Kwantificeren van Drosophila melanogaster oogfenotypes: een computationele benadering die ilastik en Flynotyper integreert

Samenvatting

Het Drosophila-oogsysteem is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van verschillende biologische processen, met name menselijke neurodegeneratieve ziekten. Handmatige kwantificering van fenotypes van ruwe ogen kan echter vertekend en onbetrouwbaar zijn. Hier beschrijven we een methode waarmee ilastik en Flynotyper worden gebruikt om het oogfenotype op een onbevooroordeelde manier te kwantificeren.

Samenvatting

Het samengestelde oog van Drosophila melanogaster is een goed gestructureerde en uitgebreide reeks van ongeveer 800 ommatidia, die een symmetrisch en zeshoekig patroon vertoont. Deze regelmaat en het gemak van observatie maken het Drosophila-oogsysteem tot een krachtig hulpmiddel om verschillende menselijke neurodegeneratieve ziekten te modelleren. Manieren om abnormale fenotypes te kwantificeren, zoals handmatige rangschikking van oogernstscores, hebben echter beperkingen, vooral bij het rangschikken van zwakke veranderingen in oogmorfologie. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn computationele benaderingen ontwikkeld, zoals Flynotyper. Het gebruik van een ringlicht zorgt voor betere kwalitatieve beelden die toegang krijgen tot de intactheid van individuele ommatidia. Deze beelden kunnen echter niet rechtstreeks door Flynotyper worden geanalyseerd vanwege schaduwen op ommatidia die door het ringlicht worden geïntroduceerd. Hier beschrijven we een onbevooroordeelde manier om fenotypes van ruwe ogen te kwantificeren die zijn waargenomen in modellen voor de ziekte van Drosophila door twee software te combineren, ilastik en Flynotyper. Door de beelden voor te bewerken met ilastik, kan met Flynotyper een succesvolle kwantificering van het ruwe oog fenotype worden bereikt.

Inleiding

Het genoom van Drosophila melanogaster bevat ~75% van de aan de menselijke ziekte gerelateerde genorthologen. Bovendien wordt tijdens de ontwikkeling van het Drosophila-oog ongeveer tweederde van de genen in het genoom tot expressie gebracht, waardoor het Drosophila-oog een uitstekend genetisch systeem is om verschillende moleculaire en cellulaire functies, ontwikkeling en ziektemodellen te onderzoeken ^1,2. Het Drosophila-oogsysteem is dus een nuttig experimenteel hulpmiddel om verschillende biologische processen te bestuderen.

Het samengestelde oog van Drosophila is een goed gestructureerde en uitgebreide reeks van ~ 800 ommatidia die een symmetrisch en zeshoekig patroon vertonen³. De regelmaat van dit zeshoekige patroon kan worden gebruikt om het effect van het introduceren van mutaties en veranderingen in genexpressie in de oogmorfologie te schatten⁴. Eerdere studies die evaluatie van de oogmorfologie vereisen, waren sterk afhankelijk van handmatige rangschikking van de ernst van oogfenotypes die met het blote oog worden gedetecteerd. Om de oogfenotypes te rangschikken, worden externe oogmorfologiebeelden gemaakt met een stereomicroscoop ^5,6. Het oogfenotype van elke groep wordt beoordeeld door het uitwendige oog in vier gebieden te splitsen en het aandeel degeneratie in elk gebied te berekenen ^5,6. Vervolgens worden de waarden gebruikt om gemiddelden te berekenen die worden vergeleken met de waarden die zijn verkregen van controlevliegen⁷. De score is gebaseerd op de mate van fusie, verlies van ommatidie en borstelharenorganisatie ^7,8. Vliegenoogfoto's gemaakt met een stereomicroscoop worden gemaakt door één onderzoeker en de oogfenotype-analyse wordt uitgevoerd door een andere onderzoeker met drievoudige validatiesets ^7,8.

