Screening van covalente fragmenten met behulp van de kwantitatieve onomkeerbare tethering-assay

Summary

De kwantitatieve irreversibele tethering (qIT)-test is een op fluorescentie gebaseerde methode voor het identificeren van covalente fragmenten die selectief een doeleiwit aangaan. Hier wordt een gedetailleerd protocol geschetst om de qIT-test te beschrijven, inclusief voorbeeldresultaten.

Abstract

Verbindingen die covalente bindingen vormen met specifieke doeleiwitten bieden een verscheidenheid aan voordelen als chemische sondes en therapeutische middelen. Meestal worden licht reactieve, elektrofiele kleine moleculen gebruikt om covalente bindingen te vormen met geselecteerde cysteïnezijketens in specifieke eiwitten. Elektrofiele benaderingen van ligandontdekking, waarbij een bibliotheek van elektrofiele kleine moleculen wordt gescreend tegen een eiwitdoelwit, zijn populair geworden omdat ze de noodzaak van tijdrovende stroomafwaartse installatie van een elektrofiele kernkop vermijden. Een dergelijke screening is echter gecompliceerd, omdat elektrofiele liganden een breed scala aan verschillende snelheden van spontane reactie met cysteïnen kunnen vertonen. Kwantitatief-irreversibele tethering (qIT) biedt een op fluorescentie gebaseerde methode voor hitidentificatie en -ontwikkeling die gegevens normaliseert voor deze verschillen in reactiviteit van intrinsieke verbindingen. De reactiesnelheid van individuele verbindingen met een doeleiwit wordt bepaald en vergeleken met de reactiviteit van de verbinding met het ongestructureerde tripeptide glutathion (dit is een proxy voor spontane samengestelde reactie), waardoor verbindingen kunnen worden geïdentificeerd die bij voorkeur reageren met het eiwit van belang. Deze methodologie is met succes toegepast om selectieve covalente fragmenten te identificeren tegen verschillende geneesmiddeldoelen, waaronder SARS-CoV-2 hoofdprotease, cycline-afhankelijke kinase 2 en RAP27A. Hier demonstreren we de toepassing van qIT op een doeleiwit om een kwantitatieve en robuuste dataset te genereren, waardoor prioriteit kan worden gegeven aan hitliganden voor toekomstige ontwikkeling.

Introduction

Cysteïne-reactieve gerichte covalente liganden (moleculen die een biologisch effect uitoefenen door te reageren met een geselecteerd cysteïneresidu op een specifiek eiwit) zijn de afgelopen decennia steeds populairder geworden als chemische hulpmiddelen en therapieën¹. Deze bestaan meestal uit een licht reactieve elektrofiel (zoals een acrylamide, chlooracetamide of vinylsulfon) toegevoegd aan een ligandgroep met een hoge affiniteit voor een eiwitdoelwit². Idealiter verloopt de ligand-eiwitinteractie via een tweestapsmechanisme met initiële niet-covalente ligandbinding, gevolgd door onomkeerbare covalente bindingsvorming tussen het doelcysteïne en elektrofiel³.

Verschillende vroege gerichte covalente liganden, waaronder Bruton's tyrosinekinaseremmer Ibrutinib, werden ontwikkeld door een eerder geïdentificeerde omkeerbare ligand te voorzien van een elektrofiel handvat⁴. Deze aanpak is echter niet altijd succesvol, en bij andere pogingen is gebleken dat de installatie van elektrofielen aanzienlijk moet worden geoptimaliseerd⁵. In plaats daarvan zijn elektrofiele benaderingen, met name met behulp van elektrofiele fragmenten, de laatste jaren populairder geworden. Deze omvatten meestal het incuberen van een bibliotheek van elektrofielen met een eiwit en vervolgens het selecteren van verbindingen met een verhoogde reactiesnelheid op een cysteïne, waarvan wordt aangenomen dat deze wordt geïnduceerd door productieve niet-covalente interacties tussen het ligand en bindingszak⁶. Deze methoden werden met name met succes toegepast tijdens de ontwikkeling van de KRAS (G12C)-remmer Sotorasib¹.

