Het Drosophila-oogsysteem is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van verschillende biologische processen, met name menselijke neurodegeneratieve ziekten. Handmatige kwantificering van fenotypes van ruwe ogen kan echter vertekend en onbetrouwbaar zijn. Hier beschrijven we een methode waarmee ilastik en Flynotyper worden gebruikt om het oogfenotype op een onbevooroordeelde manier te kwantificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificeren van Drosophila melanogaster oogfenotypes: een computationele benadering die ilastik en Flynotyper integreert
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het samengestelde oog van Drosophila melanogaster is een goed gestructureerde en uitgebreide reeks van ongeveer 800 ommatidia, die een symmetrisch en zeshoekig patroon vertoont. Deze regelmaat en het gemak van observatie maken het Drosophila-oogsysteem tot een krachtig hulpmiddel om verschillende menselijke neurodegeneratieve ziekten te modelleren. Manieren om abnormale fenotypes te kwantificeren, zoals handmatige rangschikking van oogernstscores, hebben echter beperkingen, vooral bij het rangschikken van zwakke veranderingen in oogmorfologie. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn computationele benaderingen ontwikkeld, zoals Flynotyper. Het gebruik van een ringlicht zorgt voor betere kwalitatieve beelden die toegang krijgen tot de intactheid van individuele ommatidia. Deze beelden kunnen echter niet rechtstreeks door Flynotyper worden geanalyseerd vanwege schaduwen op ommatidia die door het ringlicht worden geïntroduceerd. Hier beschrijven we een onbevooroordeelde manier om fenotypes van ruwe ogen te kwantificeren die zijn waargenomen in modellen voor de ziekte van Drosophila door twee software te combineren, ilastik en Flynotyper. Door de beelden voor te bewerken met ilastik, kan met Flynotyper een succesvolle kwantificering van het ruwe oog fenotype worden bereikt.
Inleiding
Het genoom van Drosophila melanogaster bevat ~75% van de aan de menselijke ziekte gerelateerde genorthologen. Bovendien wordt tijdens de ontwikkeling van het Drosophila-oog ongeveer tweederde van de genen in het genoom tot expressie gebracht, waardoor het Drosophila-oog een uitstekend genetisch systeem is om verschillende moleculaire en cellulaire functies, ontwikkeling en ziektemodellen te onderzoeken 1,2. Het Drosophila-oogsysteem is dus een nuttig experimenteel hulpmiddel om verschillende biologische processen te bestuderen.
Het samengestelde oog van Drosophila is een goed gestructureerde en uitgebreide reeks van ~ 800 ommatidia die een symmetrisch en zeshoekig patroon vertonen3. De regelmaat van dit zeshoekige patroon kan worden gebruikt om het effect van het introduceren van mutaties en veranderingen in genexpressie in de oogmorfologie te schatten4. Eerdere studies die evaluatie van de oogmorfologie vereisen, waren sterk afhankelijk van handmatige rangschikking van de ernst van oogfenotypes die met het blote oog worden gedetecteerd. Om de oogfenotypes te rangschikken, worden externe oogmorfologiebeelden gemaakt met een stereomicroscoop 5,6. Het oogfenotype van elke groep wordt beoordeeld door het uitwendige oog in vier gebieden te splitsen en het aandeel degeneratie in elk gebied te berekenen 5,6. Vervolgens worden de waarden gebruikt om gemiddelden te berekenen die worden vergeleken met de waarden die zijn verkregen van controlevliegen7. De score is gebaseerd op de mate van fusie, verlies van ommatidie en borstelharenorganisatie 7,8. Vliegenoogfoto's gemaakt met een stereomicroscoop worden gemaakt door één onderzoeker en de oogfenotype-analyse wordt uitgevoerd door een andere onderzoeker met drievoudige validatiesets 7,8.
