Real-time visualisatie van DNA met één molecuul door CMG Helicase

Samenvatting

Dit protocol demonstreert het uitvoeren van een single-molecule assay voor live visualisatie van DNA-afwikkeling door CMG helicase. Het beschrijft (1) het prepareren van een DNA-substraat, (2) het zuiveren van fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG-helicase, (3) het voorbereiden van een microfluïdische flowcel voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, en (4) de single-molecule DNA-afwikkeltest.

Samenvatting

Betrouwbare genoomduplicatie is essentieel voor het behoud van de genetische stabiliteit van delende cellen. DNA-replicatie wordt tijdens de S-fase uitgevoerd door een dynamisch complex van eiwitten dat het replisoom wordt genoemd. De kern van het replisoom is de CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, die de twee strengen van de dubbele DNA-helix scheidt, zodat DNA-polymerasen elke streng kunnen kopiëren. Tijdens genoomduplicatie moeten replisomen een overvloed aan obstakels en uitdagingen overwinnen. Elk van deze bedreigt de stabiliteit van het genoom, omdat het niet volledig en nauwkeurig repliceren van DNA kan leiden tot mutaties, ziekten of celdood. Daarom is het van groot belang om te begrijpen hoe CMG functioneert in het replisoom tijdens zowel normale replicatie als replicatiestress. Hier beschrijven we een totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopietest met behulp van recombinant gezuiverde eiwitten, die real-time visualisatie van aan het oppervlak gebonden uitgerekte DNA-moleculen door individuele CMG-complexen mogelijk maakt. Deze test biedt een krachtig platform om CMG-gedrag op het niveau van één molecuul te onderzoeken, waardoor de helicase-dynamiek direct kan worden waargenomen met real-time controle over reactieomstandigheden.

Inleiding

DNA-replicatie is streng gereguleerd, omdat een cel zijn genoom nauwkeurig moet dupliceren om mutaties, ziekte of dood te voorkomen. Eukaryote DNA-replicatie wordt uitgevoerd door het replisoomcomplex, dat ouderlijk DNA afwikkelt en enkelstrengs DNA (ssDNA) gebruikt als een sjabloon om nieuw DNA te synthetiseren. In de G1-fase worden katalytisch inactieve dubbele hexameren van MCM2-7 geladen op dubbelstrengs DNA (dsDNA) bij replicatieoorsprong¹. In de S-fase worden MCM2-7-complexen geactiveerd door de binding van CDC45 en GINS² om 11-subeenheid CMG-complexen te vormen (CDC45, MCM2-7, GINS). Elke CMG initieert DNA-afwikkeling in tegengestelde richtingen en vormt de kerneenheid die het replisoom zich rond³ rangschikt.

Twee decennia geleden werd de CMG-helicase voor het eerst geïdentificeerd als een complex met 11 subeenheden, essentieel voor DNA-replicatie⁴. Sindsdien is ons begrip van CMG aanzienlijk geëvolueerd, van laden en activeren ^5,6 tot DNA-afwikkeling en -beëindiging⁷. Traditionele biochemische en structurele biologische technieken zijn van cruciaal belang geweest voor veel van deze ontdekkingen; deze methoden waren echter vaak beperkt in hun vermogen om de meer dynamische aspecten van CMG te bestuderen. Methoden met één molecuul maken gebruik van fysieke manipulatie van individuele biomoleculen om hun activiteit molecuul voor molecuul te meten of te visualiseren. Dit kan worden gebruikt om inzicht te geven in de real-time dynamiek van eiwitten die vaak worden gemist of niet detecteerbaar zijn met andere technieken ^8,9.

Hier beschrijven we een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopietest om de DNA-afwikkeling door CMG-helicase in realtime te visualiseren. Gezuiverd, fluorescerend gelabeld CMG wordt geladen op het vrije 3'-uiteinde van lang DNA dat een vooraf gemaakte DNA-vorkstructuur bevat. Lineair DNA wordt uitgerekt op een biotine-PEG-dekglaasje in een microfluïdische stroomcel door elk uiteinde van het DNA achtereenvolgens aan het oppervlak te binden. Deze aanpak zorgt voor een meer uniforme DNA-tethering, wat de variatie waarmee rekening moet worden gehouden tijdens de gegevensanalyse aanzienlijk vermindert. In aanwezigheid van ATP-γ-s wordt CMG op het enkelstrengs DNA aan het 3'-uiteinde van de vork geladen. ATP-γ-s is een langzaam hydrolyseerbare ATP-analoog, die CMG-binding aan DNA mogelijk maakt, maar niet afwikkelt. De daaropvolgende toevoeging van ATP, samen met gezuiverd, fluorescerend gelabeld RPA, activeert CMG en initieert uitgebreide DNA-afwikkeling. Visueel transloceert CMG langs het DNA, waardoor een groeiend stuk RPA-gebonden ssDNA achterblijft. Het ongebonden DNA-uiteinde reist mee met CMG en vormt een "strakke bal" als gevolg van verdichting veroorzaakt door RPA-binding. Dankzij het ontwerp van de flowcel kan de buffer op elk moment tijdens het afwikkelen worden uitgewisseld, waardoor u tijdens en over elk experiment een goede controle heeft.

Dit protocol is onderverdeeld in vier methoden, die onafhankelijk van elkaar kunnen worden uitgevoerd. Sectie 1 beschrijft de bereiding van een 20 kb lineair gevorkt DNA-substraat voor tests met één molecuul. Sectie 2 schetst de zuivering en fluorescerende etikettering van Drosophila melanogaster CMG (DmCMG). Belangrijke informatie over de expressie van DmCMG is opgenomen in de sectie toelichting. Deel 3 behandelt de bereiding van een microfluïdische flowcel die op een TIRF-microscoop kan worden gebruikt. In hoofdstuk 4 wordt beschreven hoe de DNA-afwikkeltest met één molecuul moet worden uitgevoerd.

