Methodenartikel

Standaardisatie van een nieuwe semi-automatische software voor het meten van de uitgroei van je nauriet

DOI:

10.3791/67163

⸱

9 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neriet-uitgroeianalyses bieden een kwantitatieve waarde over regeneratieve neuronale processen. Het voordeel van deze semi-automatische software is dat het cellichamen en neurieten afzonderlijk segmenteert door een masker te maken en verschillende parameters meet, zoals neurietlengte, aantal vertakkingspunten, cel-lichaamclusteroppervlak en aantal celclusters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Effectieve live-beeldvormingstechnieken zijn cruciaal om de neuronale morfologie te beoordelen om de uitgroei van neurieten in realtime te meten. De juiste meting van de uitgroei van neurieten is in de loop der jaren een langdurige uitdaging geweest op het gebied van neurowetenschappelijk onderzoek. Deze parameter dient als hoeksteen in tal van in vitro experimentele opstellingen, variërend van gedissocieerde culturen en organotypische culturen tot cellijnen. Door de neurietlengte te kwantificeren, is het mogelijk om te bepalen of een specifieke behandeling werkte of dat axonale regeneratie in verschillende experimentele groepen wordt versterkt. In deze studie is het doel om de robuustheid en nauwkeurigheid van de Incucyte Neurotrack neurietuitgroeianalysesoftware aan te tonen. Deze semi-automatische software is beschikbaar in een time-lapse microscopiesysteem dat verschillende voordelen biedt ten opzichte van veelgebruikte methodologieën bij het kwantificeren van de neurietlengte in fasecontrastbeelden. Het algoritme maskeert en kwantificeert verschillende parameters in elke afbeelding en retourneert neuronale celstatistieken, waaronder neurietlengte, vertakkingspunten, cel-lichaamclusters en cel-lichaamclustergebieden. Ten eerste hebben we de robuustheid en nauwkeurigheid van de software gevalideerd door de waarden te correleren met die van de handmatige NeuronJ, een Fiji-plug-in. Ten tweede hebben we het algoritme gebruikt dat zowel op fasecontrastbeelden als op immunocytochemische beelden kan werken. Met behulp van specifieke neuronale markers valideerden we de haalbaarheid van de op fluorescentie gebaseerde analyse van neurietuitgroei op sensorische neuronen in vitroculturen . Bovendien kan deze software de lengte van neurieten meten in verschillende zaaiomstandigheden, variërend van individuele cellen tot complexe neuronale netwerken. Kortom, de software biedt een innovatief en tijdbesparend platform voor neurietuitgroeianalyses, wat de weg vrijmaakt voor snellere en betrouwbaardere kwantificeringen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij heupzenuwen is het mogelijk om axonale regeneratie te meten1. Bovendien hebben in vitro studies de haalbaarheid aangetoond van het monitoren van axonale uitgroei 2,3 om de verschillende fasen te begrijpen, van axonale ontkieming tot axonale degeneratie, in zowel gezonde als beschadigde neuronen. Door deze processen te volgen, is het mogelijk om parameters zoals axonale polariteit, initiatie, stabiliteit en vertakking te meten. De laatste parameter is cruciaal om neuropathische pijnperceptiete begrijpen 4,5,6. Evenzo kan axonale degeneratie in vivo7 of in vitro 8,9 worden gecontroleerd. Tijdens de uitgroei van neurieten stabiliseren of veranderen de cytoskeletnetwerken van actine en microtubuli afhankelijk van de behoeften van de cel10. Het actine-cytoskelet reorganiseert zich om de vorming van de axonale groeikegel mogelijk te maken, en de microtubuli worden opnieuw uitgelijnd in bundels om de groeiende neuriet te stabiliseren11. Om de uitgroei van neurieten van centrale en perifere neuronen in vitro te bestuderen, worden drie gemeenschappelijke parameters gekwantificeerd: totale axonale lengte, maximale afstand en vertakkingspunten. Deze parameters worden gebruikt om de neuronale uitgroeirespons op behandeling (d.w.z. neurotrofines, verbindingen, remmers, retinoïnezuur, siRNA, shRNA) of bij genetisch gemodificeerde dieren te bestuderen 12,13,14. Om te beoordelen of neuronen meer langwerpige neurieten en/of meer vertakkingen hebben, stellen deze drie parameters ons in staat om de morfologie van een neuron te beoordelen. De meting van de nierietlengte is de belangrijkste parameter in verschillende in vitro experimentele opstellingen. Vanuit dorsale wortelganglia worden voornamelijk twee soorten culturen uitgevoerd: gedissocieerde in vitro cultuur of organotypische cultuur van hele DRG-explantaten. In beide gevallen is de lengte van neuriet een gouden parameter om de uitkomst van het experiment te beoordelen. In een motorneuronachtige cellijn (NSC-34) worden axonale uitgroei en vertakking gemeten na differentiatie geïnduceerd door retinoïnezuur15,16. Door de uitgroei van neurieten te meten, is het zelfs mogelijk om te bepalen of een specifieke behandeling heeft gewerkt17, de groeisnelheid18 of het regeneratievermogen na een verwondingsprocedure19.

Het goed beoordelen van de uitgroei van neurieten heeft in de loop der jaren een aanzienlijk aantal uitdagingen met zich meegebracht op het gebied van onderzoek. Er is echter geen standaardisatie van neurietlengtemetingen. Enkele van de meest gebruikte methoden voor in vitro celculturen zijn bijvoorbeeld de handmatige NeuronJ-plug-in op Fiji18,20 of MetaMorph21,23 en de semi-automatische Neurolucida23,24. Naast handmatige methodologieën zijn er ook automatische methoden, zoals de NeuriteTracer-plug-in op Fiji25, HCA Vision-software 26,27 of WIS-NeuroMath 2,28. Andere, minder nauwkeurige methodologieën zijn gebaseerd op het meten van de totale dimensie van de neuronen. Deze methoden omvatten de meting van de vectorafstand van het cellichaam tot de punt van het langste axon29 of de Sholl-analyse30. Deze meetmethoden zijn echter geschikt voor culturen met een zeer lage dichtheid of enkele neuronen. Bovendien worden al deze methodologieën voornamelijk gebruikt op gekleurde neuronen of neuronen die genetisch gecodeerde fluoroforen tot expressie brengen (d.w.z. GFP, Venus, mCherry). Het type neuron en de dichtheid van de celcultuur zijn van grote invloed op de keuze van de meetmethode. Het handmatig segmenteren van neuronen met zeer ingewikkelde en gecompliceerde morfologieën, zoals DRG-neuronen, kan bijvoorbeeld gemakkelijk een onmogelijke taak worden. Als ingewikkelde neuronen al een uitdaging zijn om te segmenteren, zijn neurale netwerken volledig onbereikbaar voor handmatige benaderingen vanwege hun zeer complexe organisatie.

