Methodenartikel

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

DOI:

10.3791/67213

⸱

20 september 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Biodiscovery Institute, University of Nottingham, 2MiDx Ltd, Biodiscovery Institute, University of Nottingham, 3School of Life Sciences, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 4National Biofilms Innovation Centre, School of Life Sciences, Biodiscovery Institute, University of Nottingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er bestaat een reeks biofilmmodellen voor bacteriën voor het testen van antibiotica. Veel hiervan zijn echter beperkt tot een enkele experimentele output, zoals kolonievormende eenheden of metabolische activiteit. Bovendien weerspiegelen veel biofilmmodellen niet de biologische en fysiochemische eigenschappen van de menselijke gastheeromgeving. Dit is een belangrijk probleem bij veel aandoeningen, maar het meest merkbaar bij cystische fibrose (CF). Een groot deel van de mensen met CF lijdt aan zowel chronische als intermitterende infecties, en in vitro correleert het testen van antibioticagevoeligheid slecht met de behandelingsresultaten van de patiënt. Sommige biofilmmodellen bevatten CF-longrelevante media, waaronder synthetische sputumnabootsingen, maar houden geen rekening met de polymicrobiële aard van de omgeving, die de biofilmarchitectuur, fysiologie en de manier waarop microben op de behandeling reageren, verandert. Het hier beschreven biofilmmodel van de vaste-lucht-interface van de kolonie is zeer aanpasbaar en omvat zowel CF-relevante media als een polymicrobiële context. Dit model kan ook worden gebruikt voor mid-throughput screening van antimicrobiële stoffen en om hun effect op de polymicrobiële dynamiek te bestuderen. Outputmetingen van het model kunnen kolonievormende eenheden, metabolische activiteit en confocale microscopie-analyse zijn. Het model kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende micro-organismen, media, temperaturen en variabele zuurstofcondities en kan worden gebruikt om een breed scala aan chemische, biologische en fysische behandelingen te testen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cystic fibrosis (CF) is een genetische aandoening die meer dan 11.000 mensen in het VK en 162.000 mensen wereldwijd treft 1,2. Hoewel CF een ziekte met meerdere organen is, is een belangrijk symptoom dat mensen met cystische fibrose (pwCF) ervaren, de vorming van abnormaal dik, uitgedroogd slijm in hun luchtwegen3. Dit, samen met een verminderd kloppen van trilhaartjes, kan de kolonisatie van de longen door een breed scala aan bacteriën, schimmels, virussen en archaeaverbeteren 4,5. Ondanks dat de CF-long omstandigheden en selectieve druk biedt om de groei en overleving van micro-organismen te beperken, zijn bacteriën zoals Pseudomonas aeruginosa sterk aangepast aan deze barre omgevingen6. Dit zorgt voor zowel kolonisatie als overleving, wat resulteert in de vorming van aanhoudende chronische infecties7.

Veel van de microben die deze chronische infecties veroorzaken, doen dit met behulp van een fenotypische verschuiving van een initiële planktonische naar een biofilmgroeistijl, hetzij aan het oppervlak of in aggregaten7. Deze biofilms worden gekenmerkt door dicht opeengepakte bacteriële gemeenschappen omhuld door een exopolysacharide (EPS)-matrix die bestaat uit een verscheidenheid aan componenten, waaronder polysachariden, eiwitten, lipiden en omgevings-DNA (eDNA)8. Deze matrix is een gemeenschappelijk kenmerk tussen micro-organismen; De samenstelling kan echter verschillen. De belangrijkste polysacharidecomponenten van de bacteriële P. aeruginosa-matrix zijn bijvoorbeeld Psl, Pel en alginaat, in tegenstelling tot de schimmels Candida albicans, waarvan de belangrijkste polysacharidematrixcomponenten mannanen en glucanen zijn9. In biofilms van monospecies kan deze matrix de antibioticatolerantie sterk beïnvloeden in vergelijking met plankton door de penetratie van antibiotica in de biofilm te verminderen, waardoor hun effectiviteit afneemt10. De biofilm-groeistijl induceert ook de vorming van persisterende cellen met verminderde metabolische activiteit in vergelijking met hun planktonische tegenhangers en daarom een verder verminderde gevoeligheid voor antibiotica11. Deze groeistijl wordt ook gekenmerkt door de opregulatie van sommige antibioticaresistentiemechanismen, zoals effluxpompen en die nodig zijn voor horizontale genoverdracht, waardoor de uitwisseling van resistentiegenen mogelijk wordt 11,12,13. Daarnaast heeft de ziektegerelateerde omgeving van de gastheer grote invloed op de microbiële fysiologie en de manier waarop ze reageren op antibiotica. Dit omvat de verhoogde micro-aerobiose in het dikke slijm, evenals de beschikbaarheid van niet-standaard koolstofbronnen zoals aminozuren en eDNA, hetzij afkomstig van de gastheer of door microbiële afbraak van longproducten 14,15,16.

Deze specifieke interacties worden verder gecompliceerd door de polymicrobiële aard van biofilms, die een extra laag complexiteit introduceert met complexe interacties, niet alleen tussen bacteriën, maar ook tussen bacteriën en schimmels. In vergelijking met bacteriële biofilms is er minder bekend over sommige interacties tussen bacteriële en schimmelbiofilms, ondanks dat C. albicans geïsoleerd is uit meer dan 75% van de mensen met CF15. Over het algemeen zijn de interacties tussen C. albicans en bacteriën zoals P. aeruginosa antagonistisch, maar kunnen ze leiden tot meer chronische en ernstige infecties18. De combinatie van microbiële interacties, zowel pathogeen als commensale, naast een reeks CF-gerelateerde omgevingsfactoren kan uiteindelijk resulteren in een verhoogde antibioticatolerantie19,20. Veel van deze factoren worden niet vaak overwogen in preklinische antibioticatests, ondanks dat ze in bestaande modellen worden toegeschreven aan een verhoogde antibioticatolerantie21.

