Methodenartikel

Productie van collageen met nanofibrillaire patronen voor weefselmanipulatie

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 september 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het volgende protocol presenteert een op afschuiving gebaseerde extrusiemethode voor de fabricage van collageenhydrogels met fibrillen met nanoschaalpatronen, die kan worden toegepast op een breed scala aan weefselengineeringtoepassingen.

Samenvatting

Regeneratieve biomaterialen zijn ontworpen om interacties tussen cellen en materialen te vergemakkelijken om het herstel van beschadigde weefsels en organen te begeleiden. Deze materialen zijn ontworpen om de biofysische eigenschappen van natuurlijk weefsel na te bootsen en cellulaire fenotypische en morfologische begeleiding te bieden die bijdraagt aan het herstel van de regeneratieve weefselniche. Collageen, een veel voorkomend extracellulair matrixeiwit, is een veelgebruikt bestanddeel van deze regeneratieve biomaterialen vanwege de biocompatibiliteit en andere gunstige eigenschappen. De huidige studie beschrijft een nieuwe en eenvoudige methode voor de fabricage van gemanipuleerd nanofibrillair collageen met gerichte fibrilpatronen. Door de manipulatie van schuifspanning, temperatuur en pH worden collageenfibrillogenese en uitlijning nauwkeurig gecontroleerd zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is. Deze benadering maakt het mogelijk om nanofibrillaire collageenbiomaterialen te creëren die de natuurlijke structuur van weefsels nabootsen die anisotrope of isotrope kenmerken vertonen. De flexibiliteit in patroonvorming van collageennanofibrillen vergemakkelijkt niet alleen de studie van patroonvorming op nanoschaal op celgedrag, maar biedt ook diverse mogelijkheden voor toepassingen van weefselmanipulatie met patronen.

Inleiding

Het doel van regeneratieve geneeskunde is het verbeteren van weefselregeneratie en genezing door de toepassing van gemanipuleerde therapieën. Eén benadering omvat de fabricage van biomateriaalconstructies die de samenstelling en structuur van natuurlijke weefsels nauw nabootsen. Bij het ontwerpen van deze constructies is een kritische overweging de natuurlijke onderliggende extracellulaire matrix (ECM), die instructieve aanwijzingen geeft voor celproliferatie, migratie en differentiatie, en uiteindelijk weefselregeneratie aanstuurt 1,2. De natieve ECM bestaat voornamelijk uit fibrillair collageen 3,4. In sterk georganiseerde weefsels zoals skeletspieren en pees vertonen deze ECM's een uitgelijnd patroon, wat essentieel is voor het ondersteunen van de krachtoverdracht over het weefsel en de motorische functie 5,6.

Het nut van collageen als biomateriaal voor weefselmanipulatietoepassingen gaat verder dan de uitgebreide prevalentie in natuurlijke weefsels, omdat het ook een goede biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en celaffiniteit vertoont 7,8,9. Recente ontwikkelingen in de ontwikkeling van op collageen gebaseerde biomaterialen zijn gericht op de verfijning van biofysische eigenschappen om de mechanische en biochemische signalen die essentieel zijn voor specifieke weefselregeneratie beter te begeleiden. Het maken van collageenbiomaterialen met een fibrillaire structuur in vitro is relatief eenvoudig, aangezien in zuur oplosbare collageenmoleculen in staat zijn om zichzelf te assembleren tot nanofibrillen wanneer ze worden blootgesteld aan warme temperaturen en een neutrale pHvan 10,11. Zonder geleide manipulatie zullen deze fibrillen zich echter vormen tot willekeurige netwerken, waardoor ze ongeschikt worden voor anisotrope weefselmanipulatietoepassingen. Technieken die in staat zijn om uitgelijnde fibrillen te produceren, zijn onder meer elektrospinnen en natspinnen, samen met andere oplossingsextrusietechnieken12,13, vriesdrogen14, elektrochemische of magnetische fabricage15,16, afschuifstroomafzetting17, door stroming geïnduceerde kristallisatie18, gel-extrusie19, door rek geïnduceerde uitlijning20 en krachtgeleide uitlijning door de manipulatie van vloeistof debiet21,22. Veel van deze methoden zijn echter niet erg compatibel met collageen, produceren uitlijning op microschaal maar niet op nanoschaal, vereisen extra nabewerkingsstappen om uitlijning en stabiliteit te induceren of vereisen zeer gespecialiseerde apparatuur en reagentia, waardoor hun wijdverbreide acceptatie uitdagend wordt.