Als het gaat om het rangschikken van zwakke veranderingen in oogmorfologie met het blote oog, zijn er beperkingen⁴. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn computationele benaderingen zoals FLEYE en Flynotyper ontwikkeld ^1,9. Flynotyper is een nieuwe computationele methode voor het kwantitatief schatten van morfologische veranderingen in het Drosophila-oogsysteem¹. Het detecteert automatisch het Drosophila-oog en het individuele ommatidium en berekent fenotypische scores (P-scores) op basis van de onregelmatigheid van hetoog¹. Een hogere P-score geeft aan dat het vliegenoog meer gedegenereerd is. Deze software werd met succes gebruikt bij het kwantificeren van de afwijking van Drosophila-ogen ¹⁰. Hoewel Flynotyper zorgt voor een geautomatiseerd proces, kan het nog steeds niet met succes worden toegepast op sommige oogfoto's die met verschillende lichtmicroscopiemethoden zijn gemaakt.

Kwalitatief gezien geven we de voorkeur aan een ringlichtbron in vergelijking met een enkelpuntslichtbron, omdat deze een nauwkeurigere weergave van elk ommatidium biedt. Wanneer het ringlicht echter wordt gebruikt, genereert het een ringvormige schaduw aan de bovenkant van elk ommatidium vanwege de halfronde vorm van het ommatidium. Deze ringvormige schaduw verhindert nauwkeurige ommatidiale detectie door Flynotyper, wat leidt tot onjuiste berekening van P-scores.

Om deze problemen op te lossen, hebben we ilastik geïmplementeerd, een op machine learning gebaseerde tool voor verschillende analyses, om ommatidia te classificeren in flyeye-afbeeldingen¹¹. Vervolgens voerden we de door ilastik gegenereerde afbeeldingen in Flynotyper in om P-scores te berekenen. Dit stelt ons in staat om de morfologische defecten van het Drosophila-oog onbevooroordeeld te kwantificeren¹.

Protocol

1. Voorbereiding op kwantificering

1. Download en installeer ilastik¹¹, ImageJ en de ImageJ-plug-in Flynotyper¹. Zie Tabel met materialen voor websitelinks naar installatie. Download de juiste pakketten volgens het besturingssysteem van de computer (Mac, Windows, Linux, enz.). Volg de installatie-instructies precies zoals vermeld.
   NOTITIE: Het is absoluut noodzakelijk om de aanwijzingen precies zoals vermeld in de verstrekte links op te volgen. De gebruikte computer heeft een 64-bits besturingssysteem nodig; Anders zijn er geen andere vereiste specificaties. Zie de Tabel met Materialen voor de computerspecificaties van het systeem dat voor dit protocol wordt gebruikt.
2. Gebruik een standaardafbeelding om het machine learning-model te trainen. Maak een foto van een gezond vliegenoog met behulp van een lichtmicroscoop met een ringlicht (zoals w1118 x GMR-GAL4), waarbij u het midden van het oog als brandpunt gebruikt. Analyseer mannen en vrouwen afzonderlijk; Zorg daarom voor een standaardafbeelding voor mannen en voor vrouwen.
   NOTITIE: De instellingen variëren sterk, afhankelijk van de microscoop en camera. Zie de tweede alinea in de discussie voor meer algemene informatie over vliegvoorbereiding en beeldacquisitie.
3. Maak foto's van de experimentele vliegenogen met dezelfde instellingen die worden gebruikt voor de standaard beeldacquisitie.
   OPMERKING: Een goede oriëntatie is van het grootste belang voor nauwkeurige kwantificering. Zie figuur 4 als voorbeeld voor de juiste oriëntatie.