Deze aandoeningen zijn ook moeilijk in vitro samen te vatten, en als gevolg daarvan missen veel modellen de aanwezigheid van specifieke tolerantie-inducerende factoren die aanwezig zijn in pwCF, zoals die welke de bèta-lactamaseproductie verhogen in P. aeruginosa22, de inductie van kleine kolonievarianten in Staphylococcus aureus en de remming van woordafbreking in C. albicans; waarvan is aangetoond dat ze allemaal voorkomen in CF-sputum23,24.

Er is daarom een groot verschil tussen de omstandigheden die worden gebruikt in de huidige testmethoden voor antibioticagevoeligheid, gebaseerd op planktonische of agarplaatgekweekte culturen in gestandaardiseerde media zoals Mueller-Hinton met schijfdiffusie, Etest en CLSI-bouillonmicrodilutietesten, en de omstandigheden die worden aangetroffen in de gastheeromgeving25. Dit slaagt er vaak niet in om de antibioticagevoeligheid nauwkeurig te bepalen26. Dit probleem wordt verder gecompliceerd door een gebrek aan standaardisatie bij het testen van antimicrobiële biofilm, waardoor het moeilijk is om de antimicrobiële werkzaamheid nauwkeurig te vertalen van het laboratorium naar de kliniek27,28.

Het polymicrobiële model dat we hier hebben ontwikkeld, toont een verhoogde tolerantie van Pseudomonas aeruginosa voor een reeks antimicrobiële stoffen, waaronder meropenem en tobramycine. Dit illustreert de grote variatie tussen de huidige antimicrobiële tests met behulp van mono-species biofilms en het polymicrobiële biofilmmodel dat in deze studie is ontwikkeld om minimale remmende concentraties te bepalen. Dit model behoudt ook een relatief hoge doorvoer en is goedkoop en wenselijk voor antimicrobiële tests. Het model kan ook worden gebruikt om de impact van antimicrobiële therapie op de polymicrobiële dynamiek te bestuderen en vast te stellen of een bepaalde behandeling ertoe kan leiden dat een bepaalde ziekteverwekker dominant wordt, waardoor verdere complicaties kunnen worden voorspeld. Hoewel dit model de opbouw van complexe biofilms mogelijk maakt, vereist de opstelling ervan geen geavanceerde laboratoriumapparatuur en biedt het een platform voor een breed scala aan klinische en onderzoeksresultaten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van Synthetische Cystic Fibrosis media-2 (SCFM2) en platen

  1. Maak SCFM2 volgens het recept beschreven in Palmer et al.16 in een borosilicaatglazen fles van 500 ml in een concentratie van 2x met een paar aanpassingen.
    1. Weeg de voorraden af en bereid ze voor zoals aangegeven in tabel 1. Bereid de aminozuurvoorraden voor volgens tabel 2.
    2. Weeg 5 g mucine (uit varkensmaag (type II)) en 600 mg eDNA (uit zalmsperma) af in 100 ml dH2O in een fles van 200 ml borosilicaatglas. Roer een nacht bij 4 °C voordat u het in de autoclaaf sterilisatie.
    3. Voeg aan een gesteriliseerde fles van 500 ml 0,54 g glucose, 6,06 g NaCl en 2,228 g KCl toe. Voeg 10 ml toe elk van de in stap 1.1.1 bereide bouillons. Stel de pH in op 6,9 met 1 M NaOH of HCl.
    4. Voeg 10 ml dH2O toe, gevolgd door 10 ml 0,175 M CaCl2 en 0,0606 M MgCl2. Bereid en voeg 10 ml 0,93 M L-melkzuur toe. Voeg direct voor gebruik 10 ml 0,36 mM Fe(III)SO47H2O toe
    5. Filter steriliseer de SCFM2 met behulp van een filtereenheid en vacuümpomp en voeg vervolgens het geautoclaveerde mucine en eDNA toe.
      OPMERKING: De bereide SCFM2 kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
  2. Bereid SCFM2-agarplaten voor zoals hieronder beschreven.
    1. Verwarm 25 ml 2x SCFM2 voor in een buis van 50 ml in een waterbad van 55 °C alvorens te mengen met 25 ml voorgesmolten 3% (w/v) technische agar, wat resulteert in een mengsel van 1x SCFM2 en 1,5% (w/v) technische agar.
    2. Breng met behulp van een serologische pipet 5 ml van het mengsel over in elk putje van een plaat met 6 putjes.
    3. Bereid hetzelfde aantal 13 mm polycarbonaat schijven met een poriegrootte van 0,2 μm voor door ze op de bodem van een petrischaal te plaatsen en UV-C gedurende 600 s aan te brengen bij een golflengte van 254 nm en een frequentie van 60 Hz. Draai de schijven om en herhaal de UV-C-procedure.
    4. Zodra de 1x SCFM2-1,5 % (m/v) technische agar is uitgehard, gebruikt u een steriele tang om een enkele schijf van polycarbonaat toe te voegen aan het oppervlak van elk putje van de plaat met 6 putjes.

