Methodenartikel

Integratie van de flexibiliteit en dynamiek van de doeleiwitstructuur bij het ontdekken van computationele geneesmiddelen met behulp van ensemble-gebaseerde dockinganalyse

DOI:

10.3791/67174

⸱

20 juni 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Computationele methoden zijn veelbelovend voor het versnellen van de ontdekking van geneesmiddelen, maar ze zien vaak de dynamische aard van eiwitstructuren over het hoofd. Hier bespreken we ensemble-gebaseerde docking-analyse om indirect eiwitflexibiliteit op te nemen, waardoor de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen mogelijk wordt verbeterd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het proces voor het ontdekken van geneesmiddelen is een rigoureuze, tijdrovende en dure operatie. De computationele benadering bij het ontdekken van geneesmiddelen stelt onderzoekers in staat om prioriteit te geven aan de meest veelbelovende verbindingen voor verdere tests, wat de vereiste middelen aanzienlijk zou verminderen, wat zou leiden tot een toename van de algehele efficiëntie in de pijplijnen voor het ontdekken van geneesmiddelen. Structuurgebaseerde ontdekking van geneesmiddelen is een veelgebruikte benadering die de structurele informatie van het doeleiwit in een driedimensionaal formaat vereist. De huidige beperking van de meeste computerondersteunde strategieën voor het ontdekken van geneesmiddelen is echter hun onvermogen om de flexibiliteit en dynamiek van de doeleiwitstructuur te introduceren tijdens de simulatie van het ligand-eiwit docking. Hoewel zowel geïnduceerde fit docking als ensemble-gebaseerde docking gericht zijn op het aanpakken van eiwitflexibiliteit in de dockingprocedure, kan de laatste een uitgebreider beeld geven van dynamisch eiwitgedrag door meerdere conformaties in de simulatie op te nemen. In dit rapport demonstreren en bespreken we de toepassing van een techniek die ensemble-gebaseerde docking-analyse wordt genoemd en die indirect de flexibiliteit en dynamiek van de doeleiwitstructuur in het moleculaire dockingproces introduceert. Het eiwit en ligand geselecteerd voor ensemble-gebaseerde docking-studies waren respectievelijk lysozym en Flovokawain B (FB). Van FB is eerder gemeld dat het een bindende werking heeft met lysozym. Een moleculaire dynamica (MD) simulatie werd uitgevoerd op lysozym in aanwezigheid van water, en de totale energie, wortel-gemiddelde-kwadratische afwijking (RMSD) en wortel-gemiddelde-kwadraatfluctuatie (RMSF) werden onderzocht. Conformatieclustering werd gegenereerd op basis van verschillende clustering-cutoff-waarden en werd gekozen voor aanvullende docking-analyse met FB. Cluster nr. 2 geeft de laagste bindingsenergie bij -29,37 kJ/mol. Moleculaire dockingbeelden werden gegenereerd om te anticiperen op de aanwezigheid van bindende krachten. Door de structurele dynamiek van het eiwit op te nemen, kan de ensemble-gebaseerde docking-benadering het bereik van mogelijke bindingsscenario's beter vastleggen, wat leidt tot betrouwbaardere voorspellingen van bindingsresultaten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij computational drug discovery (CDD) worden technieken uit de informatica, scheikunde, biologie en natuurkunde geïntegreerd om een enorme chemische ruimte te verkennen, interacties tussen geneesmiddelen en doelwitten te voorspellen en kandidaat-geneesmiddelen te optimaliseren met een hogere efficiëntie en lagere kosten in vergelijking met alleen traditionele experimentele methoden. Het is een krachtige benadering die gebruikmaakt van computationele methoden en algoritmen om de ontdekking en optimalisatie van nieuwe therapeutische verbindingen te versnellen 1,2,3. CDD heeft een revolutie teweeggebracht in de ontdekking van geneesmiddelen. Er zijn echter beperkingen verbonden aan de driedimensionale (3D) structuurdynamiek van eiwitten die de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van computationele voorspellingen kunnen beïnvloeden4. Eiwit 3D-structuren dienen als sjablonen in CDD voor het ontwerpen of optimaliseren van kandidaat-geneesmiddelen op basis van de doelwit-eiwit-geneesmiddelinteracties. Hoewel röntgenkristallografiemodellen van eiwitstructuren waardevolle structurele informatie over eiwitten bieden, is het essentieel om de dynamische aard van eiwitstructuren en de beperkingen van statische modellen te erkennen 5,6,7. Bovendien hebben recente ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) en computationele voorspellingen zoals AlphaFold ook de beschikbaarheid van structurele gegevens bij het vastleggen van het volledige spectrum van eiwitflexibiliteit en -dynamiek aanzienlijk uitgebreid 8,9,10,11,12.

Moleculaire dynamica (MD) simulaties simuleren de beweging en interacties van atomen en moleculen in de loop van de tijd en verschaffen inzicht in het dynamische gedrag en de flexibiliteit van de 3D-structuur van eiwitten13,14. MD-simulaties worden gebruikt om 3D-structuren van eiwitten te genereren die verschillende conformationele toestanden vertegenwoordigen, die dienen als input voor ensemble-gebaseerde docking-analyse. Door de bemonstering van diverse eiwitconformaties houdt ensemble-gebaseerde docking-analyse rekening met de inherente flexibiliteit en dynamiek van biologische doelen, waardoor een uitgebreidere verkenning van ligandbindingsmodi en -interacties mogelijk is3.

