Methodenartikel

Ultragevoelige cDNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie van microRNA's uit kleine extracellulaire blaasjes

DOI:

10.3791/67154

⸱

13 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) bevatten celspecifieke microRNA's die ontvangende cellen reguleren, waarvan de identificatie licht kan werpen op hun functie en rol als biomarkers. Ons geoptimaliseerde cDNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol introduceert unieke barcodes die samplemultiplexing en verbeterde verwerking van EV's met lage input mogelijk maken, terwijl gebruik wordt gemaakt van dubbele indexbarcodes met gekoppelde uiteinden voor compatibiliteit met Illumina-sequencers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente studies tonen aan dat kleine extracellulaire blaasjes (sEV's), die in alle biovloeistoffen worden aangetroffen, een cruciale rol spelen in intercellulaire communicatie door eiwitten, DNA en RNA's te kanaliseren. MicroRNA's (miRNA's) die in sEV's zijn verpakt, zijn naar voren gekomen als kritische regulatoren in ontvangende cellen. Aangezien sEV's die door normale en zieke cellen worden uitgescheiden, verschillende miRNA-ladingen dragen, suggereren recente sEV-miRNA-profileringsstudies dat ze kunnen helpen bij het identificeren van nieuwe circulerende biomarkers. Cel-/ziektespecifieke sEV's die in verschillende biovloeistoffen circuleren, leveren echter, eenmaal geïsoleerd, lage miRNA-hoeveelheden, die over het algemeen moeilijk te kwantificeren zijn met behulp van conventionele spectrometrische methodologieën. Kleine niet-coderende RNA Next Generation Sequencing (NGS), die de amplificatie van gekloonde miRNA-sequenties mogelijk maakt, biedt een waardevolle gelegenheid om de miRNA-ladingen van sEV's te evalueren. Helaas vereisen commerciële cDNA-bibliotheekvoorbereidingsprocedures vaak RNA-inputs die ver boven de niet-kwantificeerbare hoeveelheden liggen die beschikbaar zijn van geïsoleerde sEV's.

Dus, rekening houdend met de robuustheid en multiplexingmogelijkheden van onze bestaande cDNA-bibliotheekvoorbereidingsprocedure (d.w.z. aanvankelijk geoptimaliseerd voor de analyse van low-input, sterk gedegradeerd, formaline-gefixeerd paraffine-ingebed (FFPE) RNA), probeerden we de toepasbaarheid ervan voor de analyse van sEV-miRNA's te evalueren. Belangrijk is dat, rekening houdend met de recente technische clusteringverbeteringen van sequencing-chips, we hebben geprobeerd onze transcript-barcoderingsbenadering aan te passen binnen een gepaarde, dubbele index-compatibele cDNA-bibliotheekvoorbereidingsworkflow om onze sequencing- en multiplexing-mogelijkheden te verbeteren. Met behulp van RNA geëxtraheerd uit 8,4 × 109 sEV's in 16 replicaten, en van afnemende hoeveelheden sEV's van 1010 sEV's tot zo laag als 2,5 × 107 sEV's, evalueerden we de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van deze methodologie. De gegevens tonen aan dat de 16 3' geadenyleerde DNA-barcodes een zeer reproduceerbare en gevoelige detectie van sEV-miRNA-profielen over herhalingen mogelijk maken, waarbij slechts 3,15 pg in totaal kleine niet-coderende RNA's of 1,35 pg miRNA's worden gebruikt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn van cellen afgeleide deeltjes van nanoformaat (~30-200 nm in diameter) die zijn omhuld door een fosfolipidedubbellaags membraan, dat is geërfd van hun cel van oorsprong en dat hun moleculaire ladingen robuust beschermt 1,2. Het is algemeen aanvaard dat vrijwel alle cellen sEV's produceren en afgeven in het intercellulaire compartiment, die op hun beurt kunnen worden gedetecteerd in de meeste biovloeistoffen (d.w.z. bloed, urine, speeksel, enz.)2,3,4. Recente studies hebben aangetoond dat de stabiel ingekapselde moleculaire ladingen (d.w.z. DNA, RNA, eiwitten, lipiden, enz.) 5,6,7 van sEV's, eenmaal in contact of afgeleverd bij ontvangende cellen, intercellulaire communicatie bemiddelen8. De huidige onderzoeksinspanningen zijn gericht op het verbeteren van de isolatie van celspecifieke sEV's uit diverse biovloeistoffen, om deze moleculaire ladingen nauwkeurig te identificeren en te monitoren 9,10. Gezien het feit dat sEV's kleine niet-coderende RNA's bevatten en met name microRNA's (miRNA's), die hun regulerende functie behouden bij cellulaire afgifte, zijn veel onderzoeken gericht op het evalueren van het nut van miRNA's als biomarkers die de toestand van hun cel van oorsprong kunnen onthullen 11,12,13.

MicroRNA's (miRNA's) vertegenwoordigen een grote klasse (~2.000 bekend bij mensen) van kleine niet-coderende RNA's met een grootte tussen 19 en 25 nucleotiden (nt), die binden aan onvolmaakte complementaire plaatsen in de 3' niet-getransleerde regio's van hun mRNA-doelen en hun degradatie en/of post-transcriptionele onderdrukking sturen14,15. Functioneel gezien is beschreven dat miRNA's veel biologische processen beheersen, en de deregulering van hun expressie is in verband gebracht met veranderingen in moleculaire, biochemische en fysiologische processen die bijdragen aan het ontstaan en de ontwikkeling van ziekten, waaronder kanker 16,17,18. Belangrijk is dat studies hebben aangetoond dat zieke cellen, en met name kankercellen, niet alleen miRNA's anders tot expressie brengen in vergelijking met normale cellen18, maar dat hun verpakking in sEV's ook verschilt19,20.

