Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cerebraal ischemisch comamodel geïnduceerd door gemodificeerde occlusie van vier bloedvaten

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67161

⸱

5 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, 2School of Medicine, Foshan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het proces voor het induceren van een cerebraal ischemisch comamodel met behulp van een aangepaste occlusiemethode met vier vaten.

Samenvatting

Coma veroorzaakt door cerebrale ischemie is de ernstigste complicatie van cerebrale ischemie. Occlusie van vier vaten kan een cerebraal ischemisch comamodel tot stand brengen voor ziekteonderzoek en de ontwikkeling van geneesmiddelen. De veelgebruikte occlusiemethode met vier vaten omvat echter voornamelijk het inbrengen van een elektrocoagulatiepen in het bilaterale pterygoïde foramen van de eerste halswervel achter de nek om de wervelslagaders te elektrocoaguleren. Dit proces brengt het risico met zich mee van onvolledige elektrocoagulatie, bloedingen en schade aan de hersenstam en het ruggenmerg. Vierentwintig uur na de operatie ondergaan opnieuw verdoofde ratten een ligatie van de halsslagader voor de nek. Twee operaties stellen de ratten bloot aan een hoger risico op infectie en verlengen de experimentele periode. In deze studie werd tijdens een enkele chirurgische ingreep een voorste cervicale incisie gebruikt om de belangrijkste plaats te lokaliseren waar de wervelslagader de eerste halswervel binnendringt. De bilaterale wervelslagaders werden onder visuele omstandigheden geëlektrocautiseerd, terwijl de bilaterale gemeenschappelijke halsslagaders werden gescheiden om losse knopen te plaatsen. Toen de ledematen van de ratten begonnen te trillen, werden de bilaterale gemeenschappelijke halsslagaders snel afgebonden om ischemisch coma te induceren. Deze methode kan het risico op infectie veroorzaakt door twee chirurgische ingrepen vermijden en is gemakkelijk uit te voeren met een hoog slagingspercentage, wat een nuttige referentie biedt voor relevante beoefenaars.

Inleiding

Ischemisch hersenletsel is het meest voorkomende hersenletsel in de klinische praktijk, goed voor ongeveer 75% van de gevallen van cerebrovasculaire aandoeningen. Ischemie kan leiden tot ernstig secundair hersenletsel en ziekten 1,2, en coma is het ernstigste symptoom dat wordt veroorzaakt door ischemisch hypoxisch hersenletsel. Het is ook de laatste weg voor veel kritieke omstandigheden3. Coma is een kritieke en ernstige ziekte in de klinische praktijk die moeilijk te beheersen is4. Hoe langer de coma duurt, hoe groter het potentiële gevaar. Snel ontwaken is het primaire doel om de verslechtering en progressie van de aandoening te voorkomen. Hoewel naloxoninjectie een breed scala aan klinische toepassingen heeft bij het bevorderen van waakzaamheid, heeft het nog steedsenkele bijwerkingen. Daarom is de ontwikkeling van veilige en effectieve waakzaamheidsbevorderende medicijnen een urgent probleem dat moet worden aangepakt. Het opzetten van een eenvoudig en gemakkelijk te bedienen ischemisch comamodel voor de hersenen is essentieel voor het ophelderen van de pathogenese van ischemisch coma en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen 6,7,8.

Het doel van deze studie is om een model te introduceren voor het induceren van wereldwijd ischemisch coma door middel van elektrocoagulatie van bilaterale wervelslagaders (VA) en tijdelijke ligatie van bilaterale gemeenschappelijke halsslagaders (CCA), wat eenvoudig en gebruiksvriendelijk is voor beginners. Het vorige protocol omvatte het blootleggen van het bilaterale pterygoïde foramen van de eerste achterste halswervel tijdens de eerste operatie en het elektrisch verbranden van het pterygoïde foramen om de bilaterale VA's te blokkeren. Een tweede operatie werd 24 uur later uitgevoerd om totale ischemische coma te induceren door ligatie van de bilaterale CCA's 9,10,11,12. Vanwege onzichtbaarheid bestaat er echter een risico op onvolledige elektrocoagulatie, bloedingen, hersenstam- en ruggenmergletsel, evenals een langdurige experimentele periode. Daarom is het noodzakelijk om deze problemen aan te pakken.

