Bepaling van de serumstabiliteit van het humaan enzym adenosinedeaminase 1

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we methoden om het vermogen van een enzym om zijn functie te behouden te karakteriseren wanneer het wordt geïncubeerd bij 37 °C in menselijk serum, een farmacologische eigenschap die de serumstabiliteit wordt genoemd. Dit vermogen kan een sleutelfactor zijn bij het voorspellen van het farmacokinetische profiel van een enzym en de geschiktheid ervan voor therapeutisch gebruik.

Samenvatting

Het concept van enzymstabiliteit wordt meestal gebruikt om te verwijzen naar de thermostabiliteit van een enzym - het vermogen om structuur en activiteit te behouden naarmate de temperatuur stijgt. Voor een therapeutisch enzym kunnen ook andere stabiliteitsmetingen van cruciaal belang zijn, met name het vermogen om de functie in humaan serum bij 37 °C te behouden, wat we serumstabiliteit noemen. Hier beschrijven we een in vitro test om de serumstabiliteit van het wildtype Homo sapiens adenosine deaminase I (HsADA1) enzym te beoordelen met behulp van een op absorptie gebaseerde microplaatprocedure. In het bijzonder beschrijft dit manuscript de bereiding van buffers en reagentia, een methode die zorgt voor de cocubatie van HsADA1 in serum, een methode om de testmonsters te analyseren met behulp van een microplaatlezer en een begeleidende analyse om de fractie van de activiteit te bepalen die een HsADA1-enzym in serum vasthoudt als functie van de tijd. We bespreken verder overwegingen om dit protocol aan te passen aan andere enzymen, aan de hand van een voorbeeld van een Homo sapiens kynureninase-enzym, om de aanpassing van het protocol aan andere enzymen te helpen waar serumstabiliteit van belang is.

Inleiding

De volgende methode stelt een gebruiker in staat om kwantitatief het vermogen van een enzym te beoordelen om zijn activiteit te behouden wanneer het wordt blootgesteld aan omstandigheden die lijken op wat het zal tegenkomen na intraveneuze injectie. De in-vitromethode bootst dergelijke in-vivoomstandigheden na en bestaat uit de incubatie van het enzym in gepoold humaan serum bij 37 °C en tijdgebonden analyses van het behoud van enzymactiviteit. We verwijzen naar het vermogen van een enzym om activiteit te behouden in deze omstandigheden als zijn serumstabiliteit, en de analysemethode voor enzymactiviteit maakt gebruik van verschillen in absorptie tussen het substraat van een enzym en het resulterende product. Het concept van serumstabiliteit is niet alleen enzymspecifiek en is ook toegepast op verschillende andere behandelingsmodaliteiten. Zo is de serumstabiliteit van RNA-aptameren gericht op COVID-spike-eiwitten eerder beoordeeld door hun afbraak na incubatie te monitoren met foetaal kalfsserum¹. Antibacteriële peptiden zijn ook beoordeeld op hun vermogen om bacteriegroei na incubatie te onderdrukken met gepoold humaan serum².

HsADA1 is een enzym dat de omzetting van adenosine of 2-deoxyadenosine in respectievelijk inosine of 2-deoxyinosine katalyseert³. Adenosine heeft een absorptiepiek van 260 nm, terwijl inosine het sterkst absorbeert bij 250 nm⁴. Deze verschuiving in absorptiepieken kan worden gedetecteerd op een microplaatlezer door een afname van de absorptie-intensiteit bij 260 nm wanneer HsADA1 wordt toegevoegd aan adenosine. Het HsADA1-enzym heeft belangrijke implicaties voor het menselijk lichaam en het tekort eraan veroorzaakt een ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (ADA-SCID)⁵. De runderhomoloog van HsADA1, BtADA1, kan worden gebruikt als een enzymvervangend therapeutisch middel voor de behandeling van ADA-SCID, en we hebben eerder aangetoond dat wildtype HsADA1 zijn activiteit verliest wanneer het wordt geïncubeerd met gepoold humaan serum, waardoor het gebruik ervan als therapeutisch middel mogelijk wordt belemmerd⁶. Daarom hebben we het wildtype HsADA1-enzym geselecteerd om een procedure te demonstreren om de serumstabiliteit van een enzym te bepalen. Een gedetailleerde zuiveringsmethode voor HsADA1 is eerder beschreven⁶.

