Methodenartikel

Geoptimaliseerde en vereenvoudigde techniek voor de productie en kweek van nauwkeurig gesneden leverschijfjes

DOI:

10.3791/67202

⸱

22 november 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, 3National Institute of Health Research Great Ormond Street Biomedical Research Centre

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een protocol voor de productie en kweek van Precision-cut Liver Slices (PCLS) voor de studie van muizenlevers. Het artikel richt zich op de belangrijkste aspecten van het protocol, dat alleen standaard laboratoriumapparatuur vereist met toegang tot een vibratoom en het overleven van PCLS minimaal 4 dagen mogelijk maakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een eenvoudig systeem voor het maken en kweken van precisiegesneden leverschijfjes (PCLS). PCLS bevat alle cellen in een intacte omgeving en lijkt daarom op een minimodel van het hele orgaan. Ze maken de studie van levende weefsels mogelijk terwijl ze hun complexe fenotypes repliceren. Dit protocol maakt de bereiding van plakjes van muizenlevers mogelijk met behulp van een vibratoom en standaard laboratoriumapparatuur. Protocollen voor het produceren en kweken van PCLS zijn niet gestandaardiseerd en kunnen behoorlijk drastisch variëren, afhankelijk van het weefsel van belang, het type vibratoom dat wordt gebruikt en de behoefte aan zuurstof. Deze kunnen moeilijk te reproduceren zijn in sommige laboratoria die alleen toegang hebben tot een basisvibratoom en gemeenschappelijke weefselkweekfaciliteiten. We hebben een protocol opgesteld dat zich richt op het belang van enkele belangrijke stappen binnen de gevarieerde protocollen die al beschikbaar zijn. Dit protocol benadrukt daarom het belang van de inbeddingsmethode, de snijrichting, een dynamisch versus een statisch systeem en de relevantie van een minimaal kweekvolume. Dit protocol kan op een eenvoudige manier worden opgesteld en gereproduceerd in de meeste laboratoria die toegang hebben tot een eenvoudige weefselsnijmachine. Samen genomen en volgens dit protocol kan PCLS minimaal 4 dagen in leven blijven. PCLS is een eenvoudig, economisch en reproduceerbaar model om pathofysiologische en therapeutische screening op organen zoals de lever te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precisiegesneden weefselplakjes (PCTS) zijn dunne stukjes orgaan. Ze maken het mogelijk om de architectuur van het orgaan te behouden, een mini-orgaan te repliceren, terwijl het 3-dimensionale aspect van naburige cellen en extracellulaire matrix behouden blijft. Het is een aantrekkelijk model vanwege de gemakkelijke toegang, kostenbesparende en minder arbeidsintensieve eigenschappen met behoud van de weefselarchitectuur.

PCTS vult een leemte tussen in vitro celonderzoek en in vivo dieronderzoek, waardoor de meeste nadelen van beide modellen worden overwonnen. PCTS is gegenereerd uit verschillende organen, zoals de lever1, darmen 2,3, dikke darm2, hersenen 4,5, long 6,7,8, nier 9,10, milt11,12, hart13,14 maar ook tumoren15,16. Ze kunnen ook afkomstig zijn van verschillende dieren, zoals muis1, rat17,18 maar ook varken19 en menselijk chirurgisch afval 15,20,21. Hoewel PCTS het gebruik van dieren vereist, wat ethische kwesties impliceert, kan het orgaan van één dier meerdere PCTS genereren, waardoor het aantal dieren wordt verminderd in overeenstemming met de NC3R-richtlijnen (Reduction, Replacement, Refinement)22 terwijl interindividuele variaties worden beperkt.

De ontwikkeling van verbeterde weefselsnijmachines, bijv. vibratomen23, heeft een overgang mogelijk gemaakt van handmatig gesneden plakjes die worden gekenmerkt door heterogene dikte en slecht overlevingspercentage naar reproduceerbare dunnere plakjes met een beter bewaarde structurele integriteit.

Protocollen voor de bereiding en kweek van PCTS en, meer specifiek, Precision-cut Liver Slices (PCLS) variëren echter aanzienlijk in de literatuur en zijn niet gestandaardiseerd, vooral voor essentiële parameters zoals snijapparatuur, gemiddelde inhoud en kweekomstandigheden. De protocollen kunnen ook aanzienlijk variëren, afhankelijk van het weefsel van herkomst. Sommige van de protocollen vereisen oxygenatie van de buffer of cultuur met een aantal gecompliceerde bioreactorsystemen24. Ze richten zich meestal individueel op verschillende technische aspecten of zijn ontworpen voor verschillende weefsels en kunnen vaak kostbaar en uitdagender zijn om op een kostenefficiënte manier in het gemiddelde laboratorium te reproduceren.