Het begrijpen van eiwitflexibiliteit is essentieel, omdat het van invloed is op hoe geneesmiddelen hun biologische effecten uitoefenen, de locatie en oriëntatie van bindingsplaatsen bepaalt en de bindingskinetiek, het metabolisme en het transport beïnvloedt15,16. Het vastleggen van deze dynamische aard kan de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van dockingvoorspellingen aanzienlijk verbeteren. In 1994 introduceerden Kearsley et al. een flexibele dockingtechniek, een raamwerk dat de flexibiliteit van zowel liganden als eiwitten modelleert. Deze benadering zorgt ervoor dat de conformatie van het eiwit zich tijdens het aanmeren kan aanpassen, waardoor de voorspellingen van ligand-receptorinteracties worden verbeterd door rekening te houden met structurele flexibiliteit17. Evenzo rapporteerden Carlson et al. in 1999 over ensemble-docking, waarbij flexibele farmacofoormodellering wordt toegepast op zowel statische als dynamische modellen van HIV-1-integrase, wat het belang benadrukt van het verklaren van eiwitdynamiek in docking-studies18. Bovendien rapporteerden Cavasotto et al. ook de verbetering van de nauwkeurigheid van het aanmeren van ligand door receptorflexibiliteit op te nemen in het aanmeerproces met behulp van analyse in de normale modus19. Meer recentelijk hebben ensemble-gebaseerde technieken 20,21,22,23,24,25,26,27 de ontdekking van geneesmiddelen uitgebreid door potentiële nieuwe ligandbindingsplaatsen te identificeren en nauwkeurigere schattingen te geven van vrije ligandreceptorbindingsenergie. Deze ontwikkelingen zijn toegepast op doelen zoals quadruplex-duplex DNA20, vasculaire endotheliale groeifactor 165 (VEGF-165)21, het SARS-CoV-2-doelenzym22, menselijke lever cytochroom P450-enzymen23 en antikankereiwitten24.

Flavokawain B (FB), geclassificeerd als een flavonoïde, is gedocumenteerd om verschillende farmacologische eigenschappen te vertonen 28,29,30. Op basis van experimentele en computationele analyse is gemeld dat FB een stabiel complex vormt met lysozym (LYZ)31, een eiwit dat algemeen wordt erkend vanwege zijn antimicrobiële activiteit en dat ook is geïdentificeerd als een ligandtransporter 32,33,34. In dit rapport analyseren we verder de aard van de interactie van FB met LYZ met behulp van ensemble-gebaseerde docking-analyse om de impact van eiwitflexibiliteit in de vorming van FB-LYZ-complexen op te nemen. Het doel van deze methode is om onderzoekers een stapsgewijs, herhaalbaar proces te bieden voor ensemble-gebaseerde docking-analyse. Daarnaast is het raadzaam voor onderzoekers om de eiwitstructuren van het doelorganisme te selecteren voor onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de ligandstructuur van Flavokawain B

  1. Open de website van PubChem. Zoeken naar Flavokawain B. Selecteer Downloaden en selecteer Opslaan voor SDF 2D-structuur als Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL SDF.
  2. Open de Avogadro-software. Verplaats het SDF-bestand naar de lege ruimte van de software. Klik op Ja.
    OPMERKING: Avogadro-software bouwt automatisch een driedimensionale (3D) geometrie.
  3. Klik op het tabblad op het pictogram, zoals weergegeven in afbeelding 1. Verander op het linkermenutabblad het krachtveld in MMFF9435,36. Pas de stappen per update aan naar 15. Stel het algoritme in op Steilste afdaling en klik op Start.
    OPMERKING: Verplaats geen atomen terwijl de rotatie aan de gang is. Als u klaar bent, klikt u op Stoppen. MMFF94 is geschikt voor een breed scala aan liganden met kleine moleculen (zowel neutraal als geladen) en wordt veel gebruikt voor energieminimalisatie en moleculaire modellering37. De Steepest Descent-methode wordt gekozen voor initiële energieminimalisatie omdat deze eenvoudig, rekenkundig efficiënt en effectief is voor het verwijderen van grote structurele spanningen en het bereiken van een basisminimalisatietoestand 38,39,40.
  4. Ga op het menutabblad naar Bestand en klik op Opslaan als. Wanneer de map Molecule opslaan als verschijnt, schrijft u de bestandsnaam als ligand.pdb en klikt u op Opslaan.