2. Ilastik gebruiken om ommatidia te detecteren op basis van afbeeldingen van vliegenogen

1. Voordat u met de analyse begint, moet u ervoor zorgen dat alle experimentele groepen, ongeacht de experimentele omstandigheden, zich in dezelfde bestandsmap bevinden om de volgende processen te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat bestanden de juiste naam hebben om experimentele groepen te identificeren en onderscheid te maken tussen mannen en vrouwen.
   OPMERKING: We raden aan om het protocol uit te printen en met de computer in te zoomen op figuren, omdat dit protocol visueel het gemakkelijkst te volgen is.
2. Open de software.
   OPMERKING: Het wordt afgeraden om andere applicaties open te hebben tijdens het uitvoeren van de software; Anders kan de computer erg traag werken, vooral in oudere of minder robuuste systemen.
3. Klik op Nieuw project aanmaken | Andere workflows, kies Cell Density Counting en selecteer een locatie om het projectbestand op te slaan (Afbeelding 1A).
4. Klik op 1. Invoer gegevens | Nieuwe toevoegen | Voeg afzonderlijke afbeelding(en) toe. Kies de standaardafbeelding (Figuur 1B).
5. Klik op 2. Functieselectie en selecteer functies om te gebruiken. Selecteer de functies die worden weergegeven in afbeelding 1C; Kies meer Sigma-waarden om de gevoeligheid te verhogen (d.w.z. 10, 15, 20, enz.).
   OPMERKING: Als er te veel vakjes zijn aangevinkt, kan het programma lange tijd worden uitgevoerd.
6. Klik op 3. Tellen en stel de Foreground sigma waarde in op 5.00. Markeer 50 of meer afzonderlijke ommatidium met behulp van het gereedschap Voorgrond op de standaardafbeelding.
   OPMERKING: Vijftig markeringen zijn doorgaans voldoende voor analyse; echter, hoe meer ommatidia gemarkeerd is, hoe nauwkeuriger de resultaten zullen zijn (Figuur 1D).
7. Klik op 3. Tellen en gebruik het achtergrondgereedschap om de buitenkant van de ommatidia te markeren (Figuur 1E). Teken groene lijnen in een rastervorm rond de ommatidia.
   OPMERKING: Net als bij meer markeringen op de ommatidia, hoe meer groene lijnen worden getekend, hoe nauwkeuriger de resultaten zullen zijn.
8. Klik op 4. Dichtheid Export | Kies Afbeeldingsinstellingen exporteren om afbeeldingsinstellingen in te stellen (Afbeelding 1F). Klik op Info uitvoerbestand | selecteer Formaat en tif voor verdere analyse in Flynotyper.
9. Klik op 5. Batchverwerking | Selecteer Raw Data Files en selecteer alle experimentele vliegfoto's die moeten worden geanalyseerd (Afbeelding 1G). De lijst met geïmporteerde afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd, is te zien onder Select Raw Data Files (Figuur 1H). Klik op Alle bestanden verwerken onderaan de 5. Sectie Batchverwerking .
   OPMERKING: Ter herinnering: mannelijke en vrouwelijke analyses moeten afzonderlijk worden uitgevoerd. Afhankelijk van de gebruikte computer kan deze stap 10 minuten of langer duren, vooral als er veel geïmporteerde afbeeldingen zijn.
10. Nadat de software is voltooid, controleert u dezelfde bestandsmap met de experimentele fly-eye-afbeeldingen; er zullen zwarte afbeeldingen zijn met de naam "YourSampleName_Probabilities" (Figuur 1I).