In dit protocol worden enkele belangrijke punten samengebracht, zoals de inbeddingsmethode, de snijrichting, het gebruik van transwells25, een dynamisch cultuursysteem26 en het belang van een minimaal cultuurvolume. Sommige van deze stappen zijn eerder onafhankelijk of in een andere context geoptimaliseerd, zoals fibrose27 of tumorrespons28. Dit protocol benadrukt ook het belang van inbedding met behulp van bepaalde soorten slicers en de oriëntatie van het snijden, die beide moeilijke parameters zijn om onder de knie te krijgen en vaak worden verwaarloosd in de literatuur. Deze eenvoudige methode genereert PCLS die minimaal 4 dagen in cultuur worden gehouden met een eenvoudige installatie en met behulp van standaard laboratoriumapparatuur met toegang tot een rudimentaire weefselsnijmachine.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wild-type CD57Bl/6J muizen werden gekocht bij Charles River Laboratories. Muizen hadden vrije toegang tot voedsel en water, gehuisvest in individueel geventileerde kooien met gecontroleerde temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden en met een lichtcyclus van 12 uur. Dieren van 3 weken oud werden geofferd en levers werden prompt geoogst zonder perfusie. Al het dierenwerk werd goedgekeurd na lokale ethische beoordeling door de University College London Animal Welfare and Ethical Review Board en uitgevoerd onder projectlicentie van het ministerie van Binnenlandse Zaken PP9223137 en in overeenstemming met de Home Office (Animals) Scientific Procedures Act (1986) en de ARRIVE-richtlijnen. Alles werd in het werk gesteld om de schade aan dieren te beperken in overeenstemming met de standaardpraktijk bij de Biological Services Unit van het University College London.

1. Instellen voor het experiment

  1. Voer de dag voor de oogst de volgende stappen uit.
    1. Bereid 1 L Krebs-Henseleit buffer (KREBS) voor door een injectieflacon Krebs-poeder op te lossen in 1 L steriel water. Laat het afkoelen tot 4 °C en bewaar het op nat ijs.
    2. Desinfecteer de tray met 70% ethanol en spoel af met steriel PBS. Bewaar de in aluminiumfolie gewikkelde bakplaat een nacht in de koelkast om een koude omgeving te behouden tijdens het snijden.
    3. Spuit alle andere verwijderbare onderdelen in met ethanol, spoel ze af met steriel PBS, laat ze drogen en houd ze steriel. Autoclaveer de messen en houd ze steriel tot gebruik.
    4. Bereid 4% w/v laagsmeltende agarose in steriel water. Eenmaal geresuspendeerd en gesmolten, bewaar de agarose in de koelkast bij 4 °C.
  2. Voer op de dag van de oogst en vóór de oogst van de lever de volgende stappen uit.
    1. Smelt de 4% laagsmeltende agarose en bewaar het tot gebruik in een waterbad op 37 °C. Zorg ervoor dat de agarose is afgekoeld tot 37 °C en dat alle bubbels zijn verdwenen voor gebruik.
    2. Bereid de kweekplaten voor door respectievelijk 2,6 ml, 1,5 ml en 0,7 ml per putje toe te voegen aan platen met 6, 12 en 24 putjes. Voeg 8 μm poreuze inzetstukken toe aan elk putje. Plaats de platen in een bevochtigde broedmachine die is ingesteld op 37 °C, 5% CO2 en 21% O2 niveau. Dit zal helpen de pH aan te passen tijdens het opwarmen van de media, zodat ze klaar zijn voor teelt.
    3. Kweek de plakjes met poreuze inzetstukken van 8 μm om toegang te krijgen tot beide zijden van de schijf. Bereid de media als volgt voor: Voeg aan het William's Medium E (WME), 2 mM L-glutamine supplement, 10% Foetaal Bovine Serum (FBS), 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, 10 μg/ml Gentamycine, 25 mM D-Glucose oplossing en 15 mM HEPES oplossing toe.

2. Verzameling van lever en preparaat (15 min)

  1. Steriliseer alle instrumenten voor de oogst.
  2. Verdoof de muis volgens de lokale procedures voor de verzorging van dieren voor wetenschappelijke doeleinden met behulp van een isofluraanmasker. Voordat u de buikholte opent, knijpt u tussen de tenen om ervoor te zorgen dat het dier goed wordt verdoofd. Als de lever snel kan worden verwijderd, kan de muis worden geëuthanaseerd door CO2 -verstikking of cervicale dislocatie. Aangezien de procedure een terminale procedure is, mag u geen oogzalf gebruiken, omdat dit geen invloed heeft op het dier.
  3. Spuit de buik in met 70% ethanol. Optioneel: Scheer de muis om besmetting met haren te voorkomen.
  4. Open de buikholte met een steriele tang en schaar door de huid en het buikvlies vanuit het midden van de buik af te snijden. Ontleed de lever voorzichtig van andere organen of bloedvaten en vermijd beschadiging van de lobben.
  5. Bewaar de hele lever direct in ijskoude Krebs Buffer. Voer alle verdere stappen op het ijs uit bij 4 °C en ga zo snel mogelijk over tot de leverbereiding om verdere celdood te voorkomen.