2. Lysozym eiwitstructuur preparaat

  1. Open de website van de RCSB-eiwitdatabank. Zoek naar lysozym, code: 1LYZ. Klik op Bestanden downloaden en selecteer PDB-indeling. Opslaan als 1lyz.pdb.
  2. Open de Chimera-software. Klik op het tabblad op Bestand en Openen. Selecteer in de map het bestand 1lyz.pdb .
    OPMERKING: Een 3D-structuur van lysozym zal worden geconstrueerd met behulp van software.
  3. Klik op het tabblad op Residu > selecteren > HOH. Klik vervolgens op Acties > Atom/Bindingen > Verwijderen. Klik op Selecteren en selectie wissen.
    OPMERKING: Hiermee wordt al het water uit het eiwit verwijderd.
  4. Klik op het tabblad op Selecteer > keten > A. Klik vervolgens op Extra > Structuur bewerken > AddH. Er komt een parametervak tevoorschijn en laat het als standaard staan. Klik op OK. Klik op Selecteren en selectie wissen (Afbeelding 2).
    OPMERKING: Hierdoor wordt waterstof aan het eiwit toegevoegd. Het histidineresidu wordt ook geprotoneerd om een neutraal systeem te creëren. De software kan pKa-berekeningen uitvoeren door PROPKA41,42 te integreren.
  5. Klik op het tabblad op Extra, Structuur bewerken en Kosten toevoegen. Er komt een parametervak uit; selecteer Gasteiger. Klik op OK. OPMERKING: Dit voegt gedeeltelijke ladingen toe aan het eiwit.
  6. Om het bestand op te slaan, klikt u op het tabblad op Bestand > PDB opslaan. Opslaan als protein.pdb.
    OPMERKING: In deze studie werd de structuur van lysozym gekozen om te vergelijken met eerder gerapporteerd resultaat31. Lezers wordt geadviseerd om zorgvuldig eiwitstructuren te selecteren van het doelorganisme van hun interesse.

3. MD-simulatie van lysozym in water

OPMERKING: De op maat gemaakte computers voor simulatie van moleculaire dynamica (MD) die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn Intel CORE i711e generatie voor CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 voor GPU en DDR4 128 GB geheugen. Het besturingssysteem is Ubuntu 22.04.4 LTS. De MD-simulatie maakt gebruik van GROMACS-software. De GPU-ondersteuning is CUDA.

  1. Download alle vereiste documenten via deze link: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (GROMACS Tutorial, Lysozym in Water)43.
    OPMERKING: De benodigde documenten zijn em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff en protein.pdb (uit stap 2.5). Voor het instellen van het systeem is em.mdp voor energieminimalisatie en ions.mdp is om ionen toe te voegen en het systeem te neutraliseren. Voor equilibratie is nvt.mdp voor temperatuurevenwicht, terwijl npt.mdp voor drukevenwicht is. Voor productie is md.mdp voor simulatie. Charmm36 ff is voor topologie.
  2. Klik met de rechtermuisknop op de lege ruimte in de map (de werkmap) en klik op Terminal openen. Typ gmx om de GROMACS-software te openen. OPMERKING: GROMACS heeft geen grafische gebruikersinterface; Het komt allemaal van het commando dat op de terminal is geschreven.
  3. Voor het genereren van eiwittopologie, typ gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh. Er wordt een lijst met krachtvelden gegeven, en type 1 voor CHARMM all-atom krachtveld44, gevolgd door type 1 voor TIP3P voor het watermodel.
    OPMERKING: De bijgewerkte versie, CHARMM36, is ook beschikbaar en kan worden gedownload van http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml45.
  4. Definieer een kubieke doos om de hele eiwitstructuur te bedekken. Typ gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt kubisch. OPMERKING: Het eiwit wordt ten minste 1 nm van de rand van de doos geplaatst. Zorg ervoor dat de grootte van de waterbak groot genoeg is voor eiwitten, oplosmiddelen en ionen. Bovendien moet de waterbox geschikt zijn om interacties tussen periodieke beelden van het eiwit te voorkomen. De aanbevolen minimale afstand tussen het eiwit en de rand van de doos is minimaal 1,0-1,5 nm.
  5. Typ voor oplosmiddelconfiguratie46 gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
  6. Voeg ionen zoals natrium en/of chloride toe door gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro te typen.
    OPMERKING: Natrium- en/of chloride-ionen worden/worden gebruikt voor het neutraliseren van het systeem.
  7. Neutraliseer het systeem door gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral te typen. Selecteer 13 voor de SOL-groep.
    OPMERKING: Voor lysozym zijn 8 opgeloste moleculen vervangen door chloride-ionen (Figuur 3).
  8. Zoek in het CHARMM 36-bestand naar de map ions.itp . De afkorting voor chloride-ion is CLA.
  9. Open topol.top bestand, voeg CLA en nummer 8 toe zoals weergegeven in Figuur 4.
  10. Open solv_ions.gro bestand en wissel alle CL om in CLA.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de bestanden solv_ions.gro en topol.top dezelfde afkorting van de respectievelijke ionen hebben, anders komt er een waarschuwing. Het hernoemen van de ionennaam is in overeenstemming met de CHARMM 36 ff-bestandsversie. Aangezien de afkorting voor chloride al CL is, is het niet nodig om de ionen in de oudere versie te hernoemen. Controleer echter altijd op de ionenafkorting.
  11. Ontspan de eiwitstructuur door de steilste afdaling energieminimalisatie met het maximale aantal van 50.000 stappen. Typ hiervoor gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr gevolgd door gmx mdrun -v -deffnm em.
    OPMERKING: Het oplosmiddel en de ionen worden in twee fasen rond het eiwit in evenwicht gehouden: (i) aantal deeltjes (N), systeemvolume (V) en temperatuur (T) zijn constant (NVT), en (ii) aantal deeltjes (N), systeemdruk (P) en temperatuur (T) zijn constant (NPT). Temperatuurkoppeling (NVT-fase) is ingesteld op 300 K op basis van een aangepaste Berendsen-thermostaat, terwijl drukkoppeling (NPT-fase) is ingesteld op 1 bar op basis van Parrinello-Rahman. De elektrostatische interacties op lange afstand en het zoeken naar de dichtstbijzijnde buur worden automatisch berekend met behulp van respectievelijk de deeltjes-mesh Ewald (PME)-methode en het Verlet-algoritme.
  12. Voor het evenwicht van NVT, typ gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr gevolgd door gmx mdrun -v -deffnm nvt.
    OPMERKING: De tijd die nodig is voor het temperatuurevenwicht is ongeveer 5 minuten, afhankelijk van de CPU en GPU. Voor het evenwicht van het systeem is de simulatietijd 100 ps.
  13. Voor het evenwicht van NPT, typ gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr gevolgd door gmx mdrun -v -deffnm npt.
    OPMERKING: De tijd die nodig is voor het evenwicht van de druk is ongeveer 5 minuten, afhankelijk van de CPU en GPU. Voor het evenwicht van het systeem is de simulatietijd 100 ps.
  14. Laat het systeem gedurende 1 ns equilibratieruns doorlopen, gevolgd door de productierun met behulp van de mdrun-functie met een duur van 100 ns. Open het md.mdp-bestand . Verander bij n stappen in 50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. Voor de productie van moleculaire dynamica, typ gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr gevolgd door gmx mdrun -v -deffnm md.
    LET OP: De tijd hiervoor is ongeveer ~2 dagen. De trajectframes die uit de MD-simulatie worden gegenereerd, worden vastgelegd met intervallen van 10 ps en gebruikt voor clusteranalyse op basis van rootmean square deviation (RMSD).

