Methodenartikel

Polarisatie en karakterisering van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide macrofagen op implantaatoppervlakken

DOI:

10.3791/67180

⸱

6 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Materials Science & Technology, Institute for Biomedical Engineering, University Hospital Tübingen, 2Department of Conservative Dentistry and Periodontology, University Hospital Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van het immunomodulerende potentieel van implantaatoppervlakken in vitro, met als doel de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de huidige protocollen te verbeteren en verder onderzoek te bevorderen. Secretoire cytokineprofielen, mRNA-expressie en markers op het celoppervlak werden gecontroleerd met behulp van van bloedmonocyten afgeleide macrofagen om macrofaagpolarisatie te onderzoeken die op titanium werd gekweekt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foreign body reaction (FBR), een immuungemedieerd complex genezingsproces, speelt een cruciale rol bij de integratie van implantaten in het lichaam. Macrofagen, als de eerste lijn van interactie van het immuunsysteem met implantaatoppervlakken, spelen een bidirectionele rol bij het moduleren van de balans tussen ontsteking en regeneratie. Voor een diepgaand begrip en de evaluatie van de reacties tussen implantaatmaterialen en immuunresponsen zijn betrouwbare in vitro methoden en protocollen cruciaal. Van de verschillende in vitro modellen vormen primaire monocyt-afgeleide macrofagen (MDM's) een uitstekend model voor het onderzoeken van macrofaag-implantaatinteracties. We hebben een experimenteel protocol geïmplementeerd om de polarisatie van MDM's in M1 (klassiek geactiveerde) en M2 (alternatief geactiveerde) macrofagen op implantaatoppervlakken te evalueren. We isoleerden bloedmonocyten van gezonde donoren en differentieerden ze in macrofagen met behulp van macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF). Gedifferentieerde macrofagen werden gekweekt op implantaatoppervlakken en gepolariseerd in M1- en M2-subtypes. M1-polarisatie werd bereikt in aanwezigheid van interferon (IFN)-γ en lipopolysaccharide (LPS), terwijl M2-polarisatie werd uitgevoerd in een medium dat interleukine (IL)-4 en IL-13 bevatte. We evalueerden macrofaagfenotypes door middel van Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), confocale laserscanningmicroscopie (CLSM) en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) op basis van panels van uitgescheiden cytokines, celoppervlakmarkers en tot expressie gebrachte genen. Het geëxtraheerde RNA werd omgezet in complementair DNA (cDNA) en qRT-PCR werd gebruikt om mRNA gerelateerd aan M1- en M2-macrofagen te kwantificeren. Dienovereenkomstig zijn M1-macrofagen gekenmerkt door een hogere expressie van pro-inflammatoir tumornecrosefactor (TNF-α)-cytokine en CCR7-oppervlaktemarker in vergelijking met M2-macrofagen, die hogere niveaus van CD209 en CCL13 vertoonden. Bijgevolg werden CCR7 en CD209 geïdentificeerd als specifieke en betrouwbare markers van M1- en M2-macrofaagsubtypes door immunokleuring en visualisatie door CLSM. Verdere bevestiging werd bereikt door ELISA die een verhoogd TNF-ɑ-niveau in M1 en een verhoogd CCL13 in M2-cellen detecteerde. De voorgestelde markers en experimentele opstelling kunnen effectief worden gebruikt om het immunomodulerende potentieel van implantaten te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implanteerbare biomaterialen zijn een conventionele oplossing geworden voor verschillende ziekten bij de mens en spelen een grote rol in biomedisch onderzoek, waaronder weefselmanipulatie, medicijnafgiftesystemen en implantaten 1,2. Er is een breed scala aan implantaten gemaakt van verschillende materialen met verschillende structuren en functionaliteiten, zoals heupprothesen, stents, meshes, hartkleppen of tandheelkundige implantaten. Bij implantatie veroorzaakt het contact tussen weefsel en implantaat een immuunrespons, gevolgd door resolutie, weefselremodellering en homeostase. Deze processen worden beïnvloed door de fysische, chemische en bioactieve eigenschappen van de gebruikte biomaterialen. Deze kenmerken kunnen van invloed zijn op de intensiteit en het spectrum van pro- en ontstekingsremmende reacties, fibrotische capsulevorming, weefselafbraak en genezingsfase 3,4. Om het genezingsproces en de integratie van implantaten op lange termijn te ondersteunen en te optimaliseren, is een opkomend aspect van het huidige onderzoek het onderzoeken en bemiddelen van de interactie tussen implantaatoppervlakken en immuuncellen.