Terwijl verschillende studies zich richten op het vaststellen van de moleculaire processen en routes die de verpakking van sEV's in normale en zieke cellen sturen 19,21,22, zijn biomarkerstudies momenteel gericht op het identificeren van te onderscheiden kleine niet-coderende RNA- en/of miRNA-signaturen die worden verpakt en uitgescheiden door specifieke ziekteve/kankercellen via sEV's. De gerichte isolatie van zieke celspecifieke sEV's uit diverse menselijke biovloeistoffen en de evaluatie van hun multi-omische moleculaire ladingen kan dus de ontwikkeling mogelijk maken van diagnostische en prognostische assays voor niet-invasieve detectie van diverse menselijke ziekten en kankers 23,24,25,26. Hoewel sEV-miRNA's de meest bestudeerde niet-coderende transcripten zijn, worden andere kleine niet-coderende RNA-soorten (d.w.z. miRNA-isovormen (isomiR's), piwiRNA's, transfer-RNA-fragment (tRF's), rRNA's, niet-coderende wees-RNA's (oncRNA's)...) ook geëvalueerd op hun potentiële bruikbaarheid als circulerende sEV-biomarkers, met specifieke nadruk op de detectie van verschillende kankers 27,28,29,30,31,32.

Voordelig is dat next-generation sequencing (NGS)-analyse van kleine niet-coderende RNA-transcripten (inclusief miRNA's), na hun barcodering en cDNA-bibliotheekvoorbereiding, ideaal is voor het verkennen van bekende en/of onbekende kleine niet-coderende RNA-soorten in circulerende sEV's, die in verband kunnen worden gebracht met ziekten27. Inderdaad, sEV klein-RNA NGS biedt een high-throughput-benadering voor de ontdekking van celspecifieke kleine niet-coderende RNA-transcripten die anders onbekend zouden blijven, als ze wereldwijd zouden worden geëvalueerd met doelspecifieke technologieën (d.w.z. multiplex PCR, microarrays, aangepaste panels, enz.) 32,33,34. Gezien het feit dat we eerder een ultragevoelig, zeer reproduceerbaar cDNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol hebben geoptimaliseerd, dat we hebben ontwikkeld voor de analyse van sterk gedegradeerde en in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) RNA's met een lage concentratie35,36, hebben we geprobeerd het aan te passen voor de analyse van kleine niet-coderende RNA's en miRNA's ingekapseld in sEV's 37,38,39,40.

Met de stopzetting van het Illumina HiSeq2500-instrument, dat ons jarenlang hoogwaardige single-end dual index miRNA-analyse van sEV-ladingen37,40 opleverde, probeerden we de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van ons protocol te onderzoeken wanneer het werd aangepast aan bijgewerkte sequencing-instrumenten met behulp van nu gepaarde dubbele indexchemie. Met de bedoeling om de multiplexing-mogelijkheden van het oorspronkelijke protocol te behouden, hebben we de bestaande 16 barcodes onderhouden voor de bereiding van cDNA-transcripten met klein RNA voordat we ze integreerden in de chemie met dubbele index aan het einde van de combinatie. Met slechts een paar i5- en i7-barcodes maken we de voorbereiding mogelijk van een robuuste cDNA-bibliotheek in het laboratorium waar gelijktijdige verwerking en analyse van maximaal 16 individuele monsters de analytische reproduceerbaarheid van low-input sEV-RNA verbetert. Daarom presenteren we de biochemische processen, de bijgewerkte barcodes, PCR- en groottemarkerprimers en isolatiestappen die nodig zijn om zeer reproduceerbare cDNA-bibliotheken te genereren met behulp van ultra-lage hoeveelheden miRNA's geïsoleerd uit menselijke plasma-sEV's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Alle reagentia en oligonucleotiden worden als volgt bereid:

OPMERKING: Alle nucleotiden die in dit protocol worden gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in figuur 1 en aanvullend bestand 1 in concentraties die worden gebruikt voor de implementatie van dit protocol. Zie aanvullend bestand 2 voor primersequenties.