2. Voorbereiding van bacteriën op infectie

  1. Voordat u het model instelt, moet u agarplaat(s) voorbereiden op de vereiste bacteriën en schimmelstammen volgens de standaardagar die in het laboratorium wordt gebruikt voor P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 en C. albicans SC5314 (bijv. Lysogene bouillon met 1,2% (w/v) agar voor bacteriën en Sabouraud dextrose-agar voor C. albicans).
    OPMERKING: Om het model vast te stellen, zijn specifieke laboratoriumreferentiestammen gebruikt. Dit model is echter ook gebruikt met andere stammen, waaronder klinische isolaten, met enkele aanpassingen, zoals het verlengen van de tijd voor het tot stand brengen van biofilm vóór behandeling voor langzamer groeiende stammen.
  2. Gebruik een inoculatielus van 1 μl om een enkele kolonie van elk micro-organisme te kiezen om 5 ml standaard vloeibare laboratoriummedia te inoculeren (bijv. Lysogenie bouillon voor P. aeruginosa, S. aureus en Gist pepton dextrose (YPD) voor C. albicans). Incubeer deze culturen tot ze de exponentiële groeifase bereiken bij 200 tpm, 37 °C voor de bacteriën, en 200 rpm, 30 °C voor C. albicans.
    OPMERKING: De beluchting is afhankelijk van de schudbroedmachine en de rotatiestraal

3. Instellen van het model voor de vaste luchtinterface

OPMERKING: Een algemene schematische weergave van het model is te zien in aanvullende figuur 1.

  1. Breng 1 ml van elke vloeibare cultuur over in een afzonderlijke steriele buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten op 8.000 x g om de bacteriën/schimmels te pelleteren. Voer deze en alle volgende centrifugatiestappen uit bij kamertemperatuur.
  2. Zuig het bovenstaande op met behulp van een pipet en suspendeer de pellets in 1 ml PBS voordat u ze opnieuw centrifugeert gedurende 2 minuten op 8.000 x g.
  3. Verwijder het bovenstaande zoals eerder en suspendeer de pellets opnieuw in 1 ml PBS. Verdun de geresuspendeerde P. aeruginosa en S. aureus cellen 1:10 in PBS en meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 600 nm.
  4. Pas gewassen monsters aan naar 1 x 108 kolonievormende eenheid (CFU)/ml op basis van eerdere validatie dat een OD600 van 0,05 voor P. aeruginosa en 0,1 voor S. aureus gelijk is aan 1 x 108 CFU/ml.
  5. Verdun voor C. albicans gewassen monsters 1:100 in PBS, voeg 10 μL van elk toe aan twee afzonderlijke kamers van een hemocytometer en gebruik de vaste afmetingen van de kamer en de verdunning die wordt gebruikt om CFU/ml te berekenen. Met behulp van de verbeterde Neubauer-hemocytometer ziet de berekening er als volgt uit:
    Aantal cellen = gemiddeld celgetal × 10.000 / (verdunningsfactor)
  6. De berekende CFU's vertegenwoordigen C. albicans CFU/ ml in het voorverdunde monster. Stel het C. albicans-monster in op 1 x 108 CFU/ml in PBS zoals bij de bacterieculturen.
  7. Om het inoculum voor te bereiden op toevoeging aan de biofilm, stelt u het P . aeruginosa inoculum in op 1 x 104 CFU/ml (2x 100-voudige verdunning), C. albicans op 1 x 105 CFU/ml (100-voudige verdunning gevolgd door een 10-voudige verdunning) en ten slotte S. aureus op 1 x 106 CFU/ml (100-voudige verdunning) met behulp van PBS.
  8. Voeg voor monospecies biofilms 10 μL van de verdunde gewenste microbe toe aan het midden van de polycarbonaatschijf die eerder op de 1x SCFM2-1,5 % technische agarplaten met zes putjes is geplaatst en incubeer statisch bij 37 °C gedurende 24 uur vóór behandeling of verstoring.
  9. Voeg voor polymicrobiële biofilms 10 μL van elke S. aureus en C. albicans toe op dezelfde schijf. Incubeer de geënte schijf statisch gedurende 24 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: De volgorde waarin de inoculums van S. aureus en C. albicans worden toegevoegd, heeft geen invloed op de ontwikkeling van het model en genereert dezelfde resultaten.
  10. Hierna brengt u de polycarbonaatschijven met een steriele tang over op verse 1x SCFM2-1,5% technische agarplaten en voegt u 10 μL van de 1 x 104 CFU/ml verdunning van P. aeruginosa toe bovenop de vooraf vastgestelde S. aureus - C. albicans biofilm. Incubeer nog 24 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: P. aeruginosa wordt 24 uur na S. aureus en C. albicans toegevoegd om de volgorde weer te geven waarin deze organismen vaak de CF-long koloniseren bij mensen met CF. Dit voorkomt ook dat P. aeruginosa de andere twee micro-organismen ontgroeit. Zodra P. aeruginosa is toegevoegd, kan de biofilm langer dan 24 uur worden gekweekt; De polycarbonaatschijf met de biofilm moet echter elke 24 uur op nieuwe media worden overgebracht. Vóór verstoring kunnen biofilms worden gebruikt voor microscopie met behulp van stammen die fluorescerende eiwitten, fluorescerende kleurstoffen of stam-/microbe-specifieke antilichamen tot expressie brengen. Het is echter vermeldenswaard dat sommige kleurstoffen vlekken maken op de polycarbonaatschijf.