3. Inbedding van de leverlobben (25 minuten voor elke leverkwab)

  1. Breng de lever over in een petrischaaltje op ijs met ijskoude Krebs-buffer en zorg ervoor dat de hele lever volledig ondergedompeld is.
  2. Scheid elke lob afzonderlijk met een stompe tang en een scherp, steriel mes om beschadiging van de lobben te voorkomen.
  3. Kies de eerste lob om te snijden en bewaar de resterende lobben in een ijskoude Krebs-buffer totdat ze klaar zijn om in te bedden en te snijden.
  4. Snijd alle randen af om een beter hanteerbare lob met rechte randen te krijgen die klaar is om in te bedden. Dit zal ook helpen om een deel van de vezelige Glisson-capsule te verwijderen om het doorsnijden verder te vergemakkelijken. Doe dit terwijl u de leveroppervlakken nat houdt in een ijskoude Krebs-buffer.
  5. Plaats een petrischaaltje van 3 cm (of iets dergelijks) op nat ijs en giet de 4% laagsmeltende agarose (al in een waterbad van 37 °C) erin. Blijf goed op ijs om de agarose in opwaartse richting af te laten koelen, terwijl wordt voorkomen dat de lob naar de bodem zakt en gelijkmatig wordt ingebed.
  6. Laat de agarose 30 s verder afkoelen en plaats de bijgesneden lob erin. De lob zal zich in het midden van het agaroseblok nestelen. Het inbeddingsproces vereist oefening en optimalisatie om aan elke laboratoriumconditie en persoonlijke ervaring te voldoen.
  7. Zet de ingebedde lob, nog op ijs, 5 minuten in de koelkast. De agarose moet dan duidelijk gestold zijn.
  8. Knip de buitenkant van het agaroseblok af. Maak het agaroseblok los van de schaal.
  9. Snijd de agarose in een beter hanteerbare maat en zorg ervoor dat de bovenzijde en de kant die aan het vibratoomplatform is vastgelijmd, evenwijdig zijn aan de bovenrand van de lob.
  10. Begin zo snel mogelijk met het snijproces, maar zorg ervoor dat het agaroseblok in een ijskoude Krebs-buffer en op ijs wordt bewaard.

4. Productie van leverschijfjes (40 min per lob)

  1. Stel de vibratoom voor het snijden in op een dikte van 250 μm, met een snelheid van 5 en een frequentie van 7 Hz. Dit zijn leidende parameters; Afhankelijk van het type vibratoom dat wordt gebruikt, kan dit nodig zijn voor optimalisatie.
  2. Spuit de vibratome en de bank in met 70% ethanol voordat u gaat snijden om de omgeving zo steriel mogelijk te houden.
  3. Plaats het dienblad op de vibratome en giet er ijs omheen. Plaats de messen op de vibratoom in een hoek van 10° naar beneden en onder horizontaal.
  4. Vul de vibratome tank met ijskoude Krebs buffer. Plaats een dunne laag cyanoacrylaatlijm op het platform.
  5. Droog de rand van het agaroseblok dat op het platform wordt gelijmd af met een steriel absorberend doekje.
  6. Plaats het agaroseblok op het verwijderbare platform. Plaats de lob rechtop zodat deze dwars kan worden doorgesneden. Hoewel de grootte van de plakjes wordt verkleind, vergemakkelijkt dit het snijproces drastisch door de druk op de lob tijdens het snijden te beperken.
  7. Wacht 1 minuut totdat de lijm is uitgehard en dompel het verwijderbare platform onder in de tank en zorg ervoor dat het agaroseblok volledig bedekt is met Krebs-buffer.
  8. Programmeer de vibratoom voor het snijden door de start- en stopposities in te stellen. Begin in eerste instantie met het snijden van dikkere plakjes totdat de leverkwab is bereikt.
  9. Gooi het eerste plakje weg, omdat het kan zijn dat het niet op de juiste dikte is gesneden. Om beschadiging van de plakjes te voorkomen, gebruikt u een spatel om de leverplakjes op te vangen in plaats van een tang of borstels.
    OPMERKING: Een kleine borstel die is gedesinfecteerd met 70% ethanol en gespoeld met steriele PBS kan ook worden gebruikt om het weefsel tijdens het snijproces voorzichtig te geleiden.
  10. Herhaal het proces totdat het vereiste aantal plakjes is bereikt. De lob kan af en toe loskomen van de agarose, waardoor verder gebruik wordt voorkomen. Verzamel de plakjes in ijskoude Krebs-buffer tot cultuur.

