Methodenartikel

Karakterisering van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht in melkzuurbacteriën met een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers

DOI:

10.3791/67204

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University, 2PhD Program in Systems, Synthetic, and Physical Biology, Rice University, 3Department of Bioengineering, Rice University, 4Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Rice University, 5Rice Synthetic Biology Institute, Rice University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht (EET) in melkzuurbacteriën met behulp van een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers. We illustreren deze methode met Lactiplantibacillus plantarum en de redoxmediator 1,4-dihydroxy-2-naftoïnezuur en geven een grondige beschrijving van de elektrochemische technieken die worden gebruikt om gemedieerde EET te evalueren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel bacteriën voeren extracellulaire elektronenoverdracht (EET) uit, waarbij elektronen worden overgebracht van de cel naar een extracellulaire terminale elektronenacceptor. Deze elektronenacceptor kan een elektrode zijn en elektronen kunnen indirect worden afgeleverd via een redox-actief mediatormolecuul. Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van gemedieerde EET in Lactiplantibacillus plantarum, een probiotische melkzuurbacterie die veel wordt gebruikt in de voedingsindustrie, met behulp van een bio-elektrochemisch systeem. We beschrijven hoe een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers kan worden samengesteld en geven richtlijnen voor het karakteriseren van EET in aanwezigheid van een oplosbare mediator met behulp van chronoamperometrie en cyclische voltammetrietechnieken. We gebruiken representatieve gegevens van 1,4-dihydroxy-2-naftoïnezuur (DHNA)-gemedieerde EET-experimenten met L. plantarum om gegevensanalyse en -interpretatie aan te tonen. De technieken die in dit protocol worden beschreven, kunnen nieuwe mogelijkheden bieden voor elektrofermentatie en bio-elektrokatalyse. Recente toepassingen van deze elektrochemische techniek met L. plantarum toonden een versnelling van de metabolische flux aan in de richting van het produceren van fermentatie-eindproducten, die cruciale smaakcomponenten zijn bij voedselfermentatie. Als zodanig heeft dit systeem het potentieel om verder te worden ontwikkeld om smaken in de voedselproductie te veranderen of waardevolle chemicaliën te produceren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bio-elektrochemische systemen koppelen microben aan elektroden, waardoor onderzoek naar extracellulaire elektronenoverdrachtsmechanismen (EET) mogelijk is en hernieuwbare benaderingen voor bio-elektrokatalyse worden geboden 1,2,3. Microben die van nature EET uitvoeren, staan bekend als exo-elektrogenen, die elektronen afkomstig van het metabolisme overbrengen naar extracellulaire terminale elektronenacceptoren, bijv. ijzer(hydr)oxiden en elektroden1. Voor het eerst gekarakteriseerd in Geobacter en Shewanella soorten 4,5, zijn EET-routes sindsdien geïdentificeerd in veel bacteriën. Deze exo-elektrogenen spelen een centrale rol in verschillende microbiële elektrochemische technologieën, zoals het opwekken van elektrische energie uit afvalstromen, het fixeren van CO2 en het produceren van waardevolle chemicaliën via elektrosynthese 1,6,7,8,9,10,11,12.

Een van die exo-elektrogenen is Lactiplantibacillus plantarum, een grampositieve melkzuurbacterie13. L. plantarum is een nomadische, probiotische bacterie die in een breed scala van omgevingen voorkomt, waaronder de ingewanden van mensen en andere gewervelde dieren, evenals vele soorten voedsel zoals vlees, granen, groenten en gefermenteerd voedsel en dranken 14,15,16,17. Het genoom codeert voor een flexibel, heterofermentatief metabolisme, waardoor succesvolle aanpassing in deze verschillende omgevingen mogelijk is. Het is goed bestudeerd, wordt veel gebruikt in de voedings- en gezondheidsindustrie en wordt algemeen erkend als veilig door de Food and Drug Administration18,19. Als zodanig heeft L. plantarum het potentieel om te dienen als een nuttig platform voor op EET gebaseerde technologieën.

Recent onderzoek in L. plantarum heeft een operon met meerdere genen geïdentificeerd dat codeert voor een complexe EET-route die oorspronkelijk werd gekarakteriseerd in Listeria monocytogenes13,20. In L. plantarum vergemakkelijken de eiwitten die uit dit operon worden gesynthetiseerd EET in een bio-elektrochemisch systeem (BES) wanneer het chinon-1,4-dihydroxy-2-naftoïnezuur (DHNA) als elektronenbemiddelaar wordt toegediend13. Het eerste essentiële eiwit in deze route is een membraangebonden NADH-chinonoxidoreductase (Ndh2), dat NADH oxideert en DHNA vermindert. DHNA levert elektronen rechtstreeks aan een elektrode of indirect via het accessoire-eiwit PplA (Figuur 1)13,21,22. Recent onderzoek geeft aan dat L. plantarum ook andere chinonen kan gebruiken die structureel vergelijkbaar zijn met DHNA als elektronenmediatoren; L. plantarum is echter niet in staat om DHNA of deze alternatieve chinonen te produceren, dus mediatoren moeten exogeen aanwezig zijn in de omgeving om EET te laten optreden 13,22,23.

figure-introduction-1
Figuur 1: Elektronenstroming in Lactiplantibacillus plantarum EET. Ndh2 geeft elektronen door van NADH naar het chinon DHNA. Elektronen worden naar de elektrode getransporteerd om stroom te produceren, hetzij direct door gereduceerd chinon, hetzij indirect door het accessoire-eiwit PplA. Afkortingen: FAD = Flavin adenine dinucleotide; FMN = Flavin mononucleotide; EET = extracellulaire elektronenoverdracht; NADH = verlaagd nicotinamide adenine dinucleotide; Ndh2 = NADH-chinonoxidoreductase; DHNA = 1,4-dihydroxy-2-naftolzuur; PplA = fosfolipase A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In dit artikel bieden we een uitgebreid protocol voor het gebruik van een op BES gebaseerde methode om DHNA-gemedieerde EET in L. plantarum te karakteriseren. Een systeem met drie elektroden en twee kamers beperkt bacteriën tot de werkelektrode, waardoor een nauwkeurige regeling van de potentiaal die op de bacteriën wordt toegepast, mogelijk is en overspraak tussen de werk- en tegenelektrode wordt voorkomen. We presenteren een uitgebreid protocol van 5 dagen, dat betrekking heeft op de voorbereiding vóór het experiment, de assemblage van BES, EET-analyse met behulp van chronoamperometrie (CA) en cyclische voltammetrie (CV), en monsteranalyse na het experiment. Dit protocol kan worden toegepast om de mechanismen van EET-routes te ontrafelen en om systemen voor elektrofermentatie en elektrokatalyse te bouwen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: BES-assemblages met twee kamers worden in het volgende protocol "reactoren" genoemd.

