Methodenartikel

Kwantificering van door diabetes geïnduceerde adherente leukocyten in retinale vasculatuur

DOI:

10.3791/67220

⸱

24 januari 2025

 , 
1Gavin Herbert Eye Institute-Center for Translational Vision Research, Department of Ophthalmology, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We demonstreren een methode om de wanden van het retinale vaatstelsel en aanhangende leukocyten te labelen. Deze aanhangende leukocyten kunnen vervolgens onder een fluorescentiemicroscoop worden geteld als een parameter van ontsteking of de reactie van die ontsteking op therapieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukostase verwijst naar de aanhechting van leukocyten aan de luminale wand van het vaatstelsel. Deze interactie van leukocyten met de wand van bloedvaten is kenmerkend voor ontsteking en is causaal in verband gebracht met capillaire occlusie in een verscheidenheid aan weefsels en ziekten, waaronder diabetische retinopathie.

Leukostase wordt al jaren gemeld als een levensbedreigende complicatie van hyperleukocytose en kan alleen klinisch worden gediagnosticeerd. Gezien het belang van het fenomeen is er intensief onderzoek gedaan om inzicht te krijgen in de mogelijke mechanismen die tot de manifestatie ervan leiden; Er is echter geen gouden standaardtechniek in laboratoriumomgevingen om de ernst van de gebeurtenis te visualiseren en te kwantificeren.

In de hieronder samengevatte methode wordt het vaatstelsel aanvankelijk geperfundeerd met een buffer om bloed te verwijderen, en vervolgens wordt concanavalin A in het vaatstelsel geperfundeerd waar het zich bindt aan alle blootgestelde celwanden en bijzonder heldere kleuring van leukocyten veroorzaakt. Als de perfusie om alle ongebonden bloedcellen te verwijderen succesvol was, worden de resterende fluorescerend gelabelde leukocyten aan het vaatstelsel gebonden en kunnen ze handmatig worden gekwantificeerd met behulp van een beschikbare fluorescentiemicroscoop.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukocyten (witte bloedcellen, WBC's) spelen een belangrijke rol bij de optimale functie van het vaatstelsel, zoals het behoud van de bloedvloeibaarheid en de regulatie van de trombusresolutie1. Ze spelen ook een sleutelrol bij sommige pathologische aandoeningen, zoals het langdurig hechten aan de luminale wand van het vaatstelsel, wat leidt tot obstructie van het vaatvat, althans tijdelijk, een fenomeen dat bekend staat als leukostase 2,3.

Diabetische retinopathie is een van de meest voorkomende complicaties van langdurige diabetes en een van de belangrijkste oorzaken van slechtziendheid en blindheid in de VS en wereldwijd voorpersonen van 20-75 jaar 4. Langzame en progressieve degeneratie van het retinale vaatstelsel is een klinisch betekenisvol onderdeel van de vroege stadia van de ziekte, wat bij sommige patiënten leidt tot retinale ischemie met de resulterende retinale neovascularisatie 5,6. Cumulatief bewijs geeft aan dat ontsteking een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van retinopathie7, en leukostase wordt beschouwd als een subklinische intravasculaire ontstekingsreactie. Leukostase treedt op in de vroege stadia van diabetes, ruim voordat detecteerbare klinische manifestaties zich hebben ontwikkeld 8,9,10. De herhaalde verstopping van de netvliesvaten door adherente leukocyten gedurende maanden tot jaren (chronische leukostase) bij diabetes kan bijdragen aan de vasculaire occlusie en degeneratie van de haarvaten 11,12,13. De ernst van deze leukostase is van pathologisch belang en kan worden gebruikt om de ernst van het ziekteproces te monitoren of om de werkzaamheid van een therapie in onderzoeksomgevingen te evalueren.

Om de specifieke effecten van de hyperglycemische micro-omgeving op leukostase verder te bestuderen, werden in vitro modellen ontworpen. Geïsoleerde retinale microvasculaire endotheelcellen kunnen worden gekweekt en gerangschikt in 2- of 3D-kweekmodellen (microvasculatuur-op-een-chip14) om het vasculaire endotheel (de celmonolaag die het lumen van de bloedvaten plaveit) te repliceren. De interexperimentele variatie van deze modellen beperkt echter het gebruik ervan. De studie van leukostase in het menselijk retinale vaatstelsel in vivo is nog steeds beperkt, en daarom is het grootste deel van de huidige kennis over retinale leukostase afgeleid van diermodellen van diabetische retinopathie13,15.