4. Verstoring van de biofilm

  1. Voeg keramische kralen met een diameter van 2,8 mm toe aan de platen en vernet de platen met UV-crosslink zoals beschreven in stap 1.3. Voeg 5 keramische kralen toe aan een steriele homogenisatorbuis van 2 ml met behulp van een vlamgesteriliseerde tang. Piket vervolgens 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de homogenisatiebuis van 2 ml.
  2. Vortexbuizen gedurende ten minste 10 s of totdat de biofilm van de polycarbonaatschijf is verwijderd, bepaald door visuele inspectie, waarna de polycarbonaatschijf wordt verwijderd.
  3. Plaats de buisjes met de kralen in de homogenisator en klop 2x gedurende 10 s met 6 m/s met een interval van 10 s tussen de beats.
    OPMERKING: Deze combinatie van kralen, kloptijd en gebruik van homogenisator resulteert in voldoende verstoring van de biofilm met minimale lysis zoals bepaald door microscopie en kolonievormende eenheden. Dit kan variëren afhankelijk van de specifieke kralenklopper die wordt gebruikt.
  4. Giet verstoorde biofilm uit de homogenisatorbuis in een bijou van 7 ml met 4 ml PBS, wat resulteert in een eindvolume van 5 ml.
  5. Zorg ervoor dat alle vloeistof uit de homogenisatorbuizen naar de bijou is overgebracht door de buizen gedurende 2 minuten op 8.000 x g te centrifugeren en de resterende vloeistof over te brengen naar de 7 ml bijou.
    OPMERKING: Van deze 5 ml verstoorde biofilm kan een reeks analyses worden uitgevoerd, maar het is van cruciaal belang om voor alle berekeningen de 1 ml biofilm PBS-verdunning in een eindvolume van 5 ml te onthouden.

5. Testen van metabole activiteit

  1. Voeg 200 μL van de verstoorde biofilm uit stap 4 hierboven toe aan een zwarte plaat met 96 putjes met een heldere bodem. Voeg vervolgens 10 μL 0,02% (m/v) resazurine-oplossing toe.
  2. Incubeer de met resazurine behandelde biofilm met een plaatlezer en lees de metabolische activiteit af. Incubeer de plaat bij 37 °C en schud elke 30 minuten gedurende 10 s bij 200 tpm orbitaal alvorens fluorescerende metingen te doen.
  3. Meet de fluorescentie met behulp van een excitatie van 540 nm en een emissie van 590 nm. Herhaal deze cyclus van 30 minuten gedurende 4 uur met behulp van een plaatlezer.
    OPMERKING: Het tijdspunt van 4 uur wordt gebruikt omdat het meer duidelijke variaties biedt tussen behandelde versus onbehandelde monsters en tussen monsters met variërende antibioticaconcentraties.

6. Antimicrobiële gevoeligheidstesten

  1. Om de antimicrobiële tolerantie van standaardantibiotica te testen, lost u de antibiotica van uw keuze op in het bijbehorende oplosmiddel en voegt u dit toe aan het 1x SCFM2-1,5% (w/v) technische agarmedium terwijl het nog vloeibaar is voordat u 5 ml overbrengt naar elk putje van een plaat met zes putjes. Eenmaal uitgehard, brengt u de biofilm die op de polycarbonaatschijf is gegroeid met behulp van een steriele tang over op de bovenkant van de antibioticahoudende media en voegt u een druppel van 10 μL van de overeenkomstige antibioticaconcentratie toe op de bovenkant van de biofilm.
    OPMERKING: Voor deze studie werd een 2-log fold seriële verdunning tussen 64 μg/ml en 0,125 μg/ml meropenem en tobramycine gebruikt om klinisch relevante concentraties weer te geven. Het is voldoende om antibiotica of andere antimicrobiële/antivirulentiebehandelingen uitsluitend bovenop de biofilm toe te dienen, aangezien vergelijkbare reacties zijn waargenomen wanneer ze zowel aan de media als aan de biofilm worden toegevoegd.
  2. Na 24 uur incubatie bij 37 °C met de behandeling, beeldt u biofilms af en verstoort u deze zoals beschreven in stap 4.
  3. Neem van de 5 ml verstoorde cultuur een aliquot en voer een 10-voudige seriële verdunning uit met behulp van PBS. Plak 10 μL-vlekken in drievoud op agar om kolonievormende eenheden te bepalen met behulp van de Miles en Misra-methode30.
    OPMERKING: Het volume dat aan agarplaten wordt toegevoegd, heeft invloed op de detectielimiet, grotere volumes verlagen de detectielimiet, maar vereisen meer monster en agarplaten.
  4. Voor monospecies biofilms streep P. aeruginosa en S. aureus op LB-agarplaten en C. albicans op SDA-agar.
  5. Plaats voor polymicrobiële biofilms aliquots op drie verschillende selectieve media die antibiotica bevatten om elk van de drie soorten te isoleren en de bepaling van CFU's mogelijk te maken. Dit omvat Pseudomonas-isolatieagar en mannitolzoutagar die nystatine bevatten in een dosis van 10 μg/ml om respectievelijk P. aeruginosa en S. aureus te isoleren, en Sabouraud-dextrose-agar met tetracycline in een dosis van 125 μg/ml om C. albicans te isoleren. Incubeer de platen S. aureus een nacht bij 37 °C en de platen P. aeruginosa en C. albicans bij 30 °C.
    OPMERKING: Incubeer P. aeruginosa-platen bij 30 °C om overgroei van de kolonie te minimaliseren en zwermen te verminderen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eenvoud van het biofilmmodel met vaste-luchtinterface maakt het mogelijk om een groot aantal antimicrobiële stoffen onder verschillende klinisch relevante omstandigheden tegelijk te screenen. Dit model maakt het mogelijk om de effectiviteit van antibiotica te evalueren met behulp van CFU-tellingen en metabole assays in zowel mono- als polymicrobiële biofilms die in een week kunnen worden uitgevoerd. Vanwege de aard van het model maakt het ook een gemakkelijke manipulatie van de omgevingsomstandigheden mogelijk, zoals het wijzigen van de mediasamenstelling en het plaatsen van de biofilms onder verminderde zuurstof en anaërobe omstandigheden. Met behulp van dit model hebben we veranderingen in tolerantie aangetoond voor twee antibiotica die vaak worden gebruikt bij pwCF tussen P. aeruginosa gekweekt in monospecies en polymicrobiële biofilms (Figuur 1). Daarnaast hebben we kunnen bepalen hoe antimicrobiële behandeling de populatiedynamiek binnen polymicrobiële biofilms kan beïnvloeden (Figuur 2).