Protocol

1. Bereiding van 20 kb lineair gevorkt DNA dat wordt gebruikt in tests met één molecuul (figuur 1)

Figuur 1: Grafische weergave van de voorbereiding van het DNA-substraat. (A) Het uiteinde van de gebiotinyleerde DNA-vork wordt gecreëerd door twee gedeeltelijk complementaire oligonucleotiden te gloeien: gebiotinyleerde en niet-gebiotinyleerde. (B) Het belangrijkste dsDNA-fragment (~20 kb) wordt gegenereerd door restrictie-digestie van pGC261-plasmide met twee enzymen om een lineair DNA te creëren met verschillende uitsteeksels aan elk uiteinde. (C) Het digoxigenine-duplex DNA-uiteinde wordt verkregen door een PCR-reactie die wordt uitgevoerd in aanwezigheid van digoxigenine-dUTP, gevolgd door restrictiedigestie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Generatie van gebiotinyleerd DNA-vorkuiteinde.
   1. Gloei het DNA van de vork uit.
      1. Meng twee oligonucleotiden (oHY502 en oHYbio85) in 1x STE-buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]). De uiteindelijke oligonucleotideconcentratie is 10 μM en het uiteindelijke reactievolume is 100 μL.
      2. Incubeer de reactie bij 80 °C gedurende 5 minuten op een warmteblok. Schakel het warmteblok uit en laat de reactie geleidelijk afkoelen, laat het in het warmteblok totdat de temperatuur onder de 30 °C daalt.
   2. Valideer de gloeiefficiëntie op een Tris-Borate-EDTA (TBE)-Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) gel.
      1. Bereid 8% acrylamide - TBE-gel voor (voor 4 gels: 32,8 ml H₂O; 4,8 ml 10x TBE-buffer (1 M Tris, 1 M boorzuur, 20 mM EDTA), 9,6 ml 40% acrylamide/bis-oplossing, 37,5:1; 0,8 ml 10% ammoniumpersulfaat [APS], 40 μl tetramethylethyleendiamine [TEMED]).
         LET OP: TBE, acrylamide, APS, TEMED zijn giftig/schadelijk.
      2. Laat een klein volume (1 μL) gegloeide oligonucleotiden naast de individuele oligonucleotiden verdund met 6x laadkleurstof op de 8% acrylamide - TBE-gel bij 80 V, gedurende 1 uur bij RT.
      3. Week de gel in 1x TBE aangevuld met een geschikte nucleïnezuurkleuring gedurende 30 minuten op een wipwip-schommelschudder en scan de gel vervolgens met behulp van een gelbeeldvormingssysteem.
   3. Los gegloeid DNA op TBE-PAGE-gel op voor gelexcisie.
      1. Als de oligonucleotiden goed zijn gegloeid, los dan de rest van het monster op in aanwezigheid van BSA (~100 μL gegloeid monster, 25 μL 6x laadkleurstof, 2 μL 33 mg/ml BSA). Om het grotere volume op de gel te laden, combineert u meerdere putjes met een steriel scalpel.
      2. Laat de gel in 1x TBE aangevuld met geschikte nucleïnezuurkleuring gedurende 30 minuten op een wipwip schommelshaker staan.
      3. Breng de gel over in een glazen bakje en visualiseer het DNA in een donkere kamer onder blauw licht. Gebruik een geschikt beschermend scherm of een veiligheidsbril bij het gebruik van blauw licht.
      4. Knip de gewenste band uit met een steriel scalpel. Snijd overtollige gel af.
   4. Zuiver de gegloeide vork door elektro-elutie.
      1. Knip een stuk dialyseslang lang genoeg af om het gelstuk in te brengen, maak het nat in 1x TBE en klem het ene uiteinde dicht.
      2. Verdun BSA tot 0,3 mg/ml in 500 μl 1x TBE en pipetteer het volledige volume in de slang.
      3. Gebruik de metalen spatel om het gelstuk naar binnen te schuiven. Verplaats het gelstuk naar één kant van de slang om bufferruimte te geven voor het DNA om in te migreren tijdens de elektro-elutie.
      4. Knijp de overtollige buffer eruit en knip het tweede uiteinde van de slang af.
         OPMERKING: Het resterende volume bepaalt het uiteindelijke volume en de concentratie.
      5. Plaats de dialyseslang in de agarose-elektroforesetank in 1x TBE-buffer en zorg ervoor dat de slang volledig is ondergedompeld.
         NOTITIE: Zorg ervoor dat het gelstuk aan de kant wordt geplaatst die zich het dichtst bij de negatieve elektrode bevindt, zodat DNA uit de gel in de dialysezak kan migreren.
      6. Laat de elektro-elutie 1-2 uur op 80 V draaien.
   5. Dialyse het geëlektroëluteerde DNA in 10 mM Tris-buffer (pH 8).
      1. Haal na elektro-elicentie de dialysezak uit de tank en droog het ene uiteinde af met een tissue. Vermijd het aanraken van het middelste deel van de slang met tissue, waar de gel en het monster zich bevinden.
      2. Verwijder de clip van het gedroogde uiteinde en spuit het monster voorzichtig op en neer in de slang om het DNA in de buffer te mengen.
      3. Dompel een schone spatel in 1x TBE-buffer en schep het gelstuk uit de slang.
         OPMERKING: Verwijder tijdens het verwijderen van het gelstuk zo min mogelijk buffer.
      4. Klem het open uiteinde van de dialysezak weer dicht en verwijder eventuele lucht van binnenuit.
      5. Plaats de dialysezak in een bekerglas van 2 l gevuld met 1,5 l 10 mM Tris-buffer (pH 8), 20 mM NaCl en 2 mM MgCl₂. Wikkel de clips in met parafilm om de slang aan de rand van het bekerglas te plakken terwijl u de slang volledig onderdompelt in de buffer.
         OPMERKING: Zout stabiliseert korte oligoduplexen.
      6. Gebruik een magnetische staaf om de buffer voorzichtig te roeren en dialyseer het monster bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 3-4 uur of bij 4 °C 's nachts.
      7. Droog na de dialyse het ene uiteinde van de dialysezak af met een tissue (niet om het DNA te verdunnen) en maak dit uiteinde los.
      8. Pipeteer het monster voorzichtig op en neer in de slang en breng het over in een schoon buisje van 1.5 ml.
      9. Meet de concentratie van het DNA met behulp van een microvolumespectrofotometer.
2. Genereren van een fragment van 20 kb
   1. Voer restrictievertering uit van pGC261-plasmide¹⁸ met behulp van NotI/I-CeuI-enzymen.
      1. Meng voorzichtig 8 μL NotI-HF (20.000 E/ml), 8 μL I-CeuI (5.000 E/ml) en het pGC261-plasmide (uiteindelijke plasmideconcentratie ~40 ng/μL in een reactie van 200 μL) in een buffer die wordt aanbevolen door producenten van restrictie-enzymen.
      2. Incubeer de reactie een nacht bij 37 °C.
   2. Los verteerd DNA op agarosegel op voor gelexcisie.
      1. OPTIONEEL: Laat eerst een kleine hoeveelheid van de reactie op een 0,6% agarosegel lopen om de spijsverteringsefficiëntie te testen voordat de hele reactie wordt geladen.
      2. Bereid 0,6% agarosegel volgens de stappen 1.2.2.3-1.2.2.4.
      3. Meng 0,48 g agarosepoeder met 80 ml 1x TBE-buffer. Zet de oplossing in de magnetron tot deze kookt. Draai om ervoor te zorgen dat de agarose volledig is gesmolten. Laat een paar minuten afkoelen en giet het dan in de daarvoor bestemde tank.
      4. Om putjes te combineren om het grotere volume van het monster op te vangen, plakt u vooraf een stuk tape over meerdere putjes van de kam.
      5. Zodra de gel is gestold, verwijdert u voorzichtig de kam en vult u de tank bij met 1x TBE-buffer. Meng het monster voorzichtig met DNA-ladende kleurstof en laat de gel gedurende 1 uur op 120 V draaien.
      6. Laat de gel in 1x TBE aangevuld met een geschikte nucleïnezuurvlek op een wipwip schommelschudster tot het gekleurd is.
      7. Breng de gekleurde gel over in een glazen schaal en visualiseer het DNA in een donkere kamer onder blauw licht.
      8. Knip de gewenste band uit met een steriel scalpel. Snijd overtollige gel af.
   3. Optioneel: Zuiver het gewenste fragment door elektro-elutie zoals beschreven in de stappen 1.1.4 en 1.1.5. Laat hier het zout uit de dialysebuffer weg, want dat is alleen nodig om de korte oligo duplex te stabiliseren.
3. Generatie van digoxigenine duplex DNA-einde
   1. Voer een PCR-reactie uit met digoxigenine-dUTP (dig-dUTP) met pGC261 DNA als sjabloon.
      1. Mengsel: 400 μL water, 8 μL pGC261 (0,8 ng/μL), 3,5 μL primer oHY507 (100 μM), 3,5 μL primer oHY508 (100 μM), 8 μL dig-dUTP (1 mM), 400 μL 2x PCR-mix (bereid uit DNA-polymerase (20 μL), 10 mM dNTP's (40 μL), 5x high-fidelity (HF) buffer (400 μL) en water (540 μL).
      2. Voer de volgende reactie uit in een thermische cycler:
         98 °C - 1 min
         30x: 98 °C - 20 s; 65 °C - 20 s; 72 °C - 30 s;
         72 °C - 10 min
         4 °C - Vasthouden
   2. Verbeter en zuiver digoxigenine-gelabeld PCR-product
      1. Zuiver het PCR-product met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringsset.
      2. Meng 10 μL NotI-HF (20.000 E/ml) met het PCR-product in een door de enzymleverancier aanbevolen buffer (uiteindelijke DNA-concentratie van ~50 ng/μl in een reactie van ~200 μl). Incubeer de reactie een nacht bij 37 °C.
      3. Zuiver het verteerde DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringsset.
4. Monteer componenten om het DNA-substraat te maken.
   1. Meng voorzichtig het gebiotinyleerde vorkuiteinde, het 20 kb DNA-fragment en het met digoxigenine gelabelde Not-I behandelde PCR-fragment met 5 μL T4-DNA-ligase (400.000 E/ml) in een door de enzymleverancier aanbevolen buffer in een reactie van 200 μL. Voeg echter, op basis van het toegevoegde DNA-fragment van 20 kb (1-5 μg), ongeveer een 100-voudig molair overschot van zowel het gebiotinyleerde vorkuiteinde als het PCR-fragment toe.
   2. Aliquot de reactie in PCR-buisjes (elk 50 μl) en incubeer bij 16 °C 's nachts in een thermische cycler.
   3. Los het geligeerde monster op op een 0,6% agarosegel en zuiver het geligeerde DNA door elektro-elutie zoals beschreven in stap 1.2.2 en 1.2.3.
   4. Bewaar snel ingevroren DNA bij -80 °C.