5. Incubatie van leverschijfjes

  1. Breng de plakjes met behulp van een spatel over in de voorbereide putjes met de media en inzetstukken.
  2. Plaats de platen op een orbitale schudder, stel het toerental in op 130 tpm en incubeer met een conventionele celcultuurincubator met 5% CO2 en 21% O2 bij 37 °C. Het uiteindelijke kweekvolume is 2,6 ml, 1,5 ml en 0,7 ml per putje in respectievelijk platen met 6, 12 en 24 putjes.
  3. Plaats een lege plaat onder de kweekplaat met de plakjes in cultuur om eventuele overtollige warmte afkomstig van het platform van de schudder af te voeren. Vervang het medium elke 48 uur.

6. Test op celoverleving

  1. Breng de plakjes over in een plaat met 48 putjes met 400 μl voorverwarmde complete Williams' Medium E-media en voeg 80 μl MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium) tetrazoliumreagens toe.
  2. Na incubatie gedurende 1 uur bij 37 °C 5 % CO2 op een schudder, brengt u 200 μl media over op een plaat met 96 putjes en meet u de extinctie bij 490 nm met behulp van een plaatlezer met meerdere putjes. Gebruik de plakjes die op de bank in PBS zijn achtergelaten en gedurende 24 uur bij kamertemperatuur zijn achtergelaten als negatieve controles.

7. Histologie kleuring

  1. Deparaffineer en rehydrateer de secties met xyleen en ethanol, gevolgd door gedeïoniseerd water. Kleur de secties gedurende 3 minuten met hematoxylineoplossing.
  2. Spoel 5 minuten af met gedeïoniseerd water. Dompel snel 10x in zure ethanol (1 ml geconcentreerd HCL en 400 ml 70% ethanol).
  3. Spoel 2x af in gedeïoniseerd water en dep overtollig water af. Dompel de secties 30 s in Eosin.
  4. Dehydrateer tot 95% ethanol en vervolgens 100% ethanol gedurende 5 minuten, 3x elk. Dompel de secties 3x in xyleen gedurende 15 minuten elk. Plaats dekglaasjes op dia's.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij de oogst wordt perfusie van het dier met opzet weggelaten om een snelle verwerking van het orgaan te garanderen en orgaanschade te voorkomen. De lever wordt snel na de incisie geëxtraheerd en onmiddellijk in een ijskoude orgaanbeschermende buffer geplaatst, bijv. Krebs-buffer 24,29. Hoewel het snijden van vers leverweefsel zonder inbedding eerder is beschreven1, zal inbedding van de lever in laagsmeltende agarose30 (Figuur 1) in combinatie met een orgaanbeschermende buffer optimale snijomstandigheden op de vibratoom mogelijk maken, waardoor weefselbeschadiging wordt verminderd en de reproduceerbaarheid in sectiedikte wordt verhoogd. De weefseldikte is van cruciaal belang, omdat dunne secties meer cellagen toegang geven tot voedingsstoffen en zuurstof31 en celdood verminderen. Te dunne secties worden echter moeilijk homogeen te snijden. Omgekeerd zullen plakjes die dikker zijn dan 400 μm een lagere penetratiegraad van voedingsstoffen vertonen. De secties werden geïncubeerd in een vloeistof-lucht-interface met behulp van een insert (figuur 1) en geïncubeerd met 5% CO2 en 21 % O2 bij 37 °C op een schudder. Secties moeten binnen 3 uur na de oogst in een kweekmedium worden geïncubeerd, waarna celdood snel optreedt32.

Om de levensvatbaarheid van PCLS te bepalen, werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld aan de hand van de 4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-test, waarvoor NAD(P)H-afhankelijke dehydrogenasen, d.w.z. metabolisch actieve cellen, nodig zijn om MTS te verminderen. MTS-waarden zijn genormaliseerd naar het respectieve schijfgewicht. Om de levensvatbaarheid van PCLS te optimaliseren, was een minimaal volume kweekmedium essentieel om de levensvatbaarheid na 24 uur incubatie te behouden. Een volume van 0,7 ml in platen met 24 putjes vertoonde een significante vermindering van de levensvatbaarheid door TMS-assay (p = 0,02) vergeleken met 1,5 ml in platen met 12 putjes en 2,6 ml in platen met 6 putjes (Figuur 2A). Deze volumes zijn gekozen om de secties enigszins te bedekken, maar ze moeten mogelijk worden aangepast afhankelijk van het type inzetstukken en platen dat wordt gebruikt. Net alsandere 33 worden platen met 12 putjes gebruikt als het beste compromis voor optimale overleving binnen een kleiner volume kweekmedium.

Schudden is essentieel en verhoogt de levensvatbaarheid van PCLS met 50% 24 uur na de incubatie in vergelijking met een statische cultuur (Figuur 2B). Schudden creëert een kritische lucht-vloeistofinterface, geoptimaliseerd met het gebruik van transwells, waardoor toegang tot voedingsstoffen en zuurstof naar beide zijden van de sectie mogelijk is. De opname van zuurstof en voedingsstoffen wordt ook verhoogd door de constante stroom die wordt gecreëerd door de schudbeweging, die ook door het transwellmembraan gaat.