Om deze experimenten uit te voeren, werd het eerste inoculum bereid zoals gespecificeerd in het bovenstaande protocol, wat leidde tot de vorming van stabiele monosoorten en polymicrobiële biofilms met reproduceerbare CFU/ml en kleine standaarddeviaties zoals bepaald door een- of tweerichtings-ANOVA. Dit model benadrukte ook consistente groei en CFU-herstel, en bood de mogelijkheid om deze klassieke microbiologische technieken te combineren met andere technieken die niet in deze studie zijn uitgevoerd zonder de noodzaak van geavanceerde verwerking. Deze omvatten beeldvorming zoals levend/dood, matrixvisualisatie en moleculaire analyse, die andere driedimensionale modellen niet op zo'n toegankelijke manier kunnen bieden (Figuur 1)31. Opgemerkt moet worden dat de verwachte standaarddeviatie voor CFU/ml toeneemt wanneer de gegevens worden weergegeven als het percentage van overleving in vergelijking met CFU/ml (Figuur 1). Bij het vergelijken van de effectiviteit van antibioticabehandeling tussen monospecies en polymicrobiële biofilms, was er een significante toename van alle antibioticaconcentraties die nodig waren om 50% doding te bereiken. Een toename van de antibioticaconcentratie met 2 logs was nodig om dit niveau van doding voor meropenem en tobramycine te bereiken (Figuur 1). Er was ook een algemene toename van de overleving van P. aeruginosa in aanwezigheid van S. aureus en C. albicans in de polymicrobiële biofilm bij behandeling met 64 μg/ml tobramycine, terwijl het tegenovergestelde waar was voor meropenem.

De methode die wordt gebruikt om de metabole activiteit te bepalen, meet de totale activiteit van de gehele polymicrobiële biofilm zonder de individuele bijdrage van elke soort te kunnen onderscheiden. Om deze reden worden alleen metabolische veranderingen van monospecies aangetoond die het gebruik van metabole activiteitstesten voor dit model aantonen. Voor monospecies biofilms was er een sterke relatie tussen de overleving van P. aeruginosa en de metabole activiteit voor zowel meropenem als tobramycine (Figuur 2). Het gebruik van zowel metabole activiteit als CFU-tellingen uit dezelfde monsters maakt het mogelijk om zowel bacteriostatische als bacteriedodende effecten gemakkelijk te identificeren. Voor polymicrobiële biofilms kan de bepaling van de metabole activiteit aangeven hoe het richten op één soort een algehele toename van de metabolische activiteit van biofilm kan veroorzaken en daarom mogelijk de microbiële groei van andere soorten kan verhogen.

Hoewel CFU's de gouden standaard zijn voor antimicrobiële gevoeligheidstests, maken ze in polymicrobiële biofilms ook de beoordeling van de soortensamenstelling in de biofilm mogelijk. Door P. aeruginosa te behandelen in polymicrobiële biofilms, kunnen we niet alleen de verhoogde MBEC50 voor dit organisme aantonen, maar ook het effect hiervan op de andere co-geïsoleerde soorten vaststellen (Figuur 3). Dit is bijvoorbeeld te zien bij meropenem (antipseudomonaal), waar de vermindering van P. aeruginosa gepaard gaat met een toename van S. aureus en C. albicans CFU, waardoor S. aureus het meest voorkomende organisme wordt bij blootstelling aan bepaalde antibioticaconcentraties (Figuur 3A). Dit benadrukt het belang van het overwegen van de polymicrobiële aard van de biofilm vanwege de mogelijke toename van de populatiegrootte van andere ziekteverwekkende soorten bij de behandeling van een bepaalde ziekteverwekker.