3. ImageJ gebruiken om foto's voor te bereiden voor Flynotyper

1. Open het door ilastik gegenereerde .tif bestand (de zwarte vakken) in ImageJ.
   OPMERKING: Elke ilastik die .tif bestand is gegenereerd, moet afzonderlijk worden behandeld.
2. Gebruik het gereedschap Rechthoek selecteren om een rechthoek te maken rond alleen het oog. Nadat de rechthoek is getekend, snijdt u het gebied bij door Ctrl + X of Ctrl + C te kiezen (Figuur 2A). Wacht tot er een zwart vak in de vorm van de rechthoekige omtrek verschijnt.
   OPMERKING: Het besturingssysteem van de computer bepaalt of 'Ctrl + X' of 'Ctrl + C' moet worden gebruikt. Meestal is 'Ctrl + X' voor Windows en 'Ctrl + C' wordt gebruikt voor Mac.
3. Open het nu geknipte vliegenoog met behulp van ImageJ; klik op Bestand | Nieuw | Intern klembord (Figuur 2B).
4. Sla het gesneden vliegenoog op als JPEG door te klikken op Bestand | Opslaan als | Jpeg. De geknipte afbeeldingen bevinden zich nu in dezelfde bestandsmap als de originele experimentele afbeeldingen.
   OPMERKING: Om de volgende stap gemakkelijker te maken, wordt aanbevolen om een nieuwe bestandsmap met de naam 'knippen' te maken en alle geknipte afbeeldingen in die map te plaatsen.

4. Flynotyper gebruiken om fenotypische scores te berekenen

1. Open Flynotyper als een ImageJ-plug-in door te klikken op Plug-ins | Vlieger.
2. Selecteer Genotypen toevoegen en open de map met de geknipte afbeeldingen van vliegogen (map met geknipt bestand). De mapnaam wordt weergegeven onder Genotypen (Figuur 2C).
3. Controleer de vakjes Lichtmicroscoop en Verticaal, maar pas indien nodig dienovereenkomstig aan. Vink de vakjes Stabiliteit en Afstand tot het midden aan onder Rang Ommatidia door: (Figuur 2C).
4. Voor het aantal gerangschikte ommatidia dat in aanmerking wordt genomen, voer 200 in.
   OPMERKING: Over het algemeen is 200 een goed aantal, maar pas het dienovereenkomstig aan de voorkeuren aan.
5. Klik op Uitvoeren en wacht tot de resultaten van de analyse verschijnen (Figuur 2D).
   OPMERKING: Deze stap kan 5 minuten of langer (of korter) duren, afhankelijk van de verwerkingskracht van de gebruikte computer.
6. Kopieer en plak het voorbeeldbestand en de P-score in statistische software voor verdere analyse.

Resultaten

In een eerdere studie gebruikten we dit protocol om genetische modificatoren te bepalen van mutant VCP-eiwit gekoppeld aan amyotrofische laterale sclerose met frontotemporale dementie (ALS-FTD)¹². Bovendien werd deze methode ook gebruikt in een ander artikel om de toxiciteit van CHCHD10^{S59L-gemedieerde} ALS-FTD te beoordelen, zelfs bij gebruik van een oudere stereomicroscoop¹³. Om deze resultaten verder te valideren, gebruikten we ilastik en Flynotyper in dezelfde ALS-FTD-ziektemutatie als Baek et ^al.13; Een niet-getraind laboratoriumpersoneel voerde het experiment echter uit en verkreeg vergelijkbare resultaten. De combinatie van ilastik en Flynotyper is dus een robuuste methode voor het onbevooroordeeld scoren van degeneratie van de Drosophila ommatidia.