Als het gaat om het rangschikken van zwakke veranderingen in oogmorfologie met het blote oog, zijn er beperkingen4. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn computationele benaderingen zoals FLEYE en Flynotyper ontwikkeld 1,9. Flynotyper is een nieuwe computationele methode voor het kwantitatief schatten van morfologische veranderingen in het Drosophila-oogsysteem1. Het detecteert automatisch het Drosophila-oog en het individuele ommatidium en berekent fenotypische scores (P-scores) op basis van de onregelmatigheid van hetoog1. Een hogere P-score geeft aan dat het vliegenoog meer gedegenereerd is. Deze software werd met succes gebruikt bij het kwantificeren van de afwijking van Drosophila-ogen 10. Hoewel Flynotyper zorgt voor een geautomatiseerd proces, kan het nog steeds niet met succes worden toegepast op sommige oogfoto's die met verschillende lichtmicroscopiemethoden zijn gemaakt.
Kwalitatief gezien geven we de voorkeur aan een ringlichtbron in vergelijking met een enkelpuntslichtbron, omdat deze een nauwkeurigere weergave van elk ommatidium biedt. Wanneer het ringlicht echter wordt gebruikt, genereert het een ringvormige schaduw aan de bovenkant van elk ommatidium vanwege de halfronde vorm van het ommatidium. Deze ringvormige schaduw verhindert nauwkeurige ommatidiale detectie door Flynotyper, wat leidt tot onjuiste berekening van P-scores.
Om deze problemen op te lossen, hebben we ilastik geïmplementeerd, een op machine learning gebaseerde tool voor verschillende analyses, om ommatidia te classificeren in flyeye-afbeeldingen11. Vervolgens voerden we de door ilastik gegenereerde afbeeldingen in Flynotyper in om P-scores te berekenen. Dit stelt ons in staat om de morfologische defecten van het Drosophila-oog onbevooroordeeld te kwantificeren1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding op kwantificering
- Download en installeer ilastik11, ImageJ en de ImageJ-plug-in Flynotyper1. Zie Tabel met materialen voor websitelinks naar installatie. Download de juiste pakketten volgens het besturingssysteem van de computer (Mac, Windows, Linux, enz.). Volg de installatie-instructies precies zoals vermeld.
NOTITIE: Het is absoluut noodzakelijk om de aanwijzingen precies zoals vermeld in de verstrekte links op te volgen. De gebruikte computer heeft een 64-bits besturingssysteem nodig; Anders zijn er geen andere vereiste specificaties. Zie de Tabel met Materialen voor de computerspecificaties van het systeem dat voor dit protocol wordt gebruikt. - Gebruik een standaardafbeelding om het machine learning-model te trainen. Maak een foto van een gezond vliegenoog met behulp van een lichtmicroscoop met een ringlicht (zoals w1118 x GMR-GAL4), waarbij u het midden van het oog als brandpunt gebruikt. Analyseer mannen en vrouwen afzonderlijk; Zorg daarom voor een standaardafbeelding voor mannen en voor vrouwen.
NOTITIE: De instellingen variëren sterk, afhankelijk van de microscoop en camera. Zie de tweede alinea in de discussie voor meer algemene informatie over vliegvoorbereiding en beeldacquisitie. - Maak foto's van de experimentele vliegenogen met dezelfde instellingen die worden gebruikt voor de standaard beeldacquisitie.
OPMERKING: Een goede oriëntatie is van het grootste belang voor nauwkeurige kwantificering. Zie figuur 4 als voorbeeld voor de juiste oriëntatie.
2. Ilastik gebruiken om ommatidia te detecteren op basis van afbeeldingen van vliegenogen
- Voordat u met de analyse begint, moet u ervoor zorgen dat alle experimentele groepen, ongeacht de experimentele omstandigheden, zich in dezelfde bestandsmap bevinden om de volgende processen te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat bestanden de juiste naam hebben om experimentele groepen te identificeren en onderscheid te maken tussen mannen en vrouwen.
OPMERKING: We raden aan om het protocol uit te printen en met de computer in te zoomen op figuren, omdat dit protocol visueel het gemakkelijkst te volgen is. - Open de software.