2. Zuivering van Drosophila melanogaster CMG (Figuur 2)

Figuur 2: Zuivering van Drosophila melanogaster CMG uit 4 L Hi Five cellen. De eiwitten werden opgelost op 4%-12% Bis-Tris polyacrylamidegel onder 200 V in aanwezigheid van MOPS-buffer. Het monster wordt getoond in elke fase van de zuivering (cellysaat - 2 μL, FLAG-elutie - 10 μL, na de eerste ionenuitwisselingskolom - 10 μL, en na etikettering en de tweede ionenuitwisselingskolom - 1 μL. (A) Coomassie-kleuring bevestigt de aanwezigheid van alle 11 subeenheden van het CMG-complex vóór (10 μL) en na (1 μL) fluorescerende etikettering. (B) De etiketteringsefficiëntie van de MCM3-subeenheid werd gevalideerd door te scannen op Cy5 met een fluorescerende beeldanalysator met behulp van een LPR-filter (Long Pass Red). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Om fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG te bereiden, werd een TEV-splitsingsplaats (ENLYFQG) gevolgd door vier Gly-residuen stroomafwaarts van de N-terminale FLAG-tag op de MCM3-subeenheid (in pFastBac1-vector)¹⁰ geïntroduceerd. Om het complex tot uitdrukking te brengen, werd het baculovirus-expressiesysteem gebruikt. Voor de initiële transfectie werden Sf21-cellen afzonderlijk gebruikt voor elke CMG-subeenheid (P1-virusstadium). Om de virussen verder te amplificeren werden Sf9-cellen gebruikt (P2-virusstadium). Vervolgens werden Sf9-celculturen (100 ml voor elke CMG-subeenheid; 0,5 x 10⁶ cellen/ml) geïnfecteerd met 0,5 ml P2-virus aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (P3-virusstadium). Om het volledige CMG-complex tot expressie te brengen in 4 L Hi Five-cellen (1 x 10⁶ cellen/ml), werd 200 ml P3-virussen gebruikt voor elk van de subeenheden. Na het oogsten van de Hi Five-cellen die het CMG-complex tot expressie brengen, kan de celpellet snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80°C. Voer de hele zuivering uit op ijs of bij 4 °C. De buffers kunnen op voorhand worden bereid, op voorwaarde dat de reductiemiddelen (DTT of 2-Mercaptoethanol) en proteaseremmers (VOORZICHTIG) vlak voor het gebruik worden toegevoegd. Zorg ervoor dat alle buffers van tevoren zijn voorgekoeld, gefilterd en ontgast.