1. Voorbereiding van de media

  1. Bereid L. plantarum kweekmedia.
    1. Bereid commerciële MRS-media (de Man Rogosa Sharpe) voor volgens de instructies en mMRS-media24 zoals beschreven in tabel 1. Stel de pH van mMRS in op 6,5. Filtreer beide media door ze door een filter van 0,22 μm te leiden en bewaar beide bij 4 °C tot gebruik.
    2. Bereid een chemisch gedefinieerd medium voor met mannitol (mCDM)13,25 zoals beschreven in tabel 2 en stel de pH in op 6,5. Bereid voldoende medium voor om de anodische kamer van elke reactor te vullen met 110 ml medium. Filter-steriliseer mCDM door een filter van 0,22 μm.
      OPMERKING: mCDM moet vers worden bereid op de dag van het beoogde gebruik. De componentoplossingen kunnen van tevoren worden voorbereid. Filter-steriliseer alle componentoplossingen door een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C. Bij het bereiden van Wolfe's vitamines, pas de pH aan op 11 voordat u ze steriliseert en bewaar ze in het donker of gewikkeld in folie. Pas bij het bereiden van Wolfe's mineralen de pH aan naar 8 na toevoeging van nitrilotriazijnzuur (NTA). Voeg vervolgens de resterende componenten toe, steriliseer en bewaar in het donker of gewikkeld in folie.
  2. Bereid 1x PBS en autoclaaf voor om te steriliseren. Bewaren bij 4 °C voor gebruik in dit protocol.
  3. Bereid commerciële M9-media voor volgens de instructies (tabel 3) en autoclaaf om te steriliseren. Bereid voldoende media voor om de kathodische kamer van elke reactor met 110 ml te vullen. Bewaren bij kamertemperatuur.

2. Dag 1: Montage BES-reactor en eersteteelt van L. plantarum  

OPMERKING: Referentiefiguur 2 voor een schema van een BES-reactor en een diagram met details over de in het protocol aangegeven montagestukken.

figure-protocol-1
Figuur 2: BES-componenten en schema voor assemblage. (A) Een schema van een BES-reactor met twee kamers. Bacteriën (groen) in de anodische kamer brengen elektronen over naar een werkende elektrode (zwarte cirkel) in aanwezigheid van een chinonmediator. Elektronen stromen door het circuit naar de kathodische kamer, waardoor stroommetingen tussen de anode en de kathode door een potentiostaat kunnen worden uitgevoerd. (B) Een afbeelding van een volledig geassembleerde BES-reactor, inclusief N2-inlaat - en uitlaatnaalden in de anodische kamer. (C) Een afbeelding van alle onderdelen van een gedemonteerde reactor. Afkorting: BES = bio-elektrochemisch systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Reactoren monteren en steriliseren.
    1. Bereid de werk- en tegenelektroden voor. Schuur voorgesneden titaniumdraden met een diameter van 1,0 mm voor de werk- en tegenelektroden met aluminiumoxide schuurpapier tot ze gelijkmatig glanzend zijn. Buig met een tang het ene uiteinde van elke werkende elektrodedraad in een kleine haak. Schuif een ronde van 16 cm2 koolstofvilt op elke werkende elektrodedraad, weef de draad één keer in en uit de koolstofviltronde en trek de ronde langs de draad naar beneden totdat deze op de haak vastzit. Bevestig de werk- en tegenelektroden in GL45-doppen door het rubberen septum met de draad te doorboren en het een paar centimeter door te trekken.
    2. Om gepaarde reactoren in elkaar te zetten, zet u eerst de O-ring in elkaar en plaatst u een voorgesneden kationenuitwisselingsmembraan dat is voorgeweekt in water in de geassembleerde O-ring. Plaats de O-ring met het membraan tussen de grote bodemopeningen van twee gekoppelde reactorflessen. Zet de reactorpaarflessen en de O-ring met het membraan met een knokkelklem vast aan de vingervastheid. Laat een magnetische roerstaaf in elke anodische kamer vallen en sluit vervolgens alle kleine openingen aan de bovenkant van elke fles met GL14-doppen voorzien van rubberen septa.
      NOTITIE: Draai de knokkelklemmen of doppen niet te vast aan, omdat dit kan leiden tot scheuren of breuken in de flessen.
    3. Vul elke reactorfles met 110 ml gedeïoniseerd (DI) water en sluit vervolgens elke fles af met de juiste GL45-dop met elektrode. Plaats doppen die zijn voorzien van een ronde werkelektrode van koolstofvilt door de bovenkant van de vilten ronde voorzichtig naar beneden te drukken zodat de ronde op de haak blijft.
      OPMERKING: Vers koolstofvilt is hydrofoob en stoot water af in de reactor bij de eerste montage. Autoclaveren zorgt ervoor dat de gevoelde koolstof op de juiste manier hydrofiel wordt om mee te experimenteren.
    4. Verzamel GL14 elektrodekapjes voorzien van siliconen afdichtringen.
    5. Maak voorzichtig alle GL45-doppen los voordat u gaat autoclaveren. Autoclaaf met water gevulde reactoren en elektrodedoppen om te steriliseren. Laat de reactoren na het autoclaveren afkoelen tot kamertemperatuur.
  2. Cultuur L. plantarum NCIMB8826. Schraap onder steriele omstandigheden wat bacteriën van de bovenkant van een glycerolvoorraad en inoculeer deze in 3 ml commerciële MRS-media. Kweek de cultuur 's nachts bij 37 °C zonder te schudden.
    OPMERKING: L. plantarum gebruikt geen zuurstof als terminale elektronenacceptor; Daarom is het niet nodig om de media van zuurstof te voorzien door te schudden26. De kweekomstandigheden zullen echter variëren als andere microben worden gebruikt.

3. Dag 2: Voorbereiding van de referentie-elektroden, voorbereiding van de reactoren voor de start van het experiment en subcultuur van L. plantarum

