Methodenartikel

Bemonstering van door N-methyl-N-nitrosoureum geïnduceerde netvliesbeschadiging bij ratten en multi-index evaluatie van pathologische veranderingen

571 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67159

⸱

13 september 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een procedure voor het bemonsteren van het netvlies bij ratten en het gebruik van hematoxyline-eosinekleuring, TUNEL-assay en Western blot om pathologische veranderingen en apoptose in het netvlies te detecteren na intraperitoneale injectie van N-methyl-N-nitrosoureum.

Samenvatting

Retinopathie kan worden waargenomen bij de meeste oogaandoeningen en de late complicaties van diabetes mellitus. De specifieke pigmentepitheelcellen en de beschadiging en degeneratie van optische cellen zijn de belangrijkste kenmerken van retinopathie. Veel traditionele geneesmiddelen hebben een aanzienlijke klinische werkzaamheid aangetoond bij de behandeling van retinopathie. Het snel en volledig verkrijgen van een netvlies is een belangrijke stap in het onderzoek naar traditionele geneeskunde voor de behandeling van retinopathie. In deze studie streven we ernaar een gestandaardiseerde en uitvoerbare procedure te bieden voor bemonstering van door N-methyl-N-nitrosoureum (MNU) geïnduceerde netvliesbeschadiging bij ratten en multi-indexevaluatie van pathologische veranderingen. Ratten werden eenmaal intraperitoneaal geïnjecteerd met 60 mg/kg MNU om netvliesbeschadiging te induceren, en netvliesmonsters werden na 7 dagen verkregen. Daarnaast voerden we hematoxyline-eosinekleuring uit om pathologische veranderingen in het netvlies te beoordelen. Bepaling van de apoptosesnelheid en het apoptose-eiwit door TUNEL en Western blot. Deze gestandaardiseerde protocollen voor netvliesbemonstering en evaluatie van pathologische veranderingen zijn nuttig bij het bevorderen van de verkenning van het mechanisme van retinopathie en de ontdekking van nieuwe en effectieve traditionele kruiden.

Inleiding

Retinitis pigmentosa (RP) is een erfelijke en verblindende netvliesaandoening1. De incidentie van RP ligt tussen 1/3500 en 1/5000 en beïnvloedt de visuele functie van ongeveer 2,5 miljoen mensen in de wereld. Het is een van de meest bekende ziekten die leiden tot slechtziendheid bij de mens en een aanzienlijke last vormen voor de hele samenleving2. De ziekte wordt gekenmerkt door het geleidelijke verlies van de functie van het pigmentepitheel van het netvlies en de progressieve apoptose van fotoreceptoren. In een vroeg stadium ervaren patiënten nachtblindheid, die zich manifesteert als defecten aan het perifere gezichtsveld en uiteindelijk leidt tot verlies van centraal zicht3. Daarom is remming van retinale fotoreceptorapoptose het punt voor de preventie en behandeling van RP.

Retinale celapoptose is een gemeenschappelijk kenmerk van menselijke RP en modeldieren4. Intraperitoneale injectie van 60 mg/kg N-methyl-N-nitrosoureum (MNU) bij ratten gedurende 7 dagen kan apoptose en verlies van retinale fotoreceptorcellen veroorzaken, en het is een veelgebruikt diermodel van RP 5,6. Het analyseren van de veranderingen in pathologische structuur, specifieke celapoptose en apoptose-gerelateerde eiwitexpressie van retinaal weefsel in modeldieren kan effectieve experimentele gegevens en theoretische ondersteuning bieden bij het bestuderen van de pathogenese van menselijke RP en screeningsgeneesmiddelen 7,8. Daarom bepaalt de kwaliteit van retinale monsters de betrouwbaarheid van experimentele gegevens. Vanwege de bijzonderheid van oogweefsel zijn er echter zeer weinig rapporten over hoe het netvlies van de rat 9 kan wordenverkregen.