1. Bereid de volgende buffers voor.
   1. Bereid de resuspensiebuffer A voor door 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) pH 7,5, 0,02% Tween-20, 10% glycerol, 15 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM EDTA en 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA) te mengen.
      LET OP: 2-mercaptoethanol, DTT en EDTA zijn giftig/schadelijk
   2. Bereid Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS; 0,1 M Glycine HCl, pH 3,5) buffer voor voor de bereiding van ANTI-FLAG M2 affiniteitsgel.
   3. Bereid buffer A-100 voor door 25 mM HEPES pH 7.5, 0.02% Tween-20, 10% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA en 1 mM EGTA te mengen.
   4. Bereid de dialysebuffer voor door 25 mM HEPES pH 7.5, 50 mM natriumacetaat, 10 mM magnesiumacetaat, 10% glycerol en 1 mM DTT toe te voegen.
   5. Bereid de TBS-buffer voor door 50 mM Tris-HCl pH 7,5 en 150 mM NaCl te mengen.
2. Resuspendeer pellet uit 4 L cultuur van Hi Five cellen in 200 ml koude resuspensiebuffer A aangevuld met proteaseremmer cocktailtabletten. Meng de buizen door omkering totdat de hele pellet volledig is geresuspendeerd.
3. Breng de geresuspendeerde cellen over in een voorgekoelde 40 ml Dounce-homogenisator. Om zoveel mogelijk cellen terug te winnen, wast u de buizen die worden gebruikt voor het invriezen van de celpellets met hetzelfde type buffer en voegt u deze toe aan de Dounce-homogenisator. Zorg ervoor dat het totale volume in de homogenisator de aanbevolen limiet niet overschrijdt. Lyseer de cellen op ijs met 60-70 slagen.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de zuiger de bodem van de buis bereikt, maar oefen niet te veel druk uit, aangezien de homogenisator kan breken. Zorg ervoor dat u de zuiger niet boven het vloeistofniveau verwijdert, omdat er dan luchtbellen ontstaan.
4. Herhaal de vorige stap totdat het hele monster is gehomogeniseerd en meng het in de voorgekoelde beker. Beoordeel het uiteindelijke volume van het monster. Voeg druppelsgewijs gefilterd KCl toe tot de uiteindelijke concentratie van 100 mM en meng voorzichtig.
5. Koel de centrifuge vooraf af tot 4 °C. Giet het monster in centrifugatiebuizen en zorg ervoor dat het door de producent aanbevolen volume wordt bereikt. Balanceer de buizen op een weegschaal.
   OPMERKING: Buizen met een te klein volume kunnen tijdens het centrifugeren breken.
6. Centrifugeer de gelyseerde cellen bij 23.500 x g gedurende 15-30 minuten bij 4 °C. Bereid intussen ANTI-FLAG M2 affiniteitsgel in lijn met de volgende stap.
7. Meng de fles met ANTI-FLAG M2 affiniteitsgel (50% suspensie) voorzichtig. Snijd het uiteinde van een P-100 pipetpunt af (om de punt te verbreden) en gebruik het om onmiddellijk 4 ml suspensie (2 ml korrels) over te brengen in een 20 ml poly-prep chromatografiekolom. Om de kralen die in de punt vastzitten te herstellen, wast u de punt met TBS en voegt u deze toe aan de kolom. Laat alle kralen in de kolom bezinken, maar pas op dat ze niet uitdrogen.
8. Was de hars met 3x parelvolume (6 ml totaal) van 0,1 M Glycine HCl pH 3,5. Was de kralen vervolgens met 3-5 kralenvolume TBS (6-10 ml). Was de kralen vervolgens 3 keer (6 ml) met Buffer A-100.
   OPMERKING: Laat de korrels niet langer dan 20 minuten in de 0,1 M Glycine HCl pH 3,5-oplossing liggen. Om de stroomdruk en wassnelheid te verhogen, dekt u de kolom af met een deksel. Laat de hars op geen enkel moment drogen.
9. Laat na het voorbereiden van de hars 2 ml Buffer A-100 boven de hars en sluit de uitlaat van de kolom.
10. Giet het supernatans na het centrifugeren voorzichtig in voorgekoelde buisjes van 50 ml. Pas op dat u de pellet niet verstoort. Neem een kleine aliquot (~10 μL) om later te valideren door SDS-PAGE-elektroforese.
11. Voeg een gelijke hoeveelheid ANTI-FLAG M2-korrels (bereid in overeenstemming met de vorige stap) toe aan elk van de buisjes van 50 ml. Probeer alle korrels uit de kolom te recupereren door ze opnieuw te suspenderen met een paar extra milliliter Buffer A-100 en deze resuspensie over te brengen naar de buizen.
12. Incubeer het monster (supernatant) met ANTI-FLAG M2-hars en draai gedurende 2,5 uur bij 4 °C.
13. Draai het monster na de incubatie 5 minuten rond op 1.000 x g bij 4 °C. Gebruik een pipet om het grootste deel van het supernatant te verwijderen. Gebruik een afgesneden punt om de korrels in een paar milliliter van het resterende supernatans te suspenderen en over te brengen in twee buisjes van 15 ml. Om eventuele parels die aan de wanden van de buisjes van 50 ml vastzitten te herstellen, voeg je een paar milliliter Buffer A-100 toe en breng je dit ook over naar de buisjes van 15 ml.
14. Draai de buisjes van 15 ml op 1.000 x g gedurende 5 minuten op 4 °C. Verwijder het supernatant.
15. Was de korrels door ~14 ml Buffer A-100 aan elke buis toe te voegen, gevolgd door korte, zachte rotatie bij 4 °C en vervolgens centrifugeren op 1000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Herhaal de wasbeurten twee keer. Neem kleine aliquots van elke wasbeurt (~10 μL) om later te valideren door SDS-PAGE-elektroforese.
16. Deze stap (2.16) is een alternatieve procedure voor de voorgaande stappen (2.13-2.15).
    1. Na de incubatie met ANTI-FLAG M2-hars, giet het monster in twee 20 ml poly-prep chromatografiekolommen.
    2. Als u voor deze methode kiest, laat dan de kralen aan de onderkant van de kolom bezinken en het ongebonden monster door de zwaartekracht door de kolom gaan. Voeg vervolgens Buffer A-100 rechtstreeks toe aan de kolom en laat het monster via de zwaartekracht wassen.
17. Breng de korrels (geresuspendeerd in Buffer A-100) over naar twee 10-ml poly-prep chromatografiekolommen.
    1. Laat Buffer A-100 door de hars gaan, sluit de uitlaat wanneer het bufferniveau de bovenkant van de hars bereikt en elueer het eiwit uit de korrels door Buffer A-100 toe te voegen aangevuld met 200 μg/ml (DYKDDDDK) peptide (FLAG-elutiebuffer).
    2. Voeg voor de eerste elutie 3 ml van de FLAG-elutiebuffer toe en draai de gesloten kolom voorzichtig gedurende 15 minuten bij RT. Open de uitlaat om de eerste elutiefractie op te vangen.
    3. Sluit de uitlaat en voeg 2 ml van de FLAG-elutiebuffer toe aan elke kolom. Draai nog eens 10 minuten en verzamel de tweede elutiefractie.
18. Combineer alle geëlueerde fracties samen (~10 ml) en houd op 4 °C. Neem een klein aliquot van de geëlueerde fractie (~10 μL) om later te valideren door SDS-PAGE-elektroforese.
19. Filtreer het geëlueerde monster met behulp van spuitfilters van 0,22 μm.
20. Bereid van tevoren de CaptoHiRes Q (5/50) kolom (ionenuitwisselingschromatografiekolom met hoge resolutie) voor die is aangesloten op een eiwitzuiveringssysteem, in overeenstemming met het protocol van de fabrikant. Breng vervolgens de kolom in evenwicht met Buffer A-100 en laad het gefilterde monster op de evenwichtige kolom.
21. Was de kolom met 20 kolomvolumes (CV) buffer A-100 (~20 ml in totaal, aangezien het volume van de kolom ~1 ml is).
22. Om het eiwit te elueren, bereidt u van tevoren twee buffers voor: Buffer A-100 en Buffer B met dezelfde samenstelling als Buffer A-100, maar met 550 mM KCl in plaats van 100 mM KCl. Stel de gradiëntelutie in voor 20 CV (~20 ml) met toenemende zoutconcentratie van 100 mM tot 550 mM KCl. Verzamel 0,3-0,5 ml eluties in een breukcollector.
    OPMERKING: De CMG moet elueren bij een concentratie van ongeveer 70%-75% Buffer B. Neem kleine hoeveelheden van de gewassen en geëlueerde fracties voor SDS-PAGE-elektroforese.
23. Voer SDS-PAGE-elektroforese uit om te bevestigen dat CMG aanwezig is in de gekozen fracties. Reinig intussen de kolom en het zuiveringssysteem volgens het protocol van de fabrikant.
24. Incubeer de gekozen fracties 's nachts met TEV-protease door 50 μL TEV-protease (1 mg/ml) per 1 ml monster te mengen.
25. Maak een dialysebuis vooraf nat en zorg ervoor dat het membraan niet wordt beschadigd. Voeg het CMG/TEV-mengsel toe aan de dialyseslang en doe het in een bekerglas van 2 l met 1,5 l voorgekoelde Buffer A-100 en de magneetstaaf erin. Dialyse met zacht roeren 's nachts op 4°C.
26. Meng het monster met 50 μM LD655-gelabeld peptide en 10 μg/ml sortase-enzym in aanwezigheid van 5 mM CaCl₂. Incubeer de reactie bij 4 °C, draai gedurende 30 minuten en zorg ervoor dat de buis bedekt is met licht. Neem een kleine aliquot voor en na de etikettering voor SDS-PAGE-elektroforese.
27. Filtreer het geëtiketteerde monster met behulp van centrifugefilters van 0,22 μm voordat u het op het zuiveringssysteem plaatst, aangezien het peptide kan neerslaan.
28. Bereid de chromatografiekolom met hoge resolutie van tevoren voor, zoals eerder beschreven (stap 2.20). Bedek deze keer de kolom en het fractiecollectorsysteem met aluminiumfolie om het monster tegen licht te beschermen.
29. Om het vrije peptide te verwijderen, laadt u het gefilterde monster op de chromatografiekolom met hoge resolutie ionenuitwisseling. Voer de zuivering uit op dezelfde manier als eerder beschreven (stappen 2.21-2.22). Zorg ervoor dat de gelabelde CMG elueert met een concentratie van Buffer-B die vergelijkbaar is met die voorheen.
30. Voer SDS-PAGE-elektroforese uit om de kwaliteit van de gekozen fracties te valideren. Om de fluorescentie in beeld te brengen, kookt u de monsters niet voordat u ze laadt en zorgt u ervoor dat de elektroforesetank beschermd is tegen licht. Visualiseer eerst de eiwitfluorescentie met behulp van een gelbeeldvormingssysteem, kleur de gel vervolgens met Coomassie kleurstof en breng deze opnieuw in beeld om alle eiwitten te visualiseren.
31. Dialyse de gekozen fracties 's nachts bij 4 °C, tegen 1,5 L van de dialysebuffer. Concentreer het monster indien nodig.
32. Vries het eiwit snel in in vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C tot verder gebruik.