Aan de ene kant is handmatige segmentatie zeer nauwkeurig omdat het wordt uitgevoerd door menselijke ogen en intelligentie; Aan de andere kant is het erg tijdrovend. Het grootste nadeel is de verhoogde tijdsbesteding die handmatige methoden vereisen. Om deze reden worden slechts een paar neuronen verworven voor analyse, waardoor het minder nauwkeurig en kostbaar is in termen van tijd. Automatische of semi-automatische benaderingen daarentegen verminderen de tijdsbesteding gedeeltelijk. Ze hebben echter ook enkele nadelen. Automatische methoden moeten worden getraind om goed te werken, en als de software niet interactief genoeg is met de gebruiker, kan de segmentatie verkeerd zijn.

Naast het meten van de uitgroei van neurieten, is ook het aantal vertakkingspunten waardevolle informatie. Met handmatige segmentatie kan het aantal vertakkingspunten worden berekend, terwijl dit met een vectorafstand niet mogelijk is. Bij automatische methoden wordt meestal het aantal vertakkingspunten opgegeven, terwijl bij de Sholl-analyse het met een wiskundige formule moet worden berekend.

In dit methodedocument willen we de functionaliteit en effectiviteit van deze semi-automatische software beschrijven bij het meten van de totale axonale lengte en andere parameters. De machine maakt het mogelijk om automatisch beelden te verkrijgen op gedefinieerde tijdstippen of om langetermijnstudies (dagen, weken, maanden) uit te voeren, waarbij een fysiologische omgeving voor levende cellen behouden blijft. Het meten van de uitgroei van neurieten met behulp van time-lapse-beeldvorming met fasecontrast heeft het voordeel dat de kinetiek en groei van neurieten continu kunnen worden bewaakt. Daarnaast is het ook mogelijk om de celdood te monitoren door de toevoeging in de media van specifieke kleurstoffen die zich richten op dode cellen 31,32,33. Hoewel de software in 2012 is uitgebracht, zijn we de eersten die deze methodologie op een reproduceerbare en onbevooroordeelde manier hebben gestandaardiseerd voor de nauwkeurige kwantificering van de uitgroei van neurieten. Het is echter belangrijk op te merken dat de software niet is inbegrepen bij de aankoop van de machine. Ondanks deze extra kosten biedt het gebruik ervan aanzienlijke voordelen bij het meten van de totale axonale lengte en andere parameters, waardoor het bijdraagt aan onderzoek op het gebied van neurowetenschappen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Scannen van het vat op de machine

OPMERKING: De detectie wordt uitgevoerd door de ingebouwde Basler Ace 1920-155 μm camera.

  1. Open het programma door op Verbinden met apparaat te klikken en Schema - Te verwerven te selecteren. Klik vervolgens op het +- teken.
  2. Geef aan of het vaartuig herhaaldelijk of slechts 1x wordt gescand door respectievelijk de optie Scannen op schema of Nu eenmaal scannen te kiezen.
  3. Selecteer Nieuw om een gloednieuw schip te maken om te scannen. Als er geen nieuw schip wordt toegevoegd, maakt u een nieuwe scan met behulp van een van de hieronder beschreven opties.
    1. Selecteer Stroom kopiëren om een nieuw schip te maken door een schip uit het huidige schema te kopiëren. Selecteer Vorige kopiëren om een nieuw vaartuig te maken door een eerder gescand vaartuig te kopiëren.
    2. Selecteer Scan toevoegen om een eerder gescande vessel te herstellen voor extra scans.
  4. Selecteer het scantype op basis van de test en de toepassing. Selecteer voor de analyse Standaard.
  5. Geef scaninstellingen op. Kies een van de opties Cel voor Cel, Geen, Aanhangende Cel-voor-Cel of Niet-Aanhangende Cel-voor-Cel, en specificeer de beeldkanalen afhankelijk van de gebruikte fluorescerende moleculen. Selecteer de optie Geen voor volwassen en embryonale sensorische neuronculturen. Selecteer voor cellijnen de opties Geen of Aanhangend Cel voor cel .
  6. Selecteer het microscoopobjectief (4x, 10x, 20x). Verwerven met de hogere vergroting (20x) in primaire culturen, terwijl in cellijnen 10x voldoende is.
  7. Selecteer het type vaartuig dat u wilt scannen uit de beschikbare opties. Geef de locatie van het vat in de lade aan door de positie ervan te selecteren op de virtuele kaart van de lade.
  8. Specificeer het scanpatroon voor de beeldacquisitie door de te scannen putten te selecteren. Selecteer het gewenste aantal afbeeldingen per putje. Er verschijnt een schatting van de scanduur.
  9. Geef informatie over het schip door de naam te typen en geef de kentekenkaart op door op het +- teken te klikken.
  10. Klik op Volgende. Kies het analysetype en klik op Volgende. Er verschijnt een overzichtsscherm met de geselecteerde opties. Als dit klopt, klikt u op Nu scannen en de scan begint.

2. Instellen voor beeldanalyse met fasecontrast

OPMERKING: Neurotrack-analyse kan alleen worden uitgevoerd op afbeeldingen die eerder door de machine zijn verkregen.