Dit artikel biedt een eenvoudige, snelle, gestandaardiseerde en operabele procedure voor netvliesbemonstering bij ratten om de bovenstaande tekortkomingen te verhelpen. Hematoxyline-eosinekleuring (HE), terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde deoxyuridinetrifosfaat-digoxigenine nick-end labeling (TUNEL) kleuring en Western blot worden gebruikt om de pathologische veranderingen in beschadiging van het netvliesweefsel en apoptose bij de ratten te analyseren. Alle methoden zijn afgeleid van de ervaring van onze onderzoeksgroep met de specifieke operationele processen.

Protocol

Alle protocollen en chirurgische ingrepen zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Ningxia Medical University (ethisch nummer: nr. 2020-Q066). SPF Sprauge-Dawley (SD) mannelijke ratten, in de leeftijd van 7-8 weken en met een gewicht van 200-220 g, werden gekocht bij de Ningxia Medical University met het dierlicentienummer SCXK (Ning) 2020-0001. Alle dieren zijn grootgebracht in het Laboratory Animal Center van de Ningxia Medical University. De temperatuur en vochtigheid waren geschikt, de dag-nachtlichtcyclus werd gehandhaafd en het voedsel en water waren gratis en voldoende.

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Voorbereiding van materialen
    1. Bereid rattenplaten, inhalatie-anesthesieapparaten, ingebedde dozen, bevroren bewaarbuizen, chirurgische wegwerphandschoenen en -maskers, flessen met wijde opening, 4% paraformaldehyde, ijspakken, oogheelkundige scharen, oogheelkundige pincetten, chirurgische messen en meshandvatten, microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor en steriliseer ze van tevoren (zie materiaaltabel).
  2. Voorbereiding van dieren
    1. Verdeel willekeurig 20 mannelijke SD-ratten in de modelgroep (n=10) en de controlegroep (n=10). Injecteer modelratten intraperitoneaal met 60 mg/kg MNU en injecteer controleratten intraperitoneaal met dezelfde hoeveelheid zoutoplossing.
    2. Vast de ratten na 7 dagen injectie en laat ze de avond voor de bemonstering vrij drinken.
    3. Leg de volgende dag de rat in rugligging op de operatietafel en gebruik een masker om anesthesie toe te dienen met 4% isofluraan en 2 l/min zuurstof. Meet de diepte van de anesthesie door in het midden van de voet te knijpen om de reacties van de ratten te observeren.

2. Retinale bemonstering voor detectie van eiwitfactor

  1. Fixeer de oogkas van de rat met de linkerhand en verwijder het oog met matige kracht met de rechterhand met behulp van een oogheelkundige buigtang. Plaats de oogbol in een sagittale positie in een koude glazen schaal.
  2. Maak met de linkerhand een oogheelkundig recht pincet om de oogbol te fixeren en met de rechterhand het chirurgische mesje vast, een longitudinale incisie van 2 mm in de buurt van de plaats van de lens.
  3. Knip het hoornvlies af met de oogheelkundige schaar langs de incisie en pel voorzichtig de lens, het glasvocht en de blootliggende oogschelp af.
  4. Plaats de onderkant van de oogschelp aan het uiteinde van de microcentrifugebuis van 1.5 ml, draai de oogschelp over de buis en leg het netvlies bloot (het netvlies is zwak geel).
  5. Verwijder het hele netvlies langs de sclerale wand van de oogbol met een oogheelkundig buigpincet, plaats het vervolgens in een bevroren buisje en bewaar het in een tank met vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik (Figuur 1).