3. Voorbereiding van de flowcel (figuur 3)

1. Bereid biotine-PEG-dekglaasjes volgens een eerder beschreven protocol¹¹, waarbij u de bakstap in de oven overlaat. Biotine-PEG dekglaasjes zijn bij RT minimaal 1 maand stabiel onder vacuüm. Snijd voor de voorbereiding van de flowcel het biotine-PEG dekglaasje (24 mm x 60 mm) doormidden (ongeveer 24 mm x 30 mm).
   NOTITIE: Zorg ervoor dat u het centrale gebied van het dekglaasje waar de stroomkanalen zich zullen bevinden, niet aanraakt.
2. Bereid kleine stukjes glas voor door een glasplaatje te etsen en te breken in stukjes van ongeveer 2,4 cm x 1 cm.
3. Boor met een diamantboor van 0,8 mm twee gaten met een tussenruimte van 1,4 mm, het ene iets breder dan het andere (0,043" = inlaat, 0,048" = uitlaat). Test of de gaten de juiste maat hebben door te proberen een stuk van de inlaat-/uitlaatslang in te brengen en dezelfde boor te gebruiken om het gat te verbreden totdat de slang past. Zorg ervoor dat de slang strak genoeg past om er niet gemakkelijk uit te vallen.
   NOTITIE: Smallere inlaatslangen worden gebruikt om het dode volume te minimaliseren.
4. Knip dubbelzijdig plakband in dezelfde vorm als de stukjes glas.
5. Lijn de dia op de tape uit en steek een naald door elk gat om hun posities op de tape te markeren. Snijd met een scheermesje een kanaal dat beide gaten omvat.
   NOTITIE: Snijd het kanaal niet te lang, aangezien overtollige ruimte aan de andere kant van elk gat droog kan blijven wanneer er vloeistof in wordt gestroomd en dit kan leiden tot problemen met luchtbellen tijdens het stromen. Probeer bij het snijden de lange randen in één zuivere snede te snijden, omdat gerafelde randen van meerdere sneden de kwaliteit van het stroomkanaal kunnen beïnvloeden. Snijd met hetzelfde doel niet in de randen van het stroomkanaal, aangezien sneden in het bruikbare stuk de vloeistofstroom kunnen beïnvloeden of zelfs kunnen lekken in de geassembleerde stroomcel.
6. Reinig het stuk glas met aceton en tissue tot het droog is en plaats het vervolgens op een schoon oppervlak. Trek een kant van het plakband los en plak het op het stuk glas zodat beide gaten zich volledig in het kanaal bevinden.
7. Plak de tape op het stuk glas met behulp van een p1000-pipetpunt om luchtbellen te verwijderen door met stevige maar matige druk op het oppervlak te drukken. Ga over het hele oppervlak om af te dichten.
8. Trek de tweede rand van de tape van beide stukjes glas en leg ze op een schoon oppervlak met de plakkerige kant naar boven. Plaats de glaasjes dicht bij elkaar, maar niet tegen elkaar aan in de positie waarin ze aan het dekglaasje worden bevestigd (laat voldoende ruimte ertussen voor de epoxy om een volledige afdichting rond elk stuk glas te creëren).
9. Pak het halve biotine-PEG-dekglaasje op met een plastic pincet, houd het alleen bij de rand vast (raak het gebied dat het stroomkanaal zal vormen niet aan) en laat de PEG-gefunctionaliseerde kant op de lijm zakken. Zet vast door met een vinger naar beneden te drukken om het op zijn plaats te bevestigen, voltooi vervolgens de afdichting door matig stevig over het oppervlak te wrijven met een pipetpunt om luchtbellen te verwijderen (niet op het gebied van het stroomkanaal, omdat dit kan breken) en draai het vervolgens om.
   OPMERKING: Ga voorzichtig om met het dekglaasje.
10. Snijd voor elke stroomcel ~10 cm van elk type polyethyleen slang (PE20 en PE60). Gebruik de smallere buis als inlaat naar de stroomkamer om het dode volume te verminderen.
11. Steek de slang met de hand in de gaten in de slede. Als de diameter van de gaten correct is, zorg er dan voor dat de slang na het inbrengen vanzelf rechtop in het gat staat. Snijd de punt van de slang in een lichte hoek <45° om het inbrengen van de slang iets gemakkelijker te maken en te voorkomen dat de slang een afdichting vormt tegen het dekglaasje, wat het kan doen als het uiteinde plat is (dit kan de doorstroming belemmeren).
    OPMERKING: De nauwkeurige pasvorm van de slang in het stuk glas maakt de constructie van de stroomcel betrouwbaarder en helpt de introductie van luchtbellen in de stroomcel te voorkomen.
12. Meng de epoxycomponenten goed en gebruik vervolgens een p200-punt om epoxy te deppen om de slang af te dichten en een afdichting rond elk stuk glas te creëren. Voeg voldoende epoxy toe zodat het tot aan de rand van het dekglaasje rond gaat, omdat dit ook het delicate dekglaasje versterkt. Zorg er echter voor dat er geen epoxy op de onderkant van het dekglaasje komt, omdat dit kan voorkomen dat het plat op het podium ligt.
    OPMERKING: Indien nodig kunnen kleine hoeveelheden overtollige epoxy met een scheermesje van de onderkant worden geschraapt.
13. Laat minstens 30-60 minuten intrekken om de epoxy volledig uit te harden.
    NOTITIE: Als de flowcel niet meteen wordt gebruikt, bewaar deze dan onder vacuüm bij RT nadat deze volledig is uitgehard.
14. Na gebruik van de flowcel recupereert u de glasstukken en hergebruikt u ze voor onbepaalde tijd. Trek de slang naar buiten en plaats de stroomcel gedurende ten minste 24 uur in een glaasjespot met aceton om de epoxy en dubbelzijdige lijm zachter te maken, zodat de stukjes glas gemakkelijk kunnen worden verwijderd. Voordat u ze opnieuw gebruikt om een andere stroomcel te maken, maakt u de stukjes glas schoon door ze te schrobben met een spons en een sopje, ze af te drogen en ze te schrobben met aceton en tissuepapier.

Figuur 3: Grafische weergave van de voorbereiding van de flowcel. (A) Knip dubbelzijdig plakband af zodat het past bij de grootte van het glasstuk. Lijn de dia uit op de bovenkant van de tape en markeer de positie van elk gat met een naald. Snijd met een scheermesje rond elk houvast om een kanaal te creëren. (B) Trek een kant van de tape los en plak de tape op het stuk glas. Zorg ervoor dat beide gaten zich in het kanaal bevinden. Trek het tweede uiteinde van de tape los en plak het biotine-PEG dekglaasje erop. (C) Steek de polyethyleenslang in elk gat en dicht de slang op zijn plaats af met epoxy, waarbij u elk stuk glas ook op het dekglaasje afdicht. (D) Nadat u beide kanalen hebt gebruikt, trekt u de slang eruit en plaatst u de stroomcel in een kleurpot gevuld met aceton. Na ongeveer 24 uur zijn de epoxy en tape zacht geworden en kunnen de lagen van de flowcel uit elkaar worden gepeld. De stukjes glas kunnen worden gerecupereerd en opgeslagen in aceton om voor onbepaalde tijd te worden hergebruikt voor het maken van de volgende stroomcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. TIRF-test met één molecuul om CMG-gemedieerde DNA-afwikkeling te visualiseren