4. Clusteranalyse op basis van RMSD

  1. Ga na de MD-simulatie verder met de commando-analyse. Eiwit zal door de eenheidscel diffunderen en kan "gebroken" lijken of "springen" naar de andere kant van de doos. Typ gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -your compact. Type 1 voor het centreren van het eiwit en 0 voor de output van het systeem. Typ vmd em.gro om het eiwit te visualiseren.
  2. Typ voor de analyse van de totale energie gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg en ga verder met type 14 voor totale energie.
    OPMERKING: Het bewaken van de totale energie is van fundamenteel belang voor het waarborgen van de betrouwbaarheid en correctheid van MD-simulaties47,48.
  3. Typ voor RMSD-analyse gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns. Ga verder met type 3 voor de C-alfa van de kleinste kwadratenfit en 3 voor de C-alfa van de RMSD-berekening (Figuur 5).
  4. Typ voor RMSF-analyse gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res. Ga door met type 1 voor eiwit.
  5. Typ deze opdracht xmgrace totalenergy.xvg om grace te gebruiken. Pas de assen aan door te dubbelklikken op de lijn van het grafiekvak. Er verschijnt een vak Grace: Axes . Klik op Accepteren.
  6. Klik in het tabbladmenu op Bestand en Print_setup. Er verschijnt een genade: het instellen van het apparaat . Verander het apparaat van PostScript naar JPEG. Klik op Accepteren. Klik nu op Afdrukken in het bestandsmenu. Opslaan als totalenergy.jpg.
  7. Herhaal stap 4.5 en 4.6 voor xmgrace rmsd.xvg en xmgrace rmsfxvg.
  8. Typ voor clusteranalyse gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0. Ga verder met type 1 (eiwitgroep) om de kleinste kwadratenpasvorm te berekenen en RMSD en type 1 (eiwitgroep) voor systeemuitvoer.
    NOTITIE: Pas de afkapwaarde aan op basis van het clusterresultaat. Command -cl vertegenwoordigt de output van het gemiddelde voor elk cluster.
  9. Open cluster-size.xvg.
    1. Verhoog op basis van de verstrekte informatie de RMSD-afkapwaarde als het aantal clusters laag is of verlaag de RMSD-afkapwaarde als het aantal clusters hoog is.
  10. Herhaal stap 4.8 met verschillende afkapwaarden.
    OPMERKING: Clustering met verschillende afkapwaarden totdat een optimale RMSD-afkapwaarde is bepaald op basis van de volgende criteria: (1) Het totale aantal clusters moet worden beperkt tot minder dan 30. (2) Het minimaliseren van de aanwezigheid van clusters met slechts één lid heeft de voorkeur. (3) Het is wenselijk dat meer dan 90% van het traject vertegenwoordigd is in minder dan 10 clusters.
  11. Open de Chimera-software en zoek naar cluster.pdb.
    OPMERKING: cluster.pdb bevat een gemiddelde voor elke clustergroep.
  12. Klik op Cadeaus en Publicatie 1 (silhouet, afgerond lint).
  13. Ga vervolgens naar Bestand > Afbeelding opslaan > Opslaan.
  14. Klik op Select > Chain > (geen ID) > cluster.pdb . Klik op Selecteren > Omkeren (alle modellen). Klik op Acties > Atomen/bindingen > verwijderen.
    OPMERKING: Hiermee worden alle groepsclusters verwijderd, behalve cluster 1.
  15. Ga vervolgens naar Bestand > PDB opslaan > opslaan. Opslaan als cluster1.pdb.
  16. Herhaal stap 4.11-4.15 voor verschillende clusters. Sla op als cluster2.pdb, cluster3.pdb en cluster4.pdb.
    OPMERKING: Aangezien het totale aantal van de top 4 clusters meer dan 90% van de totale trajecten is, wordt elke vertegenwoordiger van de top 4 clusters geëxtraheerd en onderworpen aan moleculaire dockinganalyse met behulp van chimera (zie figuur 6).