Onder andere immuuncellen zijn macrofagen, die door het hele lichaam worden aangetroffen, belangrijke spelers bij ontstekingen en antipathogene afweer, evenals bij genezingsprocessen en het behoud van weefselhomeostase 5,6. Op basis van hun plasticiteit en de lokale micro-omgevingsstimuli van het weefsel, kunnen macrofagen polariseren in verschillende functionele fenotypes, die grote verschillen vertonen in celmetabolisme, cellulaire functies en cytokinesecretieprofielen. Klassiek geactiveerd M1-fenotype kan worden onderscheiden door secretie van pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1β, IL-6 en TNF-α, en is betrokken bij de initiële en chronische ontstekingsreactie op trauma en vreemde biomaterialen. Daarentegen hebben geactiveerde M2-macrofagen, die worden geactiveerd door cytokines zoals IL-4 en IL-13, karakteristieke kenmerken zoals het oplossen van ontstekingen en het bevorderen van weefselgenezing. M2-gepolariseerde macrofagen kunnen worden geïdentificeerd door de expressie van celoppervlakmarkers zoals CD206 en de productie van cytokines zoals IL-10 en IL-47. Op dezelfde manier kunnen macrofagen die al gepolariseerd zijn, zichzelf herprogrammeren in een nieuwe micro-omgeving.

Veel studies naar interacties tussen cellen en biomaterialen hebben het belang van macrofagen aangetoond in de cascade van immunologische reacties op implanteerbare biomaterialen en bij het orkestreren van processen die betrokken zijn bij de genezing van implantaatgerelateerde complicaties 8,9,10. Hoewel biomedische technologie de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang heeft geboekt, is verder onderzoek nodig om te begrijpen hoe implantaten het gedrag en de polarisatie van macrofagen moduleren 11,12,13.

In celcultuur kunnen van monocyten afgeleide perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden gedifferentieerd in aanhangende M0-macrofagen, gevolgd door geïnduceerde polarisatie naar M1- of M2-fenotypes met behulp van respectievelijk LPS en IFN-γ of IL-4. Na in vitro incubatie met nieuwe biomateriaalspecimens is het mogelijk om de verschillende celoppervlakreceptoren en cytokineprofielen van M1- en M2-macrofagen te gebruiken om het immunomodulerende potentieel van biomaterialen in vitro te detecteren 14,15. Deze studie had tot doel een in vitro protocol te ontwikkelen dat kan worden gebruikt om de polarisatie van MDM's als reactie op verschillende implantaatoppervlakken te onderzoeken. Genexpressieanalyses, microscopietechnieken en ELISA kunnen worden gebruikt om de fenotypische markers en specifieke cytokineprofielen van M1- en M2-macrofagen te bepalen die door het biomateriaal worden gemoduleerd. Zo kunnen de complexe interacties tussen macrofagen en biomateriaaloppervlakken worden opgehelderd en kan waardevolle informatie worden verkregen om macrofaag-biomateriaalinteracties beter te begrijpen. Ten slotte zorgt een gestandaardiseerd in-vitroprotocol voor reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten door de variabiliteit in de experimentele opstelling te minimaliseren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijk perifeer bloed werd verkregen van gezonde bloeddonoren in overeenstemming met het protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit van Tübingen (ethische goedkeuring: 286/2021 BO). Menselijke PBMC's werden geïsoleerd met behulp van Density Gradient Centrifugation, zoals eerder beschreven16. Het volgende protocol wordt uiteengezet voor PBMC's geïsoleerd uit 24 ml bloed. Een schematische weergave van het protocol is weergegeven in figuur 1.

OPMERKING: Het bloedvolume moet worden aangepast afhankelijk van het aantal gebruikte M0-macrofagen.

In totaal werden 35,46 ± 9,1 miljoen PBMC's verkregen uit 24 ml bloed, wat resulteerde in 1,97 ± 0,46 miljoen M0-macrofagen (n = 5). Alle reagentia, verbruiksartikelen en apparaten worden vermeld in de Materiaaltabel. Buffers staan vermeld in tabel 1.

1. Differentiatie van monocyten van menselijk bloed tot macrofagen

  1. Resuspendeer de geïsoleerde PBMC's in 15 ml voorverwarmd monocytbevestigingsmedium en breng ze over naar een T75-celkweekkolf.
  2. Incubeer de cellen gedurende 90 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om hechting mogelijk te maken.
  3. Gooi het bovenstaande weg en was de cellen eenmaal met voorverwarmd volledig medium met zachte kanteling om niet-aanhangende of loszittende cellen te verwijderen.
    OPMERKING: De aangehechte cellen zijn monocyten, die ongeveer 10% uitmaken van het totale aantal PBMC's dat oorspronkelijk aan de kolf was toegevoegd.
  4. Voeg 15 ml compleet medium met 10 ng/ml macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) toe aan aanhangende cellen en incubeer gedurende 6 dagen om differentiatie te bevorderen.
  5. Vervang het medium om de 2 dagen door vers, compleet medium met 10 ng/ml m-CSF.

2. Teelt en polarisatie van MDM's op het oppervlak van het titanium implantaat

OPMERKING: Op dag 6 van de differentiatie werden M0-macrofagen gedurende 48 uur met verschillende stimuli op de biomateriaaloppervlakken gezaaid om volledig gepolariseerde M1- of M2-macrofagen te verkrijgen. Voor elk onderzocht oppervlak werden drie schijven gebruikt om M0-, M1- en M2-macrofagen te zaaien. Als controlevlakken werden met celcultuur behandelde plastic dekglaasjes gebruikt.

  1. Verwijder het kweekmedium uit de T75-kolven en was de cellen gedurende 5 minuten met 10 ml PBS.
  2. Maak de aanhangende cellen los door ze gedurende 30 minuten te incuberen met 10 ml voorverwarmde celloslatingsoplossing.
  3. Tik zachtjes op de cellen en doe ze in een tube van 50 ml. Maak de resterende cellen los door ze voorzichtig in 10 ml PBS te schrapen.
  4. Breng de losgemaakte cellen over in de buis van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 300 x g .
  5. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 5 ml voorverwarmd volledig medium.
  6. Tel de cellen met behulp van trypanblauwe kleuring en een hemocytometer om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te bepalen.
  7. Bereid de celsuspensie voor door het celaantal aan te passen tot 160.000 cellen per 1 ml volledig medium.
  8. Reinig de biomateriaalschijven ultrasoon in 70% ethanol gedurende 5 minuten, gevolgd door sterilisatie in 70% ethanol gedurende 30 minuten.
  9. Droog de titaniumschijven 1-2 uur, plaats ze vervolgens in niet-behandelde platen met 24 putjes en voeg 1 ml voorbereide celsuspensie toe aan elk putje.
  10. Om M1-gepolariseerde macrofagen te verkrijgen, voegt u IFN-γ en LPS toe in een concentratie van respectievelijk 50 ng/ml en 10 ng/ml. Voeg voor M2-polarisatie IL-4 en IL-13 toe in een concentratie van elk 20 ng/ml. Zorg ervoor dat de M0-cellen worden gekweekt zonder polarisatiemiddelen. Incubeer de cellen nog 48 uur bij 37 °C en 5% CO2 om polarisatie te induceren.

3. Karakterisering van gepolariseerde macrofagen met behulp van ELISA

OPMERKING: Op dag 2 van de polarisatie werden monsters voorbereid voor karakteriseringsanalyses. TNF-ɑ cytokine en CCL13-chemokine werden gemeten om respectievelijk M1- en M2-gepolariseerde macrofagen te karakteriseren. De concentratie van uitgescheiden eiwitten werd genormaliseerd naar de totale concentratie van uitgescheiden eiwitten in het corresponderende supernatant.

  1. Vang het bovenstaande op in een buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g . Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje.
  2. Breng de schijven over naar een nieuwe plaat met 24 putjes voor verdere experimenten. Het doel is om dode of loszittende cellen in niet-behandelde platen met 24 putjes te verwijderen.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cellen moet over oppervlakken worden geverifieerd voordat een analyse wordt uitgevoerd. De levensvatbaarheid van cellen kan worden bepaald door middel van levensvatbaarheidstests voor levende/dode cellen of indirect door middel van celproliferatie- en cytotoxiciteitstests.
  3. Meet de cytokines en chemokines volgens de specifieke instructies van de fabrikant. Meet de cytokinen onmiddellijk of bewaar de monsters bij -80 °C voor toekomstige metingen.
    OPMERKING: Voor elk type kit (rekening houdend met de gevoeligheid en detectielimieten van de ELISA-kit) moet de juiste monsterverdunning worden bepaald. Voor de bicinchoninezuur (BCA)-test werden de monsters 1:5 verdund. De M1-monsters voor TNF-ɑ werden 1:10 verdund en de M2-monsters voor CCL13 werden 1:12 verdund.
  4. Bereken de concentratie van uitgescheiden cytokines/chemokinen met behulp van de standaardcurve volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Meet de totale eiwithoeveelheid met behulp van de BCA-eiwittestkit.
  6. Normaliseer de concentratie van uitgescheiden eiwitten naar mg totaal eiwit.

4. Karakterisering van gepolariseerde macrofagen met behulp van CLSM

OPMERKING: Gepolariseerde macrofagen werden verder gekarakteriseerd door ze te kleuren met antilichamen tegen CD209- en CCR7-celoppervlaktemarkers. De kernen werden gekleurd met DRAQ5. CD68 of andere markers kunnen worden gebruikt als pan-macrofaagmarkers.

  1. Was de cellen 2x in 800 μL PBS. Incubeer de schijven gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) in 400 μl fixatiebuffer.
  2. Na het verwijderen van de fixatiebuffer driemaal wassen in 400 μL PBS. Kleur de monsters onmiddellijk of bewaar ze bij 4 °C in 1 ml opslagbuffer.
    OPMERKING: Met dit fixatie- en opslagprotocol werden monsters binnen 1-6 weken na fixatie met succes gekleurd en afgebeeld.
  3. Was de schijven vóór de volgende stap na opslag twee keer met 800 μL PBS.
  4. Incubeer schijven met 400 μL blokkeerbuffer gedurende 30 minuten bij RT om de niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren.
  5. Gooi de blokkeerbuffer weg en incubeer de schijven gedurende 1 uur bij RT met primaire antilichamen verdund in 400 μL kleuringsbuffer.
    1. Voer een immunofluorescentieprocedure uit met dubbele kleuring om de expressie van CCR7 en CD209 in één monster te onderzoeken. Combineer hiervoor primaire antilichamen van verschillende soorten (muis en konijn) in dezelfde kleuringsstap.
      OPMERKING: Om een sterk signaal te bereiken met minimale achtergrond, optimaliseert u de antilichaamconcentratie. CCR7-antilichaam werd gebruikt in een eindconcentratie van 10 μg/ml en het CD209-antilichaam werd verdund tot 1/400.
  6. Verwijder de primaire antilichamen en spoel 3x met 400 μL wasbuffer.
  7. Voeg fluorofoor-gelabelde secundaire antilichamen verdund in kleuringsbuffer toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.
    OPMERKING: De concentratie van secundaire antilichamen moet worden geoptimaliseerd om maximale specifieke signalen te verkrijgen met een minimale achtergrond. In deze studie werden secundaire antilichamen gebruikt in een concentratie van 5 μg/ml voor kleuring.
  8. Was de monsters na het verwijderen van het supernatant drie keer in de wasbuffer gedurende 3 minuten elk.
  9. Voeg 10 μM DRAQ5 toe in PBS en incubeer gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
  10. Verwijder het bovenstaande en was de schijven eenmaal in PBS.
  11. Verwijder de resterende PBS en voeg 1 druppel montagemedium toe.
  12. Breng na 5 min de dekglaasjes aan en laat de monsters 1 uur drogen.
  13. Sluit na het drogen van de monsters de randen af met heldere nagellak en bewaar ze bij 4 °C in het donker tot ze op de korrel zijn.
  14. Om een overzicht van cellen te krijgen, beeldt u de monsters af met een vergroting van 25x. Om de structuur en lokalisatie van oppervlaktemarkeringen verder te bepalen, verkrijgt u afbeeldingen met een vergroting van 63x.
  15. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van CCR7 en CD209 met behulp van ImageJ-software.
    OPMERKING: Beeldacquisitie werd uitgevoerd met een fotomultiplicator (PMT) met behulp van een CLSM-systeem, dat was uitgerust met een argonlaser (488 nm), DPSS-laser (561 nm) en HeNe-laser (633 nm).

5. Karakterisering van gepolariseerde macrofagen met behulp van qRT-PCR

OPMERKING: Voor RNA-isolatie werden twee schijven per monster gebruikt om voldoende RNA te verkrijgen voor cDNA-synthese.

  1. Was de schijven 2x met 800 μL PBS.
  2. Voeg 350 μL lysisbuffer toe aan de eerste schijf en lyseer de cellen door op en neer te pipetteren.
  3. Breng het lysaat over naar de tweede schijf en herhaal het lyseringsproces.
  4. Voeg 350 μL 70% ethanol toe aan het lysaat en pipetteer op en neer tot een homogeen.
  5. Breng het lysaat over naar de spinkolom en volg de instructies van de fabrikant voor RNA-isolatie.
  6. Kwantificeer de RNA-hoeveelheid met behulp van een nanodruppel of een ander apparaat.
  7. Normaliseer de RNA-concentraties voor verschillende monsters en synthetiseer cDNA volgens de instructies van de fabrikant met behulp van het RT-PCR-systeem voor first-Strand cDNA-synthese.
  8. Synthetiseer het cDNA met behulp van 350 ng RNA volgens het protocol van de fabrikant en bewaar het bij -20 °C totdat qRT-PCR-analyse is uitgevoerd.
    OPMERKING: Hier werd 350 ng gezuiverd RNA gebruikt om cDNA te synthetiseren met behulp van 4 μL RT Mix (5x) in 20 μL.
  9. Voer qRT-PCR uit op een real-time PCR-systeem in platen met 96 putjes en individuele reacties van 15 μl (1x Syber green mastermix, 0,2 μM voorwaartse en achterwaartse primers en 4,5 μl 1:10 verdund cDNA).
    OPMERKING: Het PCR-programma begint met een verwarmd deksel (105 °C), gevolgd door drie stappen: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 15 s bij 95 °C en 30 s bij 55 °C gedurende 40 cycli.
  10. Normaliseer de expressieniveaus van verschillende genen naar het huishoudgen GAPDH (of andere huishoudelijke genen zoals β-actine).
  11. Bereken de relatieve genexpressie met behulp van de 2−ΔΔCt-methode door de M0-cellen gekweekt op dekglaasjes van weefselkweek als referentie te nemen. Tabel 2 geeft een overzicht van alle primers die in dit onderzoek zijn gebruikt.

6. Statistische analyse

  1. Presenteer alle gegevens als het gemiddelde ± SEM. Herhaal alle tests (in dit onderzoek werden de tests vijf keer herhaald) om de reproduceerbaarheid te garanderen. Beoordeel de statistisch significante verschillen tussen normaal verdeelde gegevens met behulp van een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de meervoudige test van Tukey.
  2. Gebruik de Friedman-test en de meervoudige vergelijkingstest van Dunn om niet-parametrische datasets te analyseren. Gebruik de juiste software voor gegevensanalyse om de gegevens te analyseren en statistische significantie te definiëren als een p-waarde van minder dan 0,05.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten van deze studie tonen succesvolle differentiatie en polarisatie van MDM's op titaniumoppervlakken, gevolgd door karakterisering van M1 of M2 gepolariseerde macrofagen. In de eerste stap hebben we gepolariseerde MDM's gekarakteriseerd met behulp van CLSM. Op basis van onze voorlopige studies werden CD209 en CCR7 gebruikt als specifieke markers om M1 te onderscheiden van M2 gepolariseerde MDM's. Zoals te zien is in figuur 2A,B, polariseerden MDM's met succes in M1- en M2-macrofagen. Op het titaniumoppervlak werd CCR7 sterker tot expressie gebracht in M1-gepolariseerde macrofagen dan CD209, specifiek tot expressie gebracht in M2-gepolariseerde macrofagen. Bovendien vergemakkelijkte het kwantificeren van de relatieve fluorescentie-intensiteit het toewijzen van markers aan M1- of M2-subtypes (Figuur 2C).

Figuur 3 toont een representatieve qRT-PCR-analyse van MDM's op titanium- en dekglaasoppervlakken. De resultaten toonden aan dat MDM's op beide oppervlakken met succes gepolariseerd waren, zoals blijkt uit de hoge expressie van de M1 (CCR7 en TNF-ɑ) en M2 (CD209 en CCL13) polarisatiemarkers. Dit werd verder bevestigd op eiwitniveau door het waarnemen van hoge niveaus van inflammatoire TNF-α-cytokines (Figuur 4A) en IL-13-chemokines (Figuur 4B) in respectievelijk M1- en M2-gepolariseerde cellen.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Karakterisering van gepolariseerde MDM's met behulp van CLSM. Verrijking van M1 en M2 gepolariseerde macrofagen werd bevestigd door specifieke antilichaamkleuring en CLSM-analyse met behulp van CCR7- en CD209-antilichamen op dag 2 van het zaaien. Volgens fluorescentiekleuring en CLSM-analyse, (A) 25x vergroting en (B) 63x vergroting, brachten M1-cellen een hogere CCR7 (in groen) tot expressie dan M0 of M2. M2-cellen vertonen een significant CD209-expressiepatroon (in groen). (C) De kwantitatieve analyse van de relatieve fluorescentie-intensiteit van CCR7 en CD209. De kernen waren gekleurd met DRAQ5 (in paars). De resultaten zijn representatief voor 5 vergelijkbare experimenten die onafhankelijk van elkaar zijn uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Karakterisering van gepolariseerde MDM's met behulp van genexpressieprofielen. Kwantitatieve reverse transcriptie polymerase werd gebruikt om de mRNA-niveaus van verschillende genen geassocieerd met M1 (CCR7 en TNF-ɑ) en M2 (CD209 en CCL13) polarisatie te bestuderen. GAPDH werd gebruikt als huishoudgen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Productie van cytokinen door M0-, M1- en M2-macrofagen gekweekt op titanium en plastic dekglaasjes. (A) TNF-ɑ cytokineniveau en (B) CCL13-niveaus in de celkweeksupernatanten werden gemeten met behulp van ELISA. De cytokinesecretie werd genormaliseerd naar de totale eiwitsecretie gemeten met een BCA-test. Staafdiagrammen geven het gemiddelde ± SEM weer (n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Buffer/oplossingTevreden
Buffer voor vlekken/blokkerenPBS + 1% BSA + 0.1% Tussen 20
Was bufferPBS + 0.1% Tussen 20
Fixatie buffer3% paraformaldehyde (PFA) in PBS
Opslag buffer1% penicilline en streptomycine in PBS

Tabel 1: Lijst van buffers.

Naam van de primerVoorwaartse primersequentiesOmgekeerde primersequenties
GAPDH5 '-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
CCR75'- TGGTGATCGGCTTTCTGGTC-3'5'- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'
CD2095'- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3'5'- CAACGTTGTTGGGCTCTCCT-3'
CCL135'-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3'5'-ACTTCTCCTTTGGGTCAGCA-3'
TNF-ɑ5'- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3'5'- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3'

Tabel 2. Sequenties van primers die worden gebruikt in qRT-PCR.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een grondig begrip van het gedrag van macrofagen is essentieel voor het begrijpen van de immunomodulerende eigenschappen van implanteerbare materialen. Verschillende onderzoeken hebben heterogene markers, een verscheidenheid aan celmodellen en protocollen voor het karakteriseren van macrofaagpolarisatie in vitro gerapporteerd 17,18,19,20. Om de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten te verbeteren, zijn gestandaardiseerde en geverifieerde protocollen, samen met een geschikt celmodel en consensuskarakteriseringsmarkers, essentieel. Een nauwkeurige simulatie van de immunomodulerende eigenschappen van implantaatmaterialen vereist dan ook eerst een goed celmodel. Verschillende studies hebben gebruik gemaakt van een breed scala aan celmodellen, zoals geïsoleerde weefselmacrofagen, gedifferentieerde macrofagen afgeleid van bloedmonocyten en onsterfelijke monocytische cellijnen. Hoewel weefselgeïsoleerde macrofagen als meer representatief kunnen worden beschouwd voor in vivo omstandigheden, zijn ze technisch en ethisch uitdagend21,22. Macrofagen worden ook vaak verkregen uit gevestigde onsterfelijke monocytaire cellijnen, zoals THP1-cellen 23,24,25,26. Hoewel deze cellen meer homogeniteit in celrespons kunnen bieden als een onbeperkte bron van niet-senescente cellen, worden ze meestal verkregen van patiënten met hematologische neoplasmata en kunnen hun reacties aanzienlijk verschillen van normale cellen. Er is bijvoorbeeld gemeld dat monocytaire THP1-cellen beter reageren op M1-simulatoren en meer kans hebben om M1-kenmerken te vertonen22. De resultaten van deze studie komen overeen met die uit onze voorstudie (gegevens worden hier niet gepresenteerd).

Bovendien, aangezien van bloed afgeleide monocyten worden beschouwd als de voorlopers van weefselresidente macrofagen en gemakkelijk in hogere opbrengsten kunnen worden verkregen, kunnen ze een haalbaar alternatief zijn voor macrofagen 27,28,29. Op basis van onze studie met behulp van macrofagen afkomstig van bloedmonocyten, ontdekten we dat deze cellen even goed reageerden op M1- en M2-stimulatoren op zowel titanium als met celcultuur behandelde dekglaasjes. Bovendien vertoonden ze meerdere M1- en M2-consensusmarkers, waarvan sommige worden weergegeven in de representatieve resultaten. De resultaten toonden aan dat MDM's kunnen worden gebruikt als een haalbaar in vitro model voor het simuleren van implantaat-macrofaaginteracties.

Voor verdere vooruitgang in immunomodulatiestudies zijn constante en specifieke karakteriseringsmarkers essentieel. Studies hebben een verscheidenheid aan markers voor de karakterisering van macrofagen geïntroduceerd die niet alleen verschillen tussen macrofagen uit verschillende bronnen, maar ook tussen macrofagen uit dezelfde bron 17,18,19,24. Een panel van M1- en M2-markers die kenmerkend zijn voor MDM's werd bepaald en geverifieerd via de evaluatie van verschillende gerapporteerde markers. Enkele van de belangrijkste belangrijke markeringen worden in dit artikel gepresenteerd.

Het bepalen van de meest geschikte detectiemethoden is ook een cruciaal onderdeel van het evaluatieproces. Analysetechnieken die vaak worden gebruikt om markers op het celoppervlak te beoordelen, vereisen doorgaans de verwijdering van cellen uit biomaterialen. Er is echter waargenomen dat dit proces de cellen negatief beïnvloedt door hun oppervlaktemarkers te beschadigen en te resulteren in een laag aantal losgeraakte cellen30. Bijgevolg is flowcytometrie, waarvoor celloslating nodig is, niet geschikt voor het evalueren van macrofagen die stevig aan implantaten zijn bevestigd. In deze studie werd de detectie van celoppervlaktemarkers uitgevoerd met behulp van CLSM. Door de juiste markers te gebruiken en het kleuringsproces te optimaliseren, konden we de M1- en M2-subtypes met succes karakteriseren in vergelijking met elkaar en met M0-cellen. Het is belangrijk op te merken dat fluorescentiekleuring semi-kwantitatief is, wat een van de beperkingen is. Dit kan de evaluatie van cellen bemoeilijken met behulp van markers die in alle subtypen tot expressie komen zonder significante verschillen. CCR7 en CD209 werden geselecteerd na het testen van verschillende markers om de MDM's te karakteriseren met behulp van CLSM. CCR7 en CD209 waren consistent hoger uitgedrukt in respectievelijk M1- en M2-subtypes.

Binnen de beperkingen van deze studie benadrukken de resultaten het nut en de effectiviteit van geïmplementeerde protocollen bij het polariseren van macrofagen op implantaatoppervlakken en het nauwkeurig karakteriseren ervan in termen van genexpressie, uitgescheiden eiwitten en celoppervlaktemarkers. Bovendien bracht de analyse van de beschreven markers consistente en specifieke expressiepatronen aan het licht die kunnen worden gebruikt om verschillende subtypes van MDM's te onderscheiden. Dit in vitro model weerspiegelt echter niet volledig de fenotypische diversiteit en plasticiteit van menselijke macrofagen. Verschillende macrofaagsubtypes (M2a, M2b, M2c, M2d) worden nu geïdentificeerd, wat aangeeft dat er behoefte is aan meer diverse in vitro modellen om te bestuderen hoe verschillende biomaterialen en hun kenmerken (bijv. fysisch-chemische eigenschappen) de plasticiteit en polarisatie van macrofagen beïnvloeden31,32. Hoewel het niet mogelijk is om de complexe in vivo situatie na te bootsen met behulp van in vitro modellen, kunnen veel resultaten worden verkregen met behulp van het gepresenteerde in vitro protocol om het immunomodulerende potentieel van nieuwe implanteerbarebiomaterialen 9 effectief te beschrijven. Last but not least is verdere vaststelling nodig om macrofagen te karakteriseren in complexere in vitro of in vivo modellen waarbij de rol van andere spelers in complexe fysiologische contexten betrokken is. Over het algemeen zal deze studie bijdragen aan de ontwikkeling en het ontwerpen van immunomodulerende biomaterialen om gunstige weefselregeneratieprocessen en succesvolle implantaatintegratie te verbeteren en te bevorderen, en om implantaat-geassocieerde chronische ontsteking te voorkomen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De schijven werden ter beschikking gesteld door Medentis Medical, Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Duitsland. De auteurs erkennen de steun van de afdeling Mond-, Kaak- en Aangezichtschirurgie (Universitair Ziekenhuis Tübingen).

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well plate, not-treatedCorning Incorporated (Kennebunk, USA) 144530
Absorbance reader Infinite F50 TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria)TCAT91000001
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTAEMD Millipore Corp. (Burlington, USA)SCR005
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshieldabcam (Cambridge, UK)ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal CyclerBio-Rad / MJ Research7212
Bovine serum albumin (BSA)VWR International bvba (Leuven, Belgium)422361V
Centrifuge 5804 REppendorf SE (Hamburg, Germany)5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology13193
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining SolutionMilteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-117-344
Ethanol ≥99.8% for molecularbiologyCarl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany)1HPH.1
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed
Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488		InvitrogenA32723TR
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3InvitrogenA10520
GraphPad PrismGraphPadVersion  9.4.1
Human CCR7 AntibodyR&D SystemsMAB197
Human IFN-gamma RecombinantInvitrogen (Rockford, USA)RIFNG100
Human IL-13Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)5230901032
Human IL-4Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-095-373
Human M-CSFPeprotech (Cranbury, USA)300-25
Leica TCS SP5Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany)https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides from EscherichiaSigma Aldrich Co. (Missouri, USA)L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix New England BiolabsNEB #M3003
LunaScript RT SuperMix KitNew England BiolabsE3010L
Lymphocyte Separation Medium 1077PromoCell (Heidelberg, Germany)C-44010
MCP-4/CCL13 Human ELISA KitInvitrogenEHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems (Waltham, USA)4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife Technologies Corporation (Carlsbad, USA)4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well BaseApplied Biosystems (Waltham, USA)4312063
Microlitercentrifuge CD-3124RPhoenix Instrument (Germany)9013111121
Microscope Cover Glasses, 10 mmCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany4HX4.1
Monocyte Attachment MediumPromoCell (Heidelberg, Germany)C-28051
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PPSarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany)7,27,35,100
Nanodrop OneThermo Scientific (USA)ND-ONE-W
QuantStudio 3 SystemLife Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany)A28567
RNeasy Micro KitQiagen74007
RPMI 1640, 1x, with L-glutamineMediatech, Inc. (Manassas, USA)10-040-CV
Sterile bench, LaminarAir HB 2472 Heraeus instruments (Hanau, Germany)51012197
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic)Sarstedt Inc. (Newton, USA)83,18,40,002
Titanium machinied discs 12 cm Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany)N/A
TNF alpha Human ELISA KitInvitrogenKHC3011
Trypan blue solution 0.4%Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)1680.1
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics. Biomaterials. 167, 191-204 (2018).
  2. Ikada, Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).
  3. Aamodt, J. M., Grainger, D. W. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials. 86, 68-82 (2016).
  4. Batool, F., et al. Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration. J Tissue Eng. 12, 20417314211041428(2021).
  5. Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling. J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).
  6. Shrivastava, R., Shukla, N. Attributes of alternatively activated (M2) macrophages. Life Sci. 224, 222-231 (2019).
  7. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).
  8. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Kzhyshkowska, J., et al. Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine. J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).
  11. Browne, S., Pandit, A. Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment. Front Bioeng Biotechnol. 3, 67(2015).
  12. Piatnitskaia, S., et al. Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement. Front Immunol. 15, 1349461(2024).
  13. Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. Activation of macrophages in response to biomaterials. Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).
  14. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  15. Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biol. 15 (1), 53(2017).
  16. Salma Iqbal, A. K. Characterization of in vitro generated human polarized macrophages. J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).
  17. Hotchkiss, K. M., et al. Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation. Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).
  18. Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants. Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).
  19. Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo. Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).
  20. Lu, W., et al. Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization. Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).
  21. Murray, P. J., Wynn, T. A. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).
  22. Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies. Biochem Biophys Rep. 32, 101383(2022).
  23. Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).
  24. Zhang, Y., et al. Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs. Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).
  25. Cerqueira, A., et al. Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels. J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).
  26. Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).
  27. Nobs, S. P., Kopf, M. Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis. Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).
  28. Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222(2020).
  29. Parisi, L., et al. Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro. J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).
  30. Feuerer, N., et al. Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods. J Immunol Regen Med. 11, 100035(2021).
  31. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  32. Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles. Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

M1 macrofaagpolarisatieM2 macrofaagpolarisatiemacrofaagkarakteriseringqRT PCR analyseconfocale microscopieELISA assayCCR7 markerCD209 marker

Gerelateerde artikelen