OPMERKING: Het wordt afgeraden om andere applicaties open te hebben tijdens het uitvoeren van de software; Anders kan de computer erg traag werken, vooral in oudere of minder robuuste systemen. - Klik op Nieuw project aanmaken | Andere workflows, kies Cell Density Counting en selecteer een locatie om het projectbestand op te slaan (Afbeelding 1A).
- Klik op 1. Invoer gegevens | Nieuwe toevoegen | Voeg afzonderlijke afbeelding(en) toe. Kies de standaardafbeelding (Figuur 1B).
- Klik op 2. Functieselectie en selecteer functies om te gebruiken. Selecteer de functies die worden weergegeven in afbeelding 1C; Kies meer Sigma-waarden om de gevoeligheid te verhogen (d.w.z. 10, 15, 20, enz.).
OPMERKING: Als er te veel vakjes zijn aangevinkt, kan het programma lange tijd worden uitgevoerd. - Klik op 3. Tellen en stel de Foreground sigma waarde in op 5.00. Markeer 50 of meer afzonderlijke ommatidium met behulp van het gereedschap Voorgrond op de standaardafbeelding.
OPMERKING: Vijftig markeringen zijn doorgaans voldoende voor analyse; echter, hoe meer ommatidia gemarkeerd is, hoe nauwkeuriger de resultaten zullen zijn (Figuur 1D). - Klik op 3. Tellen en gebruik het achtergrondgereedschap om de buitenkant van de ommatidia te markeren (Figuur 1E). Teken groene lijnen in een rastervorm rond de ommatidia.
OPMERKING: Net als bij meer markeringen op de ommatidia, hoe meer groene lijnen worden getekend, hoe nauwkeuriger de resultaten zullen zijn. - Klik op 4. Dichtheid Export | Kies Afbeeldingsinstellingen exporteren om afbeeldingsinstellingen in te stellen (Afbeelding 1F). Klik op Info uitvoerbestand | selecteer Formaat en tif voor verdere analyse in Flynotyper.
- Klik op 5. Batchverwerking | Selecteer Raw Data Files en selecteer alle experimentele vliegfoto's die moeten worden geanalyseerd (Afbeelding 1G). De lijst met geïmporteerde afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd, is te zien onder Select Raw Data Files (Figuur 1H). Klik op Alle bestanden verwerken onderaan de 5. Sectie Batchverwerking .
OPMERKING: Ter herinnering: mannelijke en vrouwelijke analyses moeten afzonderlijk worden uitgevoerd. Afhankelijk van de gebruikte computer kan deze stap 10 minuten of langer duren, vooral als er veel geïmporteerde afbeeldingen zijn. - Nadat de software is voltooid, controleert u dezelfde bestandsmap met de experimentele fly-eye-afbeeldingen; er zullen zwarte afbeeldingen zijn met de naam "YourSampleName_Probabilities" (Figuur 1I).
3. ImageJ gebruiken om foto's voor te bereiden voor Flynotyper
- Open het door ilastik gegenereerde .tif bestand (de zwarte vakken) in ImageJ.
OPMERKING: Elke ilastik die .tif bestand is gegenereerd, moet afzonderlijk worden behandeld. - Gebruik het gereedschap Rechthoek selecteren om een rechthoek te maken rond alleen het oog. Nadat de rechthoek is getekend, snijdt u het gebied bij door Ctrl + X of Ctrl + C te kiezen (Figuur 2A). Wacht tot er een zwart vak in de vorm van de rechthoekige omtrek verschijnt.
OPMERKING: Het besturingssysteem van de computer bepaalt of 'Ctrl + X' of 'Ctrl + C' moet worden gebruikt. Meestal is 'Ctrl + X' voor Windows en 'Ctrl + C' wordt gebruikt voor Mac. - Open het nu geknipte vliegenoog met behulp van ImageJ; klik op Bestand | Nieuw | Intern klembord (Figuur 2B).