5. Docking op basis van ensembles

  1. Dubbelklik op Autodock Tools-software .
    OPMERKING: Voor het docken is in dit onderzoek gebruik gemaakt van AutoDock en AutoDock tools software 13,49,50,51.
  2. Plaats de bestanden cluster1.pdb en ligand.pdb in een nieuwe map.
  3. Klik in het menu op Bestand > Voorkeuren > Instellen. Er verschijnt een vak Gebruikersvoorkeuren instellen . Kopieer het adres van de "nieuwe map" als tekst. Plak het adres in de opstartmap in het vak Gebruikersvoorkeuren instellen . Klik op Instellen.
    OPMERKING: Dit is een belangrijke stap bij het gebruik van Windows OS.
  4. Klik op de blauwe mapafbeelding. Er verschijnt een map met gelezen moleculen . Selecteer cluster1.pdb.
    OPMERKING: Autodock-tools lezen de moleculaire structuur van het eiwit.
  5. Klik op > toeslagen bewerken > Kollman-toeslagen toevoegen. Klik vervolgens op OK. Klik op > waterstofatomen bewerken > niet-polair samenvoegen.
    OPMERKING: Kollman-ladingen worden aan het eiwit toegevoegd.
  6. Klik op Raster > macromoleculen > kiezen. Er verschijnt een vak Macromoleculen kiezen . Selecteer cluster1 en klik op Moleculen selecteren. Klik op OK. Er verschijnt een gewijzigd AutoDock4 Macromolecule-bestand . Opslaan als cluster1.pdbqt.
  7. Maak de werkruimte leeg door te klikken op Bewerken > Verwijderen > Alle moleculen verwijderen. Klik op Doorgaan.
  8. Klik op Ligand > voer > Open in.  Er verschijnt een Ligand-bestand voor de map Autodock4. Kies Alle bestanden, selecteer ligand.pdb en klik op Openen. Klik op OK.
    OPMERKING: De installatieligand omvat de opname van Gasteiger-ladingen en het samenvoegen van niet-polaire waterstof.
  9. Klik op Ligand > Torsieboom > Root detecteren.
  10. Klik op Ligand > Uitvoer > op Opslaan als PDBQT. Er verschijnt een map Geformatteerde Autotors Molecules . Opslaan als ligand.pdbqt.
  11. Maak de werkruimte leeg door te klikken op Bewerken > Verwijderen > Alle moleculen verwijderen. Klik op Doorgaan.
    OPMERKING: Volg dezelfde procedure als beschreven in stap 5.6.
  12. Klik op Raster > macromoleculen > openen. Selecteer cluster1.pdbqt en klik op Openen. Klik op Ja. Klik op OK.
  13. Klik op Raster > Kaarttypen instellen > Ligand openen. Selecteer ligand.pdbqt en klik op Openen.
    OPMERKING: In de werkruimte zijn er eiwitten en liganden.
  14. Klik op Raster en Rastervak. Er verschijnt een vak Rasteropties . Bij Aantal punten in x-dimensie, past u de parameter aan op 120 en stelt u Aantal punten in y-dimensie in op 120, stelt u Aantal punten in z-dimensie in op 120. Stel de afstand (angstrom) in op 0,375. Laat de parameters van het middelste rastervak als standaard staan. Klik op Bestand en sluit Stroom opslaan.
    OPMERKING: De roosterdoos bedekt het hele eiwit, wat betekent dat het een blinde docking is.
  15. Klik op Raster > Uitvoer > GPF opslaan. Er verschijnt een uitvoerbestand voor rasterparameters . Typ grid.gpf in de bestandsnaam en klik op Opslaan.
  16. Klik op Uitvoeren en AutoGrid uitvoeren. Er verschijnt een vak AutoGrid uitvoeren . Klik op het tabblad Parameter Bestandsnaam op Bladeren. Er verschijnt een Autogrid Parameter-bestand . Selecteer grid.gpf. Klik op Openen. Ga naar de programmapadnaam > blader. Er verschijnt een autogrid4-bestand . Zoek naar autogrid4.exe en klik op Openen > starten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de mapnaam geen spaties bevat, omdat dit kan leiden tot een fout tijdens het uitvoeren. De map autogrid4.exe kan vanuit https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/ worden geïnstalleerd.
  17. Klik op Vastzetten > macromoleculen > Starre bestandsnamen instellen. Er verschijnt een PDBQT Macromolecules-bestand . Selecteer cluster1.pdbqt en klik op Openen.
  18. Klik op Docking > ligand > kiezen. Er verschijnt een vak Liganden kiezen. Selecteer de ligand en klik op Ligand selecteren. Er verschijnt een vak AutoDpf4 Ligand Parameter. Klik op Accepteren.
  19. Klik op Docking > zoekparameter > genetisch algoritme. Er verschijnt een vak Genetische algoritmeparameters. Wijzig het aantal GA-uitvoeringen in 100. Laat de overige parameters als standaard staan. Klik op Accepteren.
  20. Klik op Docking > Output > Lamarckian GA(4.2). Er verschijnt een Autodock4.2 GALS Docking Parameter Output-bestand. Typ docking.dpf voor de bestandsnaam en klik op Opslaan.
  21. Klik op Uitvoeren > AutoDock uitvoeren. Er verschijnt een vak Autodock uitvoeren . Klik bij Parameter Bestandsnaam op Bladeren. Er wordt een autodock4 Parameter-bestand weergegeven. Selecteer docking.dpf. Klik op Openen. Klik bij Programmapadnaam op Bladeren. Er verschijnt een autodock4-bestand . Zoek naar autodock4.exe en klik op Openen. Klik op Starten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de mapnaam geen spaties bevat, omdat dit kan leiden tot een fout tijdens het uitvoeren. De benodigde tijd is ~30 min. De map autodock4.exe kan worden geïnstalleerd via de link: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. Verwijder alle moleculen zoals beschreven in stap 5.7.
  23. Herhaal de stappen van 5.1-5.22 voor cluster2.pdb, cluster3.pdb en cluster4.pdb.
    OPMERKING: Alle 4 de dockinggroepen worden gebruikt voor analyse.