  1. Bereid een stockoplossing van kalibratorcocktail, die in elke individuele ligatie zal worden gebruikt als controle voor de verschillende enzymatische reacties:
    1. Resuspendeer de drageroligonucleotide (0,5 μM) (aanvullend bestand 1) met RNasevrij water.
    2. Combineer de 10 kalibratoren (elk 10 μL, aanvullend bestand 1) in een enkele buis van 1,5 ml om een voorraad van 100 μM te bereiken, verdun deze met behulp van de drageroligonucleotide om de 0,0052 nm-oplossing te bereiken en bewaar bij -20 °C.
  2. Resuspendeer elk van de 17 unieke (16 experimentele en 1 testadapter met streepjescode) geadenyleerde 3'-adapters (Figuur 1A) met nucleasevrij water in een concentratie van 50 μM.
    OPMERKING: Elke adapter wordt verdeeld in afzonderlijke buisjes van 2.5 μL voor opslag bij -80 °C gedurende maximaal 2 jaar, om vries-dooicycli van de grotere voorraad te voorkomen.
  3. Resuspendeer de verschillende experimentele RNA-oligonucleotiden, inclusief de RNA-extractiedrager (aanvullend bestand 1), de RNA 3'-ligatiedrager (aanvullend bestand 1), de RNA-ligatietest (aanvullend bestand 1) en de 3'-ligatie (aanvullend bestand 1; 19 nt-3'-adapter en 24 nt-3'-adapter) en 5'-ligatie (aanvullend bestand 1; 5'adapter-19 nt-3'-adapter en 5'adapter-24 nt-3'adapter) DNA-groottemarkeringen, tot 250 ng/μL.
  4. Verdun de HPLC-gezuiverde 5'-adapter tot 100 μM met nucleasevrij water (Figuur 1A).
  5. Resuspendeer de RT- en eerste PCR 5' en 3' RT/PCR-primers tot 100 μM met nucleasevrij water (figuur 1B).
  6. Resuspendeer de tweede PCR 5' en 3' PCR i7- en i5-oligonucleotiden tot 100 μM met nucleasevrij water (figuur 1B).
    OPMERKING: Aliquot elke DNA-primer voor maximaal 10 experimenten en bewaren bij -80 °C.
  7. Bereid PolyAcrylamide denAturing (PAA) gel loading kleurstof voor, meng en aliquoot 1 ml in tubes en bewaar bij -80 °C.
    1. Bereid een oplossing van 0,5 M Na2H2 EDTA door 18,6 g Na2H2 EDTA toe te voegen aan 50 ml nucleasevrij water. Voeg NaOH-pellets langzaam toe aan de bereide Na2H2 EDTA-oplossing om een pH van 8,0 te bereiken. Vul het volume aan tot 100 ml met ddH2O om een 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0) stockoplossing te krijgen
    2. Weeg 15 mg broomfenolblauw af in een tube van 15 ml, suspendeer het poeder in 600 μl nucleasevrij water, voeg 14,25 ml gedeïoniseerde formamide toe. Voeg ten slotte 150 μL van een 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 oplossing toe. Verdeel de uiteindelijke PAA-oplossing in buisjes van 1 ml en bewaar bij -80 °C.
    3. Bereid de 5x agarose gel loading kleurstof voor.
      1. Weeg en los 1,86 g Na2H 2-EDTA op in 50 ml RNasevrij water en pas de pH aan naar 8,0 door NaOH-pellets toe te voegen. Voeg RNasevrij water toe aan 100 ml om een 50 mM Na2H2 EDTA-oplossing te krijgen.
      2. Voeg aan 5 ml 50 ml Na2H2 EDTA 20 mg broomfenolblauw, 20 mg xyleencyaanol FF en 2 g Ficoll type-400 toe. Vortex de tube met de drie te mengen kleurstoffen en voeg nog eens 5 ml 50 mM Na2H2 EDTA toe. Aliquot individuele tubes van 1 ml 5x agarosegel, laad kleurstof en bewaar bij -80°C.

2. Voorbereiding van de EV RNA-monsters

  1. Evalueer na de isolatie van sEV's hun morfologie met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; Figuur 2), concentratie met behulp van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA; Figuur 3), en oppervlakte-eiwitdistributie met behulp van super-resolutie nanoimaging (Figuur 4), of gelijkwaardige sEV-kwantificeringstechnologie.
  2. Voeg een equivalent aantal sEV's in verschillende buisjes toe, voeg RNase-A (12,5 μg/ml) toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  3. Start de extractie van kleine niet-coderende RNA's, waaronder miRNA's, uit sEV's met behulp van de kleine-RNA-extractiekit en start de isolatie van de RNA-fase.
  4. Scheid de onderste waterige fase van de RNA-lysisbuffer, voeg deze toe aan een nieuwe buis en voeg vervolgens 4 ng RNA-drageroligonucleotide (aanvullend bestand 1) toe aan elk RNA-monster, voordat u de kolomisolatie uitvoert volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Vacuüm elk afzonderlijk RNA-monster snel tot 9,5 μl om het voorbereidingsprotocol voor de cDNA-bibliotheek te starten.

3. Zet ligaties van de 3' barcode-adapter op met 16 RNA-monsters en 1 testmonster

  1. Identificeer 16 individuele sEV-RNA-monsters, verdeel ze in 9,5 μL nucleasevrij water in gesiliconiseerde microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en plaats ze ten minste 10 minuten voordat u met de experimenten begint op ijs.
  2. Bereid de 10x RNA Ligasebuffer (zonder ATP) vers voor op het experiment.
    1. Meng in een gesiliconiseerde buis van 1,5 ml 343 μl nucleasevrij dubbel gedestilleerd water (ddH2O), 500 μl 1 M Tris pH 7,5, 100 μl 1 M MgCl2, 50 μl 20 mg/ml runderserumalbumine en 7 μl 14 M 2-mercaptoethanol.
    2. Meng de oplossing door de buis te tikken, centrifugeer gedurende 2 s bij 2.000 × g bij kamertemperatuur (RT) op een tafelcentrifuge en zet vervolgens op ijs.
      OPMERKING: Alle stappen die een "centrifuge gedurende 2 s" beschrijven, worden allemaal gedaan met een microcentrifuge bij RT met een snelheid die niet hoger is dan 2.000 × g.
  3. Ontdooi de 0,0052 nM kalibratorcocktail door de buis 10 minuten op ijs te plaatsen.
  4. Bereid de Ligation Master Mix voor op 18 reacties in een gesiliconiseerde buis van 1,5 ml door 40 μl 10x RNA-ligasebuffer, 10 μl 0,0052 nM kalibratorcocktail en 40 μl nucleasevrije ddH2O te combineren.
  5. Veeg en draai de tube van 1.5 ml en zet hem op ijs.
  6. Voeg 4,5 μL van de Ligation Master Mix toe aan elk van de 16 afzonderlijk verdeelde sEV RNA-monsters, en de testligatiereactie die 100 ng RNA-ligatietestoligonucleotide bevat (aanvullend bestand 1) eerder verdeeld en met een volume van 9,5 μL. Veeg om de buizen te mengen en te draaien voordat je ze weer op ijs plaatst.
  7. Breng de 16 monsters en de testreactie gedurende 1 minuut bij 90 °C over op een warmteblok en breng terug naar ijs.
  8. Breng afzonderlijk 4 μL 50% PEG over naar elke buis, veeg om te mengen en draai de buizen rond voordat u ze weer op ijs plaatst.
  9. Ontdooi 2,5 μL aliquots uit elk van de 17 3' barcodeadapters (16 experimentele (#1 tot #16) en testadapter (#17)) en plaats op ijs om te ontdooien.
  10. Breng 1 μL van elk van de 17 adapters over naar de corresponderende 16 monsters die sEV-RNA bevatten en één testmonster, met Ligation Master Mix (d.w.z. 4.5 μL) en 50% PEG (d.w.z. 4 μL).
    OPMERKING: Alle oplossingen en reacties worden gemengd door de buizen te tikken en te draaien, in plaats van de oplossingen op en neer te pipetteren, om materiaalverlies te voorkomen.
  11. Bereid het verdunde T4 RNA ligase 2 afgekapte K227Q-ligatie-enzym voor door 10 μL van het enzym met 10 μL nucleasevrij ddH2O toe te voegen aan een nieuwe gesiliconiseerde buis van 1,5 ml.
  12. Breng 1 μL van het verdunde T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q ligatie-enzym over in elk van de 17 buisjes (16 experimentele en 1 test-RNA-monsters). Pipetter niet op en neer, verwissel de tips tussen elke buisjes, houd de buisjes op ijs, blader het mengsel, centrifugeer en plaats de buisjes op ijs.
  13. Plaats de ligaties op vers ijs in een buishouder in een ijsemmer in de koelcel, een nacht gedurende maximaal 18 uur.