  1. Bereid Ag/AgCl-referentie-elektroden voor.
    OPMERKING: Deze stappen beschrijven de voorbereiding van de Ag/AgCl-referentie-elektroden die worden aangegeven in de materiaaltabel. Gebruikers dienen de instructies van de fabrikant te volgen als ze een andere referentie-elektrode gebruiken.
    1. Demonteer de Ag/AgCl-referentie-elektroden en schuur de draden. Trek de elektrode voorzichtig uit de glazen behuizing en tik op de glazen behuizing om de oude KCl-oplossing te legen. Schuur de elektrodedraden voorzichtig met aluminiumoxide schuurpapier tot ze gelijkmatig glanzend zijn om geoxideerd materiaal te verwijderen.
    2. Verzamel alle geschuurde referentie-elektrodedraden in een klein bekerglas met een kleine roerstaaf en vul het bekerglas met 100% bleekmiddel totdat de draden volledig ondergedompeld zijn. Chloride de draden door de draden 30 minuten op een roerplatform te laten bleken totdat de elektroden donkerder grijs worden. Spoel de elektrodedraden na het bleken grondig af met DI-water.
    3. Om een referentie-elektrode weer in elkaar te zetten, gebruikt u een spuit om de glazen behuizing volledig te vullen met 3 M KCl-oplossing verzadigd met zilverchloride en tikt u zachtjes op de zijkant om eventuele luchtbellen los te maken. Gebruik dezelfde spuit om de dop van de elektrodedraad te vullen met KCl-oplossing en steek de draad vervolgens in de behuizing. Plaats de onderkant van de glazen behuizing tegen een papieren handdoek op het werkblad, plaats de elektrode in de glazen behuizing en druk vervolgens stevig op de dop om de elektrode te sluiten. Bewaar de referentie-elektroden in een bekerglas dat ondiep gevuld is met KCl-oplossing tot u ze nodig hebt en herhaal met alle resterende referentie-elektroden.
    4. Gebruik een digitale multimeter om de spanning van zelfgemaakte Ag/AgCl-referentie-elektroden te meten.
      1. Dompel de uiteinden van de Ag/AgCl-referentie-elektroden (geschat op 197 mV versus de standaard waterstofelektrode, SHE) ondiep onder in een bekerglas gevuld met 3 M KCl. Sluit de multimeter stevig aan op een in de handel gekochte verzadigde calomelelektrode (SCE, 241 mV versus SHE) die ook is ondergedompeld in dezelfde KCl-elektrolyten.
      2. Meet het potentiaalverschil tussen elke referentie-elektrode en de SCE. Controleer of de referentie-elektroden 44 ± 10 mV van de SCE verschillen. Demonteer en monteer alle referentie-elektroden die buiten dit bereik vallen.
    5. Dicht de naad waar de dop de glazen behuizing raakt af met parafilm.
  2. Bereid de reactoren voor op experimenten.
    1. Vervang in een steriele bioveiligheidskast het geautoclaveerde water in de reactoren door de juiste media. Giet het geautoclaveerde water eruit. Vul de kathodische kamers met 110 ml geautoclateerd M9-medium. Vul de anodische kamers met 110 ml vers bereide mCDM.
    2. Installeer de referentie-elektroden. Verwijder een GL14-dop uit elke anodische kamer en vervang deze door een geautoclaveerde elektrodedop (GL14-dop met een siliconen afdichtring). Spuit de referentie-elektroden in met 70% ethanol om ze te steriliseren en plaats vervolgens één referentie-elektrode door de elektrodekap in elke anodische kamer.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de referentie-elektrode niet direct contact maakt met de koolstofviltronde.
    3. Voordat u de reactoren uit de bioveiligheidskast haalt, moet u alle doppen en klemmen handvast draaien om lekken te voorkomen.
    4. Sluit de reactoren aan op het waterpompsysteem. Plaats elke reactor op het juiste roerstaafplatform. Sluit de watermantelkranen van elke reactor aan op de volgende met rubberen slangen en sluit de eindreactoren aan op de in- en uitstroombuizen van de waterpomp.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat alle verbindingen goed vastzitten zonder lekken en gebruik indien nodig kabelbinders om de slangen vast te zetten.
    5. Vul de pomp met water en voeg 4-6 druppels waterconditioner toe. Zet het pompsysteem aan en stel de temperatuur in op 30 °C. Start de pomp en observeer de waterstroom door alle watermantels van de reactor, waarbij u ervoor zorgt dat er geen lekken zijn bij aansluitingen.
    6. Zet de roerplateaus aan en zet ze op continu roeren op 220 RPM.
    7. Sluit de reactoren aan op de stikstofspoelende gasleidingen. Bevestig een luchtfilter aan een naald van 4 inch, 22 G en steek de naald door het bovenste septum van een anodische reactorkamer in de media om als stikstofinlaat te dienen. Steek nog een naald van 1 inch, 18 G in het bovenste septum van de anodische kamer om als stikstofuitlaat te dienen. Sluit gasleidingen van een stikstofbron aan op het luchtfilter en open de klep zodat het gas voorzichtig door de reactor kan borrelen. Zorg ervoor dat stikstof tijdens het experiment continu door alle anodische kamers borrelt om de anaërobe omstandigheden te behouden.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de inlaatnaald uit de buurt van de ronde koolstofvilt is geplaatst. De bellenstroom mag geen contact maken met de koolstofvilt of referentie-elektroden.
    8. Bevestig de bioreactoren aan de potentiostaatkabels. Sluit de krokodillenklem van de werk-, teller- en referentie-elektrode van de potentiostaat aan op de bijbehorende elektroden.
      NOTITIE: Gebruik een multimeter om de weerstand tussen de draad-/stroomcollector en de elektroden te controleren om correcte elektrische verbindingen te garanderen en mogelijke meetfouten te minimaliseren.
  3. Input potentiostaat parameters voor prerun.
    OPMERKING: Kritieke techniekinstellingen worden hieronder gegeven. Zie Tabel 4 voor een uitgebreide lijst van software-instellingen voor elke techniek.
    1. Zet de potentiostaat aan en initialiseer de EC-lab software op de computer. Sluit de potentiostaat aan op de computer door op de knop van het potentiostaatsymbool in de linkerbovenhoek onder Apparaten te klikken. Eenmaal verbonden, verschijnt de naam van het apparaat met een groene cirkel in het onderstaande tekstvak.
    2. Synchroniseer alle kanalen die op de bioreactoren zijn aangesloten in één groep door op het tabblad Bewerken te klikken en vervolgens synchroniseren te selecteren. Klik op de juiste vakjes voor kanaalnummers | ok.
    3. Voeg de techniek open circuit voltage (OCV) toe aan de potentiostaat door op de knop + te klikken in het paneel Parameters Instellingen aan de linkerkant. In het blauwe instellingenvak; stel het in om de werkelektrodepotentiaal (EWE) te meten ten opzichte van de referentie-elektrode (RE), waarbij de tijd in interval dt elke 36 s wordt geregistreerd voor een totaal van 3 uur.
    4. Voeg vervolgens de techniek cyclische voltammetrie (CV) toe aan de potentiostaat. Stel de initiële potentiaal van de EWE in op Ei van 0 V versus RE met een scansnelheid van 2 mV/s. Sweep naar een vertexpotentiaal (E1) van 0,4 V versus RE, omkering naar vertexpotentiaal (E2) van -0,7 V versus RE. Herhaal de scan voor in totaal twee veegbewegingen.
      OPMERKING: In microbiële elektrochemische systemen induceren microbiële inoculatie en biofilmvorming hoge capaciteiten in vergelijking met metaalmaterialen of anorganische moleculen. Tijdens cyclisch voltammetrie-scannen varieert de potentiaal en fungeert een laadstroom als achtergrond. Om een hoge signaal-ruisverhouding te bereiken, zijn lagere scansnelheden nodig, hoewel dit de duur van de scan verlengt. Aangezien we twee cycli scannen die een breed elektrochemisch venster van 1,1 V bestrijken, resulteert een scansnelheid van 2 mV/s in een halve cyclus die maximaal 9,1 minuten duurt. Bijgevolg duren twee cycli in totaal 36,4 minuten. Het verder verlagen van de scansnelheid zou buitensporig tijdrovend zijn.
    5. Voeg de techniek chronoamperometrie (CA) toe. Pas een constante potentiaal EWE van 0,2 V versus RE toe voor een tijd van t = 200 uur, waarbij de tijd wordt geregistreerd in intervallen dt om de 25-40 s. Pas het tijdsinterval aan op basis van potentiostaat software om het gewenste detailniveau te verkrijgen.
      OPMERKING: Het middelpuntpotentiaal van DHNA is ongeveer -0,093 V vs. Ag/AgCl; dus een toegepaste potentiaal van 0,2 V versus RE op de werkende elektrode is voldoende om elektronenoverdracht van DHNA naar de elektrode mogelijk te maken.
    6. Nadat u alle parameters hebt ingevoerd, begint u de run door op de groene startdriehoek te drukken. Sla het bestand op zoals aangegeven door de software en klik vervolgens op Opslaan. De software begint met techniek 1, "OCV". Bekijk de OCV-sporen gedurende een paar minuten om ervoor te zorgen dat alle reactoren positief lezen en met een stabiel signaal sluiten. Laat het experiment een nacht draaien om OCV en initiële CV te voltooien (zie aanvullende figuur S1 voor de mediabesturings-CV) en laat CA uitvoeren totdat deze is gestabiliseerd.
  4. Onder steriele omstandigheden de MRS-cultuur van L. plantarum 1:200 in 50 ml mMRS subculturen. Kweek de cellen een nacht bij 37 °C zonder te schudden.
    OPMERKING: Een nachtelijke cultuur van 50 ml produceert doorgaans meer dan genoeg cellen voor zes reactoren, uitgaande van een uiteindelijke OD600 van 0,2 in de reactor. Pas de kweekvolumes dienovereenkomstig aan voor grotere of kleinere experimenten.