- Sla het gesneden vliegenoog op als JPEG door te klikken op Bestand | Opslaan als | Jpeg. De geknipte afbeeldingen bevinden zich nu in dezelfde bestandsmap als de originele experimentele afbeeldingen.
OPMERKING: Om de volgende stap gemakkelijker te maken, wordt aanbevolen om een nieuwe bestandsmap met de naam 'knippen' te maken en alle geknipte afbeeldingen in die map te plaatsen.
4. Flynotyper gebruiken om fenotypische scores te berekenen
- Open Flynotyper als een ImageJ-plug-in door te klikken op Plug-ins | Vlieger.
- Selecteer Genotypen toevoegen en open de map met de geknipte afbeeldingen van vliegogen (map met geknipt bestand). De mapnaam wordt weergegeven onder Genotypen (Figuur 2C).
- Controleer de vakjes Lichtmicroscoop en Verticaal, maar pas indien nodig dienovereenkomstig aan. Vink de vakjes Stabiliteit en Afstand tot het midden aan onder Rang Ommatidia door: (Figuur 2C).
- Voor het aantal gerangschikte ommatidia dat in aanmerking wordt genomen, voer 200 in.
OPMERKING: Over het algemeen is 200 een goed aantal, maar pas het dienovereenkomstig aan de voorkeuren aan. - Klik op Uitvoeren en wacht tot de resultaten van de analyse verschijnen (Figuur 2D).
OPMERKING: Deze stap kan 5 minuten of langer (of korter) duren, afhankelijk van de verwerkingskracht van de gebruikte computer. - Kopieer en plak het voorbeeldbestand en de P-score in statistische software voor verdere analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In een eerdere studie gebruikten we dit protocol om genetische modificatoren te bepalen van mutant VCP-eiwit gekoppeld aan amyotrofische laterale sclerose met frontotemporale dementie (ALS-FTD)12. Bovendien werd deze methode ook gebruikt in een ander artikel om de toxiciteit van CHCHD10S59L-gemedieerde ALS-FTD te beoordelen, zelfs bij gebruik van een oudere stereomicroscoop13. Om deze resultaten verder te valideren, gebruikten we...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ommatidia van Drosophila vormen een nuttig systeem voor het bestuderen van verschillende biologische functies en genetische ziekten. De regelmaat van ommatidia is een goede maat om het effect van genetische mutaties te onderzoeken4. Hoewel er verschillende methoden bestaan voor het berekenen van ommatidiale regelmatigheid, zoals handmatige rangschikking, kunnen deze methoden sterk vertekend zijn. Om deze bevooroordeelde benadering te ondervangen, zijn ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
We danken Pedro Fernandez-Funez voor het gebruik van de microscoop en camera die in dit protocol zijn gebruikt. Ook willen we Ava Schapman bedanken voor het geven van feedback over de duidelijkheid van het protocol. Financiële steun werd verleend door The Wallin Neuroscience Discovery Fund aan Nam Chul Kim.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Computerspecificaties | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Download de software hier: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Open source software. Gebruik Flynotyper 2.0 niet. Op het moment van publicatie was 2.0 vrij nieuw en dit protocol is geoptimaliseerd voor de originele versie van Flynotyper. |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | Download de software hier: https://www.ilastik.org/download.html | Open source software. Download versie 1.4.0.post1 onder Regular Builds die overeenkomt met je computerbesturingssysteem. |
| ImageJ | Download de software hier: https://imagej.net/ij/download.html | Open source software. Versies 1.53 en 1.54 werden gebruikt. 1.54 is de bijgewerkte versie en is de standaard download. | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | Systeem en software gebruikt voor z-stack acquisitie. |
| Leica Z16 APO microscoop met een DMC2900 camera | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | Aangeduid als Z-stack microscoop en camera in de tekst. Dit product is nu gearchiveerd. |
Referenties
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
- Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
- Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
- Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
- Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
- Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