De huidige studie presenteert een gemakkelijke, op afschuiving gebaseerde methode voor de fabricage van nanofibrillair collageen, met uitgelijnde of willekeurig georiënteerde fibrilpatronen, zonder dat er gespecialiseerde apparatuur zoals spuitpompen of elektrospinners nodig zijn. Deze techniek maakt gebruik van de pH-afhankelijkheid van collageenfibrillogenese. Toepassing van afschuifkracht op zuur monomeer collageen in een neutraliserende buffer bevordert uitgelijnde fibrillogenese in de richting van de afschuiving. Evenzo kan collageen worden geïnduceerd om fibrillogenese te ondergaan in afwezigheid van afschuiving, waardoor fibrillen met willekeurige patronen worden geproduceerd. De resulterende 3D-collageenstrips, bestaande uit uitgelijnd of willekeurig gevormd nanofibrillair collageen, kunnen dienen als hulpmiddelen om de effecten van patronen op nanoschaal op celgedrag te bestuderen. Bovendien bieden ze diverse mogelijkheden voor zowel anisotrope als isotrope weefselengineeringtoepassingen 23,24,25,26,27. Het patroon kan worden aangepast aan de structuur van het natuurlijke weefsel van belang. De collageenstrips kunnen ook worden gecombineerd tot bundels van verschillende grootte om te dienen als een getransplanteerd gemanipuleerd therapeutisch middel in verschillende maten en vormen van verwondingen.

Protocol

1. Bereiding van gedialyseerd collageen ( Figuur 1)

  1. Knip de dialyseslang op een lengte van ongeveer 3 inch. Gebruik slangen met de volgende specificaties: 32 mm platte breedte, 20 mm opgeblazen diameter en 4,8 nm poriegrootte.
  2. Rehydrateer de dialyseslang in ultrazuiver water.
  3. Klem het ene uiteinde van de slang vast met een dialyseslangclip.
  4. Breng 5-6 ml rattenstaartcollageen type I (concentratie: 9-10 mg/ml in 0,02 N azijnzuur) over in de slang met behulp van een spuit van 10 ml die is uitgerust met een naald van 18 G. Klem het andere uiteinde van de slang vast om te sluiten.
  5. Plaats een 0,5-1 cm dikke laag polyethyleenglycol (PEG) vlokken op de bodem van een glazen schaal en plaats vervolgens de met collageen gevulde dialyseslang op de PEG-laag.
    OPMERKING: Een glazen schaal van 13 inch x 9 inch x 2 inch is doorgaans geschikt voor een rij van 4-5 met collageen gevulde buizen. De grootte van de schaal kan worden aangepast op basis van de hoeveelheid collageen die nodig is.
  6. Voeg meer PEG-vlokken toe om de slang volledig te bedekken en plaats de lade in een koelkast van 4 °C.
  7. Verwijder elke 10-15 minuten de natte PEG-vlokken van het oppervlak van de dialyseslang en bedek de slang opnieuw met een nieuwe laag droge PEG. Zet de schaal terug in de koelkast van 4 °C.
  8. Herhaal stap 1.7 nog twee keer en spoel na 30-35 minuten de natte PEG-vlokken af met kraanwater.
  9. Spoel de slang nog een keer af met ultrazuiver water en dep de slang droog met een tissue.
  10. Maak het ene uiteinde van de slang los en breng het gedialyseerde collageen (eindconcentratie: ~30 mg/ml) over in microcentrifugebuisjes. Draai de luchtbellen in het collageen kort af met behulp van een minicentrifuge (2.000 x g, ≤30 s, kamertemperatuur [RT]) en bewaar bij 4° C voor later gebruik.
  11. Doe het collageen een dag voor gebruik in spuiten.
    1. Gebruik een naald van 16 gauge om ~1 ml gedialyseerd collageen op te zuigen in een spuit van 1 ml.
      LET OP: Collageen is een stroperige stof. De naaldkop moet mogelijk worden voorgeladen met collageen voordat er meer collageen wordt opgetrokken. Verwijder de naaldkop en verwijder indien nodig grote luchtbellen
    2. Verwijder de naald en wikkel de kop van de spuit in met parafilm.
    3. Bewaar de met collageen gevulde spuit een nacht rechtop bij 4° C om kleine luchtbelletjes te laten knappen.