4. PAGE isolatie van de 3'-adapter geligeerde kleine RNA's

  1. Plaats de 17 buisjes gedurende 1 minuut op een warmteblok bij 90 °C om het T4 RNA Ligase 2 te deactiveren en plaats ze 2 minuten op ijs om af te koelen.
  2. Combineer 1 μl GlycoBlue en 26 μl 5 M nucleasevrije NaCl in een verse tube en breng 1,2 μl van deze precipitatieoplossing over in elk van de 17 tubes.
  3. Voeg 63 μL 100% ethanol toe aan elk van de 17 buisjes, sluit, veeg en draai 2 s naar beneden voordat u het weer op ijs plaatst.
  4. Combineer de inhoud van de 16 sEV-RNA-buisjes in een enkele gesiliconiseerde buis van 1,5 ml, terwijl u de test-RNA-ligatiebuis gescheiden houdt.
  5. Keer de buis met de gecombineerde monsters 3x om om te mengen, centrifugeer kort gedurende 2 s en zet 60 minuten op ijs om neer te slaan.
  6. Bereid als volgt een grote (16 x 20cm2) 15% polyacrylamide (PAGE) gel voor:
    1. Siliconiseren (d.w.z. met behulp van een oplossing op siliconenbasis) en giet de korte en lange glasplaten samen met afstandhouders van 0,1 cm.
    2. Bereid de 15% PAGE-gelmix voor door 9 ml systeemverdunningsmiddel, 18 ml systeemconcentraat, 3 ml systeembuffer, 240 μl APS (9%) en 12 μl TEMED te combineren in een conische tube van 50 ml.
    3. Breng de oplossing snel over tussen de glasplaten met behulp van een pipet van 30 ml. Voordat de gel polymeriseert, voegt u een kam met 14 putjes (0,1 cm dik) toe en zet u de gel 30 minuten rechtop bij RT.
  7. Haal de buis met de gecombineerde RNA-monsters uit het ijs en centrifugeer deze gedurende 60 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C.
  8. Bewerk ondertussen het instellen van de 15% PAGE door de kam voorzichtig te verwijderen, de putjes schoon te maken met nucleasevrije H2O met een spuitfles boven een gootsteen, alvorens te drogen en de 15% PAGE op het gelapparaat in te stellen, waarbij zowel de bovenste als de onderste reservoirs worden gevuld met 0,5x Tris-Boraat EDTA (TBE) oplossing, voorafgaand aan een voorrun van 30 minuten op 450 V.
  9. Haal de buis uit de centrifuge (stap 4.6) en droog de RNA-pellet voorzichtig af met behulp van een pasteurpipet met aan het uiteinde een niet-filtertip van 10 μl die is aangesloten op een vacuümsysteem, zonder de pellet te verstoren.
  10. Resuspendeer de RNA-pellet met de neergeslagen 16 RNA-ligaties in 20 μl nucleasevrije ddH2O en voeg 20 μl PAA-gellaadoplossing toe. Veeg de buis om te mengen, centrifugeer gedurende 2 s en zet op ijs.
  11. Vervang 0.5x TBE van het gelapparaat door verse 0.5x TBE.
  12. Zet een buisje op met een 20 bp RNA-formaatladder, twee buisjes met elk van de twee 3'-ligatie korte DNA-groottemarkers (aanvullend bestand 1) en een buisje met de RNA-ligatietestoligonucleotide (d.w.z. geligeerd met barcode-adapter #17).
  13. Voeg aan elk van de buisjes (d.w.z. ladder, 3' ligatie korte DNA-oligo's en RNA-ligatietest) 20 μL PAA-gellaadoplossing toe.
  14. Stel de 16 geligeerde RNA-monsterbuisjes en 1 RNA-ligatiereageerbuis gedurende 1 minuut in op 90 °C en zet terug op ijs.
  15. Vervang 0,5x TBE-buffer uit zowel de onderste als de bovenste reservoirs (d.w.z. voeg een buffer toe onder het niveau van de put zodat er geen kruisbesmetting tussen de putten is tijdens het laden) en laad de ladder op de uiteinden van de gel, de RNA-testligatie, de twee korte DNA-groottemarkeringen aan weerszijden van de put met de 16 gecombineerde 3' RNA-ligaties met streepjescode (zie figuur 5).
  16. Laat de 15% PAGE-gel met alle monsters gedurende 90 minuten draaien bij 450 V (~35 mA) onder gekoelde omstandigheden (d.w.z. met ventilatoren die lucht op de glasplaten blazen).
  17. Verwijder 15% PAGE van glas en spuit het lichtjes in met SYBR Gold oplossing (10 μL SYBR Gold in 25 ml 0,5x TBE) en laat het 5 minuten schuin in het donker staan.
  18. Plaats de gel op een blauwlichtstraler (Figuur 5) en lijn zowel de 19 nt-3'-adapter als de 24 nt-3'-adaptergroottemarker korte DNA-oligonucleotiden uit met een liniaal en snijd het gebied van de gel dat de geligeerde miRNA-constructen bevat weg (Figuur 6 geeft de 3'-ligatie en het resulterende construct weer). Snijd afzonderlijk de bovenste band van de RNA-testligatie weg, die de volgende dag ook zal worden gebruikt voor een test 5'-ligatie.
  19. Plaats de twee afzonderlijke uitgesneden gelstukjes (d.w.z. voor 16 RNA-monsters en voor testligatie) in verschillende gelbrekerbuizen van 0.5 ml die in gesiliconiseerde buizen van 1.5 ml zijn geplaatst, centrifugeer bij 16,000 × g gedurende 3 minuten bij RT en suspendeer vervolgens de twee set gefragmenteerde gelstukjes opnieuw met 300 μL 400 mM NaCl-oplossing, sluit de buisjes, en verzegel ze met parafilm.
  20. Zet de buizen op een schudder met agitatie bij 1.100 tpm bij 4 °C, 's nachts (16-17 uur).