1. Bereid de volgende buffers voor.
   1. Bereid een blokkeerbuffer voor (20 mM Tris, pH 8,0; 50 mM NaCl; 2 mM EDTA; 0,2 mg/ml BSA). Filtreer de buffer met een spuitfilter van 0,22 μm en bewaar deze bij 4 °C.
   2. Bereid 10x Reactiebuffer 1 voor (250 mM HEPES pH 7,5; 50 mM NaCl; 100 mM Magnesiumacetaat). Filtreer de buffer met een spuitfilter van 0,22 μm en bewaar deze bij 4 °C.
   3. Bereid 10x reactiebuffer 2 voor (250 mM Tris, pH 7,5; 100 mM magnesiumacetaat; 1,25 M Kaliumglutamaat; 1 mM EDTA; 0,025% Tween-20). Filtreer de buffer met een spuitfilter van 0,22 μm en bewaar deze bij 4 °C.
2. Ontgas ongeveer 2,5 ml blokkeerbuffer en 5 ml ultrapuur water door de open buizen in een exsiccator te plaatsen en ze 15 minuten onder vacuüm te laten staan.
   NOTITIE: Vul de buizen niet tot de rand, omdat luchtbellen tijdens het ontgassen vloeistof kunnen doen spatten.
3. Plaats de stroomcel op een microscooptafel en zet deze op zijn plaats vast met behulp van een zelfklevende stopverf aan elk uiteinde. Het is belangrijk om goed vast te zetten om te voorkomen dat de flowcel later tijdens de acquisitie in beweging komt.
4. Sluit de slang van de uitlaat van de flowcel aan op de spuitpomp, waarvan de slang met een naald aan het andere uiteinde aan de spuit is bevestigd. Steek deze naald in de uitlaatslang om de stroomcel aan te sluiten.
5. Schakel de objectiefverwarming in op 30 °C.
6. Bevestig 1-2 ml ontgast water in een buis op een apart stuk zelfklevende stopverf in de buurt van de stroomcel, zodat de inlaatslang kan worden ingebracht en de bodem van de buis kan bereiken.
7. Laat water door het kanaal stromen en gebruik vervolgens een snellere stroom om eventuele ingesloten bellen in de buurt van de inlaatslang te verwijderen en voeg indien nodig meer water toe. Anders kunnen grote bellen later in de experimenten losraken en door het kanaal gaan. Laat een paar minuten wachten totdat de stroom volledig is gestopt, omdat de snelle stroom ervoor kan zorgen dat er nog een tijdje vloeistof wordt getrokken nadat deze is gestopt, terwijl de druk in de spuit stabiliseert.
   OPMERKING: Elk DNA dat in contact komt met een luchtbel wordt onbruikbaar, zelfs als het opnieuw is gehydrateerd.
8. Voeg 100 μL ontgaste blokkeerbuffer toe aan een aliquot van 20 μl 1 mg/ml streptavidine. Bevestig de open buis aan de zelfklevende stopverf en breng de inlaatslang over van het water naar de streptavidine. Stroom met een snelheid van 40 μL/min gedurende 2 minuten (80 μL totaal) en incubeer gedurende 5 minuten.
9. Overtollige streptavidine wegspoelen met de blokkeerbuffer (50 μL/min voor 100 μL).
10. Stroming in gebiotinyleerd DNA, verdund in blokkeerbuffer met 25 nM SYTOX oranje. Afbeelding met behulp van liveweergave met de 532 nm-laser om het DNA in realtime aan het oppervlak te zien vastmaken.
11. Wanneer de geschatte dichtheid van DNA op het oppervlak is bereikt, stroomt u in de blokkeerbuffer, ook met 25 nM SYTOX (50 μL/min voor 100 μL), om het vrije DNA uit te wassen.
12. Stroom in gebiotinyleerd anti-digoxigenine-antilichaam (~10 μg/ml) verdund in blokkeerbuffer met 25 nM SYTOX oranje (100 μL/min voor 300 μL).
    OPMERKING: De SYTOX oranje intercaleert tussen de basenparen van DNA, waardoor de contourlengte wordt verlengd. Dit betekent dat de end-to-end lengte van het DNA toeneemt in SYTOX oranje, waardoor de tweede ketting zich verder van de eerste aan het oppervlak kan hechten, waardoor het DNA beter wordt uitgerekt wanneer het SYTOX oranje later wordt uitgewassen. Het gebruik van een ander deel aan elk DNA-uiteinde maakt een gelijkmatigere hechting van DNA aan het dekglaasjeoppervlak mogelijk (Figuur 4). Wanneer beide uiteinden worden gebiotinyleerd, worden ze in dezelfde stap aan elkaar vastgemaakt, wat resulteert in een aanzienlijke variatie in hun bevestigingsposities. Het gebruik van digoxigenine aan het ene uiteinde geeft meer controle over de DNA-dekking voordat het tweede uiteinde wordt vastgebonden. Hierdoor kan ook de DNA-dekking worden verhoogd door incubatie.
13. Was het gebiotinyleerde anti-digoxigenine-antilichaam en SYTOX oranje met blokkeerbuffer (50 μL/min voor 100 μL).
14. Maak 120 μl 'ATP-g-s-mix' (1x reactiebuffer 1, 0,75 mg/ml BSA, 1,25 mg/ml caseïne, 8 mM DTT, 0,33 mM ATP-g-s), voeg 30 μl toe aan een nieuw buisje en giet vervolgens 50 μl van het oorspronkelijke buisje naar de stroomcel (50 μl/min voor 50 μl). Dit helpt het effect van buffermenging door terugstroming of diffusie van de uitlaatslang te minimaliseren.
15. Voeg gezuiverd CMG toe aan ~100 nM final in 30 μL ATP-g-s-mix en giet vervolgens in met 20 μL/min voor 20 μL. Incubeer gedurende 15 minuten.
16. Maak 120 μL 'ATP/RPA-mix' (1x reactiebuffer 1, 0,75 mg/ml BSA, 8 mM DTT, 3,3 mM ATP, 20 nM EGFP-hRPA) en vloei in de flowcel met 40 μL/min voor 80 μL.
17. Begin onmiddellijk met het verkrijgen van afbeeldingen. Verkrijg elke 30 s 6 x 6 gezichtsvelden voor elk frame (of een geschikte framesnelheid voor het experiment). Lagere framesnelheden kunnen de blootstelling aan lasers en het fotobleken van fluoroforen verminderen. Visualiseer EGFP-hRPA met een laser van 488 nm met een vermogen van 1%. Als CMG is gelabeld, bijv. LD655, visualiseer CMG dan met een laser van 640 nm (max. vermogen = 30 mW) met een vermogen van 10%. Visualiseer SYTOX oranje gekleurd DNA met een laser van 532 nm met een vermogen van 0,5%. Gebruik elke laser met een belichtingstijd van 50-100 ms.
    NOTITIE: Elke keer dat de inlaatslang van de stroomcel van de ene vloeistofslang naar de andere wordt overgebracht, dep u de punt van de slang meerdere keren op de bodem van de buis voordat u deze uit de vloeistof verwijdert. Dit helpt voorkomen dat er luchtbellen binnenkomen tijdens het overbrengen. Minimaliseer de tijd dat de punt van de inlaatslang uit de vloeistof wordt gehouden en richt de punt niet naar boven of til de punt niet aanzienlijk op, omdat hierdoor de vloeistof naar het kanaal wegloopt en lucht in de punt wordt getrokken. Probeer tijdens het overbrengen van de inlaatslang geen spanning op de slang te zetten, omdat deze hierdoor uit de epoxy kan worden getrokken en aan de stroomcel kan worden bevestigd. Voor beeldvorming van DNA-afwikkeling, in aanwezigheid van SYTOX oranje om dubbelstrengs DNA te visualiseren, vervangt u 10x reactiebuffer 1 door 10x reactiebuffer 2 voor de ATP/RPA-mix. SYTOX oranje bindt onder deze omstandigheden beter aan DNA. Leeg de spuitpomp volledig aan het einde van elk experiment. Af en toe wassen door met water te vullen en meerdere keren te legen of te demonteren en te wassen met een sopje.

Figuur 4: DNA dat aan het oppervlak wordt vastgemaakt. (A) Bij het binden van DNA-substraten met biotine aan beide uiteinden, kan de afstand tussen de twee kettingen variëren, afhankelijk van hoe de uiteinden het oppervlak raken (i). Door digoxigenine aan één uiteinde te gebruiken, kan de binding van elk uiteinde tijdelijk worden gescheiden voor consistentere touwafstanden en gelijkmatiger uitgerekt DNA (ii). (B) Voorbeeld van een gezichtsveld met DNA dat aan beide uiteinden is vastgebonden (digoxigenine-gelabeld) en gekleurd met fluorescerende intercalerende nucleïnezuurkleuring. DNA, dat aan beide uiteinden is vastgebonden, verschijnt als een lijn, terwijl DNA dat aan slechts één uiteinde is vastgemaakt, als vlekken verschijnt. Idealiter zou het DNA zo dicht mogelijk moeten worden vastgemaakt zonder overlappend ander DNA. Het beeld is 512 x 512 pixels (pixelgrootte = 154,6 nm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Wanneer CMG DNA afwikkelt, zal in de loop van de tijd een karakteristiek RPA-kanaal groeien (Figuur 5). Het 5'-uiteinde van het afgewikkelde DNA is vastgemaakt aan het oppervlak; daarom wordt het gezien als een lineair stuk RPA-signaal tussen de ketting en de vork. Het 3'-uiteinde is niet vastgemaakt en beweegt daarom met de vork mee en wordt waargenomen als een compact EGFP-RPA-signaal. De positie van de verdichte, afgewikkelde translocatiestreng komt ongeveer overeen met de positie van de replicatievork, die samen beweegt met LD655-CMG, gevisualiseerd via een 640 nm-laser.