6. Analyse van het aanmeren op basis van ensembles

  1. Gebruik de AutoDock Tools-software om de analyse voort te zetten. Klik op Analyseren > dockingstation > openen. Er verschijnt een logbestand voor het dockingstation. Selecteer docking.dlg en klik op Openen. Klik vervolgens op OK.
  2. Klik op Analyseren > macromoleculen > openen.
  3. Klik op Analyseer > conformaties > Play, gerangschikt op energie. Er verschijnt een ligandvak .
  4. Open de map docking.dlg in de nieuwe map met behulp van een kladblok. Zoeken naar clusteranalyse van conformatie. Zoek aan de hand van de gegeven informatie de exterieurloop (vermeld als Run), die de laagste bindingsenergie heeft.
    OPMERKING: Aangezien er 100 conformaties worden uitgevoerd, heeft er slechts één de sterkste bindingsaffiniteit tussen ligand en eiwit. De term voor de laagste bindingsenergie wordt gedefinieerd als het hebben van een sterkere bindingsaffiniteit 52,53,54.
  5. Voer vanaf stap 6.3 (ligandvak ) de conformatierun in (vanaf stap 6.4) en druk op Enter.
    OPMERKING: De ligand zal zich dienovereenkomstig in het eiwit positioneren.
  6. Klik in het ligandvak op de knop open paneel om de afspeeloptie te wijzigen. Er verschijnt een vak Optie instellenvoor afspelen. Klik op Complex schrijven. Er verschijnt een schrijfcomplex van een receptormap . Opslaan als complex.pdb.
    OPMERKING: Aangezien er 4 clustergroepen zijn, kan het bestand complex.pdb dienovereenkomstig worden genoemd, zoals complex1.pdb voor clustergroep 1.
  7. Open de Chimera-software en zoek naar complex.pdb (zoals in stap 6.6).
  8. Klik op Voorinstellingen > Interactief 1 (linten) > Publicatie 1 (silhouet, afgerond lint).
  9. Ga vervolgens naar Bestand en klik op Afbeelding opslaan.
    OPMERKING: De opgeslagen afbeelding is de lintstructuur van het FB-LYZ-complex.
  10. Klik op Voorinstellingen > Interactief 3 (hydrofobiciteitsoppervlak) > Publicatie 1 (silhouet, afgerond lint).
    OPMERKING: De opgeslagen afbeelding is de ballonstructuur van het FB-LYZ-complex.
  11. Open de software van Discovery Studio.
  12. Sleep de complex.pdb naar de lege ruimte van de software.
  13. Klik op het tabblad Extra en selecteer 2D-diagram weergeven.
    OPMERKING: De software genereert automatisch de 2D-structuur van het complex (Afbeelding 7).
  14. Klik op Bestand en Opslaan als. Schrijf de bestandsnaam en klik op Opslaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De chemische structuur en de 3D-structurele weergave van FB na optimalisatie worden weergegeven in figuur 8A. Figuur 8B toont de 3D-structuur van lysozym met pdb-code 1LYZ in de begintoestand voorafgaand aan de MD-simulatie. Om de dynamiek en flexibiliteit van de 3D-structuur van lysozym te bestuderen, werd een MD-simulatie voor 100 ns uitgevoerd. De totale energie van de eiwitstructuur was stabi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ensemble-gebaseerde toepassing bij het ontdekken van computationele geneesmiddelen omvat het gebruik van talrijke conformationele ensembles die zijn afgeleid van kristalstructuren, nucleaire magnetische resonantie (NMR) studies of moleculaire dynamica-simulaties26. Het gebruik van meerdere computationele conformaties zou het mogelijk maken om de analyse de dynamiek en flexibiliteit van een eiwitstructuur op te nemen, wat leidt tot een verbetering van de nauwkeurig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed zouden kunnen zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Universiti Malaya RMF Grant, Project Number RMF1392-2021 van Universiti Malaya.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AutoDockThe Scripps Research Institute, USVersie 4.2.6
AutoDock ToolsThe Scripps Research Institute, USVersie 1.5.6
AvogadroGeoffrey R Hutchison, Department of Chemistry, University of Pittsburgh, Pittsburgh, USAVersie 1.95
Discovery StudioDassault Systèmes, Massachusetts, USVersie 2021
GROMACSUniversity of Groningen
Royal Institute of Technology
Uppsala University, Sweden		Versie 2023
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization, and Informatics
University of California		Versie 1.16