4. Dag 3: Injectie van cellen en DHNA/DMSO

  1. Was de cellen en injecteer ze in reactoren.
    1. Haal de mMRS L. plantarumcultuur 's ochtends uit de broedmachine. Breng de cultuur onder steriele omstandigheden over in een conische buis van 50 ml en plaats de cultuur op ijs.
    2. Was de cellen 2x in steriele, koude 1x PBS. Centrifugeer hiervoor de cultuur bij 4.000 × g gedurende 5 minuten in een centrifuge van 4 °C om de cellen te pelleteren. Onder steriele omstandigheden de cellen voorzichtig maar grondig opnieuw suspenderen in 50 ml PBS en vervolgens opnieuw centrifugeren zoals voorheen; Herhaal dit voor een tweede wasbeurt. Resuspendeer de cellen na de laatste centrifuge in koude PBS tot OD600 = 11.
    3. Laad onder steriele omstandigheden 2 ml geresuspendeerde cellen in een spuit van 3 ml die is uitgerust met een naald voor elke reactor.
    4. Verwijder in het reactorstation een celspuit en steek de naald in de bovenkant van de anodische kamer van een reactor. Druk de zuiger van de spuit op dit moment niet in; Herhaal dit voor alle reactoren. Zodra alle spuiten op hun plaats zitten, drukt u de zuigers in om de cellen in de reactoren te injecteren en registreert u het tijdstip van injectie op basis van het CA-spoor. Dit volume cellen produceert een uiteindelijke OD600 van 0,2 in de reactoren. Gooi alle spuiten weg in dozen voor biologisch gevaar en naalden in de daarvoor bestemde container voor biologisch gevaarlijk gevaar voor scherpe voorwerpen. Laat de stroom gedurende 2-4 uur stabiliseren op het CA-spoor.
      OPMERKING: Bij injectie kunnen stroomfluctuaties worden waargenomen op het CA-spoor. Na 2-4 uur zullen deze fluctuaties stabiliseren tot een vlakke stroom (<2 μA verandering in stroom in de loop van een uur), waarna DHNA kan worden geïnjecteerd.
  2. Meet de initiële pH en injecteer DHNA.
    1. Bereid een DHNA-oplossing voor. Bereid in een tube van 1,5 ml 500 μl van een DHNA-oplossing van 20 mg/ml door DHNA in poedervorm op te lossen in 100% DMSO. Vul 3 insulinespuiten met 110 μl DHNA-oplossing en 3 insulinespuiten met alleen 110 μl DMSO.
      OPMERKING: Hoewel DHNA mild oplosbaar is in water, is DMSO bij deze concentratie een beter oplosmiddel voor DHNA-voorraden. Het oplosmiddel van de bemiddelaar kan variëren als andere bemiddelaars worden gebruikt.
    2. Label in het BES-reactorstation de experimentele reactoren als + DHNA en de oplosmiddelcontrolereactoren als - DHNA. Ontkap een DHNA-spuit en steek de spuit in de bovenkant van elke anodische kamer die is aangeduid als + DHNA. Steek een spuit met alleen DMSO in elke anodische kamer die is aangeduid als - DHNA. Druk de zuigers van de spuit nu niet in.
    3. Neem monsters op een 0-uurs tijdstip voor monsteranalyse. Gebruik een spuit van 3 ml voorzien van een naald van 2 inch en 21 G, neem een mediamonster van 2 ml uit elke anodische kamer door het ongebruikte septum met kleine dop en breng de monsters over naar een plaat met 24 diepe putjes om pH-metingen uit te voeren voor het 0-uurstijdstip (DHNA-injectiepunt). Neem desgewenst 1 ml gebruikte media uit elke anodische kamer en filtreer door een filter van 0,2 μm in schoon geëtiketteerde buisjes voor het kwantificeren van metabolieten met behulp van HPLC of andere testen. Bewaar gebruikte mediamonsters bij -80 °C.
    4. Druk de zuigers van alle DHNA- en DMSO-spuiten in om in de reactoren te injecteren. Noteer het tijdstip van injectie aan de hand van het CA-spoor. Gooi alle spuiten en naalden op de juiste manier weg.
    5. Meet en registreer de 0 h pH-monsters voor elke reactor.

5. Dag 4: Voltooiing van het experiment en verzameling van monsters

  1. Voer 24 uur na DHNA-injectie een elektrochemische analyse uit en neem de definitieve monsters.
    1. Beëindig de CA-run 24 uur na DHNA-injectie.
    2. Neem 24-uurs tijdpuntmonsters voor monsteranalyse volgens stap 4.2.3.
    3. Voer CV opnieuw uit voor het 24-uurs tijdstip volgens de parameters beschreven in stap 3.3.4.
    4. Meet en registreer de pH voor de 24-uurs monsters van elke reactor.
  2. Demonteer en reinig de reactoren.
    1. Schakel de potentiostaat uit. Koppel vervolgens de werk-, teller- en referentiekabels los van elke reactor. Veeg eventueel vocht van de krokodillenklemmen van het potentiostaatlood.
    2. Schakel de stikstofgasstroom uit. Koppel de gasleidingen los en verwijder vervolgens de in- en uitstroomnaalden. Gooi alle naalden op de juiste manier weg in een naaldencontainer.
    3. Zet de waterpomp uit. Koppel de in- en uitstroomslang los van de pomp en laat het water in een emmer weglopen. Houd bij het loskoppelen de slanguiteinden boven de waterleiding in de pomp om te voorkomen dat het water op de vloer terechtkomt. Koppel elke reactor één voor één los van de slang van de watermantel en werk van de laatste uitstroomreactor naar de eerste instroomreactor.
    4. Leeg alle media van de reactoren in een grote container voor biologisch gevaar. Volg de normale kweekbleekmethoden voor verwijdering.
    5. Eenmaal geleegd, demonteert en reinigt u alle reactoronderdelen. Gooi kationenuitwisselingsmembranen en koolstofviltrondjes weg bij het juiste biologisch gevaarlijk afval. Reinig referentie-elektroden en titaniumdraden met 70% ethanol en bewaar de gereinigde referentie-elektroden in een bekerglas dat ondiep met water is gevuld. Reinig reactorflessen, doppen, O-ringen en klemmen voorzichtig in warm water met laboratoriumwasmiddel, spoel grondig af met DI-water en laat alle onderdelen aan de lucht drogen voordat u ze opbergt.

6. Dag 5: Elektrochemische analyse

OPMERKING: Hieronder vindt u een algemene beschrijving van het plotten van gegevens voor dit protocol. Meer gedetailleerde beschrijvingen met betrekking tot analyse en gegevensinterpretatie zullen worden gegeven in de sectie Representatieve resultaten.

  1. Voor CA-analyse: Stel de tijd van DHNA-injectie in op het tijdstip van 0 uur. Plot het gemiddelde en de standaarddeviatie van de gemeten stroomdichtheid (j in μA/cm2) die elke 36 s wordt genomen voor alle replicaten vanaf het 0 h-tijdstip als functie van de tijd (h). Bereken de stroomdichtheid als functie van het werkelektrodegebied (16 cm2).
  2. Voor CV-analyse: Plot een representatief CV-spoor voor elke experimentele conditie (alleen media, DMSO of DHNA) die de stroomdichtheid (j in μA/cm2) weergeeft als functie van de werkende elektrodepotentiaal (EWE in V). Plot cyclus twee van de geselecteerde CV-run.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronoamperometrie analyse
De EET van L. plantarum kan worden waargenomen aan de hand van de chronoamperometrie (CA)-gegevens die zijn weergegeven in figuur 3, waarin het stroomdichtheidsspoor de elektronenoverdracht van L. plantarum naar de werkelektrode visualiseert. We hebben de stroomdichtheid (j) versus de tijd gemonitord met behoud van een constant potentieel van +200 mV versus Ag/AgCl gedurende 24 uur. Bij het injecteren van 20 μg/ml DHNA in de roerende elektrolytoplossing werd een abiotische DHNA-oxidatiepiek waargenomen, gevolgd door een snelle toename van de biotische stroomdichtheid met een piek van 132,0 ± 2,47 μA/cm2 op ongeveer het 8-uurs tijdstip. Omgekeerd resulteerde de injectie van DMSO in een verwaarloosbare stroomdichtheid. Deze resultaten benadrukken het belang van DHNA als een noodzakelijke en efficiënte bemiddelaar om de elektronenoverdracht tussen L. plantarum en de elektrode te vergemakkelijken. Gebruikers kunnen de stroomuitgang aanpassen door de concentratie DHNA in de BES aan te passen. Eerder onderzoek geeft ook aan dat L. plantarum op een dosisafhankelijke manier reageert op DHNA over een breed scala van DHNA-concentraties, waarbij een significante stroom wordt geproduceerd in aanwezigheid van DHNA-concentraties zo laag als 0,01 μg/ml13,22.