Elektrofiele screening brengt verschillende unieke uitdagingen met zich mee in vergelijking met traditionele niet-covalente ligandscreening, voornamelijk vanwege de hoge variabiliteit in reactiviteit binnen en tussen kernkopklassen⁷. De meeste cysteïne-reactieve elektrofielen zullen na verloop van tijd reageren met alle aan oplosmiddel blootgestelde cysteïneresiduen, ongeacht enige selectieve interactie voor het doeleiwit. De ligandbezetting zal daarom in de loop van de tijd toenemen voor bijna alle elektrofielen, en zonder controle op reactiviteit zal de trefferselectie vaak vertekend zijn in de richting van meer reactieve fragmenten die een doelwit sneller aanvallen⁸.

Bovendien maken elektrofiele screeningsmethoden vaak gebruik van massaspectrometrie om de vorming van eiwit-ligandadduct te detecteren, die beperkt is in doorvoer⁹. Regelmatige reactiebemonstering is vereist over een langere periode (uren tot dagen) om de reactiekinetiek correct te karakteriseren voor een bibliotheek van verbindingen met gevarieerde elektrofiliciteit¹⁰. Voor een screening van 300 fragmenten die op 10 tijdstippen zijn bemonsterd, moeten daarom 3000 massaspectra worden uitgevoerd, wat de doorvoer van de meeste eiwitmassaspectrometriesystemen overschrijdt. Methoden met een hogere doorvoer voor het monitoren van de vorming van eiwit-ligandadduct zijn daarom wenselijk.

De hier beschreven benadering, de quantitate irreversible tethering (qIT) assay, is een elektrofiele screeningsmethode die de intrinsieke reactiviteit regelt en gebruik maakt van een eenvoudige fluorescentie-uitlezing⁷. Eiwit of glutathion (een ongestructureerd, thiolbevattend tripeptide dat wordt gebruikt als controle voor intrinsieke reactiviteit) wordt geïncubeerd met een bibliotheek van elektrofiele fragmenten en regelmatige monsters die worden genomen om te blussen tot een oplossing van CPM (7-diethylamino-3-(4'-maleimidylfenyl)-4-methylcumarine, een fluorogeen thiol-kwantificeringsmiddel). Adductvorming tussen het cysteïne en het elektrofiele fragment vermindert de hoeveelheid thiol die beschikbaar is voor reactie met CPM, waardoor de resulterende fluorescentie bij afschrikken wordt verminderd. CPM-fluorescentie fungeert dus als een proxy voor niet-gereageerd thiol, waardoor de kinetiek van de thiolreactie met elk elektrofiel fragment kan worden bepaald. Elektrofiele fragmenten met een significant verbeterde eiwitreactiviteit ten opzichte van glutathion worden geselecteerd als treffers en geprioriteerd voor verdere ontwikkeling (Figuur 1).

Figuur 1: Schema van qIT. Een schematisch overzicht van de qIT-test. (gemaakt met BioRender). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hitselectie met behulp van REF-waarden controleert op intrinsieke reactiviteit en zorgt ervoor dat fragmenten alleen als hits worden geselecteerd als ze productieve niet-covalente interacties vormen met een eiwitdoelwit. De eenvoudige fluorescentie-uitlezing betekent ook dat de qIT-test zeer schaalbaar is en geen op massaspectrometrie gebaseerde methoden voor reactiemonitoring vereist.

Hier wordt een uitgebreide procedure voor de qIT-assay geschetst, met voorbeeldresultaten om de testprestaties en de trefferselectie te illustreren.