We geven de voorkeur aan het gebruik van een ringlicht omdat dit betere kwalitatieve beoordelingen mogelijk maakt (Figuur 3). Het gebruik van een ringlicht veroorzaakt echter een schaduw die Flynotyper niet direct kan analyseren. Om dit te verhelpen, hebben we de afbeeldingen voorbewerkt in ilastik voordat we P-Scores kwantificeerden met Flynotyper. Over het algemeen waren de P-scores van het niet-gedegenereerde (GMR-GAL4) vliegenoog significant lager in vergelijking met een matig gedegenereerd oog (2x_S81L) en een ernstig gedegenereerd oog (3x_S81L) (Figuur 4A,B en Tabel 1). Dit is het verwachte resultaat, aangezien hogere P-scores gegenereerd door Flynotyper duiden op een meer gedegenereerd oog¹. Wanneer ilastik niet werd gebruikt, waren er verwaarloosbare verschillen in P-scores tussen een niet-gedegenereerd oog en een matig gedegenereerd oog (Figuur 4C en Tabel 1). Dit suggereert dat Flynotyper moeite heeft om ommatidiapatronen nauwkeurig te identificeren onder ringlichtomstandigheden zonder ilastik te gebruiken. Dit komt omdat Flynotyper is ontworpen om foto's te gebruiken die zijn gemaakt met een dubbelpuntslicht dat wordt omgezet in grijstinten met extra aanpassingen om het ommatidiale centrum^{te identificeren 1}. Ilastik repliceert dit proces door een punt in het midden van elk ommatidium op te nemen, waardoor kwantificering binnen Flynotyper mogelijk wordt.

Figuur 1: Voorbeeld ilastik workflow. (A) Een nieuw project aanmaken in ilastik. (B) Het kiezen van de standaardafbeelding. (C) Sigma-waarden selecteren onder Functieselectie. (D) Het markeren van de voorgrond van ommatidia voor gevoeligheid. (E) Het markeren van de achtergrond van ommatidia voor gevoeligheid. (F) Selecteren hoe de software verwerkte bestanden zal exporteren. (G) Kiezen welke experimentele vliegoogbeelden moeten worden geanalyseerd. (H) Aantonen welke experimentele fly-eye-beelden zullen worden geanalyseerd. (I) Afgewerkt product na het uitvoeren van de software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeeld Flynotyper workflow. (A) Alleen het oog van de vlieg selecteren voor verdere analyse. (B) Het openen van de afbeelding van het snijoog in een nieuw venster. (C) Selecteren welke gesneden beelden moeten worden geanalyseerd en de parameters die moeten worden gecontroleerd voor analyse. (D) Voorbeelden van resultaten. Fenotypische scores worden uiterst rechts gepresenteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kwalitatieve Drosophila oogbeelden. Hetzelfde vliegenoog genomen met een ringlicht (links) en genomen met een dubbelpuntslicht (rechts) in niet-gedegenereerde (boven) en gedegenereerde (onder) omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Gebruik van ilastik voor Flynotyper voor nauwkeurige kwantificering van het fenotype van het ruwe oog bij Drosophila. (A) Representatieve Drosophila-oogbeelden van een niet-gedegenereerd oog (GMR-GAL4), een matig gedegenereerd oog (2x_S81L) en een ernstig gedegenereerd oog (3x_S81L). (B) Kwantificeringsresultaten van Flynotyper na gebruik van ilastik. P-waarden van een tweezijdige permutatie t-test werden berekend om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken (GMR-GAL4 versus 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 versus 3x_S81L: p = 0) (C) Kwantificeringsresultaten van Flynotyper zonder ilastik te gebruiken. P-waarden van een tweezijdige permutatie t-test werden berekend om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken (GMR-GAL4 versus 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 versus 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 voor elke groep. Gegevenspunten worden geschud of gestapeld op de x-as voor visuele duidelijkheid. De ononderbroken horizontale lijn geeft het gemiddelde weer. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
Met ilastik	Zonder ilastik	Met ilastik	Zonder ilastik	Met ilastik	Zonder ilastik
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Tabel 1: P-scores bij gebruik van Flynotyper met ilastik en bij gebruik van Flynotyper alleen.