figure-results-1
Figuur 3: Chronoamperometrie-analyse van Lactiplantibacillus plantarum EET gemedieerd door DHNA. DHNA (20 μg/ml) of DMSO werd geïnjecteerd in mCDM-elektrolyten (pH~ 6,5) met een injectietijd geïdentificeerd als t = 0. j geeft de stroomdichtheid weer als functie van het werkelektrodegebied. Er werden experimenten uitgevoerd bij 200 mV versus Ag/AgCl met een koolstofviltelektrode (16cm2) en roeren. De waarden worden uitgezet als gemiddelde ± sd verkregen in drievoud BES-reactoren. Afkortingen: EET = extracellulaire elektronenoverdracht; DHNA = 1,4-dihydroxy-2-naftolzuur; DMSO = dimethylsulfoxide; mCDM = Chemisch gedefinieerd medium met mannitol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cyclische voltammetrie analyse
Om DHNA-gemedieerde EET in L. plantarum verder te evalueren, voerden we cyclische voltammetrie uit 24 uur na DHNA-injectie. Hier tonen we CV-sporen voor drie aandoeningen: L. plantarum met 20 μg/ml DHNA, L. plantarum met DMSO en media met 20 μg/ml DHNA. Zoals te zien is in figuur 4A, resulteerde de aanwezigheid van 20 μg/ml DHNA in reactoren die L. plantarum bevatten in een duidelijke toename van de oxidatieve stroom bij 50 mV die niet optrad in de aanwezigheid van DMSO alleen. Deze gegevens bevestigen dat het toevoegen van de redoxmediator DHNA noodzakelijk is om de elektronenoverdracht tussen L. plantarum en de anode te vergemakkelijken. Hoewel we verschillende kleinere redoxpieken hebben waargenomen in het L. plantarum + DMSO-spoor, waren deze pieken vergelijkbaar met het mediacontrolespoor en worden ze waarschijnlijk toegeschreven aan redox-actieve componenten in mCDM (aanvullende figuur S1). In Figuur 4B vergeleken we sporen van DHNA onder biotische omstandigheden (L. plantarum + DHNA) versus DHNA onder abiotische omstandigheden (Media + DHNA). Hoewel beide sporen een duidelijke DHNA-oxidatieve piek vertoonden rond 50 mV, zagen we alleen onder biotische omstandigheden een aanhoudende toename van de stroom tot boven 50 mV. De katalytische piek bereikte een stroomdichtheid van 129 μA/cm2 bij 300 mV, wat neerkomt op een toename van 256% ten opzichte van het abiotische spoor. Dit turnover CV-profiel is kenmerkend voor microbieel EET27, wat wijst op herreductie van DHNA door L. plantarum-cellen in aanwezigheid van een elektronenbron (mannitol) na oxidatie van DHNA aan de anode. Bovendien vertoonde het abiotische spoor nieuwe oxidatieve pieken rond -240 mV en -180 mV. Eerder onderzoek wijst uit dat het verschijnen van deze pieken te wijten kan zijn aan de afbraak van DHNA in ACNQ (2-amino-3-carboxy-1,4-naftochinon)21,28. We hebben deze pieken in het biotische spoor niet waargenomen, wat aangeeft dat de interactie van L. plantarum-cellen met DHNA DHNA kan stabiliseren en afbraak kan voorkomen. Een punt om op te merken is dat de 24-uurs tracering voor media met 20 μg/ml DHNA afzonderlijk werd uitgevoerd volgens dit protocol zonder cellen toe te voegen.

figure-results-2
Figuur 4: Representatieve cyclische voltammetriesporen. Alle CV-experimenten werden uitgevoerd in mCDM met behulp van koolstofvilt (16cm2) als werkelektrode met een scansnelheid van 2 mV/s tijdens het roeren van de oplossing. (A) CV-sporen voor Lactiplantibacillus plantarum met DHNA (20 μg/ml) of DMSO bij t = 24 uur. (B) CV-sporen van 20 μg/ml DHNA in L. plantarum (biotische omstandigheden) of alleen mCDM (abiotische omstandigheden) bij t = 24 uur. Afkortingen: CV = cyclische voltammetrie; mCDM = Chemisch gedefinieerd medium met mannitol; DHNA = 1,4-dihydroxy-2-naftolzuur; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

pH-analyse
EET-activiteit in L. plantarum resulteerde in een opmerkelijke daling van de pH gedurende 24 uur. Zoals te zien is in figuur 5, daalde de gemiddelde pH van het monster van L. plantarum blootgesteld aan DHNA tot 3,33 ± 0,01 (p = 6,85 × 10-6, n = 3), terwijl de gemiddelde pH van het monster van L. plantarum blootgesteld aan DMSO daalde tot 6,50 ± 0,06 (p = 0,0409, n = 3). Zoals aangetoond in eerder onderzoek, wordt deze daling toegeschreven aan een toename van het fermentatieve metabolisme die optreedt wanneer L. plantarum EET13 uitvoert. L. plantarum metaboliseert normaal gesproken mannitol via glycolyse en fermentatieve routes, die acetaat, lactaat en ethanol produceren als eindfermentatieproducten en ATP genereren door fosforylering op substraatniveau29. Onder EET-omstandigheden neemt de metabolische flux door fermentatie toe, waardoor de productie van producten van de eindfermentatie in de BES-media toeneemt13. Deze metabolische verschuiving zorgt ervoor dat de pH van de media in de reactoren met DHNA sneller daalt in vergelijking met de DMSO-controlereactoren.