Protocol

1. Constructie van de fragmentbibliotheek

1. Ontwerp een bibliotheek met elektrofiele fragmenten en synthetiseer of koop ze. Elektrofiele fragmentbibliotheken bestaan doorgaans uit licht reactieve elektrofielen (zoals acrylamiden, chlooracetamiden en vinylsulfonamiden) die zijn toegevoegd aan een breed scala aan chemische steigers. Elektrofiele fragmentbibliotheken zijn op grote schaal verkrijgbaar bij commerciële leveranciers, en meer details over hun ontwerp en constructie worden elders besproken ^5,11.
2. Los elke verbinding op in DMSO tot een concentratie van 50 mM en doseer vervolgens een andere verbinding in elk putje van de kolommen 3 tot en met 22 van een reservoirplaat met 384 putjes, de Fragment Library Plate genoemd.
   1. Doseer DMSO in elk putje van de kolommen 1, 2, 23 en 24 voor de positieve en negatieve controles. De lay-out van de plaat kan worden gevarieerd afhankelijk van het aantal verbindingen dat wordt gezeefd (Figuur 2). Het volume dat aan de bibliotheekplaat wordt toegevoegd, is afhankelijk van het aantal schermen dat moet worden uitgevoerd, aangezien er ongeveer 1,8 μL uit elke put nodig is per qIT-scherm. Bereid deze Fragment Library Plate op voorhand voor en bewaar hem bij 4 °C.

Figuur 2: Lay-out van de plaat. Een overzicht van de lay-out van de qIT-test met 384 putjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Opstelling van de test (figuur 3)