2. Bereiding van glassnippers ( Figuur 1)

LET OP: Gebruik oogbescherming voor dit deel van het protocol.

OPMERKING: Speciaal gecoate hydrofobe glasdia's worden gebruikt voor celkweekexperimenten. De geleiders moeten aan de randen worden gehanteerd om te voorkomen dat de oppervlaktelaag wordt verwijderd. Voer de glassnijprocedure uit op een geschikt snijoppervlak.

  1. Meet en markeer de gewenste afmetingen van de glassplinter met behulp van een permanente marker
    1. Als u 8-strooks steigers maakt, markeert u stappen van ongeveer 1 cm langs de lange zijde van de dia. Pas de afmetingen indien nodig aan op basis van de gewenste grootte van de steiger.
  2. Gebruik een rechte rand (d.w.z. een plaatrand met 6 putjes) en laat de glassnijder over de lengte van de eerste meting glijden om het glas te scoren.
  3. De dia zal ofwel uit zichzelf langs de ingekerfde lijn breken of de dia omdraaien op een weefsel (hydrofobe kant naar beneden) en handmatig druk uitoefenen op het gescoorde gebied.
  4. Markeer de gecoate kant van de hydrofobe glasplaat met een ethanol markeerstift.
  5. Spoel de glassplinter af met ultrazuiver water om achtergebleven glasstof te verwijderen.
  6. Droog de glasspanen met behulp van een tafelmondstuk voor perslucht of door ze schuin in de zuurkast te stapelen.
  7. Herhaal indien nodig voor het vereiste aantal chips. Bewaar de chips bij RT. Gebruik voor de beste celkweekresultaten bereide chips binnen 7 dagen.

3. Bereiding van 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)

  1. Vul een glazen fles met 500 ml ultrazuiver water.
  2. Voeg 10 PBS-tabletten toe aan de fles.
    OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat de tabletverhouding voor 1x PBS 1 tablet per 500 ml is. Pas het aantal tablets naar behoefte aan als u een ander tabletformaat of merk gebruikt.
  3. Voeg een roerstaaf toe aan de fles en plaats deze op een roerplaat tot de tabletten zijn opgelost.
  4. Breng op de dag van de hydrogelfabricage het benodigde volume van 10x PBS over op conische buizen van 50 ml.
  5. Plaats de met PBS gevulde buisjes in een waterbad van 37 °C gedurende ten minste 15 minuten voordat u het collageen produceert.

4. Fabricage van uitgelijnde collageennanofibrillen (Figuur 2)

  1. Haal een spuit collageen uit de koelkast en bevestig een stompe naald van 22 G.
  2. Plaats een glasplaatje in het deksel van een bord met 4 putjes.
  3. Bedek de dia met voldoende opgewarmde 37 °C 10x PBS om hem onder te dompelen (30-50 ml).
  4. Houd de spuit in een hoek van ongeveer 30-45° en extrudeer handmatig dunne reepjes collageen op de glaschip met een snelheid van ~340 mm/s en een debiet van ~3,2 ml/min.
    OPMERKING: Voltooi de collageenextrusie binnen 30-60 s na het toevoegen van de opgewarmde PBS om ervoor te zorgen dat de PBS niet overmatig afkoelt.
  5. Wacht 1-2 minuten om het collageen de fibrillogenese te laten voltooien of totdat het collageen een ondoorzichtige witte kleur krijgt.
  6. Gebruik een tang om de collageenstrips op lengte te knippen. Zorg ervoor dat de strips lang genoeg zijn, zodat er 3-5 mm onder beide uiteinden van de chip kan worden gevouwen.
  7. Drapeer de stroken collageen een voor een voorzichtig in de lengte (evenwijdig aan het gegroefde gebied) over een voorbereide glaschip. Stop de randen onder de chip.
  8. Ga door met het plaatsen van collageenstrips totdat de gewenste afmetingen zijn bereikt.
  9. Plaats de nieuw gevormde collageenhydrogel over twee putjes van een plaat met 12 putjes. Dit zorgt voor luchtstroom tijdens het droogproces en voorkomt dat de uiteinden van het collageen zich aan ongewenste oppervlakken hechten.
  10. Laat de hydrogels 1-3 uur op het werkblad drogen of totdat PBS-zoutkristallen 50%-90% van het hydrogeloppervlak bedekken.
    OPMERKING: De droogtijd is afhankelijk van de grootte van de hydrogel en de aanwezigheid van overtollige vloeistof.
  11. Dompel elke hydrogel onder in 1x PBS gedurende ongeveer 30-60 s of totdat de zoutkristallen zijn opgelost.
  12. Dep voorzichtig overtollig PBS af met een tissue.
  13. Plaats de hydrogels terug op de putplaat en laat ze een nacht drogen in een zuurkast.
  14. Bewaar de gedroogde hydrogels ongeveer 1 week bij RT.