De MTS-test werd beoordeeld vanaf 1 uur incubatie tot dag 6 van de incubatie. De levensvatbaarheid van de cellen bleef constant van dag 0 tot dag 4 na de incubatie voordat een significante afname (p = 0,05) op dag 6 werd waargenomen (Figuur 2C). De PCLS-morfologie beoordeeld door hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring vertoonde geen verandering van de galwegen en architectuur tot 5 dagen na de incubatie (Figuur 3A-D). Vergeleken met dag 0 (Figuur 3A) vertoonde PCLS geen histologisch verschil op dag 1 (Figuur 3B) en dag 2 (Figuur 3C) na incubatie, met nucleaire hyperchromasie, mild inflammatoir infiltraat, vacuolisatie ten gunste van een matig celdoodproces op dag 5 na incubatie (Figuur 3D). Alles bij elkaar zorgt dit PCLS-kweekprotocol voor levensvatbaarheid gedurende ten minste 4 dagen, in overeenstemming met studies met plakjes in vergelijkbare omstandigheden31.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische samenvatting van het protocol voor het genereren van PCLS. Dit cijfer is gewijzigd van34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Geoptimaliseerd protocol van PCLS-cultuur toont bevredigende levensvatbaarheid gedurende 5 dagen. (A) Effect van putgrootte op celproliferatie (n=3). (B) Effect van schudden op celproliferatie (n=6 per aandoening). (C) MTS-celproliferatietest van leversecties van d0 tot d6 dagen incubatie (n=5 per tijdstip). OD willekeurige eenheid, genormaliseerd om vers gewicht te snijden. Grafiek toont het gemiddelde ± SD. Ongepaarde 2-zijdige Student's t-toets, ns=niet significant, *p<0.05, **p<0.01. Dit cijfer is gewijzigd van34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Histologie resultaten. (A-D) Representatieve beelden van de histologie van lever-PCLS na H&E-kleuring. Schaal balk = 100 μM. Dit cijfer is gewijzigd van34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We tonen aan dat het produceren en kweken van PCLS gemakkelijk kan worden bereikt met een halfwaardetijd van minimaal 4 dagen. Dit protocol vat vijf cruciale stappen samen: de inbeddingsmethode als dit type vibratoom wordt gebruikt, de oriëntatie van het snijden, een dynamisch kweeksysteem, een minimaal kweekvolume en het gebruik van inserts.

Protocollen voor de productie en teelt van PCLS zijn algemeen beschikbaar. Ze missen echter wel standaardisatie; Ze kunnen zich richten op vergelijkbare en specifieke punten van het protocol, maar kunnen moeilijk te repliceren zijn op een eenvoudige manier of in de meeste laboratoria die toegang hebben tot een basisvibratoom. De soorten vibratomen of weefselsnijders zijn breed. Ze zullen variëren in kosten en technische specificiteiten, zoals het al dan niet hebben van een geïntegreerd koelsysteem, maar hun gemeenschappelijke kenmerk is hun snijsysteem met behulp van een oscillerend scheermesje. Het belangrijkste verschil met betrekking tot het snijden van tissues is de vereiste voor inbedding. Om voor de hand liggende redenen en de impact van inbedding op de levensvatbaarheid, moet het idealiter worden vermeden. Een voorbeeld van een referentieslicer die niet hoeft te worden ingebed, is de Krumdieck slicer35. Met dit type slicer kan het weefsel in een gekoelde buffer worden gesneden terwijl een kern wordt gebruikt, waardoor plakjes van gelijke grootte worden geproduceerd en inbedding wordt vermeden. Dergelijke apparaten zijn echter meestal duurder dan meer basale vibratomen en worden minder vaak gebruikt of beschikbaar in de meeste laboratoria. Vibratomen zoals die in dit protocol worden gebruikt, zijn meestal al beschikbaar voor het snijden van chemisch gefixeerde weefsels, maar vereisen inbedding van de leverlobben. Sommigen hebben aangetoond dat het snijden van leverschijfjes kan worden bereikt zonder inbedding en het gebruik van een vergelijkbare vibratoom1; Onze ervaring is echter dat dit moeilijk te reproduceren is gebleken. Ook veroorzaakt het snijden van de lever zonder een 3D-ondersteunende agarosegel tijdens het gebruik van dit type vibratoom beschadigde plakjes en een ongelijkmatige dikte en verhoogt daarom de celdood. Dit protocol omvat het dwars doorsnijden van de leverkwab in plaats van sagittally. De snijstap is een moeilijke techniek om onder de knie te krijgen, en voor zover wij weten, is de snijrichting een belangrijk detail waar nooit op wordt gefocust. De oriëntatie van de lob tijdens het snijden kan het snijproces drastisch vergemakkelijken en tegelijkertijd de druk op de lever verminderen. Het gebruik van hydrogel kan ook worden beschouwd als een verbeterd voordeel36.