In het volgende protocol (zoals beschreven in figuur 1) laten we zien hoe wildtype HsADA1 kan worden gecoördineerd in gepoold humaan serum bij 37 °C. Gedurende deze tijd worden testmonsters op gedefinieerde tijdstippen genomen en snel ingevroren voor toekomstige analyse. Nadat alle monsters zijn genomen, wordt een microplaattest uitgevoerd waarbij elk monster wordt gecombineerd met het substraat, waarbij de resulterende absorptieafname een correlatie is voor de behouden activiteit van het enzym. Representatieve resultaten die de serumstabiliteit van HsADA1 illustreren, worden getoond, en omdat deze metriek relevant kan zijn voor het bepalen van de potentiële therapeutische waarde van andere enzymen, bespreken we ook overwegingen om dit protocol aan te passen aan een gemanipuleerd Homo sapiens kynureninase-enzym (HsKYNase) en enzymen in het algemeen. HsKYNase is een enzym dat betrokken is bij het metabolisme van tryptofaan en is in staat om de tryptofaan-bijproducten kynurenine en hydroxy-kynurenine (OH-Kyn) af te breken tot respectievelijk anthranilzuur en hydroxy-anthranilzuur (OH-AA). Enzymgemedieerde modulatie van het tryptofaanmetabolisme kan van therapeutisch belang zijn⁷.

Protocol

1. Serum incubatie

1. Bereid een 10x voorraad HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) in een eindconcentratie van 10 μM. Ontdooi een 15 ml aliquot gepoold humaan serum en verwarm het voor tot 37 °C. Verwarm een aliquot van 50 ml 1x PBS voor op 37 °C.
2. Bereid de enzym-serumincubatiemengsels voor door 100 μl van de 10x HsADA1-bouillon toe te voegen aan 900 μl gepoold humaan serum in een microcentrifugebuis met lage binding, het enzym + serummengsel genoemd. Voeg in een aparte microcentrifugebuis met lage binding 100 μl van de 10x HsADA1-voorraad toe aan 900 μl 1x PBS ter vergelijking met een niet-serumcontrole, ook wel het enzym + 1x PBS-mengsel genoemd. De uiteindelijke concentratie van HsADA1 in elk mengsel zal 1 μM zijn.
3. Bereid een extra controle voor in een microcentrifugebuis met lage binding, bestaande uit 100 μl 1x PBS gemengd met 900 μl gepoold humaan serum. Dit zal dienen als de niet-enzymcontrole voor het enzym + serummengsel. Maak daarnaast een controle die bestaat uit 1 ml 1x PBS. Dit zal dienen als de niet-enzymcontrole voor het enzym + 1x PBS-mengsel.
4. Aliquot 100 μL van elk mengsel uit stap 1.2 in afzonderlijke low-binding buisjes en verdun 1:1 met 100 μL 30% (v/v) glycerol in 1x PBS. Snelvriezen met vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C. Deze monsters zijn het tijdstip van dag 0 en de concentratie van HsADA1 daarin is 500 nM. Herhaal deze stap voor de niet-enzymcontrolemengsels uit 1.3. Sluit alle enzymen en controlemengsels af met een transparante folie en plaats ze in een incubator van 37 °C.
5. Na 24 uur aliquot 100 μl van elk geïncubeerd monster en verdun 1:1 met 100 μl 30% (v/v) glycerol in 1x PBS. Snelvriezen met vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C. Deze voorbeelden zijn het tijdstip van dag 1. Breng alle enzym- en controlemengsels terug naar de incubator van 37 °C. Herhaal deze stap na 72 uur en 120 uur.
   OPMERKING: Gecertificeerde monsters hoeven niet per se met een flits te worden ingevroren. Als alternatief kan de gebruiker de op microtiterplaten gebaseerde test onmiddellijk na het nemen van elk monster uitvoeren, hoewel elke keer dat een monster wordt getest, nieuwe standaardcurven en adenosinesubstraatvoorraden moeten worden bereid.