Het is belangrijk om schade aan het DNA-substraat tot een minimum te beperken, aangezien schade zoals enkelstrengs DNA-inkepingen het aantal waarneembare afwikkelingsgebeurtenissen vermindert, waardoor de hoeveelheid gegevens die kan worden verzameld wordt beperkt (Figuur 6).

Figuur 5: DNA-afwikkeltest met één molecuul. Het DNA-substraat is vastgemaakt aan een dekglaasje. Gezuiverde CMG gelabeld met LD655 wordt gedurende 15 minuten geïncubeerd met het DNA in ATP-g-s. ATP en gezuiverd EGFP-gelabeld RPA worden toegevoegd, waardoor uitgebreide DNA-afwikkeling door CMG wordt geïnitieerd. Een cartoonschema (links) en kymografie van representatieve gegevens (rechts) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: DNA-schade vermindert de doorvoer van de test. (A) CMG kan DNA niet afwikkelen na een breuk in de DNA-backbone (DNA-nick). Een inkeping in de sjabloon van de voorste streng zorgt ervoor dat CMG van het DNA glijdt en zowel CMG als de sjabloon van de leidende streng gaan verloren. Een inkeping in de achterblijvende strengsjabloon zorgt ervoor dat de achterblijvende strengsjabloon zich scheidt van de rest van het DNA en elk DNA-stuk trekt zich terug naar hun respectievelijke ketting. Dit wordt geïllustreerd door (i) cartoonschema's en (ii) kymografen van deze gebeurtenissen (ii). Representatieve gegevens met (B) een minimaal beschadigd DNA-substraat versus (C) een meer beschadigd DNA-substraat na (i) 5 minuten, (ii) 15 minuten en (iii) 60 minuten in een enkel gezichtsveld. Het meer beschadigde DNA-substraat genereert geen lange stukken van afwikkeling, omdat de CMG's eerder inkepingen tegenkomen, ondanks vergelijkbare niveaus van afwikkelactiviteit (vergelijkbare dichtheid van groeiende RPA-vlekken na 5 minuten, wat wijst op een vergelijkbare CMG-laad-/afwikkelefficiëntie). Het gezichtsveld is 512 x 512 pixels (pixelgrootte = 154,6 nm). 1% laservermogen (488 nm) beeldvorming EGFP-RPA. Schaalbalk met 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze test biedt een platform om de real-time dynamiek van individuele CMG's te observeren en te onderzoeken, zowel geïsoleerd als in de context van de gewenste aanvullende factoren. Zoals bij veel fluorescentietechnieken met één molecuul, zijn er echter enkele veelvoorkomende uitdagingen die optimalisatie vereisen om te worden overwonnen. Deze hebben meestal betrekking op het afbeelden van fluoroforen gedurende lange perioden (fotobleken, helderheid), DNA-substraatvoorbereiding (DNA-schade), de kwaliteit van het stroomceloppervlak (achtergrondruis, niet-specifieke interacties) of de kwaliteit van het gezuiverde eiwitpreparaat (nucleasebesmetting, etiketteringsefficiëntie).

Elke fluorofoor varieert in fotostabiliteit en helderheid, dus het is belangrijk om een geschikt molecuul te kiezen. Bij het afbeelden van fluorescerend gelabelde oligomere eiwitten, zoals RPA, kan een lager laservermogen worden gebruikt, omdat veel fluoroforen in de buurt worden geëxciteerd, waardoor een zichtbaar signaal wordt gegenereerd. Voor het afbeelden van enkele fluoroforen, bijvoorbeeld CMG gelabeld op een enkele subeenheid, is een hoger laservermogen nodig om de fluorofoor duidelijk waar te nemen. De levensduur van fluorofoor kan worden verlengd door de blootstelling aan lasers te minimaliseren, bijvoorbeeld door de frequentie waarmee foto's worden gemaakt te verminderen. Bovendien genereert het opwekken van een fluorofoor reactieve zuurstofsoorten (ROS), die kunnen bijdragen aan fotobleken. Het opnemen van een zuurstofopvangsysteem in de beeldvormingsbuffer kan de levensduur van fluoroforen verlengen door ROS te elimineren. Sommige zuurstofopvangsystemen kunnen echter de pH¹² beïnvloeden.

Wat de voorbereiding van het DNA-substraat betreft, is het van cruciaal belang om DNA-schade, zoals inkepingen of enkelstrengs openingen, tot een minimum te beperken. Overmatige schade voorkomt uitgebreide DNA-afwikkeling, waardoor de hoeveelheid gegevens die kan worden verzameld, wordt beperkt. Schade kan ontstaan door mechanisch afschuiving, overmatige verhitting als gevolg van nucleasebesmetting of ROS gegenereerd tijdens beeldvorming. Afschuiving kan worden geminimaliseerd door het DNA-monster voorzichtig te behandelen door tips met een brede boring te gebruiken voor het pipetteren, langzaam te pipetteren en te voorkomen dat het monster wordt getikt. Het effect van ROS kan worden geminimaliseerd door de blootstelling aan lasers te verminderen of door een zuurstofopvangsysteem in de beeldbuffer op te nemen. Na de voorbereiding van het DNA-substraat is het mogelijk om commerciële DNA-reparatiekits te gebruiken om de schade te herstellen voordat een afwikkelreactie wordt uitgevoerd.

De efficiëntie van DNA-afwikkeling hangt ook af van de zuiverheid en activiteit van CMG. Het is een goede gewoonte om de zuiverheid van het monster na elke zuiveringsstap te beoordelen door middel van SDS-PAGE-elektroforese om te bepalen waar optimalisatie nodig is. Als er na de laatste stap te veel verontreinigingen worden waargenomen, kan het helpen om de zoutgradiëntvolumes die worden gebruikt voor de elutie van de CaptoHiRes Q (5/50) kolom te wijzigen. Het is ook van groot belang om overtollig fluorescerend peptide dat voor de eiwitetikettering wordt gebruikt, te verwijderen, omdat dit een ongewenste achtergrond op het oppervlak van het dekglaasje kan veroorzaken. Het is ook essentieel om nucleasebesmetting te voorkomen, omdat dit het DNA-substraat kan aantasten. Na een experiment kan het kleuren van het resterende DNA met SYTOX oranje een goede manier zijn om te controleren of het DNA aanzienlijk is aangetast of niet. Een bepaald niveau van DNA-schade is onvermijdelijk in de loop van een experiment, maar aanzienlijke schade duidt vaak op problematische nucleasebesmetting.

De test wordt ook inherent beperkt door de resolutie van diffractie-beperkte vlekken, waardoor fluorescerende eiwitten honderden basenparen (zo niet meer) verwijderd moeten zijn om ze als afzonderlijk te onderscheiden. Dit beperkt het detail waarin CMG-progressie en interacties kunnen worden waargenomen.