  1. Selecteer het gescande vat dat u wilt analyseren. Selecteer Analyse starten. Selecteer Nieuwe analysedefinitie maken.
  2. Selecteer Neurotrack. Selecteer Afbeeldingskanalen. Selecteer een representatieve set afbeeldingen waarop u de analyse wilt uitvoeren. Selecteer alle afbeeldingen voor elke put om het algoritme te trainen.
  3. Verfijn de instellingen voor de analysedefinitie door de volgende parameters aan te passen.
    OPMERKING: Neurieten zijn standaard gesegmenteerd in magenta, terwijl cellichamen in geel zijn gesegmenteerd. Het is mogelijk om de kleuren naar wens aan te passen.
    1. Voor segmentatie van cel-lichaamclusters past u het volgende aan zoals hieronder wordt beschreven.
      1. Segmentatiemodus: De segmentatie van de afbeeldingen wordt gedaan om cellichamen te onderscheiden van achtergrondlichamen en neurieten. Kies tussen Helderheid en Textuur. Voor primaire culturen en cellijnen selecteert u de modus Helderheid.
      2. Segmentatie-aanpassing: Gebruik de schuifregelaar om de segmentatiegevoeligheid aan te passen in de richting van meer achtergrond of meer cellen. Het varieert van 0 (achtergrond) tot 2 (cellen). Het vergroot of verkleint de grootte van het gele masker. Verplaats de schuifregelaar naar 0 (achtergrond) zodat de grootte van het gele masker geleidelijk kleiner wordt, waardoor er ruimte overblijft voor het magenta masker. Het tegenovergestelde gebeurt als de schuifregelaar naar 2 (cellen) wordt verplaatst.
    2. Pas voor het opschonen het volgende aan zoals hieronder beschreven.
      1. Gatenvulling (μm2): Pas dit aan om elk gat in het celmasker te verwijderen dat kleiner is dan het door de gebruiker opgegeven gebied.
      2. Grootte (pixels) aanpassen: Verhoog (indien positief) of verklein (indien negatief) het gele masker met het opgegeven aantal pixels. Het varieert van -10 tot +10. Pas dit aan om gele segmentatie toe te voegen of te verwijderen op objecten met een hoog contrast, zoals dode cellen en celresten.
      3. Min celbreedte (μm): Kies een waarde om de grootte te definiëren waarbij cellichamen als neurieten worden beschouwd.
    3. Voor clusterfilters voor cellen en hoofdlichamen past u het volgende aan zoals hieronder wordt beschreven.
      1. Oppervlakte (μm2): Stel een minimum- en een maximumwaarde in voor de lichaamsoppervlakte van de cel. Waarden boven en onder de ingestelde waarden worden niet als cellichamen beschouwd.
    4. Voor neurietparameters past u het volgende aan zoals hieronder beschreven.
      1. Filteren: Het vermindert het maskeren van onvolkomenheden en vuil van kleine vaten. Kies tussen de opties Geen, Beter en Beste. Kies Geen alleen voor zeer schone culturen en vaten. Kies Beter voor een snellere verwerking ten koste van het verlies van de detectie van zeer fijne neurieten. Het kan voldoende zijn voor cellen met dikke of contrastrijke neurieten; Het kan ook handig zijn voor schepen met veel onvolkomenheden of puin. Kies Best voor een langere verwerkingstijd, maar dit is de meest gevoelige filterinstelling om de detectie van zeer fijne neurieten te garanderen.
      2. Nautietgevoeligheid: Gebruik deze optie om de detectiegevoeligheid aan te passen. Verhoog de gevoeligheid om fijnere neurieten te detecteren. Het varieert van 0.25 (minder) tot 0.75 (meer).
        OPMERKING: Het verhoogt of verlaagt de gevoeligheid van de software om neurieten te herkennen. Als de schuifregelaar naar 0,25 (minder) wordt verplaatst, zal de software strenger zijn in de herkenning van neurieten. In plaats daarvan, als de schuifregelaar naar 0,75 (meer) wordt verplaatst, zal de software minder streng zijn in deze detectie, en daarom zullen meer onvolkomenheden (d.w.z. celresten, vuil) als neurieten worden beschouwd.
      3. Nautietbreedte (μm): Gebruik het om de detectie af te stemmen op de grootte van de neuronen. Het kan 1, 2 of 4 zijn. Door het te verhogen, worden de dunnere neurieten niet in aanmerking genomen. Stel deze in op 1 voor primaire volwassen sensorische neuronculturen en 2 voor cellijnen en embryonale sensorische neuronculturen.
  4. Klik op Voorbeeld van huidig om de gesegmenteerde afbeelding te visualiseren. Voor elke afbeelding worden de volgende afmetingen opgegeven: Neurite Lengte (mm/mm2), Neurite Takpunten (Per mm2), Cel-Body Clusters (Per mm2) en Cel-Body Cluster Area (mm2/mm2).
  5. Herhaal stap 2.3 en 2.4 voor alle geselecteerde afbeeldingen. Klik op Volgende.
  6. Selecteer de scantijd en goed om te analyseren. Wijs een definitienaam toe en, indien nodig, analysenotities. Klik op Volgende > voltooien.

3. Opstelling voor immunocytochemie (ICC) beeldanalyse

  1. Volg dezelfde stappen als in 2.1 tot en met 2.4. Selecteer de afbeeldingskanalen voor neurieten en kernen. Selecteer de Set afbeeldingen; selecteer Alle afbeeldingen voor elke put om het algoritme te trainen.
  2. Verfijn de instellingen voor de analysedefinitie door de volgende parameters aan te passen, zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Neurieten zijn standaard blauw gesegmenteerd, terwijl cellichamen paars zijn. De kleuren kunnen echter naar wens worden aangepast.
    1. Segmentatie van cel-lichaamclusters: gebruik dit om de afbeelding te segmenteren in interessante objecten. Schat de helderheid van de achtergrond op elke pixel in de afbeelding. Nadat de achtergrond is gevonden, voert u een van de volgende opties uit.
      1. Geen achtergrondaftrekking: gebruik dit om te segmenteren zonder de originele afbeelding te wijzigen. Kies tussen Adaptieve of Vaste drempel. Adaptief: de achtergrond wordt gebruikt om objecten te vinden, maar niet expliciet afgetrokken; met deze optie is het mogelijk om de Threshold Adjustment (GCU) in te stellen. Vaste drempel: objecten die helderder zijn dan deze drempel worden gedetecteerd in de originele afbeelding; met deze optie is het mogelijk om de drempel (GCU) in te stellen.
      2. Achtergrond aftrekken: Gebruik deze optie om de achtergrond van de afbeelding af te trekken met behulp van een Top-Hat-transformatie en pas er vervolgens een drempelwaarde op toe. Stel met deze optie Straal en Drempel in. Straal: een schijf met deze straal wordt gebruikt; De schijf moet groot genoeg zijn zodat deze niet volledig in een object in de afbeelding past. Drempelwaarde: objecten die helderder zijn dan deze drempel worden gedetecteerd in de afbeelding die op de achtergrond is afgetrokken.
    2. Opschonen: Gebruik de volgende optie om dit uit te voeren.
      1. Gatenvulling (μm2): Gebruik dit om eventuele gaten in het cellichaamsmasker te verwijderen die kleiner zijn dan het opgegeven gebied.
      2. Grootte (pixels) aanpassen: Gebruik dit om het paarse masker te vergroten (indien positief) of te verkleinen (indien negatief) met het opgegeven aantal pixels. Het bereik is -10 tot +10. Het voegt paars toe of verwijdert paars op objecten met een hoog contrast, zoals dode cellen en celresten.
      3. Min celbreedte (μm): Gebruik dit om de grootte te definiëren waarbij cellichamen als neurieten worden beschouwd.
    3. Clusterfilters voor cellen en hoofdletters: gebruik de volgende optie om de filters toe te passen.
      1. Oppervlakte (μm2): Stel een minimum- en een maximumwaarde in voor de lichaamsoppervlakte van de cel. Waarden boven en onder de ingestelde waarden worden niet als cellichamen beschouwd.
    4. Neurite parameters: Gebruik de volgende optie om deze in te stellen.
      1. Grove gevoeligheid van de neuriet: Gebruik dit om de helderheid van de neuriet aan te passen. De gevoeligheid moet worden verhoogd als de fluorescentie-intensiteit van de neurieten laag is. Het varieert van 0 (minder) tot 10 (meer). Het verhoogt of verlaagt de gevoeligheid van de software om minder heldere neurieten te herkennen. Optimale waarden variëren van 7 tot 10; Merk op dat als deze op 10 staat, het zeer waarschijnlijk is dat ook de achtergrond in aanmerking wordt genomen bij de neurietmeting.
      2. Neurite fijne gevoeligheid: Gebruik dit om de detectiegevoeligheid aan te passen. De gevoeligheid moet worden verhoogd om fijnere neurieten te detecteren. Het varieert van 0.25 (minder) tot 0.75 (meer). Het verhoogt of verlaagt de gevoeligheid van de software om fijne en minder heldere neurieten te herkennen. Als de schuifregelaar naar 0,25 (minder) wordt verplaatst, houdt de software geen rekening met zwakke neurieten. In plaats daarvan, als de schuifregelaar naar 0,75 (Meer) wordt verplaatst, zal de software ook zeer zwakke (bijna achtergrond) neurieten detecteren.
      3. Naurietbreedte (μm): Gebruik dit om de detectie af te stemmen op de grootte van de neuronen. Het kan 1, 2 of 4 zijn. Door het te verhogen, worden de dunnere neurieten niet in aanmerking genomen. Zet het op 1 voor primaire volwassen sensorische neuronenculturen, op 2 voor cellijnen en embryonale sensorische neuronenculturen.