1. Bereid de volgende oplossingen: recombinante eiwitoplossing (doeleiwit in elke buffer), qIT-assaybuffer (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), qIT-assay quenchbuffer (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7,5)) en samengestelde voorraadoplossingen (elektrofiel fragment (50 mM) in DMSO).
   OPMERKING: Een pH van 8 wordt gebruikt in de reactiebuffer om de reactie tussen het doelcysteïneresidu en de fragmenten te versnellen, waardoor de reactiesnelheid kan worden gemeten, zelfs voor extreem licht reactieve fragmenten. Een iets lagere pH van 7,5 wordt gebruikt in de quenchbuffer, omdat de thioetherbinding die wordt gevormd tussen de maleimide van CPM en de cysteïnethiol vatbaar is voor hydrolyse bij meer basische pH's (uit eerder werk bleek bijvoorbeeld dat cysteïne-maleimideconjugaten veel stabieler zijn bij pH 7,3 dan pH 8¹²).
2. Haal de DMSO-fragmenten uit de opslag en laat ze minimaal 2 uur op kamertemperatuur staan om de samengestelde voorraden te laten ontdooien.
3. Ontgas qIT-analysebuffer door ongeveer 30 minuten te borrelen met argongas.
4. Vervang de doeleiwitoplossing grondig in de ontgaste qIT-assaybuffer. Cruciaal is dat reductiemiddelen zoals DTT en TCEP grondig moeten worden verwijderd tot concentraties < 100 nM, omdat ze de kwantificering van thiol verstoren. Deze stap kan worden uitgevoerd via een repetitieve reeks bufferuitwisselingen, zoals hieronder beschreven.
   1. Verdun de eiwitoplossing boven de ontgaste qIT-analysebuffer in een centrifugefilter, concentreer met centrifugeren (4000 x g, 4 °C, 15 min) en herhaal. Doorgaans zijn 4 rondes van 1 op de 15 verdunningen nodig om DTT (1 mM) voldoende te verwijderen uit 1 ml recombinante eiwitvoorraadoplossing, hoewel deze stap kan worden aangepast afhankelijk van de concentratie reductiemiddel in de oorspronkelijke recombinante eiwitoplossing.
      OPMERKING: Als alternatief kan hetzelfde resultaat worden bereikt door de doeleiwitoplossing te dialyseren tegen een grote overmaat aan ontgaste qIT-assaybuffer.
5. Verdun de doeleiwitoplossing (geproduceerd in stap 2.1) tot een eiwitconcentratie van 15 μM in ontgaste qIT-analysebuffer. Er is ongeveer 9 ml doeleiwitoplossing nodig om een plaat met 384 putjes met voldoende dood volume te vullen.
6. Bereid een suspensie van 1,5% (v/v) van TCEP-agarose in de ontgaste qIT-assaybuffer. Per zeefplaat is ongeveer 9 ml TCEP-agarose suspensie vereist.
7. Doseer 20 μl TCEP-agaroseoplossing in elk putje van twee platen met 384 putjes.
8. Bereid een glutathionvoorraad van 15 μM voor in een ontgaste qIT-analysebuffer. Dit moet onmiddellijk voor het plateren worden bereid, omdat glutathion snel oxideert in oplossing zonder reductiemiddel.
9. Doseer 20 μL qIT-assaybuffer in kolom 1 en 2 van beide platen met 384 putjes.
10. Doseer 20 μl 15 μM eiwit of glutathionoplossing (in overeenstemming met de beoogde plaat) in de kolommen 3-24 van de plaat met 384 putjes. Deze worden de Protein Reaction Plate en de Glutathion Reaction Plate genoemd. Laat 1 uur inkoken bij RT.
11. Doseer 58,2 μL ontgaste qIT-assaybuffer in elk putje van een plaat met 384 putjes en breng vervolgens 1,8 μL over van elk corresponderend putje van de Fragment Library Plate om een samengestelde verdunningsplaat te maken, waarbij elke verbinding wordt verdund tot een concentratie van 1,5 mM in qIT-assaybuffer plus 3% DMSO.
    OPMERKING: Deze stap wordt vergemakkelijkt met een 384-pipetteerstation, waarmee samengestelde voorraden in één bewerking voor elke put kunnen worden overgebracht.
12. Na 1 uur incubatie van eiwit en glutathion met TCEP-agarose, brengt u 20 μL samengestelde oplossing uit elk putje van de samengestelde verdunningsplaat over in zowel de eiwit- als de glutathionreactieplaat om met de test te beginnen. Deze stap wordt ook vergemakkelijkt met een 384-pipetteerstation. De analysestappen zijn samengevat in figuur 3.
    OPMERKING: De fragmentconcentratie kan naar behoefte worden gevarieerd en qIT-assays kunnen desgewenst worden herhaald voor de treffers in lagere concentraties om te bevestigen dat de eiwitaffiniteit geen artefact is van de hoge fragmentconcentratie. De relatief hoge fragmentconcentratie wordt gebruikt om de k_pro en k_GSH te verhogen om ervoor te zorgen dat nauwkeurige snelheden kunnen worden bepaald voor licht reactieve verbindingen (die onder de analyseomstandigheden t_1/2 (GSH) > 24 uur kunnen weergeven). Bovendien, hoewel een fragmentconcentratie van 500 μM hoog is, zijn hoge μM tot lage mM-concentraties gebruikt bij het screenen van fragmenten, bijvoorbeeld¹³.
13. Start een timer - de test is begonnen en de quenches moeten op regelmatige tijdstippen worden uitgevoerd in overeenstemming met het onderstaande gedeelte.

Figuur 3: samenvatting van de qIT-test. Een samenvatting die de belangrijkste stappen van de opstelling van de qIT-testreactieput illustreert. (gemaakt met BioRender). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. CPM dooft af

OPMERKING: CPM-quenches worden uitgevoerd om de hoeveelheid niet-gereageerd thiol te kwantificeren die achterblijft in de eiwit- en glutathionreactieplaten. Deze moeten op discrete tijdstippen worden uitgevoerd (de volgende tijdstippen worden bijvoorbeeld meestal gebruikt: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 en 1440 min) om de reactiekinetiek te kunnen controleren.