5. Fabricage van willekeurige collageennanofibrillen (Figuur 3)

  1. Haal een spuit collageen uit de koelkast en bevestig een stompe naald van 22 G.
  2. Extrudeer collageen met ~3,2 ml/min op een droge glaschip. Extrudeer voldoende collageen om vergelijkbare afmetingen te verkrijgen als de uitgelijnde collageenhydrogels. Voorkom indien nodig de ophoping van luchtbellen.
  3. Extrudeer extra collageen om rond de randen van de glassplinter te wikkelen. Dit minimaliseert het risico op onbedoelde loslating.
  4. Gebruik een tang om het geëxtrudeerde collageen onder te dompelen in een tube van 50 ml verwarmde 10x PBS.
  5. Wacht 45-60 s totdat het collageen de fibrillogenese heeft voltooid of totdat het collageen een ondoorzichtige witte kleur krijgt.
  6. Dep voorzichtig overtollig PBS af met een tissue.
  7. Voltooi stap 4.9-4.14 om de hydrogels af te spoelen en te drogen

6. Sterilisatie en rehydratatie

OPMERKING: Voltooi alle volgende stappen in een bioveiligheidskast

  1. Steriliseer de collageenhydrogels en de omliggende putplaat gedurende 15 minuten in 70% ethanol.
    1. Breng de hydrogels halverwege de sterilisatie kort omhoog met een tang om ervoor te zorgen dat zowel de onderkant van de glassplinter als de hydrogel in contact komen met ethanol.
  2. Verwijder de ethanol en laat de hydrogels 10 minuten aan de lucht drogen.
  3. Was de hydrogels 3 keer in steriel 1x PBS, gedurende 10 minuten per stuk, om resterende ethanol te verwijderen en de hydrogels te rehydrateren. Hydrogels zijn nu klaar voor gebruik (celcultuur, enz.). Hydrogels kunnen na de laatste wasstap kort in PBS blijven zitten als ze niet onmiddellijk klaar zijn voor gebruik.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige extrusietechniek op basis van afschuiving voor de fabricage van collageenhydrogels die zijn samengesteld uit uitgelijnde (Figuur 2) of willekeurig (Figuur 3) georiënteerde nanofibrillen. Nanofibrilpatronen zijn gebaseerd op de nauwkeurige regeling van schuifkrachten, die wordt bereikt door de gecombineerde modulatie van spuitsnelheid en collageenextrusiesnelheid. Optimale waarden voor het induceren van fibrilluitlijning zijn eerder vastgesteld op een spuitsnelheid van 340 mm/s en een collageenextrusiesnelheid van 3,2 ml/min28,29. Deze balans is niet alleen van cruciaal belang voor de vorming van uitgelijnde nanofibrillen, maar ook voor het waarborgen van de functionaliteit van de hydrogels op macroschaal. Als deze verhouding niet goed is uitgelijnd, bestaat het risico dat er hydrogels worden gefabriceerd die niet het patroon hebben zoals verwacht, evenals hydrogels die collageenstrips bevatten die te dun zijn (<0,5 mm diameter), dik (>1,5 mm diameter) of golvend voor gebruik. Een te snelle beweging van de spuit, in combinatie met een te langzame extrusiesnelheid, resulteert bijvoorbeeld in dunne strips, terwijl de tegenovergestelde verhouding dikke of golvende strips oplevert (Figuur 4A-D), afhankelijk van de mate van onbalans in de verhouding. Deze verschillen in macroscopische eigenschappen kunnen voldoende variabiliteit van strook tot strook creëren om de celafzetting en lokale adhesie te beïnvloeden.