4. Uitvoer van gegevens

  1. Open de analyse. Klik op Grafiekstatistieken.
  2. Selecteer de metriek, tijdpunten en putten die u interesseren.
  3. Selecteer de groeperingsoptie tussen Alle, Geen, Kolommen, Rijen en Replicaten van plaattoewijzing.
  4. Klik op Gegevens exporteren en selecteer de map van bestemming en, indien nodig, andere opties. Er wordt een .txt bestand aangemaakt.
    NOTITIE: De machine geeft een enkele gemiddelde waarde van de gekozen metriek voor elke put. Tijdens de analyse is handmatige annotatie vereist om afzonderlijke afbeeldingswaarden op te halen.

5. Afbeelding exporteren

  1. Open het vat. Klik op Afbeeldingen en films exporteren.
  2. Selecteer het exporttype voor de afbeeldingen.
    1. Selecteer Zoals weergegeven om afbeeldingen te exporteren zoals weergegeven. Klik op Volgende en selecteer de interessante afbeeldingen om te exporteren. Klik op Volgende.
      1. Selecteer het sequentietype tussen een enkele film of een reeks afbeeldingen en de interessante tijdstippen. Klik op Volgende.
      2. Pas de exportopties naar wens aan en klik op Volgende. Stel de uitvoermap, het bestandsformaat en de naam van het bestand in en klik vervolgens op Exporteren.
    2. Selecteer Als opgeslagen om afbeeldingen in de RAW-indeling te exporteren. Selecteer het afbeeldingstype.
      1. Selecteer de Timepoints en Wells die u interesseren. Klik op Volgende. Stel de uitvoermap, het bestandsformaat en de naam van het bestand in en klik vervolgens op Exporteren.
  3. Afbeelding exporteren met de segmentatiemaskers
    1. Open de analyse. Klik op het pictogram van afbeeldingslagen. Selecteer de gewenste kanalenmaskers (fase neuriet en fase cel-lichaam cluster). Volg stap 5.2.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algoritme voor het meten van de uitgroei van neurieten is robuust in staat om neurieten te detecteren in zowel neurale netwerken als afzonderlijke neuronen. Het genereert een geel masker dat objecten met een hoog contrast segmenteert, zoals cellichamen, celresten, dode cellen, weefselexplantaten en schaduwen. Bovendien verschijnt een magenta masker op neurieten van verschillende diktes. De waarden voor de lengte van de Neurite worden weergegeven in mm/mm2, wat aangeeft dat de axonale lengte is gedeeld door de oppervlakte van het beeld, die 0,282739mm2 is en constant is voor elke scanconditie. Om zuivere waarden van de neurietlengte in mm te verkrijgen, moeten de getallen die door de software worden geleverd, worden vermenigvuldigd met de oppervlakte van het beeld.

Semi-automatische versus handmatige methode
De gebruikte software is een semi-automatische methodologie om de totale axonale lengte te meten. Om de nauwkeurigheid van de software te beoordelen, hebben we metingen uitgevoerd op dezelfde neuronen met behulp van de handmatige methode met de NeuronJ-plug-in. Zoals weergegeven in figuur 1, lijkt het segmentatiemasker op de neuronen sterk op de twee methoden (figuur 1A).

Daarnaast hebben we statistische analyses uitgevoerd op de verkregen waarden om hun correlatie te onderzoeken. De Spearman-correlatieanalyse leverde een hoge coëfficiënt r op van 0,8526, wat een sterk bewijs levert van de nauwkeurigheid en precisie van het algoritme (Figuur 1B). Automatische meting vereist hoge normen voor cultuurkwaliteit op basis van de reinheid, dichtheid en zuiverheid. De resultaten die worden verkregen met semi-automatische segmentatie zijn reproduceerbaar en worden niet beïnvloed door individueel oordeel. Onbevooroordeelde reproduceerbaarheid is een probleem voor handmatige methodologieën.

Soms kunnen semi-automatische segmentatiefouten optreden door verschillende oorzaken. In fasecontrastbeelden kon vuil in de cultuur worden gedetecteerd als neurieten door de semi-automatische segmentatie. Bovendien kan de aanwezigheid van verschillende celtypen het segmentatieproces verstoren. Dergelijke problemen doen zich niet voor bij handmatige segmentatie, omdat deze door het menselijk oog wordt uitgevoerd. Desalniettemin, als dergelijke problemen zich voordoen, kunnen ze worden overwonnen door immunocytochemische beelden als controle te gebruiken.

Segmentatie van neurieten
Voor primaire culturen van volwassen DRG-neuronen is het optimale uitgangspunt voor een betrouwbare faseanalyse om neuronen uniform te vergulden in de put- en schone cultuur. Als er fouten optreden tijdens het zaaien en cellen zich op één plek concentreren, zoals geïllustreerd in figuur 2A-B, zullen de waarden meer een schatting zijn dan een nauwkeurige weerspiegeling van de werkelijkheid. In dergelijke situaties zal het gele masker de meeste neurieten tussen de cellen bedekken (Figuur 2A-B), wat resulteert in het verlies van de neurietlengte. Bovendien zal de software aanzienlijk bevooroordeeld zijn bij de herkenning van neurieten, en het is zeer waarschijnlijk dat er een magenta masker zal verschijnen op objecten die geen neurieten zijn (Figuur 2D). In een optimaal beeld moeten er maximaal 15 neuronen zijn bij een vergroting van 20x.

Wanneer neuronen correct zijn geplateerd en de cultuur schoon is, zoals geïllustreerd in figuur 3A-B, is het raadzaam om de segmentatieschuifregelaar naar de achtergrond aan te passen (0,5 - 0,7; Figuur 3C). Dit helpt om de gele component te verminderen die verschijnt op objecten met een hoog contrast in de afbeelding, zoals vertakkingspunten die magenta moeten zijn. Bovendien, als neurieten vet zijn, zou een neurietgevoeligheid tussen 0,4 en 0,5 voldoende moeten zijn om de meeste van hen te dekken (Figuur 3C-D).