Het volgende belangrijke criterium is de noodzaak van grotere hoeveelheden cultuur om de levensvatbaarheid te vergroten. Er zijn al grotere hoeveelheden voorgesteld om meer voedingsstoffen te leveren en meer giftige galzuurproducten te verdunnen37. Het toevoegen van een dynamisch systeem met schudden en in combinatie met het gebruik van Transwells verbetert de toegang tot voedingsstoffen en mogelijk zuurstof naar beide zijden van de sectie door een constante stroom te creëren 18,38,39. Het gebruik van transwell en het voordeel van een dynamisch systeem zijn al bewezen in verschillende contexten, zoals menselijke tumorleverschijfresponsen28 en voor de modellering van fibrose 26,27. Dit protocol bevestigt hun voordeel in een breder fysiologisch aspect.

Williams' Medium E wordt vaak gekozen als standaard celkweekmedium voor PCLS40,41. Gesupplementeerde media met glucose en serum zijn beschreven met potentieel voordeel bij het behoud van de levensvatbaarheid en functionaliteit van plakjes42. De glucoseconcentratie in media varieert gewoonlijk tussen 4 nM en 36 nM43,44, maar er is geen consensus gevonden over het effect van een hogere glucoseconcentratie op de levensvatbaarheid of de oxidatieve respons. Er wordt beweerd dat de toevoeging van insuline of dexamethason35 de levensvatbaarheid op lange termijn verbetert, maar er is geen consensus bereikt omdat de toevoeging van dergelijke supplementen mogelijk secundaire insulineresistentie zou kunnen veroorzaken met een stroomafwaarts effect op de levensvatbaarheid45 .

Eerdere gegevens tonen aan dat secties die dunner zijn dan 200 μm moeilijk homogeen te snijden zijn en oxidatieve stress kunnen vertonen, terwijl plakjes dikker dan 400 μm een lage penetratiegraad van voedingsstoffen vertonen 18,19,46. Op basis van het uiterlijk van PCLS, effecten op de textuur en het snijgemak heeft ook de voorkeur aan een dikte van 250 μm. De penetratie van de voedingsstoffen of het therapeutische middel in de binnenste cellagen van de PCLS wordt ook sterk verbeterd met behulp van transwells als onderdeel van het dynamische systeem 18,32. In tegenstelling tot het gebruik van de Krumdieck-snijmachine, die het voordeel heeft dat plakjes van gelijke grootte worden geproduceerd door de integratie van een kernsnijsysteem, kan het protocol worden aangepast door de plakjes na het snijden in gelijke afmetingen te wijzigen. In het experiment moet echter rekening worden gehouden met de variabiliteit in grootte, gewicht of eiwitgehalte en de impact ervan op de kweekomgeving en dus op de levensvatbaarheid en biomarkers. Om deze reden worden de MTA-assaymetingen, terwijl dit protocol wordt gebruikt, genormaliseerd naar het verse gewicht van elke plak. Ook kan heterogeniciteit van de dikte worden waargenomen, maar helaas wordt dit waarschijnlijk waargenomen met behulp van alle soorten slicers. De gebruiker zou kunnen overwegen om de minst homogene segmenten weg te gooien door hun aspect te beoordelen, maar dit wordt nog steeds als een onbetrouwbare optie beschouwd en blijft een nadeel van PCTS. De belangrijkste beperking van dit model blijft de relatieve levensvatbaarheid op korte termijn, maar het valt binnen het reeds gepubliceerde tijdsbestek 24,31. De beschikbaarheid van zuurstof kan worden verbeterd om deze levensvatbaarheid te vergroten. Sommige eerder gepubliceerde protocollen vereisten complexe kweekmedia en een zuurstofconcentratie van meer dan 80%, waardoor het metabolisme werd gereguleerd en de levensvatbaarheid werd verlengd 1,24,35,38. Het is ook moeilijk om de zuurstofniveaus die worden gebruikt om PCLS van zuurstof te voorzien rechtstreeks te vergelijken met de zuurstofniveaus die worden gebruikt om cellijnen te kweken. Gegevens over de effecten van zuurstof op de PCLS-fysiologie zijn zeer beperkt18,47, en een hogere zuurstofconcentratie zal waarschijnlijk de pathofysiologie en het fenotype aanzienlijk wijzigen door toxische reactieve zuurstofsoorten te genereren48.