3. Netvliesbemonstering voor pathologisch onderzoek en specifieke celkleuring

  1. Gebruik met de linkerhand het oogpincet om de hoek van het oog van de rat op te tillen. Gebruik met de rechterhand een chirurgisch mesje om een opening van 4 mm langs de ooghoek van de rat te snijden.
  2. Gebruik het oogpincet om de rand van de oogbol bij de opening in de linkerhand vast te klemmen. Gebruik een oogheelkundige schaar om de omliggende weefsels langs de rand van de oogbol af te knippen, terwijl u aandacht besteedt aan het reinigen van de omliggende weefsels van de oogbol.
  3. Scheid de weefsels rond de oogzenuw aan de achterste pool van de oogbol met een oogpincet, snijd de oogzenuw door en let op het behoud ervan. Verwijder vervolgens de oogbol.
  4. Was de verwijderde oogbol in een zoutoplossing om eventueel achtergebleven bloed te verwijderen, rol het op filterpapier om overtollig water te absorberen en plaats het op koude aluminiumfolie.
  5. Fixeer het oog met een oogheelkundig pincet. Maak met een chirurgisch mesje een longitudinale incisie van 4 mm langs de kruising van het hoornvlies en het netvlies.
  6. Verwijder het hoornvlies met een oogheelkundige schaar, maak een cirkelvormige snede langs de incisie en verwijder voorzichtig de lens en het glasvocht.
  7. Plaats de resterende oogschelp met oogzenuw in een inbeddingsdoos en fixeer deze in 4% paraformaldehyde.
  8. Dompel paraformaldehyde-gefixeerde monsters in paraffine en snijd in plakjes van 4 μm voor HE-kleuring en TUNEL-kleuring7.

4. HE kleuring van het netvlies van de rat

  1. Ontwaxen en hydratatie: Leg de plakjes 10 minuten in xyleen, herhaal het proces nog 10 minuten, gevolgd door absolute ethanol gedurende 5 minuten, herhaal de ethanolbehandeling nog eens 5 minuten, gevolgd door behandeling met 95% alcohol gedurende 5 minuten, dan in 85% alcohol gedurende 5 minuten en tenslotte in 75% alcohol gedurende 5 minuten.
  2. Hematoxylinekleuring: Spoel de plak 5 minuten af met gedeïoniseerd water. Gebruik 100 μL hematoxylinekleuringsoplossing en bevlek gedurende 5 minuten, spoel af met gedeïoniseerd water gedurende 5-10 s. Voeg 100 μL 1% zoutzuur ethanol toe gedurende 30 s, spoel af met gedeïoniseerd water gedurende 20 minuten en voeg 100 μL 0,2% ammoniakwater toe gedurende 1 minuut. Spoel 5 minuten af met gedeïoniseerd water.
  3. Eosinekleuring: Gebruik 100 μL eosinekleuringsoplossing om gedurende 5 minuten te kleuren en spoel gedurende 30 s af met gedeïoniseerd water.
  4. Uitdroging en afdichting: Dompel de plakjes 5 minuten onder in 70% alcohol, vervolgens 5 minuten in 85% alcohol, gevolgd door 90% alcohol gedurende 5 minuten en absolute ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal de absolute ethanolbehandeling nog 5 minuten, dompel dan 5 minuten onder in xyleen en herhaal het proces nog eens 5 minuten. Sluit ten slotte af door ongeveer 100 μL neutrale hars toe te voegen aan het oppervlak van de plakjes en dek het vervolgens af met een afdekglas.
  5. Afbeelding van de dia's: Plaats de bevlekte plakjes op de microscoop, pas de focus van de microscoop aan totdat het beeld duidelijk zichtbaar is, stel de vergroting in op 400x en leg het beeld vast.
  6. Meet de totale dikte van het netvlies en de dikte van het buitenste netvlies: Meet de totale dikte van het netvlies en de dikte van het buitenste netvlies (dikte van de buitenste nucleaire laag en de fotoreceptorlaag) en bereken het percentage van de buitenste dikte van het netvlies
    Buitenste netvliesdikte (%) = (buitenste netvliesdikte/totale netvliesdikte) x 100.