Een andere veel voorkomende situatie die zich kan voordoen is een vuile cultuur met veel celresten en dode cellen, zoals weergegeven in figuur 4A-B. In dergelijke omstandigheden zijn er veel objecten met een hoog contrast. Daarom is het raadzaam om de grootte van het gele masker te vergroten door de segmentatieschuifregelaar naar de cel toe te passen of door de parameter voor het aanpassen van de grootte (+1, +2, enzovoort) te vergroten; Figuur 4C). Desalniettemin zou het ook nuttig zijn om de gevoeligheid van neurieten iets te verlagen om te voorkomen dat de software objecten die geen neurieten als zodanig zijn, ten onrechte als neurieten identificeert. (Figuur 4C-D).

Soms kunnen neurieten er erg dun en bleek uitzien, zoals te zien is in figuur 5A-B, wat een uitdaging vormt voor de software om ze nauwkeurig te segmenteren (figuur 5D). In dit geval is het raadzaam om de gevoeligheid van neurieten te verhogen tot ten minste 0,6 (Figuur 5C). Houd er echter rekening mee dat hoe hoger de gevoeligheid, hoe groter de kans dat de software objecten die geen neurieten zijn als zodanig ten onrechte markeert (Figuur 5D). Er kunnen enkele voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat de gevoeligheidsbias te veel toeneemt, bijvoorbeeld door de segmentatieschuifregelaar naar cellen toe te passen. Als neurieten echter te dun zijn om door de software te worden gedetecteerd, zullen de neurietlengtewaarden hoe dan ook vertekend zijn.

In het geval van immunocytochemische beelden ligt het belangrijkste probleem op de achtergrond. Afgezien van de zaaicondities waarvoor de bovengenoemde regels gelden, is de primaire bron van bias de fluorescentie zelf. De software herkent effectief zeer heldere neurieten, terwijl dunnere, minder intense neurieten achterblijven (Figuur 6A-B). Om verlies van neurietlengte te voorkomen, kan de fijngevoeligheid van neuriet worden verhoogd tot 0,75 (figuur 6C). Het is echter sterk aan te raden om de gevoeligheid voor de grove neuriet te verminderen tot ten minste 8-9 om overmatige detectiebias te voorkomen door neurieten op de achtergrond te beschouwen (Figuur 6C-D). Als dit laatste niet wordt verminderd, wordt de hele achtergrond gesegmenteerd, zoals weergegeven in figuur 7.

Een veelvoorkomend probleem bij fluorescentieverwerving is de verstrooiing van het licht. Vaak presenteren immunocytochemische beelden zaklampen in het beeld, die de kwaliteit en precisie van de analyse aanzienlijk beïnvloeden (Figuur 8A-B). In een dergelijke situatie kan er niet veel worden gedaan om de analyse te verbeteren en zullen waarden meer een schatting zijn. Lichtverstrooiing verstoort de herkenning van neurieten, zodat alleen zeer heldere neurieten worden gedetecteerd (Figuur 8C-D). Een ander probleem bij immunocytochemische beelden is de kwaliteit van de kleuring op zich. Vaak kunnen axonen door menselijke fouten worden gebroken (Figuur 9A) en kunnen cellichamen worden weggescheurd tijdens wasbeurten (Figuur 9B). Deze fouten vormen een kritiek probleem, aangezien de waarden van de neurietlengte aan precisie en nauwkeurigheid inboeten. Bijgevolg wordt de interpretatie van biologische gegevens gewijzigd, wat leidt tot verkeerde conclusies.

Voor embryonale culturen is de situatie anders. In dit type cultuur is de aanwezigheid van gliacellen overheersend. Bijgevolg nemen de fouten aanzienlijk toe omdat de software ook de bekleding van gliacellen detecteert (Figuur 10A-B). Om dit probleem tot een minimum te beperken, moet de segmentatieschuifregelaar naar cellen worden verplaatst, meestal rond waarden van 1,7-2 (Figuur 10C-D). Deze aanpak zorgt ervoor dat de meeste gliacellen worden bedekt door het gele masker en dus niet in aanmerking worden genomen bij de meting van de neurietlengte. Een andere nuttige tip is om de neurietbreedte op 2 te houden, aangezien embryonale neuronen in cultuur doorgaans bipolaire of unipolaire vormen vertonen met dikke neurieten (Figuur 10C-D). Deze voorzorgsmaatregel filtert de meeste bekledingen van gliacellen die meestal erg dun zijn. Zorg er ten slotte voor dat u de gevoeligheid van neurieten niet te veel verhoogt; Anders wordt wat door de parameter neurietbreedte is uitgefilterd, weer opgenomen in de neurietlengtemeting.

In het geval van embryonale culturen, waar de gliacelcomponent overheersend is, kan immunocytochemie de betere optie zijn. Door specifiek neuronen te kleuren, wordt het probleem van segmentatie van glia opgelost, aangezien glia niet worden gekleurd, waardoor de analyse veel gemakkelijker en nauwkeuriger wordt (Figuur 11).

Ten slotte kan de software ook worden gebruikt om het differentiatieprogramma van cellijnen en/of iPSC's te evalueren om hun groeitoestand te beoordelen. De toepassing van vergelijkbare parameters en voorzorgsmaatregelen kan dus voor verschillende doelen worden gebruikt.

Wat het differentiatieproces betreft, is de robuustheid van de software bewezen in de NSC-34-cellijn (hybride cellijn gevormd door neuroblastoomcellen van muizen en motorneuronen afkomstig van het ruggenmerg van muizenembryo's) tijdens de rijping tot motorneuronenachtige cellen. Wat de primaire DRG-culturen betreft, is het optimale uitgangspunt voor een goede analyse uniforme celzaaiing. De ongedifferentieerde en gedifferentieerde cellen kunnen, na behandeling met retinoïnezuur, worden gevolgd met behulp van acquisities gedurende de gehele kweekperiode of, zoals weergegeven in figuur 12, op het laatste tijdstip.

Inderdaad, naast de lengte van neurieten levert het algoritme ook de parameter vertakkingspunt. Het is echter belangrijk op te merken dat de parameter vertakkingspunt niet het exacte aantal vertakkingspunten vertegenwoordigt; Het geeft eerder de dichtheid van vertakkingen in het beeld aan, zoals deze wordt uitgedrukt in mm/mm2. Deze meting wordt aanzienlijk beïnvloed door puin in de cultuur en de zaaiconcentratie. Daarom zijn de dichtheid van neuronen in het beeld en de reinheid van de cultuur cruciale factoren voor het verkrijgen van betrouwbare waarden. Als de cultuur veel celresten vertoont, die niet worden weggefilterd door het gele masker, worden ze zowel in de neurietlengte als in de takpuntmeting opgenomen.

Daarom wordt aanbevolen om deze waarden voor het celgetal te normaliseren, aangezien het aantal neuronen in het beeld van invloed is op de neurietlengte en vertakkingspuntmetingen.