Het aantal afwikkelingsgebeurtenissen dat we voor elke analyse waarnemen, varieert. Voor een succesvol experiment verwachten we ten minste meerdere RPA-banen van voldoende lengte te zien per gezichtsveld van 512x512 pixels (pixelgrootte = 154,6 nm). In hetzelfde experiment kunnen meerdere gezichtsvelden worden afgebeeld, waardoor indien nodig meer gegevens kunnen worden verzameld. De banen hoeven niet even lang te zijn of het einde van het DNA te bereiken om nuttig te zijn. De gemiddelde kettingafstand voor elk experiment kan bijvoorbeeld worden bepaald door de lengte van SYTOX-gekleurd DNA te meten voordat CMG wordt toegevoegd. Dit kan worden gebruikt om te schatten hoeveel DNA er is afgewikkeld voor een RPA-kanaal (zolang er genoeg DNA is afgewikkeld om de vork zichtbaar te bewegen) door de afstand om te zetten van 'μm afgelegd' naar 'kb afgewikkeld'.

CMG vertoont afwikkelingsactiviteit op een verscheidenheid aan DNA-substraten, maar het is essentieel om een vrij 3' DNA-uiteinde te voorzien op een polyT-flap van ten minste 30 nt om de voetafdruk van CMG¹⁰ op te vangen. Het opnemen van meerdere biotinegroepen aan de vork zorgt voor een robuuste oppervlaktebinding. De rest van het DNA-substraat kan op verschillende manieren opnieuw worden ontworpen, bijvoorbeeld door verschillende DNA-sequenties, lengtes en chemische modificaties op te nemen. De conformatie van het DNA kan worden veranderd door verschillende concentraties magnesiumacetaat te gebruiken. Bij hogere concentraties (≥10 mM) magnesiumacetaat wordt het RPA-gecoate ssDNA-filament verdicht, wat leidt tot het trekken van het DNA door RPA-binding tijdens het afwikkelen. Dit kan nuttig zijn omdat het voorkomt dat het DNA overmatig beweegt, waardoor de positie van CMG en van afwikkelprogressie nauwkeuriger kan worden gemeten. Bij lage concentraties (~3 mM) magnesiumacetaat blijft het RPA-ssDNA de hele tijd ontspannen.

De beschreven test met één molecuul vertegenwoordigt een platform waarop kan worden voortgebouwd en dat kan worden aangepast om verdere aspecten van DNA-replicatie te onderzoeken. Tijdens DNA-replicatie fungeert CMG als een kern waar het replisoom en zijn componenten zich omheen verzamelen. Daarom kunnen extra gezuiverde eiwitten aan deze test worden toegevoegd, waaronder bijkomende factoren zoals TIMELESS, TIPIN en CLASPIN, om hun effect op de CMG-dynamiek te bestuderen. Van deze eiwitten is aangetoond dat ze de snelheid van replicatievorken¹³ beïnvloeden, maar het is niet duidelijk hoe ze de snelheid van CMG-afwikkeling beïnvloeden. Daarom zou het interessant zijn om met behulp van deze test te onderzoeken hoe verschillende replisoomeiwitten CMG beïnvloeden. Toevoeging van DNA-polymerasen kan een beter inzicht geven in DNA-replicatie dan alleen DNA-afwikkeling, zoals eerder beschreven met gisteiwitten¹⁴. Bovendien kan zuivering van gemodificeerd CMG een beter begrip geven van hoe bepaalde mutaties of post-translationele modificaties de helicase-activiteit beïnvloeden^15,16. Bovendien kan het ontwerpen van verschillende DNA-substraten het mogelijk maken om DNA-afwikkeling door CMG te bestuderen onder verschillende omstandigheden die replicatiestress nabootsen¹⁷. Deze modificaties omvatten DNA-obstakels ^9,18, crosslinks tussen strengen 19,20,2 ¹ en discontinuïteiten in de DNA-strengen²².

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML
Acrylamide / Bis Solution 40%	BioRad	1610148
Agarose UltraPure	Invitrogen	16500-500	Wordt gebruikt om Tris Buffer (pH 8) te bereiden
ÄKTA Pure	GE Healthcare	-	Wordt gebruikt met Fraction Collector F9-C; eiwitzuiveringssysteem
ANTI-FLAG M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
APS 10%	Sigma-Aldrich	A3678-25G
ATP (200 mM)	Sigma-Aldrich	A7699-5G
ATP-g-s (100 mM)	Sigma-Aldrich	11162306001
Biotin-PEG coverslip	N/A	N/A	Bereid zoals beschreven: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033
Biotinyleerde anti-digoxigenine antistof	Perkin Elmer	N/A
Blu Tack	Bostik	N/A	Zelfklevende stopverf
Boorzuur	Thermo Fisher Scientific	B/3800/53
BSA; 33 mg/mL	SIGMA-ALDRICH	A3858-10G	Verdund uit de stock
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
CaptoHiRes Q (5/50)	Cytiva	29275878	Verbonden met het AKTA eiwitzuiveringssysteem; hoogwaardige ionenuitwisselingschromatografie kolom
Caseïne (5% in water, 50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	C4765-10ML
ChemiDoc systeem	Bio-Rad	N/A
Clips	N/A	N/A
Snijplank	N/A	N/A
Dialysebuis (3,5 kDa)	Fisher Scientific	11425859
digoxigenine-11-dUTP	Roche	11209256910
DNA loading dye 6x	NEB	B7024S
dNTP 10 mM	NEB	N0447S
Dubbelzijdig plakband (0,14 mm dik)	N/A	N/A
DTT	Fluorochem Limited	M02712-10G
DYKDDDDK peptide	N/A	N/A	Gesynthetiseerd door chemical biology STP van The Francis Crick Institute
EDTA	Thermo Fisher Scientific	D/0700/68
EGFP-RPA	N/A	N/A	Gezuiverd zoals beschreven in 'Single Molecule Analysis', Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. en Wuite G. J. L. redacteuren, Humana Press. Eiwitinformatie: 2 mM, menselijk, geëxpresseerd in E. coli.
EGTA	Sigma-Aldrich	03779-10G
Epoxy - 5 minuten	Devcon	20845
Fujifilm FLA-5000	Fujifilm	FLA-5000	Fluorescentie beeldanalyser
GelRed nucleïnezuurkleurstof; 10000x	Cambridge Bioscience	41003-BT	Voorbeeld van een nucleïnezuurkleurstof die een veiliger alternatief is voor ethidiumbromide.
Glas- of kwartsplaatje met gaten voor buisjes	Dremel Model 395		1 mm dik plaatje, gesneden tot 2,4 cm x 1cm, twee gaten geboord 1,4 mm uit elkaar. De gaten moeten worden geboord tot verschillende maten om verschillende buisjes aan elke kant te plaatsen.
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Glycine HCl, pH 3,5	Sigma-Aldrich	G8898
Hamilton spuit, 1000 serie GASTIGHT, PTFE luer lock 1010TLL, PTFE Luer lock (met sleuven), volume 10 mL	Merck	26211-U
HEPES pH 7,5	Sigma-Aldrich	H4034
I-CeuI	NEB	R0699L
KCl	Fisher Scientific	P/4280/53
Magnesiumacetaat	Sigma-Aldrich	M2545
Maxi GeBaFlex-buis dialysekit; MWCO 14 kDa	Generon	D055
Metalen spatel	N/A	N/A
Metalen pincetten	N/A	N/A
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Millex-GP (Spuitfilters) 0,22 µm	Merck	SLGP033RS
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Naald	N/A	N/A
NotI-HF	NEB	R3189L
NuPAGE 4%–12% Bis-Tris Eiwitgels	Thermo Fisher Scientific	10247002;
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Thermo Fisher Scientific	NP0001
Objectiefverwarming	Okolab	N/A
PCR mix - 2x			Bereid uit Phusion DNA polymerase (20 µL), 10 mM dNTP's (40 µL), 5x Phusion HF buffer (400 µL) en water (540 µL).
Peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, gelabeld met LD655-MAL	N/A	N/A	peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, gelabeld met LD655-MAL (Lumidyne Technologies) op de cysteïnerest, werd gesynthetiseerd en gezuiverd door de peptidechemie STP van The Francis Crick Institute
pGC261 plasmide	N/A	N/A	https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053