figure-results-1
Figuur 1: Variatie in antimicrobiële tolerantie van P. aeruginosa voor meropenem en tobramycine tussen mono- en polymicrobiële biofilms gekweekt in het vaste-luchtinterfacemodel. P. aeruginosa PAO1 gekweekt in mono- of polymicrobiële biofilms met S. aureus en C. albicans werd vastgesteld met behulp van de vaste-luchtinterfacemodellen gedurende 24 uur op SCFM2. Biofilms werden behandeld met een reeks (A) meropenem- of (B) tobramycineconcentraties van 0,125 μg/ml tot 64 μg/ml, samen met een antibioticavrije controle. De CFU/ml van elke biofilm werd bepaald. P. aeruginosa CFU's werden bepaald in PIA en omgezet in percentage overleving door de negatieve controle te gebruiken als de 100% overleving. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan en elk gegevenspunt is afgeleid van 3 biologische herhalingen, elk met drie technische herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Variatie in metabole activiteit van P. aeruginosa biofilms in aanwezigheid van meropenem of tobramycine gekweekt in het vaste-lucht interfacemodel. P. aeruginosa PAO1-biofilms werden gekweekt op SCFM2 in het vaste-luchtinterfacemodel en een reeks (A) meropenem- of (B) tobramycineconcentraties van 0,125 μg/ml tot 64 μg/ml werden toegevoegd, samen met een antibioticavrije controle. De plaat werd fluorescerend afgelezen bij een excitatie van 540 nm en een emissie van 590 nm om de 30 minuten. Het percentage metabole activiteit werd berekend door het percentage van deze activiteit op elk met antibiotica behandeld monster te bepalen in vergelijking met de controle zonder antibiotica. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan en elk gegevenspunt is afgeleid van 3 biologische herhalingen, elk met drie technische herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Impact op het totale aantal CFU's van P. aeruginosa, S. aureus en C. albicans teruggevonden uit het polymicrobiële vaste-luchtinterfacemodel na antimicrobiële behandeling. S. aureus en C. albicans werden gekweekt op SCFM2 op het vaste-luchtinterfacemodel. P. aeruginosa werd toegevoegd en een bereik van 0,125 μg/ml tot 64 μg/ml concentraties van (A) meropenem of (B) tobramycine werden toegevoegd aan de biofilms naast een niet-antibioticacontrole. De CFU/ml van elke biofilm werd bepaald. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan en elk gegevenspunt is afgeleid van 3 biologische herhalingen, elk met drie technische herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Oprichting en workflow van het vaste-luchtinterfacemodel. Grafische weergave van het vaste-luchtinterfacemodel, biofilmverstoring en outputs. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven biofilmmodel stelt ons in staat om sommige aspecten van de CF-longinfectieomgeving na te bootsen door een reeks veelvoorkomende polymicrobiële interacties op een meer toegankelijke manier op te nemen dan momenteel gebruikte in vitro antimicrobiële testmethoden zoals de CDC-reactor en het Lubbock-biofilmmodel31. Dit is belangrijk wanneer een reeks factoren, waaronder de fysische eigenschappen van de biofilm, de beschikbaarheid van voedingsstoffen en moleculaire interacties tussen de soorten in de biofilm, zowel de activiteit van het antimicrobiële middel als de reactie van de microben op het antimicrobiële middel kunnen beïnvloeden21. Door deze factoren mee te nemen, zijn we in staat geweest om een zeer veelzijdig model te ontwikkelen dat de voorspelling van antimicrobiële behandelingsresultaten nauwkeuriger mogelijk maakt dan de huidige modellen die geen rekening houden met de bovengenoemde factoren.

P. aeruginosa, S. aureus en C. albicans werden gekozen als representatieve Gram-positieve, Gram-negatieve en schimmels die vaak worden geïsoleerd in CF32. We hebben echter ook kunnen aantonen dat dit model kan worden gebruikt voor een reeks andere CF-relevante microben, waaronder Burkholderia cenocepacia, Burkholderia multivorans, Aspergillus fumigatus, en momenteel wordt aangepast voor gebruik met anaërobe bacteriën zoals Prevotella melaninogenica. Dit toont de veelzijdigheid van het model aan, aangezien een breed scala aan microben kan worden opgenomen, wat het aanpassingsvermogen van dit model benadrukt voor antimicrobiële tests tegen een breed scala aan microbiële pathogenen. Het model kan ook eenvoudig worden aangepast aan een reeks omgevingsomstandigheden voor meer gepersonaliseerde antimicrobiële gevoeligheidstests, inclusief de vervanging van SCFM2 door sputum van de patiënt.

Het overwegen van polymicrobiële biofilmmodellen voor het testen van nieuwe antimicrobiële stoffen is ook van het grootste belang, aangezien ze een bestaande leemte in de ontwikkelingspijplijn van antimicrobiële stoffen kunnen opvullen voordat ze worden gebruikt in dier- of mensstudies33,34. Daarnaast handhaaft het model een relatief hoge doorvoer en maakt het een reeks outputs mogelijk die relevant zijn voor zowel de industrie als het onderzoek.

Hoewel we in dit artikel alleen CFU's en metabole activiteit hebben geïllustreerd, hebben we ook het nut van het model aangetoond bij de analyse van het biofilm exometaboloom met behulp van massaspectrometrie voor oppervlakteanalyse van vloeistofextractie (LESA). Dit maakt het mogelijk om enkele van de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële tolerantie35. Naast deze andere resultaten hebben we ook het gebruik van dit model aangetoond voor het testen van nieuwe antimicrobiële toedieningssystemen. Deze omvatten polymeer-ciprofloxacineconjugaten om de penetratie van dit antibioticum in de biofilm te verbeteren, terwijl de activiteit ervan wordt verhoogd en de ontwikkeling van resistentie wordt verminderd36.

Kritieke stappen en overwegingen
Het is belangrijk om steriliteit te behouden, vooral bij de productie van SCFM2 en media, omdat besmetting kan leiden tot de introductie van niet-natuurlijk voorkomende soorten, wat de resultaten kan verstoren. Verschillende stammen van dezelfde microbe en verschillende microben kunnen verschillende omgevingsomstandigheden nodig hebben voor groei of kunnen verschillende groeikenmerken hebben. Daarom moet het model worden geoptimaliseerd voordat een antibioticagevoeligheidstest wordt uitgevoerd. We raden aan om een kleine pilotstudie van 24 uur en 48 uur uit te voeren voor monosoorten en polymicrobiële biofilm om de groei onder standaardmodelomstandigheden te beoordelen. We hebben ontdekt dat verschillende P. aeruginosa-stammen en bepaalde antibioticaconcentraties kunnen leiden tot zwermen van de polycarbonaatschijf. Dit kan gemakkelijk worden ondervangen door grotere schijven te gebruiken die in de handel verkrijgbaar zijn. Verstoring van de biofilm kan ook optimalisatie vereisen, afhankelijk van de kralenklopper en de gebruikte microben. We hebben de disruptiemethode geoptimaliseerd door de CFU/ml van een bekend monster voor en na het parelslaan te bepalen. We gebruikten ook microscopie om de bead beat-monsters te visualiseren om te visualiseren hoe goed de biofilm werd verstoord.