Kortom, PCLS met een korte levensduur kan met beperkte apparatuur worden geproduceerd en gebruikt als een betrouwbaar ex vivo-model . Weefselarchitectuur is cruciaal in de leverfysiologie, en PCLS, waardoor het behouden kan blijven, is een ander voorbeeld van waarom dit model op een meer gangbare manier moet worden beschouwd. Nauwkeurig gesneden plakjes zouden daarom een meer erkend hulpmiddel moeten worden in wetenschappelijk onderzoek.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is geen concurrerend belang dat openbaar moet worden gemaakt.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Mirabela Bandol, Samantha Richards, Louise Fisher, Rebecca Towns en het personeel van UCL Biological Services voor hun hulp bij het fokken en onderhouden van de dierenkolonies. Dit werk werd ondersteund door financiering van de United Kingdom Medical Research Council Clinician Scientist Fellowship MR/T008024/1 (JB) en het NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre (JB). De geuite meningen zijn die van de auteur(s) en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS of het NIHR.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3 cm petrischaalAlleelke geschikte voor celcultuur
6, 12, 24 wel cultuurplaatAlleelke geschikte voor celcultuur
Cyanoacrylaat superlijmAlle
D-GlucoseGibcoA24940
EosineMerckHT110316
EthanolAlle
Foetaal bovien serumThermoFisher26400044
Gentamycin Gibco15750060
HematoxylineMerck51275
HEPESGibcoH0887
inserts 8um, voor 12 wel platenStrastedt83.3931.800
inserts 8um, voor 24 wel platenStrastedt83.3932.800
inserts 8um, voor 6 wel platenStrastedt83.3930.800
KREBSMerckK3753
Laminare stroomkapHepa luchtfiltratie
Laag smeltende agarose ThermoFisher16520050
MTS tetrazoliumbosreagens Abcamab197010
multi-well plate reader Alle
PBS tabletsThermoFisherP4417
Penicilline/StreptomycineGibco15140-122
ScalpelbladAlle
Chirurgische forcepsAllemet een platte vierkante punt 
Chirurgische schaarAlle
VibratomeLeicaVT1000 S
William’s Medium E met GlutaMAX (WME)ThermoFisherW4125