1. Bereid CPM-voorraadoplossingen (500 μM) in DMSO, doseer ze in hoeveelheden van 111,2 μl in microcentrifugebuisjes en bewaar ze bij -20 °C. Deze CPM-voorraden kunnen van tevoren worden voorbereid en er is 1 aliquot per quench-tijdstip nodig.
2. Bereid CPM-quenchoplossing (1.4 μM) door een bevroren CPM-voorraadoplossing (500 μM) te ontdooien en toe te voegen aan 40 ml qIT-testquenchbuffer.
3. Doseer 27 μL CPM-blusoplossing in elk putje van twee platen met 384 putjes - twee zijn nodig voor het blussen van zowel de eiwit- als de glutathionreactieplaten. Dit worden CPM-Quench Plates genoemd, bereid ze maximaal 30 minuten voor gebruik voor.
4. Centrifugeer de eiwitreactieplaat op 200 x g gedurende 3 minuten om ervoor te zorgen dat TCEP-agarose wordt gepelleteerd.
5. Breng op vooraf bepaalde tijdstippen een monster van 3 μl uit elk putje van de eiwitreactieplaat over naar een voorgevulde CPM-blusplaat. Deze stap wordt ook vereenvoudigd met behulp van een 384-pipetteerstation.
6. Meng de CPM Quench Plate door 3 x 25 μL op te zuigen en te doseren. Het is belangrijk om het monster van de bovenkant van de put te verwijderen om te voorkomen dat de TCEP-agarose op de bodem wordt opgezogen, wat de CPM-afschrikking zal verstoren.
7. Herhaal stap 3.4-3.6 met de glutathionreactieplaat.
8. Incubeer de CPM Quench Plates (bereid in 3.4-3.6) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
9. Meet de fluorescentie-intensiteit van de CPM-quenchplaat (excitatie bij 384 nm en emissie bij 470 nm).

4. Gegevensanalyse en selectie van treffers

1. Bereken voor elke quench Z' als maat voor de analysekwaliteit. Elke CPM-dooft met Z' < 0,5 moet buiten beschouwing worden gelaten.
   Z' = 1 - ((3σ_{positieve controle} + 3σ_{negatieve controle}) / (μ_{positieve controle} - μ_{negatieve controle}))
   Waarbij σ = standaarddeviatie van de fluorescentie-intensiteit en μ = gemiddelde fluorescentie-intensiteit
2. Bereken de gemiddelde fluorescentiewaarden voor de negatieve en positieve controleputjes (respectievelijk kolom 1 en 2 en kolom 23 en 24).
3. Normaliseer elke reactie goed naar de gemiddelde fluorescentiewaarden van de positieve en negatieve controles:
   % gewijzigd = 100 x (Compound well fluorescentie - negatieve controle fluorescentie) / (positieve controle fluorescentie - negatieve controle fluorescentie)
4. Zet het % gemodificeerde percentage afzonderlijk af tegen de tijd voor elke verbinding die reageert met glutathion en met doeleiwit.
5. Pas genormaliseerde % gemodificeerde versus tijdgegevens aan op een eenfasig exponentieel vervalmodel voor zowel de reactie met eiwit als met glutathion met behulp van de vergelijking:
   % Gewijzigd = ae ^{- kt + c}
   Waarbij a = het bereik van % gewijzigde waarden, k = reactiesnelheid, t = tijd, c = de % gewijzigde waarde op oneindig tijdstip. Het aanpassen van de curve en het bepalen van parameters kunnen worden uitgevoerd met behulp van commerciële software (zoals Graphpad).
6. Gebruik de snelheid waarmee fragmenten reageren met eiwit (k_pro) en glutathion (k_GSH) om de Rate Enhancement Factor (REF)-waarde voor elk fragment te berekenen:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Gebruik de REF-waarden om hitfragmenten te selecteren. Dit kan worden bereikt door een REF-drempel in te stellen (bijv. REF > 3), een willekeurig trefpercentage (bijv. top 2%), of door fragmenten te selecteren met REF 3-standaarddeviaties die groter zijn dan het geometrisch gemiddelde.