Hier presenteren we een verbeterde methode voor het modelleren van ischemisch coma. De belangrijkste procedure omvat het maken van een mediane incisie in de voorste nek, het uitvoeren van elektrische resectie van de bilaterale VA's onder visuele omstandigheden en het kort afbinden van de bilaterale CCA's tijdens een enkele operatie om de bloedtoevoer naar de hele hersenen te blokkeren, waardoor een snelle remming van het elektro-encefalogram (EEG) ontstaat en tot coma leidt. Deze methode induceert ook een korte continue coma na reperfusie. Deze procedure is eenvoudig uit te voeren, beginnersvriendelijk en vermindert het risico op secundaire trauma-infectie bij dieren, waardoor de experimentele periode wordt verkort.

Het protocol is geschikt voor de studie van globaal ischemisch coma veroorzaakt door een hartstilstand. Het is ook ideaal voor de studie van ischemische dementie, vooral omdat het hersengebied van de hippocampus extreem gevoelig is voor ischemie; Voorbijgaande cerebrale ischemie kan dus leiden tot schade of zelfs verlies van hippocampusneuronen13, wat resulteert in cognitieve disfunctie. Daarom kan het protocol een referentie zijn voor beoefenaars die cerebrale ischemie, ischemische coma en ischemische dementie bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het experimentele protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de vereisten van de Use of Laboratory Animals and Institutional Animal Care and Use Committee van de Foshan University (Recordnummer: 2023-643656). Voor dit onderzoek werden mannelijke Sprague Dawley (SD) ratten (200 g ± 20 g, 6-8 weken oud) gebruikt. Alle gegevens van dierproeven zijn opgeschreven volgens de richtlijnen van ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Implantatie van EEG-elektroden

  1. Injecteer 0,05 mg/kg atropine subcutaan 15 minuten voor de anesthesie om ademhalingsobstructie en verstikking door secreties te voorkomen. Dien een intramusculaire injectie van 20 mg/kg zoletil en 5 mg/kg xylazine toe om de ratten te verdoven14. Gebruik een pincet om de tenen van de rat vast te klemmen om diepe anesthesie te bevestigen.
  2. Verwijder het haar van de kop van de rat met een scheerapparaat. Bevestig de kop van de rat op een stereotaxisch apparaat voor de hersenen met behulp van niet-penetrerende oorbalken. Gebruik steriele wattenbolletjes om driemaal ethanol en povidonjodium op de operatieplaats aan te brengen om de huid te desinfecteren.
  3. Snijd de huid van de kop van de rat langs de onthoofde hechting met een chirurgisch mes. Verwijder de spier die de schedel bedekt en leg de schedel volledig bloot. Gebruik steriele wattenstaafjes om het bloeden tijdens het proces te stoppen.
  4. Föhn het oppervlak van de schedel droog met een oorspoelbal om tandcement stevig aan de schedel te laten hechten. Markeer de installatiepositie van de schedelnagel (diameter 1,2 mm, lengte 3 mm) met een zwarte stift (figuur 1, stap 1). De specifieke posities zijn het voorste fontanelpunt en vier andere plaatsen.
  5. Gebruik de naald van een spuit van 10 ml om vier gebieden achter elkaar te draaien en te boren. Steek achtereenvolgens vier schedelnagels in de schedel en zorg voor contact met de hersenschors (Figuur 1, stappen 2-3).
    OPMERKING: Gebruik steriele wattenstaafjes om bloed te absorberen in geval van bloedingen om roesten van de botnagels te voorkomen.
  6. Wikkel de zilverdraad van de EEG-elektrode om de schedelnagel. Plaats de elektromyografische elektrode in de spier en fixeer deze met een 6-0 hechting.
  7. Meng de basishars van het kunstgebit met zelfhardend prothesepoeder en bevestig de elektrode op de schedel. Gebruik een oorspoelbal om lucht op het oppervlak van het tandcement te blazen om de uitharding te versnellen.
  8. Injecteer 10.000 eenheden penicilline om infectie te voorkomen. Plaats elke rat in een aparte kooi om wederzijds scheuren en schade aan de elektroden te voorkomen. Subcutaan geïnjecteerd 0,2 mg/kg meloxicam gedurende drie opeenvolgende dagen om postoperatieve pijn te verlichten. Wacht 3 dagen voor het herstel van de rattenwonden en de fixatie van de elektroden (Figuur 1, stap 4).