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Niazi, S. K., Mariam, Z. Computer-aided drug design and drug discovery: a prospective analysis. Pharmaceuticals (Basel). 17 (1), 22(2023).
  2. Sadybekov, A. V., Katritch, V. Computational approaches streamlining drug discovery. Nature. 616 (7958), 673-685 (2023).
  3. Sliwoski, G., Kothiwale, S., Meiler, J., Lowe, E. W. Jr Computational methods in drug discovery. Pharmacol Rev. 66 (1), 334-395 (2014).
  4. Adelusi, T. I., et al. Molecular modeling in drug discovery. Informatics Med Unlocked. 29, 100880(2022).
  5. Durrant, J. D., McCammon, J. A. Computer-aided drug-discovery techniques that account for receptor flexibility. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 770-774 (2010).
  6. Korb, O., et al. Potential and limitations of ensemble docking. J Chem Inf Model. 52 (5), 1262-1274 (2012).
  7. Strecker, C., Meyer, B. Plasticity of the binding site of renin: optimized selection of protein structures for ensemble docking. J Chem Inf Model. 58 (5), 1121-1131 (2018).
  8. Pak, M. A., et al. Using AlphaFold to predict the impact of single mutations on protein stability and function. PLoS One. 18 (3), e0282689(2023).
  9. Jumper, J. M., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  10. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  11. Nakane, T., Kimanius, D., Lindahl, E., Scheres, S. H. Characterisation of molecular motions in cryo-EM single-particle data by multi-body refinement in RELION. eLife. 8, e36861(2018).
  12. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  13. Zhao, H., Caflisch, A. Molecular dynamics in drug design. Eur J Med Chem. 91, 4-14 (2015).
  14. Meng, X. Y., Zhang, H. X., Mezei, M., Cui, M. Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery. Curr Comput Aided Drug Des. 7 (2), 146-157 (2011).
  15. Broughton, H. B. A method for including protein flexibility in protein-ligand docking: improving tools for database mining and virtual screening. J Mol Graph Model. 18 (3), 247-257 (2000).
  16. Teague, S. J. Implications of protein flexibility for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2 (7), 527-541 (2003).
  17. Kearsley, S. K., Underwood, D. J., Sheridan, R. P., Miller, M. D. Flexibases: a way to enhance the use of molecular docking methods. J Comput Aided Mol Des. 8 (5), 565-582 (1994).
  18. Carlson, H. A., Masukawa, K. M., McCammon, J. A. Method for including the dynamic fluctuations of a protein in computer-aided drug design. J Phys Chem A. 103 (49), 10213-10219 (1999).
  19. Cavasotto, C. N., Kovacs, J. A., Abagyan, R. A. Representing receptor flexibility in ligand docking through relevant normal modes. J Am Chem Soc. 127 (26), 9632-9640 (2005).
  20. Akbari, Z., et al. HOMO-LUMO analysis and ensemble docking studies of Zn(II) complexes of bidentate and tetradentate Schiff base ligands as antileukemia agents. J Mol Struct. 1301, 137400(2024).
  21. Go, Y. J., Kalathingal, M., Rhee, Y. M. An ensemble docking approach for analyzing and designing aptamer heterodimers targeting VEGF165. Int J Mol Sci. 25 (7), 4066(2024).
  22. Ismail, C. M. K. H., et al. An ensemble docking-based virtual screening and molecular dynamics simulation of phytochemical compounds from Malaysian Kelulut Honey (KH) against SARS-CoV-2 target enzyme, human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE-2). J Biomol Struct. , (2024).
  23. Roy, P., et al. Elucidating the mechanism of metabolism of cannabichromene by human cytochrome P450s. J Nat Prod. 87 (4), 639-651 (2024).
  24. Garai, S., Thomas, J., Dey, P., Das, D. LGBM-ACp: an ensemble model for anticancer peptide prediction and in silico screening with potential drug targets. Mol Divers. 28 (4), 1965-1981 (2024).
  25. Broughton, H. B. A method for including protein flexibility in protein-ligand docking: improving tools for database mining and virtual screening. J Mol Graph Model. 18 (3), 247-257 (2000).
  26. Amaro, R. E., et al. Emerging methods for ensemble-based virtual screening. Curr Top Med Chem. 10 (1), 3-13 (2010).
  27. Amaro, R. E., et al. Ensemble docking in drug discovery. Biophys J. 114 (10), 2271-2278 (2018).
  28. Chlipała, P., et al. Multienzymatic biotransformation of flavokawain B by entomopathogenic filamentous fungi: structural modifications and pharmacological predictions. Microb Cell Fact. 23 (1), 65(2024).
  29. Kuo, Y. -F., et al. Flavokawain B, a novel chalcone from Alpinia pricei Hayata with potent apoptotic activity: involvement of ROS and GADD153 upstream of mitochondria-dependent apoptosis in HCT116 cells. Free Radic Biol Med. 49 (2), 214-226 (2010).
  30. Mohd Sakeh, N., et al. Melanogenic inhibition and toxicity assessment of flavokawain A and B on B16/F10 melanoma cells and zebrafish (Danio rerio). Molecules. 25, (2020).
  31. Feroz, S. R., et al. Interaction of flavokawain B with lysozyme: a photophysical and molecular simulation study. J Luminescence. 160, 101-109 (2015).
  32. Ding, F., et al. Potential toxicity and affinity of triphenylmethane dye malachite green to lysozyme. Ecotoxicol Environ Saf. 78, 41-49 (2012).