figure-results-3
Figuur 5: pH-analyse van het bio-elektrochemische systeem van Lactiplantibacillus plantarum . Monsters werden verzameld bij t = 0 en t = 24 uur tijdens chronoamperometrie. De waarden worden uitgezet als gemiddelde ± sd verkregen in drievoud BES-reactoren. De significantie werd bepaald door een eenzijdige t-toets. DHNA: P-waarde = 6,85 × 10-6. DMSO: P-waarde = 0,0409. Afkortingen: DHNA = 1,4-dihydroxy-2-naftoïnezuur; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Ingrediënten voor de bereiding van mMRS-media24. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Ingrediënten voor de bereiding van mCDM-media. Deze tabel is ontleend aan Tejedor-Sanz et al.13 en Aumiller et al.25. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Ingrediënten voor de bereiding van M9-media. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: EC-Lab parameterinstellingen voor OCV-, CA- en CV-technieken. Afkortingen: OCV = open circuit voltage; CA = chronoamperometrie; CV = cyclische voltammetrie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Representatieve cyclische voltammetriesporen van Lactiplantibacillus plantarum met alleen DMSO en mCDM. CV-sporen voor L. plantarum met DMSO op t = 24 uur en mCDM alleen op t = 0 uur. Alle CV-experimenten werden uitgevoerd met behulp van koolstofvilt (16cm2) als werkelektrode met een scansnelheid van 2 mV/s tijdens het roeren van de oplossing. Afkortingen: CV = cyclische voltammetrie; mCDM = Chemisch gedefinieerd medium met mannitol; DHNA = 1,4-dihydroxy-2-naftolzuur; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het bio-elektrochemische systeem met drie elektroden en twee kamers dat hier wordt beschreven, toonden we metingen van de stroomopwekking van DHNA-gemedieerde EET in L. plantarum. Deze BES-experimenten genereren gegevens van hoge kwaliteit; BES'en zijn echter gevoelig. Het succes van het protocol hangt dus af van de precisie van de gebruiker, met name bij de assemblage van reactor- en referentie-elektroden, de positionering van naalden en elektroden in de anodische kamer en de vervanging van het kationenuitwisselingsmembraan. Het is van cruciaal belang om reactoren zorgvuldig te monteren en ervoor te zorgen dat er geen water/media lekken tijdens het autoclaveren of experimenteren. Waterlekkage kan worden opgelost door ervoor te zorgen dat kationenuitwisselingsmembranen precies op de O-ring worden gesneden en door de knokkelklem handvast vast te draaien. Het is ook essentieel om de koolstofvilt tijdens het autoclaveren volledig onder te dompelen in water, zodat het hydrofiel wordt voor experimenten. We raden nieuwe gebruikers aan om nieuw geassembleerde reactoren gevuld met water 2 uur te laten staan voordat ze worden geautomatiseerd, en te controleren op tekenen van langzame lekken onder de hoofdflessenverbindingen. Bovendien garandeert het zorgen voor een goede referentie-elektrodeassemblage een consistente gegevensreplicatie tussen reactoren. Als de teflonfrit in de glazen behuizing verkleurt, barst of uitdroogt, kan dit een hoge weerstand van de referentie-elektrode veroorzaken. Gebruikers kunnen de glazen behuizing vervangen om de prestaties van de referentie-elektrode te herstellen.

Een goede oriëntatie van alle naalden en elektroden in de anodische kamer tijdens het experimenteren is van cruciaal belang voor het succes van het experiment. De referentie-elektrode mag niet rechtstreeks in contact komen met enig deel van de koolstofviltwerkelektrode. Gebruikers kunnen de positie van het koolstofvilt aanpassen door de titaniumdraad van de werkende elektrode voorzichtig van boven de reactor te draaien. Bovendien mag de plaatsing van de naald voor stikstofspoeling geen direct contact maken met elektroden in de kamer of met elektrode-/potentiostaatverbindingen boven de kamer. De stikstofstroom moet worden aangepast om niet in een van beide elektroden te stromen. Ten slotte moeten gebruikers ervoor zorgen dat de roerstaaf niet in contact komt met de werkelektrode door de werkelektrode 1-2 cm boven de roerstaaf te plaatsen. Als een onregelmatig signaal wordt waargenomen bij OCV, kan dit meestal worden opgelost door te zorgen voor de juiste plaatsing van de elektroden en de stikstofstroom in de reactor en door te controleren of de verbindingen tussen de potentiostaatdraden en de reactorelektroden correct en veilig zijn. Ten slotte leert onze ervaring dat elektronenmediatoren zoals DHNA in het kationenuitwisselingsmembraan kunnen worden vastgehouden en een hoge achtergrondstroom kunnen veroorzaken als ze te vaak worden hergebruikt. We raden aan om het kationenuitwisselingsmembraan na twee tot drie keer gebruik te vervangen, vooral bij het onderzoeken van gemedieerde EET, om betrouwbare experimentele resultaten te garanderen.

In tegenstelling tot directe EET, waarbij directe microbiële hechting aan de elektrode de elektronenoverdracht vergemakkelijkt, vereist gemedieerde EET een consistente diffusie van elektronenshuttles over het celmembraan en de elektrode, wat resulteert in de unieke BES-instellingen die hier worden beschreven. Eerst kozen we voor een tweekamer-BES boven de eenkamer-tegenhanger in ons protocol om anodische en kathodische reacties te scheiden met een kationenuitwisselingsmembraan. Deze scheiding voorkomt dat de vrij diffuse elektronenmediatoren (DHNA) en microben een kruisinteractie hebben met de kathode, waardoor microbiële EET de belangrijkste elektronenbron is om de elektronenmediatoren en de anode te verminderen. De scheiding maakt ook een nauwkeurige controle mogelijk over parameters zoals de concentratie/distributie van de bemiddelaar en het potentieel dat in evenwicht is met de anode. Daarnaast kozen we voor koolstofvilt als anodemateriaal naast andere opties zoals grafietstaven, metalen elektroden, glasachtige koolstof of indiumtinoxide (ITO). Dit komt omdat de 3D poreuze structuur van koolstofvilt een veel groter oppervlak biedt dan die elektroden30, waardoor een efficiënt gebruik van mediatoren mogelijk is, zelfs bij hoge concentraties. Onze BES-instellingen met drie elektroden en twee kamers zorgen voor een betrouwbare en reproduceerbare uitlezing van gemedieerde EET, zelfs bij langdurige monitoring; Dit proces is echter relatief weinig doorvoer. Dit protocol is geschikt voor het begrijpen van EET-mechanismen op bench-schaal of om prototypes van EET-toepassingen te testen. Alternatieve BES-architecturen zoals draagbare of geprinte BES's31,32, complementaire metaaloxide halfgeleider (CMOS) arrays33 of opgeschaalde BES's34 kunnen door onderzoekers worden overwogen voor verschillende fundamentele of toepassingsdoeleinden.

In dit protocol geven we gedetailleerde instructies voor de meest gebruikte elektrochemische technieken: chronoamperometrie (CA) en cyclische voltammetrie (CV). Het is vermeldenswaard dat andere elektrochemische technieken, zoals elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) en differentiële pulsvoltammetrie (DPV), diepere inzichten in de BES kunnen bieden door de weerstand tegen ladingsoverdracht en dubbellaagse capaciteit te analyseren 35,36,37. Hoewel dit BES-protocol EET-metingen mogelijk maakt, kan het aanvullen van elektrochemische gegevens met metingen van metabole activiteit en celbiomassa ook essentieel zijn voor een uitgebreide analyse. Microben zoals L. plantarum gebruiken EET als een van de elektronenputten naast andere fermentatiebijproducten zoals lactaat en ethanol. Bovendien is het opmerkelijk dat de groei van celbiomassa ook dient als een elektronenput13. Daarom bieden het kwantificeren van verbruikte elektronendonoren (bijv. mannitol), het beoordelen van de groei van celbiomassa en het monitoren van fermentatiebijproducten een dieper inzicht in de efficiëntie en fysiologische gevolgen van EET. Cellulaire metabolieten worden gewoonlijk gekwantificeerd met behulp van chromatografie en enzymatische testen, terwijl de levensvatbaarheid en groei van cellen worden beoordeeld door kolonievormende eenheden te tellen en de optische dichtheid van gebruikte media te meten bij respectievelijk 600 nm13. Het is ook belangrijk op te merken dat EET-metingen gevoelig zijn voor kleine verstoringen in experimentele omstandigheden. Dit omvat, maar is niet beperkt tot, pH, temperatuur, roersnelheid en spoelsnelheid van stikstofgas38. Daarom fungeert het normaliseren van gemeten EET-niveaus met bioanalytische metingen als een interne controle, waardoor een consistente beoordeling van experimenten die op verschillende dagen worden uitgevoerd, mogelijk wordt.