5. Bepaling van de apoptosesnelheid van retinale fotoreceptorcellen met de TUNEL-methode

  1. Ontwaxen en hydratatie: Leg de plakjes 10 minuten in xyleen, herhaal het proces nog 10 minuten, plaats ze dan 5 minuten in absolute ethanol en herhaal deze stap nog eens 5 minuten. Voer uitdroging uit door 95% alcohol gedurende 5 minuten, 90% alcohol gedurende 5 minuten, 80% alcohol gedurende 5 minuten, 70% alcohol gedurende 5 minuten toe te voegen en af te spoelen met gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.
  2. Spoel 5 minuten met 0,85% natriumchlorideoplossing en 5 minuten met PBS. Fixeer met paraformaldehyde met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten. Spoel 5 minuten met PBS en herhaal het proces nog 5 minuten.
  3. Incubatie en equilibratie7: Incubeer gedurende 15 minuten met 20 μg/ml proteïnase K-oplossing voor vertering, balanceer gedurende 10 minuten in de evenwichtsbuffer en incubeer met recombinante terminale deoxynucleotidyltransferase (rTdT)-buffer bij 37 °C gedurende 60 min.
  4. Stopreactie: Voeg 100 μL de standaard citraatoplossing (2x SSC-oplossing) toe gedurende 15 min. Spoel 5 minuten met PBS en herhaal het proces nog 5 minuten.
  5. Nucleaire kleurstof: Voeg 100 μL 4 ′, 6-diamidine-2-fenindl (DAPI) reagens toe gedurende 5 minuten. Was 5 minuten met gedeïoniseerd water en herhaal het proces nog 5 minuten.
  6. Afdichting: Veeg overtollig xyleen rond de plakjes en sluit af door ongeveer 100 μL neutrale hars toe te voegen aan het oppervlak van de plakjes en dek het vervolgens af met een afdekglas.
  7. Microscopie: Plaats de bevlekte plakjes op de microscoop, pas de focus van de microscoop aan voor een duidelijke zichtbaarheid, stel de vergroting in op 400x en leg het beeld vast. Neem de groene fluorescentie in acht bij 520 ± 20 nm met behulp van een standaard fluorescentiefilter. Observeer de blauwe DAPI op 460 nm.
  8. Bereken de apoptosesnelheid: meet de groene fluorescentiewaarden en blauwe fluorescentiewaarden van de buitenste laag van de retinale kern. Bereken het apoptosepercentage als
    Apoptose celsnelheid = groene fluorescentiewaarde/blauwe fluorescentiewaarde x 100.

6. Analyse van de westerse vlek 10

  1. Lysisbufferbehandeling: Hak en homogeniseer een bevroren netvlies met 50 μL koude lysisbuffer (1 ml lysisbuffer met 5 μL fosfataseremmer, 1 μL proteaseremmer en 5 μL 100 mM PMSF).
  2. Onderworpen aan een sonicatie van 28 kHz gedurende 5 s op een ijsbad; Herhaal 3x. Centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 10.000 x g om celresten te verwijderen. Houd het bovennatuurlijke.
  3. em>6.3Kwantificering van eiwit: Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwittestreagensset.
  4. em>6.4Elektroforese: Laad een eiwitmonster van 50 μg en scheid het af op 12% natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE).
  5. Overdracht naar membraan: Elektroforetische overdracht naar PVDF-membranen met behulp van een elektroforetisch overdrachtssysteem.
  6. Onderverdeel membranen: Verdeel de membranen en analyseer elk interessant eiwit, β-actine en GAPDH uit een enkele overdracht.
  7. Blokkering: Blokkeer de membranen gedurende 1 uur in TBST met 5% magere melk op kamertemperatuur.
  8. Incubeer primair antilichaam: Incubeer met primair antilichaam van gesplitste caspase-9 (verdunning 1:200), gesplitste caspase-3 (verdunning 1:200), gesplitste caspase-7 (verdunning 1:200) en β-actine (verdunning 1:1000) 's nachts bij 4 °C. Was de membranen 5 minuten met TBST, herhaal 3x.
  9. Incubeer tweede antilichaam: Incubeer met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:2000) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was de membranen 5 minuten met TBST, herhaal 3x.
  10. Belichting: Visualiseer de gelabelde eiwitten met behulp van Western blot-substraat en stel ten slotte de membranen bloot om de eiwitbanden te visualiseren in een automatische belichtingsmodus.
  11. Bereken het eiwitgehalte7 door de dichtheid van de eiwitband te meten.

7. Statistische analyse

  1. Analyseer de gegevens met behulp van de SPSS 19.0-software en presenteer deze als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Voer statistische analyses uit van waargenomen waarden met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie. Neem p< 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

Na HE-kleuring hadden alle retinale lagen van ratten in de controlegroep een duidelijke weefselstructuur, een ordelijke celrangschikking en uniforme kleuring, terwijl de retinale structuur van ratten in de modelgroep aanzienlijk beschadigd was, de buitenste retinale laag dunner was, de buitenste nucleaire laag bijna volledig was geïntegreerd met de binnenste kernlaag, de rangschikking van cellen in de laag was extreem ongeordend, Het aantal cellagen was aanzienlijk verminderd en de dikte van de lichtgevoelige cellaag en de buitenste nucleaire laag was aanzienlijk dunner. De dikte van de buitenste retinale laag in de controlegroep en modelgroep was respectievelijk 48% en 23% (p < 0,01; Figuur 2).