5. Ligatie van de 5'-adapter

  1. Breng twee afzonderlijke gefragmenteerde gels en hun oplossingen (16 x 3' barcodemonsters (barcodes #1 tot #16) en 3' barcode test-RNA (barcode #17)) over op twee afzonderlijke filterbuisjes van 5 μm, elk in gesiliconiseerde buisjes van 1,5 ml, sluit ze af met parafilm en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.300 g × g bij RT.
  2. Voeg 950 μL 100% ethanol toe aan elke gefilterde oplossing, sluit de buisjes, keer om om te mengen, laat 2 s naar beneden draaien, sluit de buisjes af met parafilm en zet ze 1 uur op ijs.
  3. Bereid vers een 50% waterige DMSO-bouillon door 1 ml nucleasevrij water te combineren met 1 ml DMSO, wikkel de buis in aluminiumfolie en bewaar bij RT in het donker.
  4. Bereid een 15% PAGE-gel voor en voer deze voor volgens de stappen beschreven in paragraaf 4.6.
  5. Centrifugeer de buisjes met de 3' geligeerde 16 RNA-monsters en de test-RNA-ligatie bij 16.000 × g gedurende 60 minuten bij 4 °C om de geligeerde RNA's neer te slaan.
  6. Verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de RNA-pellets aan te raken en vacuüm droog.
  7. Resuspendeer de 3' geligeerde pellet van 16 RNA-monsters en test RNA elk in 8 μl nucleasevrije ddH2O zonder op en neer te pipetteren. Veeg de buizen lichtjes om te mengen, centrifugeer gedurende 2 s (2.000 × g) bij RT en zet de buizen op ijs.
  8. Bereid de 10x RNA-ligasebuffer (met ATP) voor door 500 μl 1 M Tris (pH 7,5), 100 μl 1 M MgCl2, 50 μl 20 mg/ml geacetyleerd BSA, 200 μl 10 mM ATP, 7 μl 2-mercaptoethanol 14 M en 143 μl RNasevrij water te mengen in een buis van 1,5 ml.
  9. Voeg 2 μL 10x RNA-ligasebuffer (d.w.z. met ATP), 1 μL 100 μM 5'-adapter en 4 μL 50% waterige DMSO toe aan elke buis. Flick om te mengen, draai gedurende 2 s op RT, zet de buis vervolgens gedurende 1 minuut op 90 °C om het RNA te denatureren en plaats het terug op ijs.
  10. Voeg 3 μL 50% DMSO toe, flick om te mengen, draai tot pellet, voeg 3 μL T4 RNA Ligase toe aan elke buis, tik de buisjes, centrifugeer gedurende 2 s bij RT en zet de buisjes op de shaker op 37 °C gedurende 75 min.
    OPMERKING: Pipetter niet op en neer.
  11. Bereid de 20 nt DNA-ladder voor en twee afzonderlijke buisjes met de 5'-ligatiegroottemarker lange DNA-oligonucleotiden (aanvullend bestand 1; 5'adapter-19 nt-3'-adapter en 5'adapter-24 nt-3'-adapter), en voeg 20 μL PAA toe aan elk van de buisjes.
  12. Zodra de 5'-adapterligatie is voltooid, voegt u 20 μL PAA toe aan elk van de twee ligaties (d.w.z. 16 RNA-monsters en test-RNA), mengt u door te tikken, spint u naar beneden en stelt u gedurende 90 minuten in op 1 °C, waarna u de buizen weer op ijs plaatst.
  13. Leeg de bovenste en onderste reservoirs van het gelapparaat en voeg verse 0,5x TBE-oplossing toe onder het niveau van de putjes van het bovenste reservoir.
  14. Laad de ladder aan het uiteinde van de gel, het 5' geligeerde test-RNA-monster, de twee groottemarker lange DNA-oligonucleotiden (d.w.z. 5' adapter-19 nt-3'-adapter en 5' adapter-24 nt-3'-adapter) in putjes rond de put waar de 5' geligeerde 16 RNA-monsters zullen worden geladen (Figuur 6 toont de 5'-ligatie en de resulterende constructie). Laat de gel 90 minuten draaien op 450 volt.
  15. Zodra de run is voltooid, verwijdert u de gel van het apparaat en het glas en spuit u deze met een SYBR Gold-oplossing (d.w.z. 10 μL SYBR Gold in 25 ml 0.5x TBE) en laat u het 5 minuten in het donker staan.
  16. Gebruik de 5'-adapter-19 nt-3'-adapter en beide 5'-adapter-24 nt-3'-adaptergroottemarkeringen lange DNA-oligonucleotiden als grootterichtlijnen om het gedeelte van de gel met de 5' geligeerde 16-RNA-monsters direct weg te snijden (Figuur 7).
    OPMERKING: De test-RNA-ligatie wordt op de gel geëvalueerd om aan te tonen dat de ligatie van de 5'-adapter een verschuiving mogelijk maakt die qua grootte gelijk is aan de groottemarkeringen. De test-RNA-ligatie wordt niet uit de gel weggesneden; alleen de geligeerde 16 gecombineerde RNA-monsters.
  17. Breng het uitgesneden gelstuk met de 16 geligeerde RNA-monsters over in een gelbrekerbuis van 0.5 ml die in een buis van 1.5 ml is geplaatst, draai op 16,000 × g gedurende 3 minuten bij RT en voeg vervolgens 300 μL 300 mM NaCl en 1 μL 100 μM 3' RT/PCR-primer (Figuur 1B) toe aan de gemalen gelstukjes in de buis.
  18. Sluit de buis af met parafilm en zet deze op een schudder die 's nachts (17-18 uur) in een koude ruimte roert bij 1.100 tpm bij 4 °C.