Segmentatie van cellichamen
Onder alle parameters die door het systeem worden geleverd, zijn er cel-lichaamcluster en cel-lichaamclustergebied. Deze twee parameters zijn echter niet betrouwbaar om te gebruiken als waarden voor het tellen van cellen. Zoals geïllustreerd in afbeelding 4, segmenteert de software objecten met een hoog contrast in het gele masker, inclusief schaduwen die worden veroorzaakt door gemiddelde beweging in de put. Bovendien segmenteert het ook dode cellen en cellulair afval (Figuur 4). Om een betrouwbaar aantal cellen van de groeiende neuronen te verkrijgen, kan een handmatige methode worden gebruikt, zoals de Cell Counter-tool in Fiji (Figuur 13).

Een samenvatting van de voorgestelde analyseparameters, gesorteerd op type cultuur, is te vinden in Tabel 1 voor fasebeelden en Tabel 2 voor immunocytochemische beelden. Bovendien is in tabel 3 een samenvatting opgenomen van de voorgestelde analyseparameters om specifieke problemen op te lossen.

figure-results-1
Figuur 1: Correlatieanalyse tussen handmatige en semi-automatische neurietsegmentatie. (A) Aan de linkerkant, een representatief fasebeeld van een neuron gesegmenteerd met de NeuronJ plug-in in Fiji. Aan de rechterkant wordt een representatief fasebeeld van een neuron gesegmenteerd met de semi-automatische software. (B) Een eenvoudige lineaire regressierun op 20 neuronen werd geanalyseerd met zowel handmatige als semi-automatische methoden. Spearman correlatiecoëfficiënt r = 0,8526, p**** < 0,0001. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Zaaifout in volwassen sensorische neuroncultuur. (A) Representatief fasebeeld van de zaaifout. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het gele masker segmenteert cellichamen, het magenta masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Bovenpaneel: zoom in op de fout van de segmentatie van het cellichaam (geel masker) als gevolg van clustering van cellichamen. Onderste paneel: zoom in op de fout van de segmentatie van neurieten (magenta masker) als gevolg van cellulair puin. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Ideale sensorische neuroncultuur voor analyse van neurietuitgroei. (A) Representatief fasebeeld van een ideale zaaiconditie voor analyse van neurietuitgroei. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het gele masker segmenteert cellichamen, het magenta masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Zoom in op segmentatie van het cellichaam (geel masker) en op segmentatie van neurieten (magenta masker). De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Storende elementen in de analyse van de uitgroei van neurieten in de cultuur van volwassen sensorische neuronen. (A) Representatief fasebeeld van cellulair puin en schaduwen als gevolg van gemiddelde bewegingen. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het gele masker segmenteert cellichamen, het magenta masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Zoom in op de fout van de segmentatie van het cellichaam (geel masker) en de segmentatie van neurieten (magenta masker) als gevolg van celresten en schaduwen van het bewegende medium. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Analyse van dunne neurieten in analyse van neurietuitgroei in de cultuur van volwassen sensorische neuronen. (A) Representatief fasebeeld van neuronen gekenmerkt door zeer dunne neurieten. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het gele masker segmenteert cellichamen, het magenta masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Bovenpaneel: zoom in op het verlies van neurietlengte als gevolg van detectielimieten van de neurietsegmentatie (magenta masker). Onderste paneel: zoom in op de fout van neurietsegmentatie (magenta masker) op vreemde voorwerpen. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: De helderheid van neurieten in de analyse van de uitgroei van neurieten in de cultuur van volwassen sensorische neuronen. (A) Representatief immunocytochemisch beeld (neuronale marker Tuj1) van neuronen gekenmerkt door zeer heldere en dikke neurieten. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het paarse masker segmenteert cellichamen, het blauwe masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Bovenpaneel: zoom in op de segmentatiefout van het cellichaam (paars masker) vanwege de dikte van de neurieten. Onderste paneel: zoom in op het verlies van neurietlengte als gevolg van intense fluorescentiehelderheid van dikke neurieten. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Achtergrondfluorescentie in analyse van de uitgroei van neurieten in de cultuur van volwassen sensorische neuronen. (A) Representatief immunocytochemisch beeld (neuronale marker Tuj1) van hoge achtergrondfluorescentieruis. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het paarse masker segmenteert cellichamen, het blauwe masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Zoom in op de neurietsegmentatiefout (blauw masker) als gevolg van de interferentie van de achtergrondfluorescentie. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Lichtverstrooiing in neurietuitgroei analyse van de cultuur van volwassen sensorische neuronen. (A) Representatief immunocytochemisch beeld (neuronale marker Tuj1) van de lichtverstrooiing. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het paarse masker segmenteert cellichamen, het blauwe masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Bovenpaneel: zoom in op het verlies van neurietlengte door de interferentie van de lichtverstrooiing. Onderste paneel: zoom in op de segmentatiefout van het cellichaam (paars masker). De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Kwaliteitsbeïnvloedende fouten van de kleuringsprocedure die de analyse van de uitgroei van neurieten van de cultuur van volwassen sensorische neuronen verstoren. (A) Aan de linkerkant, een representatief fasebeeld van volwassen sensorische neuronen. Aan de rechterkant een representatief immunocytochemisch beeld (neuronale marker Tuj1) van kapotte neurieten als gevolg van wassen tijdens het kleuringsproces. (B) Aan de linkerkant, een representatief fasebeeld van volwassen sensorische neuronen. Aan de rechterkant een representatief immunocytochemisch beeld (neuronale marker Tuj1) van verwijdering van het cellichaam als gevolg van wasbeurten van de kleuringsprocedure. De beelden werden 48 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Ideale embryonale (E13.5) sensorische neuroncultuur voor analyse van neurietuitgroei. (A) Representatief fasebeeld van een ideale zaaiconditie voor analyse van neurietuitgroei in embryonale sensorische neuroncultuur. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het gele masker segmenteert cellichamen, het magenta masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Zoom in op segmentatie van het cellichaam (geel masker) en op segmentatie van neurieten (magenta masker). De beelden werden 24 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: Ideale embryonale (E13.5) sensorische neuroncultuur voor analyse van neurietuitgroei. (A) Representatief immunocytochemisch beeld (neuronale marker Tuj1) van een ideale embryonale sensorische neuronencultuur voor analyse van neurietuitgroei. (B) Representatief automatisch gesegmenteerd beeld. Het paarse masker segmenteert cellichamen, het blauwe masker segmenteert neurieten. (C) Illustratieve analyse van de uitgroei van neurieten, definitieparameters. (D) Zoom in op segmentatie van het cellichaam (paars masker) en op segmentatie van neurieten (blauw masker). De beelden werden 24 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 20x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-12
Figuur 12: Gedifferentieerde NSC-34-cellen hebben meer neurieten en vertakkingen in vergelijking met ongedifferentieerde controles. Representatieve beelden van NSC-34-cellen. Bovenpaneel: ongedifferentieerde NSC-34 cellen (controle). Onderste paneel: gedifferentieerde NSC-34-cellen na 96 uur retinoïnezuurbehandeling. Aan de linkerkant van beide panelen beelden met fasecontrast, terwijl aan de rechterkant van beide panelen automatisch gesegmenteerde afbeeldingen zijn (soma in geel, neurieten in magenta). De beelden werden 96 uur na het zaaien verkregen. Vergroting 10x. Schaal balk, 50 μm. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-13
Figuur 13: Cell Counter tool op Fiji. Handmatige celtelling uitgevoerd op een fasebeeld van een ideale zaaiconditie voor analyse van neurietuitgroei. Vergroting 20x. De figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Soort cultuurVolwassen DRG-cultuur (fase)Embryonale DRG-cultuur (fase)NSC-34 (fase)
Vergroting20 keer20 keer10x
Segmentatie modusHelderheidHelderheidHelderheid
Aanpassing van de segmentatie0.5 - 0.71.7 - 21
Grootte aanpassen (pixels)0, +1, +20, +10
FilteringBestBestBest
Neurite gevoeligheid0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
Neurite Breedte122

Tabel 1: Samenvatting van de voorgestelde analysedefinitieparameters voor volwassen sensorische neuronculturen, embryonale (E13.5) sensorische neuronculturen en NSC-34-culturen in fasecontrastbeelden.