De TUNEL-methode toonde aan dat er geen apoptotische cellen werden gedetecteerd in de controlegroep, maar dat er enkele apoptotische cellen waren in de buitenste nucleaire laag van ratten in de modelgroep (p < 0,01) en dat de TUNEL-positieve ratio 9,6% was (Figuur 3).

De caspasefamilie van eiwitten is een van de belangrijkste families die apoptose uitvoeren. Onder hen zijn gespleten caspase 3, gesplitste caspase 7 en gespleten caspase 9 klassieke indicatoren die worden gebruikt om celapoptose7 te evalueren. De resultaten van Western blot toonden aan dat in vergelijking met de controlegroep de expressie van gespleten caspase 3, gespleten caspase 7 en gespleten caspase 9 in het netvlies van de modelgroep significant was toegenomen (p<0,01; Figuur 4). Dit gaf aan dat MNU duidelijk celapoptose in het netvlies kan veroorzaken.

figure-results-1
Figuur 1: De experimentele workflow. Na intraperitoneale injectie van MNU gedurende 7 dagen (7d) werd het netvlies van verdoofde ratten verkregen voor HE- en TUNEL-kleuring. Afkortingen: MNU = N-methyl-N-nitrosoureum; HE = hematoxyline-eosine; TUNEL = terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde deoxyuridine trifosfaat-digoxigenine nick-end labeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve histopathologische HE-kleuringsbeelden op dag 7 na MNU-injectie. (A) HE-kleuring 7 dagen (7d) na toediening van MNU. (B) Buitenste netvliesverhouding. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n=6). Statistische analyses van waargenomen waarden werden uitgevoerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie. ** p < 0,01 vs controle. Afkortingen: GCL = ganglion cellaag; IPL = binnenste plexiforme laag; INL = de kernellaag; OPL = buitenste plexiforme laag; ONL = buitenste nucleaire laag; PRL = fotoreceptorlaag; MNU = N-methyl-N-nitrosoureum; HE = hematoxyline-eosine. n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: TUNEL-test toont apoptose van fotoreceptoren geïnduceerd door MNU bij ratten. (A) 7 dagen (7d) na MNU-injectie werden TUNEL-positieve cellen (groen) gepresenteerd in de ONL bij met MNU behandelde ratten. (B) TONIJN-positieve verhouding. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n=6). Statistische analyses van waargenomen waarden werden uitgevoerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie. ** p < 0,01 vs controle. Afkortingen: GCL = ganglion cellaag; IPL = binnenste plexiforme laag; INL = de kernellaag; OPL = buitenste plexiforme laag; ONL = buitenste nucleaire laag; PRL = fotoreceptorlaag; MNU = N-methyl-N-nitrosoureum; TUNEL = terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde deoxyuridine trifosfaat-digoxigenine nick-end labeling. n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Expressie van gespleten caspase 3, gespleten caspase 7 en gespleten caspase 9 in het netvlies van ratten op dag 7 na MNU-injectie. (A) Representatieve gegevens voor de expressie van gespleten caspase. (B) Verhouding van gespleten caspase 3/β-actine. (C) Verhouding van gespleten caspase 7/β-actine. (D) Verhouding van gespleten caspase 9/β-actine. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n=6). Statistische analyses van waargenomen waarden werden uitgevoerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie. ** p < 0,01 vs controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