Door elektrochemische technieken te combineren met andere bioanalytische metingen, creëert gemedieerde EET nieuwe mogelijkheden voor elektrofermentatie en bio-elektrokatalyse. Conventioneel gebruik van organische, anorganische of enzymatische elektrokatalysatoren brengt uitdagingen met zich mee vanwege hun hoge kosten en zijn vatbaar voor degradatie. Als alternatief biedt het gebruik van microben als levende elektrokatalysatoren een goedkopere en meer schaalbare oplossing vanwege het zelfherstellende en zelfreplicatievermogen van microben39. L. plantarum, algemeen erkend als een veilige melkzuurbacterie, is een bijzonder intrigerend chassis. Met behulp van identieke elektrochemische opstellingen die in dit protocol worden beschreven, hebben we eerder aangetoond dat L. plantarum boerenkoolsap kan fermenteren onder EET-omstandigheden en de metabolische flux kan versnellen naar het produceren van meer fermentatie-eindproducten zoals lactaat, acetaat en succinaat13; Deze organische zuren zijn essentiële smaakstoffen bij de fermentatie van voedsel. Dit impliceert dat, door gebruik te maken van elektrochemische technieken, gemedieerde EET in L. plantarum mogelijk kan worden gekaapt om metabolische flux te manipuleren, voedselaroma's te veranderen of waardevolle chemicaliën te produceren. Het is vermeldenswaard dat de elektrochemische technieken die in dit protocol worden gepresenteerd, niet alleen kunnen worden toegepast op L. plantarum, maar ook generiek kunnen worden toegepast op andere inheemse of gemanipuleerde microben die gemedieerde EET uitvoeren40,41. Verschillende elektronenmediatoren, zoals flavin, ferroceen, neutraal rood, ferricyanide, lawson en menadione kunnen worden geselecteerd op basis van het elektronenoverdrachtsmechanisme van de specifieke microbe die wordt gebruikt22,42. Bovendien kan het BES-protocol dat in dit werk is vastgesteld, worden uitgebreid tot exo-elektrogenen die mediatorloze EET uitvoeren, zoals eerder is aangetoond met Shewanella- en Geobacter-soorten 43,44. Een geoptimaliseerd groeimedium moet worden gebruikt om de cellulaire activiteit van de specifieke microbe te ondersteunen om zijn EET-prestaties te vergemakkelijken. Dit protocol verfijnt de parameters voor DHNA-gemedieerde EET in L. plantarum, maar wijzigingen worden verwacht wanneer een andere microbe en elektronenmediatoren worden toegepast.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de leden van het Ajo-Franklin-lab voor inzichtelijke discussies over BES-assemblage, onderhoud, kritieke stappen en probleemoplossing. Het onderzoek werd gesponsord door het Army Research Office en werd uitgevoerd onder subsidienummer W911NF-22-1-0239 (aan C. M. A-F, ter ondersteuning van R. A.) en door het Cancer Prevention and Research Institute of Texas, grant # RR190063 (aan C. M. A-F, ter ondersteuning van R. C., S. L. en B. B. K.). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)Sigma-Aldrich281255-25G
1.0 mm diameter titanium wireThermo Fisher Scientific045485.BYOp maat gesneden voor werk- en tegenrelektoren
120-C Aluminum Oxide Sheets 9" x 11"Johnson Abrasives10108-15
3 mL plastic syringesThermo Fisher Scientific14955457
3M KCl solution saturated with silver chlorideMillipore Sigma60137-250ML
6.35-mm-thick carbon feltThermo Fisher Scientific043200.RFSnijden in 16 cm2 rondjes
Ag/AgCl reference electrodeCH InstrumentsCH111
Air-Tite Premium Hypodermic NeedlesThermo Fisher Scientific14-817-102
AlK(SO)4 * 12H2OSigma-Aldrich237086-100G
Ammonium citrate tribasicMillipore SigmaA1332
Avanti J-15R CentrifugeBeckman CoulterB99517
BD Precision Glide Needle, 18 G x 1 inchThermo Fisher Scientific14-826-5G
BD Precision Glide Needle, 21 G x 2 inchThermo Fisher Scientific14-821-13N
Bel-Art SP Scienceware Cleanware Aqua-Clear Water CondtionerThermo Fisher Scientific23-278339
BiotinMillipore SigmaB4639
CaCl2Millipore SigmaC4901
Calcium D-(+)-pantothenateMillipore Sigma1087009
Casamino acidsMillipore Sigma2240-OP
cation exchange membraneMembranes InternationalCMI-7000Snijden in rondjes passend bij de BES O-ring
CoCl2 * 6H2OMillipore SigmaC8661
CuSO4 * 5H2OMillipore SigmaC8027
Cysteine-HCl * H2OMillipore Sigma30129
DMSOMillipore Sigma5439001000
DS-11+ SpectrophotometerDenovixN/A
EC-Lab SoftwareBioLogicN/A
ECO E 4 S heating circulatorLauda-BrinkmannCat. No. 115 V; 60 Hz : L001191
FeSO4 * 7H2OMillipore Sigma215422
Folic acidMillipore SigmaF8758
H3BO3Millipore SigmaB6768
Insulin syringes with BD Micro-Fine IV NeedleThermo Fisher Scientific14-829-1A
Lactiplantibacillus plantarum NCIMB8826N/AN/AReferentie: Tejedor-Sanz et al., 2022
Lactobacillus MRS BrothHiMediaM369
M9 BrothMilliport Sigma63011
Magnesium sulfate anhydrousMillipore Sigma208094
Manganese sulfate monohydrateMillipore Sigma221287
mannitolMillipore SigmaM1902-1KG
Mettler Toledo FiveEasy Benchtop pH MeterHogentoglerF20-KIT
MgCl2 * 6H2OMillipore SigmaM9272
MgSO4 * 7H2OMillipore SigmaM2773
Millex - GV 0.22 µm PVDF Membrane Filter UnitMillipore SigmaSLGV004SL
MnCl2 * 4H2OMillipore Sigma203734
MnSO4 * H2OMillipore Sigma221287
MOPSMillipore SigmaM1442
N2 gasAirgasNI UHP300Filter voor gebruik
Na2MoO4 * 2H2OMillipore Sigma331058
Na2SO4Millipore Sigma238597
NaClMillipore SigmaS9888
NH4ClMillipore SigmaA9434
Nicotinic acidMillipore SigmaN-0761
Nitrilotriacetic acid (NTA)Millipore Sigma72560
p-Aminobenzoic acidMillipore SigmaP9879
Phosphate buffered saline, 10x solutionThermo Fisher ScientificBP399-1
Potassium phosphate dibasicMillipore SigmaP8281
potentiostatBioLogicVMP-300
Protease peptone #3Bacto211693
Pyridoxine HClMillipore SigmaP6280
RiboflavinMillipore Sigma555682
RO10 magnetic stir bar platformIKA3691000
Sodium acetate trihydrateMillipore Sigma935700
Stir bar, egg-shapedThermo Fisher Scientific14-512-121Plaatsen in anodekamer van BES
Thiamine HClMillipore SigmaV-014
Thioctic acid (α-Lipoic acid)Millipore SigmaT-1395