Een van de beperkingen van dit CF-nabootsende biofilmmodel is de bevestiging aan een vast oppervlak dat polycarbonaat bevat, dat niet wordt aangetroffen in de CF-long, in plaats van vrij zwevende aggregaten te zijn in het CF-sputum37 . Het hier gepresenteerde vaste agarmodel sluit echter de noodzaak uit om de biofilms te wassen om planktonische microben te verwijderen en zorgt ervoor dat de resultaten alleen microben bevatten die zijn afgeleid van de biofilm, in tegenstelling tot een gemengde planktonische biofilmcultuur. We hebben ook ontdekt dat de penetratie van sommige antibiotica in de diepere delen van dit biofilmmodel kan worden verminderd, en het gebruik van DNase kan nodig zijn om de reologie van de extracellulaire matrix te veranderen en de elektrostatische interacties met eDNA te verminderen.

Wij zijn van mening dat het model zeer geschikt is voor antimicrobiële tests vanwege zijn veelzijdigheid, aanpassingsvermogen en opname van omgevingsfactoren waar veel bestaande modellen geen rekening mee houden. Het gebruik ervan in fundamenteel onderzoek en preklinische antimicrobiële gevoeligheidstesten kan een meer klinisch relevante benadering bieden voor ASAT van klinische monsters en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor dit werk wordt geen belangenconflict of tegenstrijdig financieel belang verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk is gefinancierd door het National Biofilms Innovation Centre (NBIC), een innovatie- en kenniscentrum dat wordt gefinancierd door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council, Innovate UK en Hartree Centre [Awards BB/R012415/1 en BB/X002950/1] en door de UK CF Trust en USA CF Foundation Strategic Research Centre: 'Een evidence-based preklinisch kader voor de ontwikkeling van antimicrobiële therapieën bij cystische fibrose' (PIPE-CF) [Award SRC022].