6. Omgekeerde transcriptie van de 5'- en 3'-geligeerde kleine niet-coderende RNA's en miRNA's met streepjescode

  1. Pipetteer de oplossing uit de buis met de gemalen gel op een filterbuis van 5 μm die in een gesiliconiseerde RNasevrije buis van 1,5 ml is gestoken en draai kort om de oplossing door het filter te laten komen.
  2. Voeg 950 μL 100% ethanol toe aan deze gefilterde oplossing, keer de buis om om te mengen, draai gedurende 2 s en zet 60 minuten op ijs.
  3. Sla de RNA-pellet neer door centrifugatie van de buis bij 16.000 g × g bij 4 °C gedurende 1 uur.
  4. Pak de buis op, verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de pellet aan te raken en droog de pellet vacuüm voordat u deze opnieuw suspendeert in 5,6 μl nucleasevrije H2O.
  5. Stel de RT-reactie in door 3 μL 5x eerste strengbuffer, 4,2 μL 10x dNTP's (elk bij 2 mM) en 1,5 μL Dithiothreitol (DTT) aan de buis toe te voegen. Veeg om te mixen en draai gedurende 2 s.
  6. Stel de reactie precies 30 s in op 90 °C en breng de buis vervolgens gedurende 2 minuten over op een blok bij 50 °C.
  7. Start de RT-reactie door 0,75 μl reverse transcriptase-enzym aan de oplossing toe te voegen, druk om te mengen en stel gedurende 35 minuten in op 50 °C.
  8. Breng de buis gedurende 1 minuut over bij 95 °C om het enzym en de cDNA/RNA-strengen te denatureren, voeg vervolgens 95 μL RNasevrije H2O toe, veeg de buis om te mengen en zet deze 2 minuten op ijs. Dit buisje bevat cDNA dat is gegenereerd uit de 16 RNA-monsters, elk afzonderlijk voorzien van een barcode in 3'.