Results

De qIT-test wordt hier gebruikt om covalente fragmenttreffers te identificeren voor een naamloos, enkelvoudig cysteïne-eiwit. MgCl₂ (10 mM) werd toegevoegd aan de reactiebuffers omdat bekend is dat het doeleiwit bindt aan Mg²⁺ -ionen. De screening werd in drievoud uitgevoerd en de snelheid waarmee elk fragment reageerde met zowel het doeleiwit (k_pro) als glutathion (k_GSH) bepaald. De Z'-waarden waren groter dan 0,5 voor alle quenchplaten en gemiddeld 0,75 voor eiwitquenches en 0,79 voor glutathionquenches, wat wijst op uitstekende testprestaties. REF-waarden werden vervolgens berekend voor elk fragment en treffers werden geselecteerd waar REF > 3.

De representatieve resultaten (Figuur 4) geven een voorbeeld van trefferselectie met behulp van de qIT-assay. Verbinding 1 reageerde 6,0 keer sneller met het cysteïneresidu op het doeleiwit dan met glutathion en werd, met behulp van een criterium van REF > 3, geselecteerd als een treffer (Figuur 4B). Deze snelheidsversnelling geeft de aanwezigheid van een sjablooneffect aan, waarbij niet-covalente interacties 1 in de juiste richting plaatsen voor de cysteïne op het doeleiwit om te reageren met de chlooracetamidekernkop. Daarentegen is 2 een voorbeeld van een niet-geraakt fragment, aangezien de reactie tussen 2 en het doelcysteïneresidu niet wordt versneld ten opzichte van de reactie tussen 2 en glutathion. Het gebrek aan snelheidsversnelling geeft aan dat er geen productieve niet-covalente interacties zijn, waarbij 2 in de juiste richting wordt geplaatst om te reageren met het doelcysteïneresidu.

Figuur 4: Representatieve resultaten. De resultaten tonen aan dat de eiwit- en glutathionreactie door qIT wordt gemonitord op (A) een hoge intrinsieke reactiviteit, een mogelijk vals-positief trefferfragment en (B) een trefferfragment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De qIT-test biedt een effectief en handig platform voor het screenen van cysteïne-reactieve elektrofiele fragmenten tegen een doelwiteiwit. Er zijn echter kritische overwegingen die de testprestaties kunnen belemmeren als er niet voldoende rekening mee wordt gehouden. Het meest opvallende is dat doeleiwitten slechts één aan het oppervlak blootgesteld cysteïne mogen bevatten om geschikt te zijn voor qIT-screening, aangezien andere cysteïneresiduen zullen reageren met CPM en fluorescentiemetingen zullen verstoren. In eerdere gevallen waarin doeleiwitten meerdere aan het oppervlak blootgestelde cysteïnen bevatten (zoals voor het SARS-CoV-2-hoofdprotease, het kleine GTPase RAP27A en cycline-afhankelijke kinase 2), zijn screeningconstructies waarvan storende residuen zijn verwijderd, eerder met succes gebruikt. De effectiviteit van deze strategie is echter afhankelijk van het eiwit 10,14,15.

Bovendien, aangezien de qIT-test de afname meet van thiol dat beschikbaar is om in de loop van de tijd met CPM te reageren, kan elke factor die het aandeel beschikbare thiolen vermindert, zoals thioloxidatie of eiwitaggregatie, de testprestaties belemmeren. Bufferontgassing en het gebruik van een geïmmobiliseerd reductiemiddel (TCEP-agarose) zorgen ervoor dat de thioloxidatie traag verloopt en dat eventuele resterende oxidatie moet worden beperkt door fluorescentiemetingen te normaliseren naar die van de positieve controleputjes. Er kunnen echter problemen ontstaan wanneer een ongelijkmatige verdeling van TCEP-agarose tussen putten niet-uniforme thioloxidatie veroorzaakt. Consistente TCEP-agarosebeplating is daarom essentieel voor de testprestaties, wat een uitdaging kan zijn omdat TCEP-agarosedeeltjes in pipetteerreservoirs zinken.