Aanvullende afbeelding S1: Flyhead-bevestiging ingesteld voor beeldacquisitie. Dit is een voorbeeld van hoe u beeldacquisitie instelt met behulp van meerdere vellen papier. Elke methode die zorgt voor een goede oriëntatie van het hoofd en het vliegenoog kan echter worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Kwantitatieve resultaten van ilastik en Flynotyper bij gebruik van een sigma-waarde van 2,5 onder functieselectie. Het gebruik van een andere sigma-waarde dan 5.0 onder functieselectie in ilastik kan leiden tot onnauwkeurige kwantificering. Concreet leidt een sigma-waarde van 2,5 tot een verlies van gevoeligheid. P-waarden van een tweezijdige permutatie t-test werden berekend om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken (GMR-GAL4 versus 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 versus 3x_S81L: p = 0). N = 3 voor elke groep. Gegevenspunten worden geschud of gestapeld op de x-as voor visuele duidelijkheid. De ononderbroken horizontale lijn geeft het gemiddelde weer. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Verlies van gevoeligheid en onnauwkeurige P-scores als gevolg van necrotische patches. Witte pijlen wijzen naar segmenten van necrotische vlekken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: P-scores bij gebruik van een sigma-waarde van 2,5 onder functieselectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De ommatidia van Drosophila vormen een nuttig systeem voor het bestuderen van verschillende biologische functies en genetische ziekten. De regelmaat van ommatidia is een goede maat om het effect van genetische mutaties te onderzoeken⁴. Hoewel er verschillende methoden bestaan voor het berekenen van ommatidiale regelmatigheid, zoals handmatige rangschikking, kunnen deze methoden sterk vertekend zijn. Om deze bevooroordeelde benadering te ondervangen, zijn semi-automatische instrumenten ontwikkeld ^1,11.

Voor een nauwkeurige kwantificering van het oog moet de voorbereiding en instelling van de vlieg worden geoptimaliseerd. Hoewel we begrijpen dat elk lab zijn eigen opzet zal hebben, bieden we de volgende opstelling in ons lab om lezers een idee te geven over hoe ze vliegen kunnen voorbereiden op beeldacquisitie. Vliegen worden ingevroren en bewaard bij -80 °C. We hebben een steekproefomvang van 3 gebruikt omdat, in onze ervaring, wanneer GMR-GAL4 wordt gecombineerd met de S81L-mutatie, er zeer weinig variatie is tussen de populatie. Houd er echter rekening mee dat de steekproefomvang moet worden aangepast om significantietests op basis van nulhypothesen uit te voeren. Om de vliegen te monteren voor beeldacquisitie, rust de vliegkop op een heel klein vel papier dat als kussen fungeert, zodat het midden van het oog ongeveer het brandpuntsvlak is (aanvullende afbeelding S1). Ons laboratorium maakt gebruik van een Z-stack microscoop en camera (zie Tabel met materialen) omdat dit over het algemeen duidelijkere beelden oplevert, waardoor de beste visualisatie van het hele oog mogelijk is, aangezien het vliegenoog koepelvormig is. De Z-stack-functie is echter geen vereiste voor dit protocol, omdat we deze methode met succes hebben toegepast met een oudere stereomicroscoop zonder de Z-stack-functie¹³. De ringlichtknop voor de helderheid is niet meer dan 1/4 van de weg naar boven gedraaid om overbelichting te voorkomen. De totale dikte van onze monsters varieert tussen 300 en 450 micron.

In deze studie hebben we aangetoond dat de analyse van vliegenogen met ilastik en Flynotyper onbevooroordeelde en betrouwbare kwantificeringsresultaten van ommatidia genereert. We analyseerden Drosophila ommatidia-patronen met behulp van ilastik, een op machine learning gebaseerde tool voor biobeeldanalyse, om ommatidia te markeren, en vervolgens Flynotyper, een computationele methode die wordt gebruikt voor het meten van ommatidia-regelmaat ^1,11. We geven de voorkeur aan het gebruik van een ringlicht om beelden te verkrijgen voor een betere kwalitatieve evaluatie. Deze aanpak stelt Flynotyper echter niet in staat om kwantitatieve resultaten te produceren met behulp van deze afbeeldingen. Daarom is ilastik geïmplementeerd om deze afbeeldingen voor te bewerken, en deze bewerkte afbeeldingen werden met succes gebruikt met Flynotyper om kwantitatieve resultaten te produceren. Wanneer de afbeeldingen niet waren voorbewerkt met ilastik vóór Flynotyper, waren de algemene P-scores vergelijkbaar tussen niet-degeneratieve en degeneratieve ogen. Dit benadrukt het belang van het gebruik van ilastik eerst bij het implementeren van een ringlicht voor kwantitatieve resultaten.