2. Chirurgisch proces van cerebraal ischemisch comamodel

  1. Verdoof de ratten drie dagen later opnieuw en leg ze in rugligging. Gebruik steriele wattenbolletjes om de operatieplaats te desinfecteren via drie herhaalde toepassingen van jodium, gevolgd door een spoeling/doekje met alcohol. Maak een incisie van ongeveer 2-3 cm lang met een scalpel vanaf de bovenrand van het borstbeen in de lengte langs het midden van de nek (Figuur 1, stap 5).
  2. Scheid botweg het onderhuidse weefsel en de sternohyoid-spier, waardoor de luchtpijp en de longus colli-spieren aan beide zijden van de luchtpijp volledig bloot komen te liggen15.
    OPMERKING: Vermijd het stimuleren van de luchtpijp gedurende de gehele procedure.
  3. Scheid de longus colli-spieren botweg van het niveau van de schildklier naar beneden, waardoor de eerste en tweede halswervel bloot komen te liggen. Breid het nekgebied uit met een weefseldilatator van ratten, waardoor de operatieplaats volledig bloot komt te liggen.
  4. Gebruik een fijne pincet om de spieren en weefsels die zichtbaar zijn in de cervicale tussenwervelruimte voorzichtig te scheiden, waardoor de karakteristieke locatie wordt blootgelegd waar de wervelslagader de eerste halswervel binnenkomt. Te zien is dat de wervelslagader door de eerste halswervel loopt (Figuur 1, stap 6).
    OPMERKING: Het plaatsen van een spuit van 1 ml onder de nek zorgt voor een duidelijkere chirurgische manipulatieruimte.
  5. Verwarm de elektrocoagulatiepen voor en steek deze 3-5 s in het gebied om ervoor te zorgen dat de wervelslagader wordt geëlektrocoaguleerd en doorgesneden. Scheid de spieren en fascia langs de binnenrand van de sternocleidomastoïde spier, leg de bilaterale CCA's bloot en bevrijd ze, en leg een losse knoop.
    NOTITIE: De elektrocoagulatiepen moet worden voorverwarmd; Anders kan het de wervelslagader niet snel laten stollen, wat tot bloedingen leidt. Beide wervelslagaders zijn elektrogecoaguleerd en losse knopen zijn rond de CCA's geknoopt.
  6. Draai snel de eerste losse knoop vast om de bloedstroom in de CCA te blokkeren wanneer de ratten weer bij bewustzijn komen en spiertrekkingen van de ledematen vertonen, terwijl de EEG-detector actieve EEG- en EMG-signalen detecteert. De ratten zullen een paar seconden worstelen en dan geleidelijk het bewustzijn verliezen (Figuur 1, stap 7).
  7. Merk na het loslaten van de fixatie op dat de ledematen van de rat stijf zijn, de oprichtende reflex verdwijnt, maar de ademhaling blijft behouden. Op dit punt presenteert het elektromyogram (EMG) een rechte lijn en wordt het EEG snel onderdrukt, wat aangeeft dat het 4-VO-geïnduceerde cerebrale ischemiemodel succesvol was16.
    OPMERKING: Respiratoire depressie treedt op bij sommige ratten tijdens bilaterale CCA-ligatie. Snelle mechanische stimulatie kan bij sommige ratten de spontane ademhaling herstellen.
  8. Volgens de "naaldcontrolemethode16" bindt u de CCA vast met een spuitnaald met een diameter van 0,5 mm met behulp van 6-0 nylondraad op ongeveer 1,5 cm afstand van de vertakking van de CCA, ICA en ECA. Trek de naald er voorzichtig uit; deze tweede knoop zorgt er vervolgens voor dat de halsslagader vernauwt (Figuur 1, stap 8).
    OPMERKING: De ligatuur die wordt gebruikt voor CCA-stenose moet gemaakt zijn van nylon materiaal, dat stabiel is. Nylondraad wordt niet aangetast door bloed en wordt niet dikker; anders kan het extreme stenose van de CCA bij ratten veroorzaken en het sterftecijfer verhogen.
  9. Maak na 30 minuten ischemie de eerste knoop los en de CCA zal reperfusie ondergaan, maar de tweede knoop zal resulteren in CCA-stenose, waardoor een aanhoudende coma wordt geïnduceerd (Figuur 1, stap 9). Sluit het onderhuidse weefsel met resorbeerbare monofilament hechtingen en de huid met niet-resorbeerbare monofilament hechtingen.