Na de extrusie en assemblage van collageen doorloopt de fabricage van hydrogel een eerste droogfase, vaak 1 tot 3 uur, voordat een wasstap wordt ondergaan in 1x PBS (Figuur 2 en Figuur 3). Het bereiken van optimale topografische resultaten is afhankelijk van een delicaat evenwicht tussen de timing en intensiteit van de wasstap. Onvoldoende of vertraagd wassen resulteert in een verstoorde vezeltopografie, aangegeven door de afdrukken van PBS-zoutkristallen op de fibrillen. Daarentegen resulteert overmatig of voortijdig wassen van collageen na de fabricage in een opgeloste collageenlaag die de topografische kenmerken bedekt (Figuur 4E,F).

Scanning elektronenmicroscopie (SEM) bevestigt de aanwezigheid van uitgelijnde of willekeurige nanofibriloriëntatie in de collageenhydrogels. In zowel de uitgelijnde als de willekeurige hydrogels vertonen de nanofibrillen fibrildiameters tussen 30-50 nm29. Kwalitatief is het duidelijk dat uitgelijnde hydrogels uniaxiaal uitgelijnde nanofibrillen bevatten (Figuur 5). Deze uitlijning is eerder gekwantificeerd met behulp van 2D snelle Fouriertransformatie-analyse, waarbij de uitlijningsgrafiek twee verschillende pieken weergeeft die 180° uit elkaar liggen voor uitgelijnde hydrogels, in tegenstelling tot willekeurig georiënteerde hydrogels die alleen laagfrequente pieken vertonen28.

Helderveldbeelden van primaire skeletspiermyoblasten van muizen illustreren dat anisotrope nanotopografische geleiding van collageenfibrillen de cellulaire uitlijning bevordert (Figuur 6). Van deze collageenhydrogels met nanopatroon is aangetoond dat ze cellulaire uitlijning induceren, niet alleen in myoblasten26, maar ook in andere celtypen, zoals endotheelcellen 23,24.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische illustratie van de voorbereiding van collageen en geslepen glas met ultrahoge dichtheid. (A-F) Proces van collageendialyse: (A) voorbereiding van de dialyseslang in stroken van 3 inch en het vastzetten van de eerste clip, (B) laden van stockcollageen met hoge dichtheid in de slang en het vastzetten van de tweede clip, (C) omhulling van de geladen dialyseslang met polyethyleenglycol (PEG) vlokken, (D) verwijdering van verzadigde PEG-vlokken, (E) afspoelen van PEG-vlokken met water, en (F) opslag van collageen met ultrahoge dichtheid in microcentrifugebuisjes. (G-L) Proces van het snijden van glasplaatjes: (G) verwerving van glasplaatjes voor studie, (H,I) insnijden van glasplaatje met diamantpuntglassnijder, (J) breken van glasplaatje vanaf niet-gegroefde zijde, (K) spoelen van geslepen glas met water, en (L) drogen van glasplaatje. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Uitgelijnd fabricageproces van collageenhydrogel. Stap 1: Collageenextrusie onder afschuiving in de 10x PBS verwarmde buffer en inductie van fibrillogenese; Stap 2: Montage van geëxtrudeerd collageen op geslepen glazen geleiders; Stap 3: Montage van extra geëxtrudeerd collageen om de grootte van de hydrogel te vergroten; en Stap 4: Drogen van collageenhydrogels. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Willekeurig fabricageproces van collageenhydrogel. Stap 1: Collageenextrusie op gesneden glasplaatjes (enkele strip); Stap 2: Voortdurende extrusie van collageen vergroot de omvang (meerdere strips); Stap 3: Onderdompeling van geëxtrudeerd collageen in een 10X PBS-buffer om fibrillogenese te starten; en Stap 4: Drogen van hydrogels. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Mogelijke foutstappen in het fabricageproces van collageenhydrogel. (A-F) Voorbeelden van (A) optimaal dikke collageenstrips, (B) te dikke collageenstrips, (C) onvoldoende dikke collageenstrips, (D) kronkelende collageenstrips en (E,F) overgewassen collageenoppervlakken weergegeven met behulp van scanning-elektronenmicroscopie. Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Scanning elektronenmicroscopiebeelden van uitgelijnde en willekeurige collageenhydrogels. De foto's zijn gemaakt met een elektronenmicroscoop. De straalcondities werden ingesteld op 2 keV, met een stroombereik van 25-100 pA en een werkafstand van 4-5 mm. Afbeeldingen werden consequent opgeslagen met een resolutie van 6144 x 4096 pixels met een verblijftijd van 1 μs. Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Primaire muizenmyoblasten gekweekt op uitgelijnde en willekeurige collageenhydrogels. Myoblasten werden gedurende 3 dagen voorafgaand aan de beeldvorming op de hydrogels gekweekt. Helderveldbeelden werden gemaakt met een vergroting van 10x met behulp van een omgekeerde microscoop. De pijl geeft de uitgelijnde oriëntatie van de nanofibrill aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