Eiwitaggregatie kan ook een probleem zijn, aangezien de testomstandigheden (24 uur incubatie bij kamertemperatuur) relatief zwaar zijn. Strategieën voor probleemoplossing, zoals het samensmelten van doeleiwitten tot het oplossen van tags, het wijzigen van reactiebuffers of het uitvoeren van de test bij lagere temperaturen, kunnen de aggregatie verminderen en kunnen problemen met de eiwitstabiliteit oplossen. Bepaalde fragmenten kunnen ook eiwitaggregatie induceren, wat opnieuw het aandeel thiol dat beschikbaar is om met CPM te reageren vermindert en vals-positieve treffers veroorzaakt. Orthogonale treffervalidatie met behulp van massaspectrometrie met intact eiwit is een effectieve methode om deze gevallen te detecteren, aangezien vals-positieve treffers een kleine of niet-bestaande populatie van gelabelde soorten zullen creëren wanneer ze worden geïncubeerd met een doeleiwit.

Wanneer deze overwegingen worden gecontroleerd, heeft de qIT-test enkele duidelijke voordelen ten opzichte van andere covalente fragmentscreeningsmethoden. Hitselectie met behulp van REF zorgt ervoor dat hits alleen worden geselecteerd als ze productieve niet-covalente interacties met het doeleiwit vormen. Fragmentelektrofiliciteit varieert over grote afstanden, zowel tussen verschillende kernkoppen als binnen kernkopklassen; Eerder werk heeft bijvoorbeeld enkele honderdvoudige variaties gevonden in de snelheid van glutathionreactiviteit tussen acrylamiden¹⁰. Dit brede scala aan elektrofiliciteit kan het een uitdaging maken om fragmenten met hoge k_pro-waarden te onderscheiden vanwege een sjablooneffect van fragmenten die gewoon zeer reactief zijn, wat ertoe kan leiden dat zeer reactieve fragmenten worden geselecteerd als vals-positieve treffers. 2 reageerde bijvoorbeeld sneller met het doelcysteïneresidu dan 1 en kan, zonder rekening te houden met intrinsieke reactiviteit, als een treffer worden geselecteerd. 2 reageert echter niet sneller met het beoogde cysteïneresidu dan met glutathion, wat aangeeft dat de grotere k_pro van 2 ten opzichte van 1 te wijten is aan een grotere intrinsieke reactiviteit van het fragment en niet aan een sjablooneffect.

De eenvoudige fluorescentie-uitlezing die door de qIT-test wordt gebruikt om de resterende thiol te kwantificeren, is ook zeer voordelig. Andere methoden voor het screenen van covalente fragmenten maken gebruik van massaspectrometrie met intacte eiwitten om de snelheid te bepalen waarmee fragmenten reageren met een doeleiwit en LC-MS om de snelheid te bepalen waarmee glutathion reageert met fragmenten - die beide gespecialiseerde apparatuur vereisen en geen doorvoer hebben ^8,16. De handige fluorescentie-uitlezing maakt de qIT-test zeer schaalbaar en vereist alleen algemeen verkrijgbare laboratoriumapparatuur.

Gecombineerd creëren deze innovaties een robuuste en schaalbare methode voor het screenen van covalente fragmenten, waardoor er geen massaspectrometrieapparatuur nodig is.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon Gas	BOC	I1149
Corning 384-well, low-flange, flat-bottom assay plates	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Immobilized TCEP-agarose	Pierce	77712
Micro plate reader	CLARIOstar
PCR Plate Seals	BioRad	MSA5001
Reduced L-glutathione	Sigma-Aldrich	G4251
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7