  33. Paramaguru, G., Kathiravan, A., Selvaraj, S., Venuvanalingam, P., Renganathan, R. Interaction of anthraquinone dyes with lysozyme: evidences from spectroscopic and docking studies. J Hazard Mater. 175 (1), 985-991 (2010).
  34. Ding, F., Zhao, G., Huang, J., Sun, Y., Zhang, L. Fluorescence spectroscopic investigation of the interaction between chloramphenicol and lysozyme. Eur J Med Chem. 44 (10), 4083-4089 (2009).
  35. Halgren, T. A. Merck molecular force field. II. MMFF94 van der Waals and electrostatic parameters for intermolecular interactions. J Comput Chem. 17 (5-6), 520-552 (1996).
  36. Sulimov, A. V., et al. Evaluation of the novel algorithm of flexible ligand docking with moveable target-protein atoms. Comput Struct Biotechnol J. 15, 275-285 (2017).
  37. Ehrman, J. N., et al. Improving small molecule force fields by identifying and characterizing small molecules with inconsistent parameters. J Comput Aided Mol Des. 35 (3), 271-284 (2021).
  38. Chaudhuri, D., Majumder, S., Giri, K. Repurposing of drugs targeting heparan sulphate binding site of dengue virus envelope protein: an in silico competitive binding study. Mol Divers. 29 (1), 87-101 (2024).
  39. Wu, N., et al. Elucidation of protein-ligand interactions by multiple trajectory analysis methods. Phys Chem Chem Phys. 26 (8), 6903-6915 (2024).
  40. Brooks, B. R., et al. CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. J Comput Chem. 4 (2), 187-217 (1983).
  41. Li, H., Robertson, A. D., Jensen, J. H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins. 61 (4), 704-721 (2005).
  42. Powers, N., Jensen, J. H. Chemically accurate protein structures: validation of protein NMR structures by comparison of measured and predicted pKa values. J Biomol NMR. 35 (1), 39-51 (2006).
  43. Lemkul, J. A. From proteins to perturbed Hamiltonians: a suite of tutorials for the GROMACS-2018 molecular simulation package [Article v1.0]. Living J Comput Mol Sci. 1 (1), 5068(2018).
  44. Best, R. B., et al. Optimization of the additive CHARMM all-atom protein force field targeting improved sampling of the backbone ϕ, ψ and side-chain χ1 and χ2 dihedral angles. J Chem Theory Comput. 8 (9), 3257-3273 (2012).
  45. Huang, J., et al. CHARMM36m: an improved force field for folded and intrinsically disordered proteins. Nat Methods. 14 (1), 71-73 (2017).
  46. Bondi, A. van der Waals volumes and radii. J Phys Chem. 68 (3), 441-451 (1964).
  47. Shukla, R., Tripathi, T. Computer-aided drug design. , Springer Singapore. Singapore. (2020).
  48. Vlachakis, D., Bencurova, E., Papangelopoulos, N., Kossida, S. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. , Elsevier, Academic Press. Swansea. (2014).
  49. Forli, S., Olson, A. J. A force field with discrete displaceable waters and desolvation entropy for hydrated ligand docking. J Med Chem. 55 (2), 623-638 (2012).
  50. Cosconati, S., et al. Virtual screening with AutoDock: theory and practice. Expert Opin Drug Discov. 5 (6), 597-607 (2010).
  51. Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  52. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 3502514(2018).
  53. Ivanova, L., Karelson, M. The impact of software used and the type of target protein on molecular docking accuracy. Molecules. 27 (24), 9041(2022).
  54. Mohapatra, R. K., et al. Comparison of the binding energies of approved mpox drugs and phytochemicals through molecular docking, molecular dynamics simulation, and ADMET studies: an in silico approach. J Biosaf Biosecur. 5 (3), 118-132 (2023).
  55. Mude, L., et al. Molecular insights in repurposing selective COX-2 inhibitor celecoxib against matrix metalloproteinases in potentiating delayed wound healing: a molecular docking and MMPB/SA based analysis of molecular dynamic simulations. J Biomol Struct Dyn. 42 (5), 2437-2448 (2024).
  56. Uttarkar, A., Rao, V., Bhat, D., Niranjan, V. Disaggregation of amyloid-beta fibrils via natural metabolites using long timescale replica exchange molecular dynamics simulation studies. J Mol Model. 30 (3), 61(2024).
  57. Liang, J. J., Pitsillou, E., Hung, A., Karagiannis, T. C. A repository of COVID-19 related molecular dynamics simulations and utilisation in the context of nsp10-nsp16 antivirals. J Mol Graph Model. 126, 108666(2024).
  58. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  59. Polikar, R. Ensemble based systems in decision making. IEEE Circ Syst Mag. 6 (3), 21-45 (2006).
  60. Ballester, P. J., Mitchell, J. B. A machine learning approach to predicting protein-ligand binding affinity with applications to molecular docking. Bioinformatics. 26 (9), 1169-1175 (2010).
  61. Yang, X., Huang, K., Yang, D., Zhao, W., Zhou, X. Biomedical big data technologies, applications, and challenges for precision medicine: a review. Global Chall. 8 (1), 2300163(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ensemble Based DockingProtein Structure FlexibilityMolecular Dynamics SimulationStructure Based Drug DiscoveryProtein Conformation ClusteringLigand DockingRoot Mean Square DeviationFlavokawain B BindingElectrostatic Surface MappingComputational Drug Discovery

Gerelateerde artikelen