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 µL inoculation loops 
13 mm 0.2 µm pore size polycarbonate discs Isopore GTTP01300Grotere discs zijn ook beschikbaar 
2 mL reinforced tubes Thermofisher 15545809
2.5 mL ceramic beads Qiagen13114-325
500 mL borosilicate glass Duran bottleSigma Aldrich Z305197grotere flessen beschikbaar in grotere volumes zijn gewenst
6-well culture platesGreiner657165
7 mL BijouThermofisher 129B
96-well platesThermofisher 167008voor seriële verdunningen in CFU-assay
Agar plates voor het bereiden van platen van P. aerugnisa, S. aureus, en C. albicans LB miller voor P. aeruginosa en S. aureus en Sabouraud dextrose agar  voor C. albicans 
Bead beater - geschikt voor 2 mL tubesFisherbrand 15515799Thermofisher bead mill 24
bench top centrifuge moet minimaal 8000 x g kunnen
Black clear bottom 96 well platesCostar 3603
Bunsen Burner 
Containers voor het weggooien van besmet materiaal volgens de gezondheids- en veiligheidsvoorschriften van het instituut. 
deionised water 
eDNA Sigma Aldrich 31149
Filter unit Fisherbrand FB12566504Verwisselbaar, afhankelijk van de gebruikte vacuümpomp, maar moet een poriegrootte van 0,2 µm hebben
Haemocytometer en dekglasHawksley HC001Haemocytometers kunnen in grootte en volume verschillen. Controleer en pas CFU-berekeningen dienovereenkomstig aan 
LB broth oxoid 1.46813
Mannitol salt agar Oxoid CM0085B
meropenemabcrAb243429
Mucin from porcine stomach Type IISigma Aldrich M2378
NystatinMillipore 1003352658
petri dishes SLSSLS2000
Phosphate buffered saline 
Pseudomonas isolation agarMillipore 17208
Resazurin sodium salt Sigma Aldrich 199303
Sabouraud dextrose agar Oxoid CM0041
selection of forceps fijne punt en weefseltang met tanden voor het overbrengen van keramische kralen
serological pipette
shaking and static incubators moet temperatuur gecontroleerd zijn
Sparks microtitre plate readerTecan Voor Resazurin-assay moet de microtitre plate reader de juiste filters hebben of een monochromator zijn voor het detecteren van fluoresceren. 
spectrophotometer
Technical agar (Agar Technical No.2 )Oxoid LP0012B 
tetracyclineSigma Aldrich T7660
UV crosslinker Spectroline 11-992-89
vacuum pump/ flaskFisherbrand FB12566504
water bath moet in staat zijn om 55 °C te handhaven
YPD broth Millipore Y1375 Kan kant-en-klaar worden gekocht of gemaakt met behulp van de basisingrediënten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. 2021 Cf foundation patient registry highlights report. , Available from: https://cysticfibrosis.msu.edu/index.php/welcome/news-and-events/39-2021-cf-foundation-patient-registry-highlights-report (2022).
  2. Guo, J., Garratt, A., Hill, A. Worldwide rates of diagnosis and effective treatment for cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 21 (3), 456-462 (2022).
  3. Mandal, V., Ghosh, N. N., Mitra, P. K., Mandal, S., Mandal, V. Production and characterization of a broad-spectrum antimicrobial 5-butyl-2-pyridine carboxylic acid from Aspergillus fumigatus nhf-01. Sci Rep. 12 (1), 6006(2022).
  4. Françoise, A., Héry-Arnaud, G. The microbiome in cystic fibrosis pulmonary disease. Genes. 11 (5), 536(2020).
  5. Grasemann, H., Ratjen, F. Cystic fibrosis. New Engl J Med. 389 (18), 1693-1707 (2023).
  6. Camus, L., Vandenesch, F., Moreau, K. From genotype to phenotype: Adaptations of pseudomonas aeruginosa to the cystic fibrosis environment. Microb Genom. 7 (3), mgen000513(2021).
  7. Rossi, E., et al. Pseudomonas aeruginosa adaptation and evolution in patients with cystic fibrosis. Nat Rev Microbiol. 19 (5), 331-342 (2021).
  8. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  9. Grainha, T., Jorge, P., Alves, D., Lopes, S. P., Pereira, M. O. Unraveling pseudomonas aeruginosa and candida albicans communication in coinfection scenarios: Insights through network analysis. Front Cell Infect Microbiol. 10, 550505(2020).
  10. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  11. Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  12. Lorusso, A. B., Carrara, J. A., Barroso, C. D. N., Tuon, F. F., Faoro, H. Role of efflux pumps on antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa. Int J Mol Sci. 23 (24), 15779(2022).
  13. Michaelis, C., Grohmann, E. Horizontal gene transfer of antibiotic resistance genes in biofilms. Antibiotics .(Basel). 12 (2), 328(2023).
  14. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J Clin Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
  15. König, J., Schreiber, R., Voelcker, T., Mall, M., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) inhibits ENaC through an increase in the intracellular Cl- concentration. EMBO Reps. 2 (11), 1047-1051 (2001).
  16. Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and cues key aspects of Pseudomonas aeruginosa physiology. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
  17. Valenza, G., et al. Prevalence and antimicrobial susceptibility of microorganisms isolated from sputa of patients with cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 7 (2), 123-127 (2008).
  18. Alam, F., Catlow, D., Di Maio, A., Blair, J. M. A., Hall, R. A. Candida albicans enhances meropenem tolerance of Pseudomonas aeruginosa in a dual-species biofilm. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 925-935 (2020).
  19. Burmølle, M., Ren, D., Bjarnsholt, T., Sørensen, S. J. Interactions in multispecies biofilms: Do they actually matter. Trends Microbiol. 22 (2), 84-91 (2014).
  20. Lories, B., Belpaire, T. E. R., Smeets, B., Steenackers, H. P. Competition quenching strategies reduce antibiotic tolerance in polymicrobial biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 23(2024).
  21. Nabb, D. L., et al. Polymicrobial interactions induce multidrug tolerance in Staphylococcus aureus through energy depletion. Front Microbiol. 10, 2803(2019).
  22. Cornforth, D. M., et al. Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (22), E5125-E5134 (2018).
  23. Wolter, D. J., et al. Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis. Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).
  24. Takagi, J., et al. Mucin o-glycans are natural inhibitors of Candida albicans pathogenicity. Nat Chem Biol. 18 (7), 762-773 (2022).
  25. Cinical and Laboratory Standard Institute. Methods for dilution susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 35 Tenth Edition, (2), (2015).
  26. Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. J Mol Biol. 427 (23), 3646-3661 (2015).
  27. Macia, M. D., Rojo-Molinero, E., Oliver, A. Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria. Clin Microbiol Infect. 20 (10), 981-990 (2014).
  28. Coenye, T., Goeres, D., Van Bambeke, F., Bjarnsholt, T. Should standardized susceptibility testing for microbial biofilms be introduced in clinical practice. Clin Microbiol Infect. 24 (6), 570-572 (2018).
  29. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  30. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg. 38 (6), 732-749 (1938).
  31. Robertson, S. N., Romero, M., Fenn, S., Kohler Riedi, P. L., Cámara, M. Development, characterization, and evaluation of a simple polymicrobial colony biofilm model for testing of antimicrobial wound dressings. J Appl Microbiol. 135 (3), lxae042(2024).
  32. Rumpf, C., Lange, J., Schwartbeck, B., Kahl, B. C. Staphylococcus aureus and cystic fibrosis-a close relationship. What can we learn from sequencing studies. Pathogens. 10 (9), 1177(2021).
  33. Tay, W. H., Chong, K. K. L., Kline, K. A. Polymicrobial-host interactions during infection. J Mol Biol. 428 (17), 3355-3371 (2016).
  34. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00519 (2019).
  35. Arjes, H. A., et al. Three-dimensional biofilm colony growth supports a mutualism involving matrix and nutrient sharing. eLife. 10, e64145(2021).
  36. Kasza, K., et al. Ciprofloxacin poly(β-amino ester) conjugates enhance antibiofilm activity and slow the development of resistance. ACS Appl Mater Interf. 16 (5), 5412-5425 (2024).
  37. Martin, I., Waters, V., Grasemann, H. Approaches to targeting bacterial biofilms in cystic fibrosis airways. Int J Mol Sci. 22 (4), 2155(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Polymicrobi le biofilmantimicrobi le testensynthetische sputummediaPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusCandida albicansmetabole activiteitconfocale microscopie

Gerelateerde artikelen