De kritieke stappen van het protocol kunnen worden gedestilleerd in drie hoofdonderdelen: 1) collageenfibrillogenese, 2) hydrogelmontage en 3) wassen. Het proces van collageenfibrillogenese vindt spontaan plaats onder neutraliserende omstandigheden en is afhankelijk van de zelfassemblage van individuele collageenmoleculen tot grotere gestabiliseerde fibrillaire structuren10,11. Dit wordt bereikt door de toepassing van een neutraliserend gebufferd medium zoals 10x PBS dat wordt opgewarmd tot 37 °C en van cruciaal belang is voor het geleiden van de elektrostatische interacties die zorgen voor de volledige ontwikkeling van collageen tot fibrillen. Fibrillaire uitlijning op nanoschaal wordt bereikt door de toepassing van schuifkrachten gelijktijdig met het optreden van fibrillogenese. De aan- of afwezigheid van afschuiving, evenals de afschuifsnelheid, bepalen de patroonvorming van de fibrillen. Ten tweede is hydrogelmontage een belangrijke stap in het versterken van de stabiliteit van het materiaal door fysieke ankers te bieden tijdens het droogproces, waarbij samentrekking en uitdroging van het collageen plaatsvinden. Deze stap is vooral van cruciaal belang als het beoogde gebruik is voor het in vitro zaaien van cellen, omdat het collageen op een stijf substraat wordt bevestigd dat ongecontroleerde samentrekking voorkomt. Het montageproces verschilt enigszins tussen de willekeurige en uitgelijnde hydrogels met patroon. Een goede hechting van willekeurige hydrogels vereist extra collageenafzetting langs de randen van het montageoppervlak (meestal glas) voorafgaand aan de fibrillogenese om het aan het oppervlak te bevestigen. De hydrogels met uitgelijnde patronen zijn om de randen van het montageoppervlak gewikkeld om hetzelfde verankeringsdoel te dienen. Een belangrijke extra overweging bij uitgelijnde hydrogels is dat de eerste plaatsing van de collageenstrip bepalend is voor de vorm en uniformiteit van de hydrogel. De daaropvolgende plaatsing van de strip wordt geleid door de oppervlaktespanning van het afgezette collageen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de hydrogel na het plaatsen niet wordt aangeraakt. Ten slotte is een goede hydrogel drogen en wassen na de montage van vitaal belang om de topografische kenmerken van de hydrogel te behouden. Onvoldoende drogen gevolgd door wassen met 1x PBS of water kan leiden tot een opgeloste of cakeachtige laag collageen. Om dit te voorkomen, is het volledig drogen van de hydrogels essentieel en kan dit visueel worden bevestigd door de vorming van PBS-kristallen en een toename van de collageenopaciteit.

De collageenhydrogels zijn gebruikt voor zowel in-vitro-onderzoeken als regeneratieve engineeringtoepassingen in vivo 23,24,25,26,27. Het is belangrijk op te merken dat de hydrogels onder niet-steriele omstandigheden worden vervaardigd en moeten worden gesteriliseerd voorafgaand aan elke vorm van celkweek of transplantatie. De aanbevolen vorm van sterilisatie is 70% ethanol, aangezien andere vormen van sterilisatie, zoals ultraviolet licht, het nanofibrilpatroon zullen verstoren door verknoping en afbraak van de collageenmoleculen30. De verwijdering van ethanol door verdampings- en wasstappen is echter belangrijk voor het minimaliseren van resterende ethanol, wat schadelijk kan zijn voor de celcompatibiliteit. Variabiliteit van batch tot batch van het bouilloncollageen kan leiden tot variabiliteit in de werkconcentratie van het gedialyseerde collageen met hoge dichtheid, wat van invloed kan zijn op het fibrillogeneseproces. Afhankelijk van de toepassing kan willekeurige isotrope patronen de voorkeur hebben boven uitgelijnde anisotrope patronen; Daarom hebben we in het huidige protocol beide benaderingen opgenomen om de fibrilorganisatie te moduleren.