3. Herstel van dieren

  1. Plaats de ratten op isolatiepads en injecteer 10.000 eenheden penicilline om infectie te voorkomen. Subcutaan 0,2 mg/kg meloxicam injecteren gedurende drie opeenvolgende dagen om postoperatieve pijn te verlichten.
  2. Zorg er na 60 minuten reperfusie voor dat de ratten geleidelijk herstellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Door ontstekingen en andere stimulatie veroorzaakt door de implantatie van elektroden, kan het EEG onstabiel zijn, zodat de ratten 3 dagen moeten herstellen. Ratten met een normaal EEG en EMG na 3 dagen kunnen worden opgenomen voor de voorbereiding van het comamodel. Toen de ratten onder narcose werden gebracht, werd de EEG- en EMG-activiteit enigszins onderdrukt, maar verliep soepel. Er was geen significante verandering in EEG- en EMG-activiteit na elektrocoagulatie die de bilaterale VA...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Occlusie van vier vaten induceert wereldwijd ischemisch en hypoxisch hersenletsel, dat acute coma, hartstilstand, verstikking, shock, ernstige aritmie en andere kritieke klinische aandoeningen veroorzaakt door cerebrale ischemie in de klinische praktijk kan simuleren. Ondertussen kan occlusie van vier vaten leiden tot schade, voornamelijk in de hippocampus17,18, het primaire functionele hersengebied dat verantwoordelijk is voor c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82173781 en 82373835), het postdoctorale onderzoeksproject (BKS212055), het wetenschaps- en technologie-innovatieproject van het Foshan Science and Technology Bureau (2320001007331), de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515010806), Key Field Projects (Intelligent Manufacturing) van algemene universiteiten in de provincie Guangdong (2020ZDZX2057) en de wetenschappelijke onderzoeksprojecten (karakteristieke innovatie) van General Universiteiten in de provincie Guangdong (2019KTSCX195).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16 kanaals microfiber foto-elektrode arrayJiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd2605
4-0 chirurgische hechtdraadNantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.B-104
6-0 chirurgische hechtdraadNingbo MEDICAL Needle Co., Ltd.JM1216-742417
EEG elektrodeKedou Brain machine Technology Co., LTDKD-EEGEMG
Elektrocoagulatie penCONPUVON Company465
Lunion Stage Automatische Slaapstadiëring SysteemShanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.1336
Miniatuur hand-held schedelboorRayward Life Technology Co., Ltd87001
Penicilline natriumChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
SD rattenSPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.180-220g
SchedelspijkerGLOBALEBIO,LTD/
Stereotactisch instrumentRayward Life Technology Co., Ltd68801
Zoletil 50Vic Trading (Shanghai) Co., LTDBN 88SHA

Referenties

  1. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  2. Rong, M., et al. A modified model preparation for middle cerebral artery occlusion reperfusion. J Vis Exp. (207), e67060(2024).
  3. Hoesch, R. E., Koenig, M. A., Geocadin, R. G. Coma after global ischemic brain injury: Pathophysiology and emerging therapies. Crit Care Clin. 24 (1), 25-44 (2008).
  4. You, W., et al. Amplitude-integrated electroencephalography predicts outcome in patients with coma after acute brain injury. Neurosc Bull. 34 (4), 639-646 (2018).
  5. He, F., Jiang, Y., Li, L. The effect of naloxone treatment on opioidinduced side effects A meta-analysis of randomized and controlled trails. Medicine (United States). 95 (37), e4729(2016).
  6. Shukla, D. Description of coma and coma arousal therapy in Caraka Sahitā and its corollary in modern medicine. Neurol India. 65 (2), 250-252 (2017).
  7. Cossu, G. Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury: State of the art of current treatments to improve coma recovery. Brit J Neurosurg. 28 (2), 187-198 (2014).
  8. Li, J., Cheng, Q., Liu, F. K., Huang, Z., Feng, S. S. Sensory stimulation to improve arousal in comatose patients after traumatic brain injury: a systematic review of the literature. Neurol Sci. 41 (9), 2367-2376 (2020).
  9. Pulsinelli, W. A., Levy, D. E., Duffy, T. E. Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model. Stroke. 14 (5), 832-834 (1983).
  10. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 10 (3), 267-272 (1979).
  11. Plaschke, K., et al. Pronounced arterial collateralization was induced after permanent rat cerebral four-vessel occlusion. Relation to neuropathology and capillary ultrastructure. J Neural Transm. 110 (7), 719-732 (2003).
  12. Sugio, K., Horigome, N., Sakaguchi, T., Goto, M. A model of bilateral hemispheric ischemia- modified four-vessel occlusion in rats: To the editor. Stroke. 19 (7), 922(1988).
  13. Sadelli, K., et al. Global cerebral ischemia in rats leads to amnesia due to selective neuronal death followed by astroglial scar formation in the CA1 layer. Neurobiol Learn Mem. 141, 168-178 (2017).
  14. Song, B. W., et al. 1H-pyrrole-2,5-dione-based small molecule-induced generation of mesenchymal stem cell-derived functional endothelial cells that facilitate rapid endothelialization after vascular injury. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 174(2015).
  15. Sun, W., et al. A modified four vessel occlusion model of global cerebral ischemia in rats. J Neurosci Methods. 352, 109090(2021).
  16. Xiaobing, J., et al. Modifying the four vessel occlusion to establish ischemic brain injury coma model in rats. Sichuan Med J. 29 (4), 384-386 (2008).
  17. Wang, W., et al. Levodopa improves cognitive function and the deficits of structural synaptic plasticity in hippocampus induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Front Neurosci. 14, 586321(2020).
  18. Zhan, L., Lu, X., Xu, W., Sun, W., Xu, E. Inhibition of MLKL-dependent necroptosis via downregulating interleukin-1R1 contributes to neuroprotection of hypoxic preconditioning in transient global cerebral ischemic rats. J Neuroinflammation. 18 (1), 97(2021).
  19. Konaka, K., Miyashita, K., Ishibashi-Ueda, H., Naritomi, H. Severe hyperthermia caused by four-vessel occlusion of main cerebral arteries. Internal Med. 48 (24), 2137-2140 (2009).
  20. Ferreira, E. D. F., Romanini, C. V., Mori, M. A., de Oliveira, R. M. W., Milani, H. Middle-aged, but not young, rats develop cognitive impairment and cortical neurodegeneration following the four-vessel occlusion/internal carotid artery model of chronic cerebral hypoperfusion. Eur J Neurosci. 34 (7), 1131-1140 (2011).
  21. Ma, B., et al. Protective effects of extract of Coeloglossum viride var. bracteatum on ischemia-induced neuronal death and cognitive impairment in rats. Behav Pharmacol. 19 (4), 325-333 (2008).
  22. Song, Y. Y., Chen, Y. H., Li, J. F., Sun, W. A review of animal models of vascular dementia. Chin J Comp Med. 33 (12), 75-85 (2023).
  23. Liu, B., et al. Autophagy activation aggravates neuronal injury in the hippocampus of vascular dementia rats. Neural Regen Res. 9 (13), 1288-1296 (2014).
  24. Li, J., Takeda, Y., Hirakawa, M. Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex. J Neurosurg Anesthesiol. 12 (3), 247-254 (2000).
  25. Rishitha, N., Muthuraman, A. Ameliorative potential of thymoquinone in four vessel occlusion induced vascular dementia in rats. Alzheimer Dement. 19 (S13), e71053(2023).
  26. Oruc, S., et al. The antioxidant and antiapoptotic effects of crocin pretreatment on global cerebral ischemia reperfusion injury induced by four vessels occlusion in rats. Life Sci. 154, 79-86 (2016).
  27. Lu, D., et al. A modified method to reduce variable outcomes in a rat model of four-vessel arterial occlusion. Neurol Res. 38 (12), 1102-1110 (2016).
  28. Idt-Kastner, R. S., Paschen, W., Ophoff, B. G., Hossmann, K. A. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats. Stroke. 20 (7), 938-946 (1989).
  29. McBean, D. E., Kelly, P. A. T. Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion. Gen Pharmacol. 30 (4), 431-434 (1998).
  30. Todd, N. V., Picozzi, P., Alan Crockard, H., Russell, A. R. R. Reperfusion after cerebral ischemia: Influence of duration of ischemia. Stroke. 17 (3), 460-466 (1986).
  31. Toda, S., et al. Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia - Modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature. Acta Neurochir (Wien). 144 (12), 1297-1304 (2002).
  32. Ma, R., Lu, D., Wang, J., Xie, Q., Guo, J. Comparison of pharmacological activity and safety of different stereochemical configurations of borneol: L-borneol, D-borneol, and synthetic borneol. Biomed Pharmacother. 164, 114668(2023).
  33. Ji, X. Y., et al. Potential targets for protecting against hippocampal cell apoptosis after transient cerebral ischemia-reperfusion injury in aged rats. Neural Regen Res. 9 (11), 1122-1128 (2014).
  34. Martínez-Alonso, E., et al. Differential association of 4E-BP2-interacting proteins is related to selective delayed neuronal death after ischemia. Int J Mol Sci. 22 (19), 10327(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Occlusie van de arteria vertebralisligatie van de arteria carotiselektrocauterisatietechniekEEG-monitoringratmodelglobale cerebrale ischemieneurologisch herstel
Cerebraal ischemisch comamodel geïnduceerd door gemodificeerde occlusie van vier bloedvaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.