2. Analyse op basis van microtiterplaten

1. Bereid de microplaatlezer voor door een kinetisch leesprotocol in te stellen (Figuur 2) om de absorptie bij 260 nm met het kortste leesinterval gedurende 30 minuten te meten en de lezer voor te verwarmen op een instelpunt van 37 °C.
2. Ontdooi alle verzamelde monsters op ijs. Verdun elk ontdooid monster 1:10 met behulp van 1x PBS voorverwarmd tot 37 °C als verdunningsmiddel in microcentrifugebuisjes met een lage binding. De nieuwe HsADA1-concentratie in deze monsters zal 50 nM zijn.
3. Maak ook een 10x verdunning tot 1x PBS van het niet-enzym serumcontrolemonster. Bereid daarnaast een adenosinebouillon van 5 mM door 66,8 mg adenosine toe te voegen aan 50 ml 1x PBS. Bereid een verdunning van 250 μM adenosine voor door 400 μL van de adenosinebouillon toe te voegen aan 7.600 μL 1x PBS en verwarm dit voor tot 37 °C in een incubator.
4. Voeg aan een 96-wells UV-compatibele microtiterplaat 160 μL van de 250 μM adenosineverdunning en 40 μL van elk verdund eiwitmonster in drievoud toe voor een totaal volume van 200 μL. Dit levert een uiteindelijke adenosineconcentratie op van 200 μM en een uiteindelijke enzymconcentratie van 10 nM.
5. Herhaal de verdunning voor de controlemonsters door 40 μl verdund serum of 1x PBS-controles en 160 μl van de 250 μM-adenosineverdunning in drievoud toe te voegen. Dit levert ook een uiteindelijke adenosineconcentratie van 200 μM op, maar dan zonder enzym.
   OPMERKING: Het kan nuttig zijn om alle verdunde enzym- en controlemonsters eerst afzonderlijk aan de microtiel toe te voegen en vervolgens het adenosinesubstraat toe te voegen met een 12-kanaals micropipet om de totale laadtijd te verkorten. Bovendien moeten in deze stap UV-transparante platen worden gebruikt om te voorkomen dat de plaat zelf het gemeten absorptiesignaal verstoort.
6. Meet de extinctie van elk putje bij 260 nm gedurende 30 minuten bij 37 °C. Als u klaar bent, exporteert u de gegevens naar een spreadsheet voor verdere analyse.

3. Analyse van de gegevens van de microplaatlezer

1. Bepaal de helling van het lineaire gebied van de absorptiegegevens als functie van de tijd gedurende de eerste paar minuten van de microplaatgegevens. Voor de serumverdunde monsters kwam dit overeen met de eerste ~120 s. Voor de 1x PBS-verdunde monsters kwam dit overeen met de eerste ~270 s. Deze helling van afnemende absorptiewaarden heeft een negatieve numerieke waarde en heeft eenheden van verandering in absorptie-eenheden per seconde (ΔA260/s).
2. Trek de helling van de negatieve controle, bestaande uit gepoold humaan serum, af van de helling van het enzym + serumgegevens. Voer dezelfde bewerking uit op het enzym + 1x PBS-mengsels door de helling van de 1x PBS-regeling af te trekken.
3. Normaliseer alle aangepaste hellingen naar de oorspronkelijke helling op t=0 h om de resterende fractie van de activiteit te verkrijgen met behulp van vergelijking 1.
   Vergelijking 1
4. Zet het deel van de resterende activiteit af tegen de tijd.

Resultaten

De figuren tonen de resultaten van de testrun wanneer deze wordt uitgevoerd met wildtype HsADA1. Figuur 3A,B illustreert de absorptiedalingscurven bij 260 nm van de monsters afkomstig van de 1x PBS/serum-enzymmengsels voor wildtype HsADA1 na toevoeging van adenosine. Deze afnemende absorptie als functie van tijdgegevens is wat de gebruiker kan verwachten na succesvolle voltooiing van de op microtiterplaten gebaseerde test en is vergelijkbaar...

Discussie

Dit protocol maakt gebruik van absorptieverandering wanneer het substraat wordt omgezet in het product om de activiteit van een enzym te meten. Als zodanig moeten het substraat en het product verschillende spectrale profielen hebben. Dit is het geval bij adenosine en inosine, beide met verschillende spectrale profielen en extinctiecoëfficiënten tussen 260-265 nm 6,8,12,13.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house