Een beperking van de in dit protocol beschreven extrusiemethode op basis van afschuiving is dat het proces in hoge mate handmatig en gebruikersafhankelijk is. Er is veel training en oefening nodig om elke operator te kalibreren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dit betekent dat de doorvoer laag en tijdrovend kan zijn om precisie te garanderen. Sommige van deze beperkingen kunnen worden opgelost met behulp van sterk geautomatiseerde, machinegebaseerde fabricagemethoden zoals 3D-printen, elektrospinnen en zachte - en oppervlaktelithografie. In tegenstelling tot deze andere methoden, vereist deze volledig handmatige fabricageprocedure voor nanofibrillen echter geen gespecialiseerde apparatuur en is deze toegankelijk en betaalbaar. Naarmate de vooruitgang in 3D-printmethodologieën en kosteneffectiviteit blijven verbeteren, is er potentieel om dit protocol aan te passen en te integreren met 3D-printtechnologie. Een dergelijke integratie is nog niet mogelijk, maar zou de consistentie en doorvoer van dit protocol ten goede komen.

De fabricage van twee verschillende hydrogel-topografieën biedt een unieke kans om zich te verdiepen in de nano-topografische geleiding van collageenfibrillen op cellulaire morfologie, gedrag en weefselregeneratie. Door de respons op verschillende fibriltopografieën te observeren, kunnen we inzicht krijgen in hoe substraatpatronen op nanoschaal het celfenotype beïnvloeden. Eerder werk geeft bijvoorbeeld aan dat wanneer endotheelcellen een langwerpige morfologie aannemen bovenop uitgelijnde nanofibrillen, ze een ontstekingsremmend fenotype vertonen en een verhoogde weerstand tegen verstoorde stromingsomstandigheden24. Deze bevindingen vergroten niet alleen ons begrip van de ontwikkeling van atherosclerotische laesies, maar zijn ook veelbelovend voor het ontwerp van toekomstige atheroprotectieve bypasstransplantaten. Deze collageenhydrogels kunnen worden gebruikt voor weefselmanipulatietoepassingen en worden verrijkt met groeifactoren of cellen voorafgaand aan implantatie om de therapeutische werkzaamheid te verbeteren 25,26,27. Vergelijkende analyse toont aan dat hydrogels met uitgelijnde topografieën superieure spierregeneratie en vascularisatie vertonen in vergelijking met hydrogels met willekeurige topografieën26 en dat deze hydrogels kunnen worden gebruikt in een acellulaire "kant-en-klare" vorm als ze beladen zijn met myogene groeifactoren om weefselregeneratie te verbeteren in een muisletselmodel27. Hoewel de primaire focus tot nu toe lag op het gebruik van deze hydrogels als potentiële therapieën voor spierblessures, kunnen ze worden toegepast op een breed spectrum van regeneratieve en weefselmanipulatietoepassingen.

Openbaarmakingen

Er zijn geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van de Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, de Oregon Health & Science University Foundation en de Collins Medical Trust. K.M.H. werd ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1937961) en de Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) Fellowship (5TL1TR2371-8). K.H.N. werd ondersteund door subsidies van de NIH/NHLBI (R00HL136701) en NIH/NIAMS (R01AR080150).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagen I, High Concentration, Rat TailCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U microscoopNikonTE-2000-U Omgekeerd microscoop
Extra Dikke MicroscoopglazenFisher Scientific22-267-005Werkt goed voor collageen extrusie oppervlak
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AScannende elektronenmicroscoop
Glas Snijgereedschap Set 2mm-20mm Potloodstijl Olievoeding Carbide TipAmazon/MOARMORB07Y1D243HOptie voor een glas snijder
Hamilton Kel-F Hub Blunt Point Naalden (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Naalden voor collageen extrusie
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Hydrofobe glijbanen
PBS TablettenThermo Fisher Scientific18912014
Polyethyleen Glycol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Naadloze Cellulose Dialyse Slangen Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Dialyse ClipsThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Glas SnijgereedschapSynthware31-501-927Optie voor een glas snijder
```

Referenties

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Nanofibrillair collageencollageenpatroneringcollageenfibrillogeneseextracellulaire matrixdialyseslangenschuifspanningcollageenhydrogelcellulaire uitlijningregeneratieve biomaterialen
Productie van collageen met nanofibrillaire patronen voor weefselmanipulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.