7. Voer de test uit PCR en grootschalige amplificatie

  1. Bereid verse 10x PCR-buffer voor door 304 μL nucleasevrije H2O, 125 μL 2 M KCl, 50 μL 1 M Tris pH 8,0, 10 μL 1 M MgCl2, 5 μL 1% Triton X-100 en 6 μL 1 M 2-mercaptoethanol te combineren in een tube die op ijs kan worden bewaard.
  2. Stel een pilot-/test-PCR-reactie samen voor het cDNA geproduceerd in stap 6.8 (hierboven) door 67 μL nucleasevrije H2O te combineren met 10 μL 10x PCR-buffer, 10 μL 10x dNTP's, 0,5 μL 100 μM 5' PCR-primer, 0,5 μL 100 μM 3' PCR-primer, 10 μL cDNA Stock Library, en 2 μL 50x Taq-polymerase in een verse PCR-buis.
    OPMERKING: Voordat u de PCR-amplificaties uitvoert, stelt u het instrument in door als volgt twee verschillende bestanden aan te maken: Voor bestand # 1: 94 °C gedurende 45 s, 50 °C gedurende 85 s en 72 °C gedurende 60 s gedurende 12 cycli en 4 °C; en voor File#2: 94 °C gedurende 45 s, 50 °C gedurende 85 s en 72 °C gedurende 60 s gedurende 2 cycli en 4 °C.
  3. Plaats voor de pilot/test PCR-reactie het PCR-buisje met de 100 μL van de PCR-reactie in de Thermocycler en voer Bestand#1 uit.
  4. Zodra File#1 is voltooid, opent u de PCR-buis en brengt u 12 μL van de reactie over in een microcentrifuge van 1,5 ml die 3 μL 5x gelladende kleurstof bevat. Sluit de buis en schrijf "12 cycli" op de dop.
  5. Neem de PCR-buis, plaats deze in de thermocycler en start File#2.
  6. Zodra File#2 compleet is, brengt u 12 μL van de PCR-reactie over in een tube van 1,5 ml met 3 μL 5x gel Loading kleurstof en schrijft u "14 cycli" op de dop.
  7. Herhaal de PCR-amplificaties nog vier keer achter elkaar (d.w.z. elk twee PCR-cycli), terwijl u aan het einde van elke amplificatie 12 μL PCR-product overbrengt, en verkrijg op uw beurt vier verschillende buisjes, gelabeld met 16, 18, 20 en 22 cycli.
  8. Laad de 20 nt size ladder en elk van de PCR-geamplificeerde producten op een 2,5% agarose en laat de gel 30 minuten in 0,5x TBE op 120 V lopen.
  9. Identificeer de optimale PCR-amplificatiecyclus (Figuur 8A), op basis van de verhouding en aanwezigheid van primerdimeren (onderste band) en het geamplificeerde cDNA (bovenste band).
    OPMERKING Aangezien de totale RNA-invoer met 16 monsters lager kan zijn dan 1 ng, wordt verwacht dat primerdimeren sneller en in grotere hoeveelheden een product zullen genereren dan het gezuiverde cDNA. De adequate PCR-cyclus wordt dus over het algemeen geselecteerd tussen 18 en 22 cycli. In figuur 8A is de adequate PCR-cyclus voor deze bibliotheek 20. In figuur 8B wordt de grootte van het PCR-construct gedetailleerd.
  10. Zodra de adequate PCR-amplificatiecyclus is vastgesteld, stelt u een negatieve PCR (geen cDNA) en vier positieve PCR-reacties van 100 μl in (d.w.z. elk met 12 μl cDNA).
    1. Om de bereiding van de PCR-reacties te vereenvoudigen, zet u een PCR-mastermix op (d.w.z. voor 4,5 reacties) in een buis van 1,5 ml door 292,5 μl nucleasevrije H2O, 45 μl 10x PCR-buffer, 45 μl 10x dNTP's, 3,25 μl 3' RT/PCR-primer (figuur 1B) en 2,25 μl 5' PCR-primer te combineren (figuur 1B). Keer deze buis om om te mengen en draai om op de bodem van de buis te verzamelen.
    2. Breng 86 μl van de PCR Master Mix over in elk van de vier PCR-buisjes van 0,5 ml.
    3. Voeg 12 μL cDNA Library (bewaard op ijs) en vervolgens 2 μL 50x titanium Taq-polymerase toe aan elk van de 4 PCR-buisjes en meng door op en neer te pipetteren.
    4. Bereid de no-template PCR-reactiebuis voor door 77 μL nucleasevrije H2O, 10 μL 10x PCR-buffer, 10 μL 10x dNTP's, 0,5 μL 5' PCR-primer, 0,5 μL 3' PCR-primer en 2 μL 50x Taq-polymerase toe te voegen aan een afzonderlijke PCR-buis en op en neer te pipetteren om te mengen.
    5. Stel de PCR-buisjes in de thermocycler in met behulp van de PCR-cyclus die is geïdentificeerd in stap 7.9 en stel een nieuw programma in op de thermocycler om indien nodig te amplificeren.
  11. Bereid een 2,5% agarosegel met 0,5x TBE en ethidiumbromide en breng 12 μL van elk PCR-buisje over in individuele buisjes met 3 μL 5x gelladende kleurstof.
  12. Bereid de 20 nt ladder voor door 3 μL ladder te combineren met 9 μL nucleasevrije H2O en 3 μL gel loading kleurstof.
  13. Laad de gel, laat deze 30 minuten draaien op 120 V en controleer of de PCR-amplificatie vergelijkbaar is tussen de vier verschillende reacties en of de knop zonder sjabloon leeg is (Figuur 8C).
  14. Combineer de vier PCR-reacties tussen twee gesiliconiseerde microcentrifugebuisjes van 1,5 ml (d.w.z. twee buisjes die elk 90 μl product bevatten) en voeg 18 μl 5 M NaCl en 800 μl 100% ethanol toe aan elk van de twee buisjes.
    1. Keer de buisjes om om te mengen en bewaar ze bij -20 °C om ze een nacht neer te slaan.

8. Zuivering van de PCR-geamplificeerde bibliotheek

  1. Centrifugeer de twee buisjes met de gemengde positieve PCR-reacties gedurende 60 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C.
  2. Verwijder na 60 minuten het supernatant, droog de DNA-pellets vacuüm en suspendeer ze opnieuw in 19,5 μl 1x buffer en voeg vervolgens 0,5 μl PmeI-enzym toe.
  3. Stel de PmeI-digesten gedurende 2 uur in op 37 °C om alle DNA-groottemarkers te verwijderen die in de aangrenzende putjes liepen (d.w.z. 19 nt-3'-adapter, 24 nt-3'-adapter) of RNA-dragers (d.w.z. RNA-extractiedrager, RNA post-3'-ligatiedrager) potentiële verontreinigingen (d.w.z. zie PmeI-sites opgenomen in RNA- en DNA-primers in aanvullend bestand 1)
  4. Laat de twee digesten in drie verschillende putjes van een 2,5% agarosegel draaien met 0,5x TBE om te voorkomen dat er een teveel aan primerdimeren in een enkel putje ontstaat en er een uitstrijkje ontstaat.
    1. Voeg 3 μL 5x gelladende kleurstof toe aan elk van de digests, combineer de twee digests en laad vervolgens 16,5 μL in drie afzonderlijke aangrenzende putjes.
    2. Laad de 20 nt DNA-grootteladder bij de eindputjes van de gel en laat de gel 90 minuten draaien op 150 V (Figuur 8D).
  5. Om de DNA-bibliotheken te zuiveren, snijdt u de bovenste PCR-banden weg uit de drie aangrenzende banen van de gel en brengt u ze over in een nieuwe buis van 1,5 ml.
  6. Zuiver de PCR-geamplificeerde bibliotheek met behulp van een gelextractiekit, volgens de instructies van de fabrikant, en kwantificeer het gezuiverde DNA-product met behulp van een fluorometer, volgens de instructies van de fabrikant.