Er zijn enkele beperkingen in onze methoden. Instellingen in ilastik kunnen sterk variëren en kunnen resulteren in niet-significante gegevens. We hebben bijvoorbeeld een andere reeks analyses uitgevoerd met dezelfde afbeeldingen, maar de sigma-waarde op de voorgrond in ilastik aangepast naar 2,5 in plaats van 5. Dit resulteerde in een verlies van gevoeligheid bij matig degeneratieve fenotypes (aanvullende figuur S2 en aanvullende tabel S1). Een andere beperking is het verlies van gevoeligheid in de ogen bij te veel degeneratie. In vergelijking met een 3x_S81L oog is een oog met necrotische plekken kwalitatief veel meer gedegenereerd. De gemiddelde P-score voor 3x_S81L ogen was echter 60,2, terwijl de gemiddelde P-score voor de ogen met necrotische pleisters 60,9 was. Ogen met te veel degeneratie, zoals necrotische pleisters, kunnen dus ook leiden tot verlies van gevoeligheid (aanvullende figuur S3).

Een cruciale stap van dit protocol is de selectie van een geschikte standaardafbeelding, die wordt gebruikt om ilastik te trainen. Een niet-gedegenereerd standaardbeeld met een duidelijk contrast tussen de ommatidia en de omliggende pigmentcellen, zoals rode of oranje ogen, zal resulteren in een nauwkeurigere kwantificering in Flynotyper. Een andere cruciale stap is Feature Selection in ilastik, waarbij gevoeligheid, weergegeven als sigma-waarden, wordt geselecteerd om de machine learning-software te verfijnen (Figuur 1D). De selectie van te weinig kenmerken kan de gevoeligheid van ilastik verminderen, wat leidt tot onnauwkeurige markering van de ommatidia. De selectie van te veel functies zal de tijdsduur en verwerkingskracht die nodig zijn om resultaten te genereren verlengen, waardoor de efficiëntie van de procedure afneemt. Als alternatief, als er sprake is van merkbare kwalitatieve degeneratie van het oog, maar de analyseresultaten niet statistisch significant zijn, zou het verhogen van de sigma-waarde van de geselecteerde kenmerken een mogelijke oplossing zijn. De functieselecties in dit protocol leveren echter regelmatig nauwkeurige resultaten op. Door de kritieke stappen te volgen zoals beschreven, kunt u de meest voorkomende problemen en probleemoplossing in de toekomst helpen oplossen.

Samenvattend levert deze methode betere kwalitatieve beelden op en levert het ook een onbevooroordeelde en betrouwbare kwantificering van het Drosophila-oogsysteem op. Bijgevolg zou deze methode het nut van oogdegeneratie als een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van degeneratieve ziekten in de toekomst kunnen vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Computerspecificaties			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download de software hier: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Gebruik Flynotyper 2.0 niet. Op het moment van publicatie was 2.0 vrij nieuw en dit protocol is geoptimaliseerd voor de originele versie van Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download de software hier: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download versie 1.4.0.post1 onder Regular Builds die overeenkomt met je computerbesturingssysteem.
ImageJ		Download de software hier: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versies 1.53 en 1.54 werden gebruikt. 1.54 is de bijgewerkte versie en is de standaard download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	Systeem en software gebruikt voor z-stack acquisitie.
Leica Z16 APO microscoop met een DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Aangeduid als Z-stack microscoop en camera in de tekst. Dit product is nu gearchiveerd.