Soort cultuurDRG-cultuur voor volwassenen (ICC)Embryonale DRG-cultuur (ICC)
Vergroting20 keer20 keer
Segmentatie modusHelderheidHelderheid
Aanpassing van de segmentatie0.5 - 0.71.7 - 2
Grootte aanpassen (pixels)0, +1, +20, +1
FilteringBestBest
Neurite grove gevoeligheid8 - 98 - 9
Neurite Fijne Gevoeligheidtot 0,750.5 - 0.75
Neurite Breedte12

Tabel 2: Samenvatting van de voorgestelde analyse definitieparameters voor volwassen sensorische neuronculturen, embryonale (E13.5) sensorische neuronculturen en NSC-34-culturen in immunocytochemische beelden.

UITGEVENSUGGESTIES
Vuile cultuurDe segmentatieschuifregelaar aanpassen in de richting van cellen
Verhoog de parameter voor het aanpassen van de grootte (+1,+2...)
Verminder de gevoeligheid van neurieten enigszins
Bleke/dunne neurietenVerhoog de gevoeligheid van neurieten (minimaal 0,6)
Pas de segmentatieschuifregelaar aan in de richting van cellen.
Dunne neurieten in ICCVerhoog de gevoeligheid van fijne neurieten (tot 0,75)
Verminder de gevoeligheid van de neuriet (ten minste tot 8-9)
GliacellenPas de segmentatieschuifregelaar aan in de richting van cellen (1.7-2)
Neurite breedte bij 2

Tabel 3: Samenvatting van de voorgestelde analysedefinitieparameters om specifieke problemen in verschillende soorten culturen op te lossen.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nauwkeurig meten van hoe neuronen groeien in gezonde, gewonde en zieke omstandigheden is een cruciale parameter in veel experimentele opstellingen binnen het neurowetenschappelijke veld. Of het nu gaat om het werken met organotypische culturen van hele DRG-explantaten of gedissocieerde culturen, het goed meten van axonale uitgroei is de afgelopen 20 jaar een grote uitdaging geweest. Zonder betrouwbare en nauwkeurige kwantificering van de uitgroei van neurieten is het onmogelijk om te beoordelen of een specifieke behandeling, zoals retinoïnezuur (gedurende 4 dagen) voor NSC-34-cellen34 of neurotrofines (gedurende 1-2 dagen) voor embryonale DRG-neuronen 14,35, effectief is geweest. Neuronen vertonen doorgaans continue groei als ze gezond zijn; Na een blessure neemt de axonale groeisnelheid echter toemet 12,13. Timing is cruciaal bij het meten van axonale groei; Daarom is het, voordat u met een experiment begint, essentieel om een proeftest uit te voeren om het optimale tijdstip voor het fixeren van de cellen te bepalen op basis van hun groeisnelheidplateaucurve.

De keuze voor de methode, handmatig of automatisch, markeert een keerpunt in termen van tijdsbesteding en nauwkeurigheid. Enkele van de meest voorkomende handmatige methoden zijn NeuronJ18,20 en Metamorph (Visitron)2,22,28. Handmatige methoden vereisen dat gebruikers neurieten handmatig traceren, wat extreem tijdrovend is en eencellige afbeeldingen vereist. Met handmatige segmentatie van neurieten zijn neurale netwerken volledig buiten bereik. Doorgaans meten deze methodologieën alleen het langste axon of maken ze gebruik van de vectorafstandsmeting, waardoor belangrijke informatie zoals het aantal vertakkingspunten en de totale axonale lengte verloren gaat. Een zekere verbetering wordt geboden door de Sholl-analyse30, die hoe dan ook beperkt is tot eencellige omstandigheden. Analyse van één cel brengt verschillende uitdagingen met zich mee, te beginnen met het zaaien van cellen. Neuronen moeten in een zeer lage concentratie worden geplateerd, wat misschien niet de meest geschikte groeiconditie is voor elk celtype. Een ander probleem doet zich voor bij het verwerven van afbeeldingen. Gewoonlijk wordt de confocale microscoop gebruikt voor beeldvorming, waarvoor getrainde gebruikers en fluorescerende neuronen nodig zijn en die noch tijd- noch kostenefficiënt is. Met de confocale microscoop worden beelden met een hoge resolutie verkregen, maar van elk experiment worden maar heel weinig neuronen in beeld gebracht. Dit is een beperking, aangezien er meer biologische replicaten nodig zijn om een adequaat aantal neuronen te bereiken.

Sommige automatische methodologieën, zoals NeuroMath 2,28, lossen het probleem op van de tijdrovende neurietsegmentatie die op een automatische manier wordt uitgevoerd.

Vanwege tijdgebrek levert deze module voor het meten van neurietuitgroei echter snellere resultaten bij het verkrijgen van beelden op de time-lapse-microscopiemachine. Dit laatste, samen met deze software, verbetert de tijd- en kostenefficiëntie aanzienlijk voor zowel studenten als hoofdonderzoekers.

Met de acquisitiemachine kan een vrij complete kaart van de put worden gemaakt, waarbij een variabel aantal afbeeldingen wordt verkregen op basis van de diameter van de put. Dit is een aanzienlijk voordeel omdat meerdere neuronen tegelijkertijd in beeld worden gebracht. Het bereiken van slechts een vergroting van 20x is echter voldoende en geschikt om de beelden met de software te analyseren. Zijn kracht berust op zijn vermogen om te trainen op een reeks beelden en een semi-automatische meting van de totale axonale lengte uit te voeren. Bovendien kan de software werken op zowel individuele neuronen als neuronale netwerken. De software is in staat om neurieten en cellichamen te segmenteren met twee verschillende maskers. Een geel masker segmenteert alle objecten met een hoog contrast in de afbeelding, zoals cellichamen, celresten en schaduwen. Een magenta masker segmenteert in plaats daarvan neurieten. De precisie en nauwkeurigheid van de software werden bewezen door de segmentatie van dezelfde neuronen met zowel de software als NeuronJ. Vanuit het oogpunt van statistische analyse correleerden de waarden van neurietlengtes mooi met een hoge Spearman-correlatiecoëfficiënt.