9. Uiteindelijke PCR-amplificatie om barcodes toe te voegen die compatibel zijn met de sequencer

  1. Bereid een verse 10x PCR-buffermix voor zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Stel PCR-reacties in door één negatieve controle (geen amplicons) en drie PCR-reacties op te nemen met 0,75 ng van het PCR-product gezuiverd uit de eerste PCR-amplificatie in elk van de drie buisjes, als volgt:
    1. Zet drie individuele PCR-reacties op door 75 μL ddH2O, 10 μL 10x PCR-buffer, 10 μL 10x dNTP's, 1 μL 5' 2nd PCR primer (d.w.z. primer i503 (Figuur 1B)), 1 μL 3' PCR 2nd primer (d.w.z. primer i702 (Figuur 1B)), 1 μL PCR-product (d.w.z. 0,75 ng van gel-gezuiverd 1st PCR-product), en 2 μL Titanium Taq Polymerase.
    2. Stel de negatieve PCR-controle in (d.w.z. geen DNA-sjabloon) door 76 μL ddH2O, 10 μL 10x PCR-buffer, 10 μL 10x dNTP's, 1 μL 5' 2nd PCR-primer (d.w.z. primer i503 (Figuur 1B)), 1 μL 3' PCR 2nd primer (d.w.z. primer i702 (Figuur 1B)) te mengen, en 2 μL Taq Polymerase.
    3. Stel de vier PCR-reacties (d.w.z. één negatieve controle, drie positieve) in op een thermocycler die als volgt is geprogrammeerd: 72 °C gedurende 3 min, 95 °C gedurende 30 s en 95 °C gedurende 10 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s gedurende 9 cycli en vervolgens 72 °C gedurende 5 min, en een laatste houdhouding bij 10 °C.
  3. Zodra de PCR-cycli zijn voltooid, neemt u 10 μL van het reactiemengsel en voegt u 3 μL laadkleurstof toe, en evalueert u de producten op een 2,5% agarosegel zoals weergegeven in Figuur 9A, samen met de 20 nt ladder.
  4. Na validatie van de grootte van het PCR-product (d.w.z. de bovenste PCR-band van 164 bp zoals weergegeven in figuur 9B en figuur 6 voor de grootte en details over het uiteindelijke construct) en de bandverdeling, combineert u de PCR-producten in twee buisjes door aan elk 135 μl PCR-product (d.w.z. 90 μl + 45 μl) 13,5 μl 5 M NaCl toe te voegen, en 650 μL 100% ethanol, en neerslaan bij -20 °C gedurende de nacht.
  5. Centrifugeer de volgende dag de twee PCR-buisjes gedurende 60 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C.
  6. Droog elke pellet, suspendeer opnieuw met 19,5 μL 1x PmeI-buffer en voeg 0,5 μL PmeI toe gedurende 2 uur bij 37 °C op een shaker om alle groottemarkeringen die in de aangrenzende putjes liepen (d.w.z. 19 nt-3'-adapter, 24 nt-3'-adapter) of RNA-dragers (d.w.z. RNA-extractiedrager, RNA post-3' ligatiedrager) verontreinigingen verder te verwijderen.
  7. Doe de verteerde producten in drie putjes van een 2,5% agarosegel en scheid ze gedurende 90 minuten op 150 V.
  8. Snijd de bovenste band weg, die loopt op 164 bp (Figuur 9C), en zuiver het DNA-product met behulp van een DNA-isolatiekit en kwantificeer met een fluorometer.
  9. Voer het uiteindelijke PCR-product uit op een DNA-chip om de grootte, concentratie en zuiverheid van de bibliotheek te valideren vóór verdunning en analyse met behulp van een sequencer.
  10. Breng het FASTQ-gegevensbestand over naar de RNAworld-pijplijn voor het bijsnijden van de adapter, demultiplexing, uitlijning met het menselijk genoom, voorafgaand aan miRNA-analyses, zoals eerder beschreven41. Als alternatief kunt u met behulp van het script in aanvullend bestand 3 de lezingen van het FASTQ-bestand demultiplex en verder verwerken met behulp van een analytische pijplijn voor klein RNA naar keuze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals beschreven in het bovenstaande protocol, beschrijven we de gelijktijdige verwerking van maximaal 16 individuele kleine extracellulaire blaasjes (sEV) RNA-monsters (d.w.z. voor analyse van kleine niet-coderende RNA's en miRNA's), die samen worden geanalyseerd binnen een enkele bibliotheek, na het ondergaan van 3' barcodering. De sEV's die voor onze analyses werden geselecteerd, werden geïsoleerd door middel van ultracentrifugatie, zoals eerder beschreven37,40...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een cDNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol ontwikkeld voor reproduceerbare en gevoelige next-generation sequencing (NGS) van niet-coderende RNA's, inclusief microRNA's (miRNA's) die efficiënt worden geïsoleerd uit kleine extracellulaire blaasjes (sEV's). Gezien het feit dat een beperkte hoeveelheid kleine niet-coderende RNA's en miRNA's kan worden teruggewonnen uit globaal of selectief geïsoleerde sEV's, hebben we getracht onze cDNA-bibliotheekvoorbereidingsprocedure te optimal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. is een niet-werkende oprichter van EValuate Diagnostics, Inc met een klein percentage van het eigen vermogen in het bedrijf. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen het laboratorium van Dr. Thomas Tuschl bedanken voor hun steun en voor het verlenen van toegang tot de originele technologie die in hun laboratorium is ontwikkeld, en voor het verlenen van toegang tot de RNAworld-pijplijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoethanolSigmaO3445I-100 
20 nt ladder Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminSigmaB8894-5ML 
50x Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific 7727-54-0
Blue light transilluminator- Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Filter tube with 5mm filterIST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mLFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sequencer Illumina20047256
Jersey-Cote (Silicon-based solution)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen28704
Qubit FluorometerThermofisher ScientificQ33238
Restriction enzyme PmeI and 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Reverse transcriptase- Superscript IIIThermoFisher12574026
RNase-free water AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixerEppendorf5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Titanium Taq PolymeraseTakara639208
T4 RNA Ligase 1 NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicroRNA sequencingsEV miRNA profileringRNA barcodingdual index sequencinglage RNA inputcirculerende biomarkersintercellulaire communicatie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen