Methodenartikel

Kwantificering van mitochondriale ademhaling in hele gistcellen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

8 november 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

In dit artikel

Samenvatting

Mitochondriale ademhaling in gistcellen is een waardevolle indicator van de bio-energetica van cellen. Hier presenteren we een protocol om dit fenotype te kwantificeren dat van toepassing is op verschillende gistsoorten.

Samenvatting

Het metabolisme wordt voornamelijk gecoördineerd door de beschikbaarheid van cellulaire energie en omgevingsomstandigheden. Tests om te weten hoe cellen het energetische metabolisme aanpassen aan verschillende voedings- en omgevingsomstandigheden, geven waardevolle informatie om moleculaire mechanismen op te helderen. Oxidatieve fosforylering is de primaire bron van ATP in de meeste cellen, en mitochondriale ademhalingsactiviteit is een belangrijk onderdeel van oxidatieve fosforylering, waardoor het mitochondriale membraanpotentieel voor ATP-synthese behouden blijft. Mitochondriale ademhaling wordt vaak bestudeerd in geïsoleerde mitochondriën die de cellulaire context missen. Hier presenteren we een methode voor het kwantificeren van mitochondriale ademhaling in gist-intacte cellen. Deze methode is van toepassing op elke gistsoort, hoewel deze over het algemeen wordt gebruikt voor Saccharomyces cerevisiae-cellen. Eerst wordt de gistgroei onder specifieke omstandigheden getest. Vervolgens worden de cellen gewassen en opnieuw gesuspendeerd in gedeïoniseerd water met een verhouding van 1:1 (w/v). Cellen worden vervolgens onder constant roeren in een oximeterkamer geplaatst en een Clark-elektrode wordt gebruikt om het zuurstofverbruik te kwantificeren. Sommige moleculen worden achtereenvolgens in de kamer geplaatst en geselecteerd op basis van dit effect op de elektronentransportketen of ATP-synthese. ATPase-remmer oligomycine wordt eerst toegevoegd om de ademhaling te meten in combinatie met ATP-synthese. Daarna wordt een ontkoppelaar gebruikt om de maximale ademhalingscapaciteit te meten. Ten slotte wordt een mix van remmers van de elektronentransportketen toegevoegd om het zuurstofverbruik weg te nemen dat geen verband houdt met de mitochondriale ademhaling. Gegevens worden geanalyseerd met behulp van een lineaire regressie om de helling te verkrijgen, die het zuurstofverbruik weergeeft. Het voordeel van deze methode is dat deze specifiek is voor mitochondriale ademhaling van gisten, waardoor de cellulaire context behouden blijft. Het is essentieel om te benadrukken dat remmers die worden gebruikt bij het kwantificeren van mitochondriale ademhaling kunnen variëren tussen gistsoorten.

Inleiding

Mitochondriën spelen een fundamentele rol in de cellulaire bio-energetica, aangezien het voor de meeste cellen de belangrijkste bron van ATP is, en verschillende routes convergeren en zijn afhankelijk van de activiteit van mitochondriale routes1. Oxidatieve fosforylering is nodig voor ATP-synthese die elektronentransport door de elektronentransportketen combineert om zuurstof- en F1F 0-ATPase-activiteit te verminderen, waarbij ATP wordt gesynthetiseerd met behulp van het mitochondriale membraanpotentiaal dat wordt geproduceerd als gevolg van elektronenflux2. Mitochondriale ademhaling maakt dus deel uit van de oxidatieve fosforylering3.

De mitochondriale ademhalingsketen bestaat uit vier complexen of, in sommige gevallen, gistcomplex I-deficiënt (bijv. Saccharomyces cerevisiae), drie complexen en drie dehydrogenase-eiwitten4. Respiratoire complexen zijn gelokaliseerd in het binnenste mitochondriale membraan; sommige gisten presenteren de canonieke elektronentransportketen met complex I (NADH-dehydrogenase) of drie NADH-dehydrogenase, ubiquinon (Co Q), complex II (succinaat ubiquinonoxidoreductase), complex III (ubiquinoncytochroomoxidoreductase), cytochroom c (Cyt c) en complex IV (cytochroom c-oxidase)5,6. Elektronentransport door de complexen maakt het mogelijk om protonen van de mitochondriënmatrix naar de intermembraanruimte te pompen, waardoor een mitochondriaal membraanpotentiaal wordt gevormd7. Protonen die zich in de intermembraanruimte bevinden, worden in omgekeerde richting naar de mitochondriënmatrix gepompt door F1F0 -ATPase om één ATP-molecuul te synthetiseren pervier protonen die 8 worden gepompt.

Mitochondriale ademhalingsmetingen bieden waardevolle inzichten in de mitochondriale integriteit, de bio-energetische cellen en de mitochondriale ademhalingscapaciteit9. De mitochondriale ademhalingsfunctie kan in vitro of in situ worden geanalyseerd met behulp van diverse technieken. Mitochondriale ademhalingsanalyse in intacte cellen zou echter een reeks voordelen kunnen bieden, aangezien het het volledige celmetabolisme omvat, aangezien de interacties van cellen met hun omgeving en intracellulair metabolisme in aanmerking worden genomen bij het gebruik van hele cellen10. Bovendien maakt het gebruik van intacte cellen een gemakkelijke evaluatie van verschillende experimentele omstandigheden mogelijk en worden minimale veranderingen gedetecteerd die niet konden worden waargenomen in geïsoleerde mitochondriën10,11. Een ander voordeel van kwantificering van mitochondriale ademhaling in intacte cellen is dat de effecten van mitochondriale proliferatie en lokalisatie behouden blijven12.

De ademhaling van mitochondriën van zoogdieren in intacte cellen is zeer gedetailleerd beschreven12, afgezien van de studie van andere eukaryote organismen, zoals gisten. Hier stellen we een techniek voor voor het kwantificeren van mitochondriale ademhaling aangepast aan gist uit zoogdierprotocollen. Daarom zijn in deze techniek concepten gebruikt uit de kwantificering van mitochondriale ademhaling door zoogdieren. Deze techniek is bijvoorbeeld onderverdeeld in verschillende fasen als het zoogdierprotocol: 1) basale ademhaling (afhankelijk van het substraat), 2) ATP-gekoppelde ademhaling (door de remming van ATP-synthase), 3) maximale ademhalingscapaciteit (met behulp van een ontkoppelaar die de permeabiliteit van protonen door het binnenste mitochondriale membraan mogelijk maakt), 4) mitochondriale ademhalingsremming (gebruik van een mix van remmers van de ademhalingsketen om het zuurstofverbruik weg te gooien voor andere bronnen dan mitochondriale ademhaling)11,13. Daarom heeft dit artikel tot doel een protocol te presenteren om de mitochondriale ademhaling in gist te kwantificeren.

Protocol

1. Kweekmedia en preparaat van inoculum

  1. Bereid 100 ml gistextract-pepton-dextrose medium (YPD) door 1 g gistextract, 2 g caseïne-pepton en 2 g glucose toe te voegen aan 95 ml gedestilleerd water. Verdeel 3 ml over glazen reageerbuisjes van 10 ml, steriliseer bij 121 °C en 1.5 psi gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Het medium kan maximaal 1 maand bij 4 - 8 °C worden bewaard.
  2. Inoculeer een glazen reageerbuis van 10 ml met 3 ml YPD-medium met 250 μl glycerolgeconserveerde gistcellen van -20 °C. Incubeer een nacht onder constant roeren bij 200 tpm en 30 °C.
    OPMERKING: De temperatuurincubatie kan bij sommige gistsoorten variëren ( bijv. Kluyveromyces marxianus heeft een optimale groeitemperatuur van 37 °C).
  3. Vul een petrischaaltje (60 x 15 mm2) met steriele 2% YPD-agar (voeg 10 g gistextract, 20 g caseïnepepton, 20 g glucose en 20 g bacteriologische agar toe aan 950 ml gedestilleerd water) en bestrijk het petrischaaltje met de gistcellen die in de glazen reageerbuis van 10 ml zijn gekweekt met behulp van een steriele lus. Incubeer de petrischaal bij 30 °C tot er geïsoleerde kolonies verschijnen.
  4. Bereid een pre-inoculum voor door een steriel glazen reageerbuisje van 10 ml met 3 ml YPD-medium met 2% glucose te inoculeren met twee of drie met gist geïsoleerde kolonies uit het petrischaaltje. Incubeer een nacht onder constant roeren bij 30 °C.

2. Groeiomstandigheden en experimentontwerp

  1. Inoculeer een erlenmeyer van 500 ml met 100 ml steriel synthetisch volledig medium (SC-medium; 0,18 g giststikstofbasis zonder aminozuren, 0,5 g ammoniumsulfaat, 0,2 g dikaliumfosfaat, 1 g synthetische drop-outsupplementen uit gist en glucose volgens de experimentele opzet, in 98,02 ml gedestilleerd water) met gistcultuur bij initiële OD600 ~ 0,1, dat is ongeveer 3 ml van het nachtelijke pre-inoculum (OD600 ~ 3). Stel de omgevingsconditie of aanvulling in met de chemische uitdaging die moet worden getest bij mitochondriale ademhaling (bijv. het toevoegen van 100 μM resveratrol). Bereid een voertuigbesturing in een aparte kolf voor op de chemische uitdaging. Test ten minste drie biologische replicaten.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een minimaal medium te gebruiken om voedingsruis in de test te verwijderen, en het minimale medium dat op dit punt wordt voorgesteld, wordt gebruikt voor S. cerevisiae en kan verschillen voor andere gistsoorten. Ten slotte is de glucoseconcentratie die in de kweekmedia wordt aangevuld van cruciaal belang om glucoseonderdrukking of het Crabtree-effect te voorkomen dat de mitochondriale ademhaling remt; concentraties onder 0,5% (w/v) gaven goede responsen in de mitochondriale ademhaling, vergezeld van hoge groeisnelheden in S. cerevisiae. In Crabtree-negatieve gisten hadden hoge glucoseconcentraties geen invloed op de mitochondriale ademhaling (bijv. K. marxianus).
  2. Weeg een lege conische buis van 50 ml en gebruik deze om cellen te oogsten in de mid-logfase (OD600 ~ 0,5) door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 5 min.
    OPMERKING: De mid-log-fase wordt aanbevolen voor het testen van de mitochondriale ademhaling, aangezien dit de groeifase is waarin het energetische metabolisme actiever is.
  3. Gooi het bovenstaande weg en was de korrel 3x met 25 ml gedeïoniseerd water. Weeg de conische buis met de pelletcellen (nat gewicht) en trek het conische buisgewicht af om het cellulaire natte gewicht te verkrijgen.
  4. Resuspendeer de pellet in 2 ml gedeïoniseerd water.
  5. Noteer de cellulaire concentratie door het natte gewicht te delen door 2 om mg cellen/ml te verkrijgen. Deze waarde is essentieel om te bepalen hoeveel volume moet worden toegevoegd om 50 mg cellen voor de test te hebben.

3. Test op het zuurstofverbruik (Polarografie)

  1. Gebruik een zuurstofelektrode van het Clark-type die is aangesloten op een YSI5300A-monitor en een computer voor gegevensverzameling.
    1. Breng 5 ml morfo-ethanolsulfonzuur aangepast aan pH 6 met triethanolamine (MES-TEA-buffer; 10 mM) en 50 mg cellen (nat gewicht) in de polarisatiekamer. Plaats de elektrode voorzichtig en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.
    2. Zet de YSI5300A monitor, de computer voor gegevensverzameling en de kamer om te roeren aan. Stel de YSI5300A monitor in door de instellingsknop voor kanaal 1 in AIR te selecteren. Stel kanaal 1 in op 100% met de kalibratieknop van kanaal 1 en stabiliseer het signaal gedurende 5 minuten op 100%.
    3. Begin met het registreren van gegevens in de computer en het meten van de tijd met behulp van een chronometer.
      OPMERKING: De YSI5300A monitor heeft geen computer of programma voor gegevensverzameling; Dit kan extern worden geïmplementeerd door de gebruiker.
    4. Gebruik laterale kanalisatie van de elektrode in de oximeterkamer om het oxideerbare substraat, oligomycine, de ontkoppelaar en de mix van respiratoire ketenremmers achtereenvolgens toe te voegen.
  2. Voeg het oxideerbare substraat (glucose, glycerol, L-lactaat of een andere koolstofbron, afhankelijk van het experimentele ontwerp) toe aan een eindconcentratie van 10 mM met een chromatografiespuit. Houd de kamer de hele tijd gesloten en met constante agitatie. Registreer het luchtpercentage gedurende 2-3 minuten om de basale ademhaling te bepalen.
    OPMERKING: Glucose, glycerol en L-lactaat worden gebruikt om de elektronentransportketen op verschillende plaatsen van de ademhalingsketen te analyseren: glucosemetabolisme reduceert NAD+ tot NADH en wordt gebruikt voor het analyseren van de gehele ademhalingsketen; glycerol brengt elektronen over naar ubiquinon en wordt gebruikt om de ademhalingsketen van ubiquinon te evalueren; ten slotte staat L-lactaat zijn elektronen af aan cytochroom c en wordt het gebruikt om het effect van cytochroom c14 te bepalen. Deze substraten kunnen variëren, afhankelijk van het enzymatische vermogen van de gistsoort.
  3. Voeg oligomycine toe om een uiteindelijke concentratie van 0,01 mM in de oximeterkamer te verkrijgen met behulp van een chromatografiespuit om ATP-gekoppelde ademhaling te evalueren en het luchtpercentageverbruik gedurende 2-3 minuten te registreren.
  4. Vul de ontkoppeling, 3-chloorfenylhydrazoncarbonylcyanide (CCCP) aan om een eindconcentratie van 0,015 mM in de oximeterkamer te verkrijgen, met een chromatografiespuit om de maximale ademhalingscapaciteit te bepalen en het luchtpercentage gedurende 2-3 minuten te registreren.
  5. Gebruik een chromatografiespuit om de remmers van de elektronentransportketen toe te voegen: eerst 2-thenoyltrifluoraceton (TTFA) en vervolgens antimycine A (AA) in eindconcentraties van respectievelijk 1 mM en 1 mg/ml. Meet elke remmer gedurende 2-3 minuten.
    OPMERKING: Remmers van de elektronentransportketen kunnen verschillen tussen gistsoorten; Hiermee moet in deze stap rekening worden gehouden.
  6. Screen elke koolstofbron afzonderlijk (d.w.z. glucose, glycerol of L-lactaat). Herhaal stap 3.3 tot en met 3.5 voor elke koolstofbron. Was de kamer na elk gebruik 3x met 70% ethanol en 3x met gedeïoniseerd water.

4. Gegevensverwerking

  1. Gebruik zuurstofverbruikscurven (uitzetten van luchtpercentage versus tijd) om de hellingen van het oxideerbare substraat (basale ademhaling), oligomycine (ATP-gekoppelde ademhaling), CCCP (maximale ademhaling), AA en TTFA (geen mitochondriale ademhaling) te berekenen; Figuur 1). Bereken individuele hellingen voor elke toegevoegde verbinding met behulp van lineaire regressie zoals hieronder beschreven.
    1. Maak een nieuw projectbestand aan in de statistische software. Kies XY in de sectie Maken. Selecteer de optie Gegevens invoeren of importeren in een nieuwe tabel in de sectie Gegevenstabel.
    2. Selecteer Getallen in de subsectie X in de sectie Opties. Klik op Voer 3 repliceerwaarden in naast elkaar geplaatste subkolommen in de Y-subsectie in de sectie Opties.
      OPMERKING: De tabelindeling heeft één X-kolom en verschillende Y-kolommen, elk met 3 subkolommen met de naam A: Y1 en A: Y2.
    3. Voer tijdgegevens in X kolommen in (bijv. 0, 2, 4, 6, 8 s of 0, 1, 2, 3 min). Schrijf het luchtpercentage in de Y-kolommen.
    4. Maak een lineaire regressieconditie. Klik op Analyseren in de menubalk. Selecteer in de optie Analyse de optie Eenvoudige lineaire regressie op XY-analyses en klik op OK.
    5. Haal de hellingswaarde op uit de tabellen Resultaten in gegevens aan de linkerkant van het scherm.
  2. Schrijf hellingswaarden in een gegevensblad en trek de hellingswaarde verkregen uit de respiratoire remmersmix (AA en TTFA) af van hellingen verkregen uit het oxideerbare substraat, oligomycine, en CCCP voor het weggooien van zuurstofverbruik uit andere bronnen dan mitochondriale ademhaling.
  3. Vermenigvuldig de verkregen waarden met 237 μM Ø2. Deze waarde wordt beschouwd als de oplosbaarheid van O2 in een gebufferd mitochondriaal medium dat in evenwicht is met lucht (20,9 % O2) bij 25 °C; Deze waarde varieert afhankelijk van de temperatuur, de hoogte en de gebruikte buffer.
  4. Omrekenen naar minuut; de verkregen waarden zijn μM van O2 per tijd, afhankelijk van hoe de tijd is uitgezet, om μM van O2/ min te verkrijgen.
  5. Deel door 50, dat wil zeggen de mg gebruikte cellen; Cel-mg kan variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp. Ten slotte wordt het zuurstofverbruik uitgedrukt als μM van O2/mg cellen x min

Resultaten

Deze mitochondriale ademhalingstechniek kan worden gebruikt voor andere gistsoorten dan S. cerevisiae, zoals Scheffersomyces stipitis15 en K. marxianus16. Voor representatieve doeleinden presenteren we echter alleen resultaten van S. cerevisiae. Het is algemeen bekend dat S. cerevisiae een overheersend respiratoir metabolisme vertoont in lage glucoseconcentraties (minder dan 0,8 mM)17,18. Om het respiratoire fenotype van S. cerevisiae te bevestigen, werd het dus gekweekt in twee glucoseconcentraties voor het stimuleren (0,5% glucose) en het beperken (5% glucose) van de mitochondriale ademhaling18,19. Zoals verwacht valideren de resultaten van de basale ademhaling (oxideerbaar substraat), ATP-gekoppelde ademhaling (oligomycine) en maximale ademhalingscapaciteit (CCCP) het karakteristieke energetische metabolisme van S. cerevisiae (Figuur 2). We zagen hogere waarden van zuurstofverbruik (basale ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling en maximale ademhalingscapaciteit) in cellen gekweekt met 0,5% glucose in vergelijking met waarden verkregen in cellen gekweekt met 5% glucose (Figuur 2).

Bovendien gebruikten de tests drie substraten: glucose, glycerol en L-lactaat. Het doel van het gebruik van diverse substraten is het evalueren van verschillende delen van de mitochondriale ademhalingsketen. Onder deze omstandigheden vertoonde de mitochondriale ademhaling geen significante substraatafhankelijke veranderingen, aangezien er geen behandeling om de ademhalingsketen te verstoren werd toegevoegd (Figuur 2).

We gebruikten quercetine om de capaciteit van de techniek te evalueren, een verbinding die de mitochondriale ademhaling negatief beïnvloedt20. De verkregen gegevens toonden aan dat quercetine de mitochondriale ademhaling aanzienlijk verminderde in cellen die werden gekweekt in media aangevuld met 0,5% glucose (Figuur 3). Aan de andere kant vertoonden cellen gekweekt in media aangevuld met 5% glucose geen significante negatieve invloed van quercetine (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Representatieve curve van het zuurstofverbruik. Zuurstofverbruikscurve verkregen in S. cerevisiae-cellen gekweekt in SC-media (0,5% glucose). Kleuren vertegenwoordigen verschillende hellingen die worden verkregen bij substraat, ontkoppelaars en suppletie met remmers. Groen: Het substraat gebruikte glucose en helling-corresponderende basale ademhaling. Blauw: oligomycine, ATP-synthaseremmer, helling gebruikt voor het bepalen van ATP-gekoppelde ademhaling. Geel: CCCP, ontkoppeling, helling gebruikt om de maximale ademhaling te evalueren. Grijs en rood: respectievelijk remmercomplex II en III; helling die wordt gebruikt voor het bepalen van het zuurstofverbruik dat niet afhankelijk is van mitochondriën. Afkortingen: CCCP = 3-chloorfenylhydrazoncarbonylcyanide; TTFA = 2- thenoyltrifluoraceton; AA = antimycine A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Zuurstofverbruikstesten in S. cerevisiae-cellen gekweekt met 0,5% en 5% glucose. Mitochondriale ademhaling wordt geëvalueerd aan de hand van zuurstofverbruik gemeten bij basale ademhaling, maximale ademhalingscapaciteit en ATP-gekoppelde ademhaling in S. cerevisiae-cellen gekweekt in SC aangevuld met 0,5% en 5% glucose. Drie substraten werden gebruikt om hun specifieke invloed op de elektronentransportketen te evalueren: glucose (NADH-dehydrogenases), glycerol (ubiquinonpool) en L-lactaat (cytochroom c). (A) Basale ademhaling bij 5% en 0,5% glucose met glucose, glycerol en L-lactaat als substraten; (B) maximale ademhaling bij 5% en 0,5% glucose met glucose, glycerol en L-lactaat als substraten; (C) ATP-gekoppelde ademhaling bij 5% en 0,5% glucose met glucose, glycerol en L-lactaat als substraat. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten, waarbij elk experiment twee technische herhalingen heeft. Eenrichtings-ANOVA gevolgd door de Tukey-test (p ≤ 0,05; verschillende letters: significant verschil, dezelfde letters: geen significant verschil) voor statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Quercetine beperkte de mitochondriale ademhaling bij een lage glucoseconcentratie in gekweekte S. cerevisiae-cellen . Meting van het zuurstofverbruik werd uitgevoerd bij basale ademhaling, maximale ademhalingscapaciteit en ATP-gekoppelde ademhaling in S. cerevisiae-cellen gekweekt in SC-media (0,5% glucose) quercetine aangevuld (100 μM). Ethanol werd gebruikt om de quercetine-oplossing op te lossen. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten, waarbij elk experiment twee technische herhalingen heeft. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een student t-test in combinatie (*, ** p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Quercetine heeft geen invloed op de mitochondriale ademhaling bij een hoge glucoseconcentratie in S. cerevisiae. Het zuurstofverbruik werd gemeten bij basale ademhaling, maximale ademhalingscapaciteit en ATP-gekoppelde ademhaling in S. cerevisiae-cellen gekweekt in SC-media (5% glucose) quercetine aangevuld (100 μM). Ethanol wordt gebruikt om de quercetine-oplossing op te lossen. De resultaten tonen een gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten, elk met twee technische herhalingen. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van student t-test gepaarde (p ≤ 0,05; ns: niet-significant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Mitochondriale ademhalingsfosforylering speelt een fundamentele rol in verschillende routes die afhankelijk zijn van het mitochondriale membraanpotentieel en die ATP-niveaus op peil houden door oxidatieve fosforylering. Begrijpen hoe omgevings- en voedingsomstandigheden de mitochondriale ademhaling van gisten beïnvloeden, dient als een hulpmiddel om moleculaire mechanismen op te helderen.

Het is essentieel om de volgende kritische stappen te overwegen om betrouwbare resultaten uit deze methode te verkrijgen. Agitatie >200 tpm is van cruciaal belang voor het verkrijgen van voldoende biomassa onder ademhalingsgroeiomstandigheden om de mitochondriale ademhaling te testen; Agitatieomstandigheden lager dan 200 tpm veroorzaken slechte groei en vorming van biomassa, waardoor het langer duurt voordat de groeifase in het midden van de log wordt bereikt en kan van invloed zijn op het zuurstofverbruik, aangezien cellen overleven in een minder zuurstofrijke omgeving. De glucoseconcentratie in de media wordt ingesteld op basis van het gistfenotype (Crabtree-positief of negatief); dit is van cruciaal belang in het geval van Crabtree-positieve gisten, aangezien hoge glucoseconcentraties de mitochondriale ademhaling remmen en een vertekening kunnen veroorzaken bij de interpretatie van de gegevens. In S. cerevisiae bijvoorbeeld veroorzaakt glucose katabole onderdrukking, waardoor de mitochondriale ademhaling wordt geremd bij hoge glucoseconcentraties21,22. Op basis van dit bewijs worden lagere waarden in basale ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling en maximale ademhaling van cellen gekweekt met een hoge glucoseconcentratie (5%) verkregen in vergelijking met gistcellen die met een lage glucoseconcentratie (0,5%) worden gekweekt. Respiratoire ketenremmers moeten zorgvuldig worden geselecteerd op basis van de gevoeligheid voor gisten; Dit is van cruciaal belang om andere bronnen van cellulair zuurstofverbruik dan mitochondriale ademhaling weg te gooien.

Substraten, mitochondriale ontkoppelaars en remmers worden gebruikt om verschillende parameters van mitochondriale ademhaling in intacte cellen te bepalen. Toch heeft het gebruik ervan enkele beperkingen. Er moet bijvoorbeeld rekening worden gehouden met de niet-specifieke doelen buiten mitochondriën van mitochondriale remmers en ontkoppelaars in intacte cellen om vertekening bij de interpretatie van het zuurstofverbruik te voorkomen. Bovendien moet het gebruik van alternatieve koolstofbronnen voor het screenen van de plaats van actie in de ademhalingsketen met meer detail worden getest, aangezien bijproducten van het glycerol- of L-lactaatmetabolisme kunnen worden geoxideerd om NAD+ of FAD+ te verminderen, die elektronen afstaat en de ademhalingsketen activeert, aangezien NADH-dehydrogenasen en Complex II respectievelijk zijn. Ten slotte herbergen S. cerevisiae en andere gisten PDR-transporters zoals Yor1p (gist-oligomycine-resistentie-eiwit), wat de uitstroom van oligomycine uit de cellen suggereert23. Verder zijn testen met PDR-deficiënte cellen, bijv. de AD1-8-stam, waarvan de belangrijkste PDR-transporters en PDR1/PDR3-transcriptiefactoren zijn verwijderd, nodig om het gebruik van oligomycine in S. cerevisiae voor kwantificering van de mitochondriale ademhaling te valideren.

Het gebruik van intacte cellen voor kwantificering van de mitochondriale ademhaling handhaaft de cellulaire context, wat een robuustere techniek oplevert om de voedings- of omgevingseffecten op de bio-energetica van gist te kennen. Bovendien is het gebruik van gist-intacte cellen voor het kwantificeren van mitochondriale ademhaling zuiniger en, op technisch niveau, gemakkelijker dan geïsoleerde mitochondriën. Bovendien, net als bij geïsoleerde mitochondriëntesten, geven diverse koolstofbronnen de plaats van actie in de ademhalingsketen van sommige moleculen aan. Als proof of concept bevestigt deze techniek dat suppletie met resveratrol de ademhalingsketen beïnvloedt op NADH-dehydrogenaseniveau, aangezien remming van resveratrol op de basale ademhaling alleen wordt waargenomen bij glucose en niet bij glycerol of L-lactaat24. In vitro studies met opgelost complex I toonden aan dat resveratrol concurreert met NAD+, wat de activiteit van complex I beïnvloedt25. Dit bevestigt het fenotype dat in intacte cellen is waargenomen met de hier gepresenteerde techniek. Bovendien is deze techniek ook betrouwbaar voor het onderzoeken van de negatieve effecten van chemicaliën op de mitochondriale ademhaling van gisten. Quercetine is bijvoorbeeld een polyfenol dat de afgelopen decennia veel is bestudeerd. Een van de belangrijkste bewijzen die zijn gevonden, is dat het de mitochondriale ademhaling in intacte cellen beperkt, wat is gevalideerd door complexe ademhalingsketenactiviteit26,27. Belangrijk is dat divers onderzoek quercetineremmende effecten op de mitochondriale ademhaling heeft gerapporteerd in verschillende modelstudies28.

Het is belangrijk om een gedetailleerde beschrijving te hebben van het gistmetabolisme, inclusief bio-energetica, aangezien deze micro-organismen dierlijke pathogenen kunnen zijn, inclusief mensen, en ook worden gebruikt als celfabrieken of in biotechnologische toepassingen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) toegekend aan LAMP.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2- thenoyltrifluoroacetone (TTFA)MerckT27006Remmer complex II
3-chlorofenylhydrazon carbonylcyanide (CCCP)MerckC2759Ontkoppeling van mitochondriale ademhaling  
Absoluut ethanolMerck107017Voor het oplossen van quercetine 
AgarMerckA1296YPD agar-voorbereiding
Ammoniumsulfaat korrelig (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC-bouillonvoorbereiding
Antimycine A (AA)MerckA8674Remmer complex III
aYSI5300A--------Monitor 
CentrifugeHermleZ 206 AVoor celcentrifuge
Clark-type zuurstof--------Elektrode 
Computer--------Voor gegevensverwerving 
Dikaliumfosfaat K2HPO4J.T. Baker3252-05SC-bouillonvoorbereiding
GlucoseMerckG7021YPD-bouillonvoorbereiding
GlycerolMerckG5516Aanvulling op substraatmedium 
LactaatMerckL1250Aanvulling op substraatmedium 
Oligomycine van Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Remming van mitochondriale ATP-synthase
Orbitale shakerThermo FisherSHKE6000Incubatie van inoculum in glazen buisjes en kolf 
Pepton uit caseïne, enzymatische verteringMerck82303YPD-bouillonvoorbereiding
Quercetine Merck337951Voor vermindering van mitochondriale ademhaling
Uracil MerckU0750SC-bouillonvoorbereiding
GistextractMerckY1625YPD-bouillonvoorbereiding
Giststikstofbasis zonder aminozuren en ammoniumsulfaatMerckY1251SC-bouillonvoorbereiding
Gist synthetische Drop-out medium supplementen zonder uracilMerckY1501SC-bouillonvoorbereiding

Referenties

  1. Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes. Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).
  2. Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta. Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).
  3. Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. The role of mitochondria in metabolism and cell death. Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).
  4. Matus-Ortega, M. G., et al. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).
  5. Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis. Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).
  6. Schägger, H. Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  7. Lasserre, J. P., et al. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).
  8. Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes. EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).
  9. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  10. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles. Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).
  11. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  12. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  13. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  14. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  15. Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation. FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).
  16. Carrillo-Garmendia, A., et al. Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).
  17. Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis. Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).
  18. Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).
  19. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).
  20. Carrillo-Garmendia, A., et al. Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).
  21. Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).
  22. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).
  23. Katzmann, D. J., et al. Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).
  24. Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism. J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).
  25. Gueguen, N., et al. Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice. PloS One. 10 (12), e0144290(2015).
  26. Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).
  27. de Oliveira, M. R., et al. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).
  28. Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. Mol Cell Biochem. , (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ZuurstofconsumptieClark elektrodeoxidatieve fosforyleringelektronentransportketenATP syntheselineaire regressieoximeterkamerSaccharomyces cerevisiae

Gerelateerde artikelen