Nadat we de betrouwbaarheid van de methode hadden beoordeeld, gingen we over tot de analyse van verschillende testomstandigheden. Voor een optimale analyse zijn enkele voorzorgsmaatregelen vereist. Ten eerste moeten neuronen gelijkmatig in de put worden gezaaid, waarbij plekken met een hoge celconcentratie worden vermeden. De clustering van neuronen zorgt ervoor dat de software precisie verliest bij de detectie van de neurieten. Een andere variabele die de nauwkeurigheid en precisie van de analyse beïnvloedt, is de reinheid van de cultuur. Een schone cultuur met weinig celresten en dode cellen heeft de voorkeur. De software is echter in staat om dergelijke problemen te compenseren door modulatie van de neurietgevoeligheid en het cellichaamsegmentatiemasker. Zoals eerder vermeld, segmenteert het gele masker objecten met een hoog contrast, waaronder er ook schaduwen zijn die worden veroorzaakt door de beweging van het medium in de put. De schaduwen kunnen neurieten bedekken, wat resulteert in het verlies van neurietlengte. Een dergelijk probleem is echter eenvoudig op te lossen door het medium te laten bezinken voordat het beeld wordt verkregen.

Het algoritme is in staat om de kwantificering van de neurietlengte uit te voeren op zowel fasecontrastbeelden als immunocytochemische beelden. Wanneer er sprake is van fluorescentie, moeten andere voorzorgsmaatregelen worden genomen om een betrouwbare analyse te verkrijgen. Ten eerste heeft de kwaliteit van de kleuring een grote invloed op de uitkomst van de analyse. Als neurieten worden gebroken of gesegmenteerd en cellichamen worden weggescheurd tijdens het wassen, verliest de analyse aan kracht en betrouwbaarheid. Bovendien vormt de fluorescentie zelf een potentieel storend element voor de analyse. Omdat de scherpstelling automatisch door de machine wordt uitgevoerd, stelt het objectief zeer heldere objecten zoals artefacten, cellichamen of dikke neurieten scherp. Hierdoor blijven er dunnere en minder heldere neurieten achter, waardoor het voor de gebruiker moeilijk is om de neurietlengte goed te meten.

Als gevolg hiervan zou de analyse van fasebeelden beter onderbouwd kunnen zijn in vergelijking met de analyse van immunocytochemische beelden. De software is in staat om aan veel verschillende neuronale morfologieën te werken, van de meest ingewikkelde en uitgebreide tot de eenvoudigste, hetzij als eencellige of in neuronale netwerken. Daarom is het bruikbaar in veel verschillende onderzoeksgebieden, variërend van primaire culturen van neuronen afkomstig uit het centrale of perifere zenuwstelsel van verschillende ontwikkelingsstadia tot iPSC-afgeleide neuronen en cellijnen zoals NSC-34.

Ondanks het aanzienlijke potentieel van de software, zijn er enkele beperkingen op te merken. Ten eerste is de precisie van de segmentatie van het cellichaam suboptimaal. Bijgevolg kunnen parameters zoals het cellichaamcluster en het cellichaamclustergebied niet op betrouwbare wijze worden gebruikt voor het tellen van cellen. Ten tweede kunnen, naast de noodzakelijke voorzorgsmaatregelen voor een optimale neurietsegmentatie, onvoldoende dikke axonen worden uitgesloten van de neurietlengtemeting, wat leidt tot gegevensverlies.

De parameter vertakkingspunt stuit op problemen met betrekking tot beide typen segmentatie. Schaduwen, dode cellen of puin in de cultuur die zich op vertakkingspunten bevinden, verdoezelen ze omdat ze bedekt raken door de segmentatie van het cellichaam. Bovendien wordt in het geval van dunne neurieten de betrouwbaarheid van de vertakkingspuntparameter opnieuw ernstig aangetast.

Bovendien kan de automatische scherpstelling tijdens het verwerven van beelden soms suboptimaal zijn. De maximale vergroting van de machine is beperkt tot 20x, wat mogelijk onvoldoende is voor het waarnemen van fijnere details of fluorescentie in slanke structuren zoals neurieten. Bovendien presteert de machine het beste met homogene kunststof substraten. Als er een glazen dekglaasje in de put wordt geplaatst, kan de scherpstelling op het glas mislukken, wat resulteert in gedeeltelijk wazige beelden. Deze software is echter niet alleen van toepassing op neuronen, maar ook op heel andere onderzoeksgebieden, zoals schimmelgroei36.

Alles bij elkaar genomen zijn wij van mening dat deze module voor het meten van neurietuitgroei een betrouwbaar hulpmiddel is om neurieten snel, onbevooroordeeld en efficiënt te meten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die mogelijk tot een belangenconflict zouden kunnen leiden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Alessandro Vercelli bedanken voor de kritische opmerkingen en de technische ondersteuning van Sartorius voor de hulp. Ons onderzoek naar deze onderwerpen is genereus ondersteund door de Rita-Levi Montalcini Grant 2021 (MIUR, Italië). Dit onderzoek werd gefinancierd door het Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR-project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 aan de afdeling Neurowetenschappen Rita Levi Montalcini. Het onderzoek van D.M.R. is uitgevoerd tijdens en met de steun van de Italiaanse nationale interuniversitaire PhD-cursus in Duurzame Ontwikkeling en Klimaatverandering (link: www.phd-sdc.it).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase AMerck / Roche10103586001
Dispase II (neutrale protease, graad II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco's gemodificeerd adelaarsmediumMerck / SigmaD5796
Fetaal bovien serum Merck / SigmaF7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 met L-GlutamineEurocloneECM0135L
Hanks' Balanced Salt SolutionEurocloneECM0507L
HBSS (10X), zonder calcium, zonder magnesium, zonder fenol roodThermoFisher Scientific14185045
HyClone gekenmerkt foetaal bovien serum (VS)CytivaSH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminine Muis Proteïne, NatuurlijkThermoFisher Scientific23017015
L-CysteineMerck / SigmaC7352
Leibovitz's L-15 medium zonder L-glutamineEurocloneECB0020L
muis NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Neurobasal Medium [-] GlutamineThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)CLU140
Papaïne uit papajalatexSigmaP4762
Penicilline-Streptomycine (5.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll (Dichtheid 1.130 g/mL)Cytiva17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)SigmaP4832
Recombinant Humaan NT-3PeproTech450-03
Retinoic AcidMerck / SigmaR2625
Trypsine-EDTA oplossingSigmaT3924
β-Tubuline III (Tuj1) antilichaamMerck / SigmaT8660

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741(2020).
  17. Kim, H., Caspar, W. T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901(2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463(2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960(2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9(2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567(2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174(2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00719 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neurietvertakkingneuronale morfologietime lapse microscopiefasecontrastbeeldvormingimmunocytochemische beeldensensorische neuronculturenaxonale regeneratieneuropathische pijn

Gerelateerde artikelen