RP is een veel voorkomende netvliesaandoening in klinieken. Het begin, de ernst en de progressie van RP zijn gerelateerd aan genen en genetische modi en worden beïnvloed door de omgeving 8,11. RP omvat familiale RP en occasionele RP, waarvan familiale RP ongeveer 60% van de patiënten uitmaakt. Door de genetische geschiedenis van de familie te traceren, zijn tot nu toe 83 genen geïdentificeerd die verband houden met RP, terwijl incidentele RP goed is voor ongeveer 40%, wat betekent dat dit type patiënt geen familiegeschiedenis heeft en een onregelmatig genetisch patroon heeft2. Hoewel de apoptose van retinale fotoreceptorcellen, die het verlies van visuele functie bij RP-patiënten veroorzaakt, een algemene erkenning is, blijft het onderliggende mechanisme van fotoreceptordood bij RP onduidelijk 12,13,14. Door de beperkte toegang tot menselijk netvliesweefsel, dat voornamelijk wordt verkregen tijdens vitrectomie, is de extractie van netvliesweefsel van modeldieren nog steeds een gangbare methode in het basisonderzoek van RP14,15.

Het netvlies is een transparant membraan dat zich in de binnenste laag van de oogbol bevindt, met de glasholte aan de binnenkant en het vaatvlies dicht aan de buitenkant. Het netvlies begint bij de gekartelde rand aan de voorkant en eindigt bij de optische schijf aan de achterkant. Het is het eerste deel van visievorming16. Retinale monsters van modeldieren worden voornamelijk gebruikt voor retinale PCR-analyse, detectie van Western blot, observatie van pathologische weefselstructuur, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentieonderzoek, evaluatie van de microvasculaire dichtheid, celisolatie en cultuur, enz.17,18. De vereisten voor netvliesbemonstering voor verschillende testindexen zijn verschillend. Retinale bemonstering voor detectie van eiwitfactor bij modeldieren en retinale bemonstering voor in paraffine ingebedde secties zijn veelgebruikte operationele technieken voor het screenen van geneesmiddelen op RP8. Vanwege de zeer fijne en complexe structuur van de oogbol van het modeldier, is het proces van het verwijderen van storende weefsels in het oog en het verkrijgen van retinale monsters echter gecompliceerd. Tijdens het bemonsteringsproces kan er sprake zijn van verlies van netvliesweefsel, besmetting, eiwitafbraak en netvliesloslating. Deze factoren zullen een impact hebben op de kwaliteit en kwantiteit van retinale eiwitextractie, evenals op het effect van doorsnedekleuring en de detectieresultaten van experimentele indicatoren. Daarom is een geschikte procedure voor netvliesbemonstering nodig.

Het is van cruciaal belang om het complexe te vereenvoudigen en de belangrijkste schakel van het oogsten te begrijpen om de techniek van het oogsten van het netvlies bij modeldieren te verbeteren. Snelle blootstelling van het netvlies en volledige verwijdering van het netvlies voor zover mogelijk zijn de belangrijkste stappen van netvliesbemonstering voor de detectie van eiwitfactoren bij modelratten. In dit onderzoek werden de oogbollen direct na de anesthesie geëxtraheerd om de bemonsteringstijd te besparen. Een truc om het netvlies bloot te leggen, is door de oogschelp over een buis van 1,5 ml te draaien, wat kosteneffectief en praktisch was en het netvlies volledig van de sclerale wand kon afpellen. Deze bedieningsprocedure is eenvoudig, snel, kostenbesparend en bevorderlijk voor de experimentele operatiepraktijk van het personeel, zodat deze in 5 minuten kan worden voltooid. Tijdens het proces van netvliesbemonstering voor pathologisch onderzoek en specifieke celkleuring is het behoud van de frisheid en structurele integriteit van het netvlies een belangrijke stap om kleuring van hoge kwaliteit te verkrijgen. Perfusie met formaldehyde uit het linker atrium en vervolgens het netvlies verkrijgen is een van de methoden die onderzoekers vaak gebruiken, maar het is tijdrovend en formaldehyde ruikt slecht en brengt ongemak met zich mee voor de operator19. In deze studie wordt het weefsel rond de oogbol na anesthesie gescheiden in een ring om de integriteit ervan te behouden. Nadat de oogzenuw is doorgesneden en vastgehouden, scheidt u het weefsel eromheen aan de achterpool van de oogbol en verwijdert u de oogbol. Verschillende delen van de oogbol werden nauwkeurig gelokaliseerd met de oogzenuw. Ten slotte werd met behulp van de ooginhoud de incisie gemaakt, het hoornvlies werd in een ring afgesneden, de lens en het glasvocht werden afgepeld en de oogschelp die de oogzenuw verbindt, werd verkregen (het netvlies bevindt zich op de sclerale wand in de oogschelp). In dit proces moet de operatie voorzichtig zijn om de integriteit van het netvlies te behouden. De operatieprocedure verbetert niet alleen de snelheid van het verzamelen van materialen aanzienlijk, maar kan ook de volledige normale structuur en vorm van de oogbol behouden en kan nauwkeurig worden gelokaliseerd in de verschillende delen van de oogbol na het verwijderen van de oogbol. Na een bekwame handeling kan de handeling in 8 minuten worden voltooid. Door gebruik te maken van de bovenstaande retinale bemonsteringsmethoden, verkreeg onze onderzoeksgroep relatief ideale resultaten voor de detectie van eiwitfactoren, HE-kleuringsresultaten en TUNEL-kleuringsresultaten.

