
  27. Kumar, M., Salem, K., Jeffery, J. J., Fowler, A. M. PET Imaging of Estrogen Receptors Using 18F-Based Radioligands. Estrogen Receptors. , Springer US. New York, NY. (2022).
  28. Zhang, W., et al. Comparative study of subcutaneous and orthotopic mouse models of prostate cancer: Vascular perfusion, vasculature density, hypoxic burden and BB2r-targeting efficacy. Sci Rep. 9 (1), 11117(2019).
  29. Lee, A. V., Oesterreich, S., Davidson, N. E. MCF-7 cells-changing the course of breast cancer research and care for 45 years. J Natl Cancer Inst. 107 (7), djv073(2015).
  30. Pedram, H., et al. 18F-fluoroestradiol PET guides dosing of selective estrogen receptor degraders. J Nucl Med. 55 (supplement 1), 11(2014).
  31. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17β-estradiol administration to mice. Gen Comp Endocrinol. 175 (1), 188-193 (2012).
  32. Luengo-Mateos, M., et al. Protocol for ovariectomy and estradiol replacement in mice. STAR Protoc. 5 (1), 102910(2024).
  33. Yang, Z., et al. High specific activity is not optimal: 18F-fluoroestradio positron emission tomography-computed tomography results in a breast cancer xenograft. J Labelled Comp Radiopharm. 59 (13), 576-581 (2016).
  34. Aliaga, A., et al. Breast cancer models to study the expression of estrogen receptors with small animal PET imaging. Nucl Med Biol. 31 (6), 761-770 (2004).
  35. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. -M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: A visual demonstration. J Vis Exp. 64, e4013(2012).
  36. Pisaneschi, F., et al. Automated, resin-based method to enhance the specific activity of fluorine-18 clicked PET radiotracers. Bioconjug Chem. 28 (2), 583-589 (2017).
  37. Johannes, N., et al. Variation of specific activities of 68Ga-aquibeprin and 68Ga-avebetrin enables selective PET imaging of different expression levels of integrins α5β1 and αvβ3. J Nucl Med. 57 (10), 1618-1624 (2016).
  38. Liu, C., Ma, G., Xu, X., Song, S., Yang, Z. Can 18F-FES PET improve the evaluation of 18F-FDG PET in patients with metastatic invasive lobular carcinoma. Clin Nucl Med. 49 (4), 301-307 (2024).
  39. Heidari, P., et al. Pharmacodynamic imaging guides dosing of a selective estrogen receptor degrader. Clin Cancer Res. 21 (6), 1340-1347 (2015).
  40. Roswall, P., et al. Microenvironmental control of breast cancer subtype elicited through paracrine platelet-derived growth factor-CC signaling. Nat Med. 24 (4), 463-473 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Oestropeenreceptor alfa18F FES PETMCF 7 cellenER alfa expressiePET beeldvormingmammavetkussentumorvisualisatiepositronemissietomografie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.