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. TerAvest, M. A., Ajo-Franklin, C. M. Transforming exoelectrogens for biotechnology using synthetic biology. Biotechnol Bioeng. 113 (4), 687-697 (2016).
  2. Chen, H., Dong, F., Minteer, S. D. The progress and outlook of bioelectrocatalysis for the production of chemicals, fuels and materials. Nat Catal. 3 (3), 225-244 (2020).
  3. Chen, H., et al. Fundamentals, applications, and future directions of bioelectrocatalysis. Chem Rev. 120 (23), 12903-12993 (2020).
  4. Lovley, D. R., Phillips, E. J. P. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Appl Environ Microbiol. 54 (6), 1472-1480 (1988).
  5. Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
  6. Koch, C., Harnisch, F. Is there a specific ecological niche for electroactive Microorganisms. ChemElectroChem. 3 (9), 1282-1295 (2016).
  7. Zhao, J., et al. Microbial extracellular electron transfer and strategies for engineering electroactive microorganisms. Biotechnol Adv. 53, 107682(2021).
  8. Zhang, J., Li, F., Liu, D., Liu, Q., Song, H. Engineering extracellular electron transfer pathways of electroactive microorganisms by synthetic biology for energy and chemicals production. Chem Soc Rev. 53 (3), 1375-1446 (2024).
  9. Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7 (5), 375-381 (2009).
  10. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals by using microbial electrochemical technologies. Science. 337 (6095), 686-690 (2012).
  11. Gu, L., Xiao, X., Yup Lee, S., Lai, B., Solem, C. Superior anodic electro-fermentation by enhancing capacity for extracellular electron transfer. Bioresour Technol. 389, 129813(2023).
  12. Boucher, D. G., et al. Bioelectrocatalytic synthesis: concepts and applications. Angew Chem Int Ed. 62 (46), e202307780(2023).
  13. Tejedor-Sanz, S., et al. Extracellular electron transfer increases fermentation in lactic acid bacteria via a hybrid metabolism. eLife. 11, e70684(2022).
  14. Martino, M. E., et al. Nomadic lifestyle of Lactobacillus plantarum revealed by comparative genomics of 54 strains isolated from different habitats. Environ Microbiol. 18 (12), 4974-4989 (2016).
  15. Fidanza, M., Panigrahi, P., Kollmann, T. R. Lactiplantibacillus plantarum-nomad and ideal probiotic. Front Microbiol. 12, 712236(2021).
  16. Duar, R. M., et al. Lifestyles in transition: evolution and natural history of the genus Lactobacillus. FEMS Microbiol Rev. 41 (Suppl_1), S27-S48 (2017).
  17. Kaushik, J. K., et al. Functional and probiotic attributes of an indigenous isolate of Lactobacillus plantarum. PLOS ONE. 4 (12), e8099(2009).
  18. Seddik, H. A., et al. Lactobacillus plantarum and its probiotic and food potentialities. Probiotics Antimicrob Proteins. 9 (2), 111-122 (2017).
  19. Siezen, R. J., et al. Phenotypic and genomic diversity of Lactobacillus plantarum strains isolated from various environmental niches. Environ Microbiol. 12 (3), 758-773 (2010).
  20. Light, S. H., et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature. 562 (7725), 140-144 (2018).
  21. Tolar, J. G., Li, S., Ajo-Franklin, C. M. The differing roles of flavins and quinones in extracellular electron transfer in Lactiplantibacillus plantarum. Appl Environ Microbiol. 89 (1), e0131322(2023).
  22. Li, S., De Groote Tavares, C., Tolar, J. G., Ajo-Franklin, C. M. Selective bioelectronic sensing of pharmacologically relevant quinones using extracellular electron transfer in Lactiplantibacillus plantarum. Biosens Bioelectron. 243, 115762(2024).
  23. Blackburn, B., Alba, R., Hatch, A., Ajo-Franklin, C. M., Mevers, E. Understanding the Chemical Properties that Drive Extracellular Electron Shuttles. ChemRxiv. , (2024).
  24. De Man, J. C., Rogosa, M., Sharpe, M. E. A medium for the cultivation of Lactobacilli. J Appl Bacteriol. 23 (1), 130-135 (1960).
  25. Aumiller, K., et al. A chemically-defined growth medium to support Lactobacillus-Acetobacter sp. community analysis. PLOS ONE. 18 (10), e0292585(2023).
  26. Brooijmans, R. J. W., de Vos, W. M., Hugenholtz, J. Lactobacillus plantarum WCFS1 electron transport chains. Appl Environ Microbiol. 75 (11), 3580-3585 (2009).
  27. LaBelle, E., Bond, D. R. Cyclic voltammetry for the study of microbial electron transfer at electrodes. Bio-electrochemical systems: from extracellular electron transfer to biotechnological application. , (2009).
  28. Mevers, E., et al. An elusive electron shuttle from a facultative anaerobe. eLife. 8, e48054(2019).
  29. Dirar, H., Collins, E. B. End-products, Fermentation balances and molar growth yields of homofermentative Lactobacilli. Microbiology. 73 (2), 233-238 (1972).
  30. Huong Le, T. X., Bechelany, M., Cretin, M. Carbon felt based-electrodes for energy and environmental applications: A review. Carbon. 122, 564-591 (2017).
  31. Zhou, A. Y., Baruch, M., Ajo-Franklin, C. M., Maharbiz, M. M. A portable bioelectronic sensing system (BESSY) for environmental deployment incorporating differential microbial sensing in miniaturized reactors. PLOS ONE. 12 (9), e0184994(2017).
  32. Benjamin, S. R., de Lima, F., Nascimento, V. A. do, de Andrade, G. M., Oriá, R. B. Advancement in paper-based electrochemical biosensing and emerging diagnostic methods. Biosensors. 13 (7), 689(2023).
  33. Kumashi, S. R., et al. A CMOS multi-modal electrochemical and impedance cellular sensing array for massively paralleled exoelectrogen screening. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. 15 (2), 221-234 (2021).
  34. Jadhav, D. A., et al. Scale-up of the bioelectrochemical system: Strategic perspectives and normalization of performance indices. Bioresour Technol. 363, 127935(2022).
  35. Kim, J., Cestellos-Blanco, S., Shen, Y., Cai, R., Yang, P. Enhancing biohybrid CO2 to multicarbon reduction via adapted whole-cell catalysts. Nano Lett. 22 (13), 5503-5509 (2022).
  36. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ Sci. 2 (2), 215-219 (2009).
  37. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  38. Zhang, X., Li, X., Zhao, X., Li, Y. Factors affecting the efficiency of a bioelectrochemical system: a review. RSC Adv. 9 (34), 19748-19761 (2019).
  39. Kornienko, N., Zhang, J. Z., Sakimoto, K. K., Yang, P., Reisner, E. Interfacing nature's catalytic machinery with synthetic materials for semi-artificial photosynthesis. Nat Nanotechnol. 13 (10), 890-899 (2018).
  40. Glasser, N. R., Saunders, S. H., Newman, D. K. The colorful world of extracellular electron shuttles. Annu Rev Microbiol. 71 (1), 731-751 (2017).
  41. Gemünde, A., Lai, B., Pause, L., Krömer, J., Holtmann, D. Redox mediators in microbial electrochemical systems. ChemElectroChem. 9 (13), e202200216(2022).
  42. Kundu, B. B., et al. Extracellular respiration is a latent energy metabolism in Escherichia coli. bioRxiv. , (2024).
  43. O'Brien, J. P., Malvankar, N. S. A simple and low-cost procedure for growing Geobacter sulfurreducens cell cultures and biofilms in bioelectrochemical systems. Curr Protoc Microbiol. 43 (1), A.4K.1-A.4K.27 (2016).
  44. Su, L., Fukushima, T., Ajo-Franklin, C. M. A hybrid cyt c maturation system enhances the bioelectrical performance of engineered Escherichia coli by improving the rate-limiting step. Biosens Bioelectron. 165, 112312(2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Three Electrode SystemMediated Electron TransferCyclic VoltammetryChronoamperometry TechniqueDHNA MediatorLactiplantibacillus PlantarumElectro Fermentation

Gerelateerde artikelen