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearen, M. A., et al. Murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology. J Vis Exp. (157), e60992(2020).
  2. De Kanter, R., et al. Prediction of whole-body metabolic clearance of drugs through the combined use of slices from rat liver, lung, kidney, small intestine and colon. Xenobiotica. 34 (3), 229-241 (2004).
  3. van de Kerkhof, E. G., de Graaf, I. A., Ungell, A. L., Groothuis, G. M. Induction of metabolism and transport in human intestine: validation of precision-cut slices as a tool to study induction of drug metabolism in human intestine in vitro. Drug Metab Dispos. 36 (3), 604-613 (2008).
  4. Nogueira, G. O., Garcez, P. P., Bardy, C., Cunningham, M. O., Sebollela, A. Modeling the human brain with ex vivo slices and in vitro organoids for translational neuroscience. Front Neurosci. 16, 838594(2022).
  5. Ucar, B., Stefanova, N., Humpel, C. Spreading of aggregated alpha-Synuclein in sagittal organotypic mouse brain slices. Biomolecules. 12 (2), 163(2022).
  6. Liu, G., et al. Precision cut lung slices: an ex vivo model for assessing the impact of immunomodulatory therapeutics on lung immune responses. Arch Toxicol. 95 (8), 2871-2877 (2021).
  7. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. J Vis Exp. (171), e62392(2021).
  8. Viana, F., O'Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Mol Microbiol. 117 (3), 578-588 (2022).
  9. De Kanter, R., et al. Drug-metabolizing activity of human and rat liver, lung, kidney and intestine slices. Xenobiotica. 32 (5), 349-362 (2002).
  10. Stribos, E. G. D., Seelen, M. A., van Goor, H., Olinga, P., Mutsaers, H. A. M. Murine precision-cut kidney slices as an ex vivo model to evaluate the role of transforming growth factor-beta1 signaling in the onset of renal fibrosis. Front Physiol. 8, 1026(2017).
  11. James, K., Skibinski, G., Hoffman, P. A comparison of the performance in vitro of precision cut tissue slices and suspensions of human spleen with special reference to immunoglobulin and cytokine production. Hum Antibodies Hybridomas. 7 (4), 138-150 (1996).
  12. Tatibana, M., Kita, K., Asai, T. Stimulation by 6-azauridine of carbamoyl phosphate synthesis for pyrimidine biosynthesis in mouse spleen slices. Eur J Biochem. 128 (2-3), 625-629 (1982).
  13. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 390-398 (2011).
  14. Liu, Z., et al. Comparative analysis of adeno-associated virus serotypes for gene transfer in organotypic heart slices. J Transl Med. 18 (1), 437(2020).
  15. Zimmermann, M., et al. Human precision-cut liver tumor slices as a tumor patient-individual predictive test system for oncolytic measles vaccine viruses. Int J Oncol. 34 (5), 1247-1256 (2009).
  16. Philouze, P., et al. CD44, gamma-H2AX, and p-ATM expressions in short-term ex vivo culture of tumour slices predict the treatment response in patients with oral squamous cell carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (2), 877(2022).
  17. Tigges, J., et al. Optimization of long-term cold storage of rat precision-cut lung slices with a tissue preservation solution. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (6), L1023-L1035 (2021).
  18. Olinga, P., et al. Comparison of five incubation systems for rat liver slices using functional and viability parameters. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 59-69 (1997).
  19. Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circ Res. 125 (6), 628-642 (2019).
  20. Martin, C. Human lung slices: New uses for an old model. Am J Respir Cell Mol Biol. 65 (5), 471-472 (2021).
  21. Sewald, K., Danov, O. Infection of human precision-cut lung slices with the Influenza virus. Methods Mol Biol. 2506, 119-134 (2022).
  22. , Accessed 08/02/2023 https://www.nc3rs.org.uk (2023).
  23. Iulianella, A. Cutting thick sections using a vibratome. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (6), (2017).
  24. Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
  25. Kenerson, H. L., Sullivan, K. M., Labadie, K. P., Pillarisetty, V. G., Yeung, R. S. Protocol for tissue slice cultures from human solid tumors to study therapeutic response. STAR Protoc. 2 (2), 100574(2021).
  26. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  27. Dewyse, L., et al. Improved precision-cut liver slice cultures for testing drug-induced liver fibrosis. Front Med (Lausanne). 9, 862185(2022).
  28. Jagatia, R., et al. Patient-derived precision cut tissue slices from primary liver cancer as a potential platform for preclinical drug testing. EBioMedicine. 97, 104826(2023).
  29. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Commun Signal. 12, 73(2014).
  30. Brugger, M., et al. High precision-cut liver slice model to study cell-autonomous antiviral defense of hepatocytes within their microenvironment. JHEP Rep. 4 (5), 100465(2022).
  31. Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. Int J Mol Sci. 22 (13), 7137(2021).
  32. Lerche-Langrand, C., Toutain, H. J. Precision-cut liver slices: characteristics and use for in vitro pharmaco-toxicology. Toxicology. 153 (1-3), 221-253 (2000).
  33. van de Kerkhof, E. G., de Graaf, I. A., de Jager, M. H., Meijer, D. K., Groothuis, G. M. Characterization of rat small intestinal and colon precision-cut slices as an in vitro system for drug metabolism and induction studies. Drug Metab Dispos. 33 (11), 1613-1620 (2005).
  34. Perocheau, D., et al. Ex vivo precision-cut liver slices model disease phenotype and monitor therapeutic response for liver monogenic diseases. F1000Res. 12, 1580(2023).
  35. de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nat Protoc. 5 (9), 1540-1551 (2010).
  36. Bailey, K. E., et al. Embedding of precision-cut lung slices in engineered hydrogel biomaterials supports extended ex vivo culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 62 (1), 14-22 (2020).
  37. Graaf, I. A., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3 (6), 879-898 (2007).
  38. Leeman, W. R., van de Gevel, I. A., Rutten, A. A. Cytotoxicity of retinoic acid, menadione and aflatoxin B(1) in rat liver slices using Netwell inserts as a new culture system. Toxicol In Vitro. 9 (3), 291-298 (1995).
  39. Schumacher, K., et al. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
  40. Jetten, M. J., et al. Interindividual variation in response to xenobiotic exposure established in precision-cut human liver slices. Toxicology. 323, 61-69 (2014).
  41. Duryee, M. J., et al. Precision-cut liver slices from diet-induced obese rats exposed to ethanol are susceptible to oxidative stress and increased fatty acid synthesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (3), G208-G217 (2014).
  42. Starokozhko, V., et al. Maintenance of drug metabolism and transport functions in human precision-cut liver slices during prolonged incubation for 5 days. Arch Toxicol. 91 (5), 2079-2092 (2017).
  43. Vickers, A. E., et al. Organ slice viability extended for pathway characterization: an in vitro model to investigate fibrosis. Toxicol Sci. 82 (2), 534-544 (2004).
  44. Boess, F., et al. Gene expression in two hepatic cell lines, cultured primary hepatocytes, and liver slices compared to the in vivo liver gene expression in rats: possible implications for toxicogenomics use of in vitro systems. Toxicol Sci. 73 (2), 386-402 (2003).
  45. Zhang, W. Y., et al. Amelioration of insulin resistance by scopoletin in high-glucose-induced, insulin-resistant HepG2 cells. Horm Metab Res. 42 (13), 930-935 (2010).
  46. Smith, J. T., et al. Effect of slice thickness on liver lesion detection and characterisation by multidetector CT. J Med Imaging Radiat Oncol. 54 (3), 188-193 (2010).
  47. Drobner, C., Glockner, R., Muller, D. Optimal oxygen tension conditions for viability and functioning of precision-cut liver slices. Exp Toxicol Pathol. 52 (4), 335-338 (2000).
  48. Hart, N. A., et al. Oxygenation during hypothermic rat liver preservation: an in vitro slice study to demonstrate beneficial or toxic oxygenation effects. Liver Transpl. 11 (11), 1403-1411 (2005).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leverkoutjeskweekvibratoomsnijdenweefselinbeddingmuizenlevertmodelorgantypische coupesdynamisch kweeksysteemagarose inbeddingKrebs Henseleit bufferorbitale schudmachine

Gerelateerde artikelen