Hoewel de huidige retinale bemonsteringsmethode enkele voordelen heeft, moet deze nog worden verbeterd. Tijdens het proces van netvliesbemonstering voor detectie van eiwitfactoren, na het blootleggen van het netvlies, bestaat ook het risico van onvolledige netvliesdissectie of verlies bij het nemen van het netvlies door een pincet te buigen vanwege het beperkte steunpunt van het buigpincet. Daarom is het noodzakelijk om de hulpmiddelen voor netvliesdissectie te verbeteren. Aan de andere kant, tijdens het proces van netvliesextractie voor pathologisch onderzoek en specifieke celkleuring, na het isoleren van de oogbol, tijdens het proces van lens- en glasvochtstrippen, zal de oogbolwand instorten als gevolg van het verlies van ondersteuning van het oog, wat gemakkelijk is om netvliesstripping te veroorzaken. De bediening moet dus snel, zacht en van de juiste sterkte zijn, en de bediener moet regelmatig oefenen. Daarom moeten onze procedures voor netvliesbemonstering nog worden verbeterd om het onderzoek naar het beschermende effect en het mechanisme van de traditionele geneeskunde tegen RP in grotere mate te bevorderen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Scientific Research Project van de afdeling Hoger Onderwijs van Ningxia (NYG2022029).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amersham ImagerGE680
Ammonium persulfate Boster Biological Technology Co.,LtdA8090
Analytical BalanceMettler ToledoME104E
BCA protein quantization kit Ken Gen Biotech. Co. LtdKGP902
cleaved caspase-3 antibodyCell Signaling Technology#9664
cleaved caspase-7 antibodyCell Signaling Technology#8438
cleaved caspase-9 antibodyCell Signaling Technology#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL SystemPromegaG3250
Glycine Boster Biological Technology Co.,LtdAR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Bioss Antibodiesbs-80295G-HRP
Goat serumBiosharpBL210A
High speed  crusherThermo Fisher ScientificAG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranesMerck Millipore. LtdISEQ00010
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
Microplate ReaderThermo Fisher Scientific1510
MicroscopeOlympusIX73
Microscope slideCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-Methyl-N-Nitrosoureasigma-AldrichN4766–100G
OvenShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Page Pre-solution (30% )Doublehelix Biology Science and Technology Co.,LtdL3202A
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26617
PBS bufferBiosharpG4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)Beyotime BiotechnologyP0015
Skim milk powderBioFroxx1172GR500
Sprague Dawley ratsNingxia Medical UniversitySCXK (Ning) 2020-0001
TEMED Boster Biological Technology Co.,LtdAR1165
Total protein extraction kit Ken Gen Biotech. Co. LtdKGP2100
Trans-Blot ModuleBIO-RAD1703935
Tris base Boster Biological Technology Co.,LtdAR1162
Tweezer Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
β-actinCell Signaling Technology#4970

Referenties

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486(2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836(2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55(2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741(2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001(2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661(2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857(2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497(2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Evaluatie van retinopathieratnetvlieshematoxyline eosin kleuringapoptosepercentageTUNEL assayWestern blottraditionele geneeskunde tegen retinopathie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.