Het doel van dit rapport is om een standaardprotocol te beschrijven op basis van elders beschreven methoden16 voor de kwantificering van gehechte leukocyten aan het retinale vaatstelsel als parameter voor leukostase. Deze test kan worden gebruikt om andere vaatziekten te bestuderen die ook leukostase vertonen, zoals maligniteiten 3,17,18,19 en sommige infectieuze en allergische aandoeningen 20. Dit protocol kan in elk fundamenteel onderzoekslaboratorium worden geïmplementeerd zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is. In de hieronder samengevatte methode wordt het vaatstelsel aanvankelijk geperfundeerd met buffer om bloed te verwijderen, en vervolgens wordt concanavalin A in het vaatstelsel geperfundeerd waar het zich bindt aan alle blootgestelde celwanden en bijzonder heldere kleuring van leukocyten veroorzaakt 21,22,23. Als de perfusie om alle ongebonden bloedcellen te verwijderen succesvol is, kunnen de resterende fluorescerend gelabelde leukocyten die aan het vaatstelsel zijn gebonden, handmatig worden gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop die voorhanden is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California Irvine en voldoet aan de overheidsvoorschriften met betrekking tot de verzorging en het gebruik van proefdieren. Er zijn geen stoppunten in dit protocol. De gemiddelde tijd per muis is 30 min.

1. Voorbereiding van de perfusiefase

  1. Verwarm de 0,9% zoutoplossing zak en concanavalin A-oplossing in een waterbad van 37 °C gedurende 20-30 minuten voor gebruik.
    OPMERKING: Bescherm concanavalin A tegen blootstelling aan licht (afdekken met folie).
  2. Zet een bak op om te voorkomen dat bloed en vloeistoffen op het oppervlak druppelen waar de procedure zal plaatsvinden. Leg op de lade een verwarmingskussen bedekt met een absorberend bankje of een ander absorberend materiaal.
    OPMERKING: Het doel is om te voorkomen dat het lichaam van de muis warmte verliest tijdens de procedure, omdat koeling het moeilijker maakt om bloed te verwijderen tijdens perfusie.

2. Instellen van de drukzetter

  1. Sluit de zak met 0,9% zoutoplossing, de I.V.-katheterset, een 4-wegklepkraan en de sondenaald in serie aan.
  2. Plaats de zak met 0,9% zoutoplossing tussen het net en de luchtblaas van de drukinfuser. Hang de zoutoplossing zak aan de haak aan de achterkant van de luchtblaas. Gebruik de RV-poollus om de drukinfuser in de IV-paal te hangen.
  3. Ontlucht de leidingen en poorten van alle luchtbellen door het systeem een paar minuten te laten openen (draaien) en stel het debiet in op 18-20 ml/min24. Om de luchtblaas van de drukzetter op te blazen, draait u de hendel van de kraan in de richting van de open kraanopening en pompt u vervolgens de opblaaslamp leeg totdat de manometer de gewenste druk aangeeft. Pas de druk opnieuw aan voordat u elke muis perfundeert. Om leeg te lopen, draait u de kraan recht naar beneden in de richting van de opblaaslamp.
    OPMERKING: Als de 0,9% zoutoplossing zak nieuw is, levert de druk van 150 mmHg gewoonlijk het gewenste debiet; De druk moet echter empirisch worden aangepast vanwege variaties in de merken van de drukinfusers en gedurende de gebruiksperiode van de 0,9% zoutoplossingzak.
  4. Bevestig een spuit van 10 ml gevuld met verwarmde concanavalin A-oplossing aan de 4-wegklep.
    OPMERKING: Bescherm de spuit tegen blootstelling aan licht (dek af met folie).

3. Anesthesie

  1. Anesthesie toedienen door intraperitoneale (IP) injectie van Ketamine: Xylazine; De meest gebruikte dosis voor operaties/procedures bij muizen is 100:10 mg/kg lichaamsgewicht25. Beoordeel de anesthesie door middel van pedaalreflex (stevige teenknijping).
    OPMERKING: Deze dosis zorgt voor een aanvang van 4-6 minuten met een duur van 45-60 minuten chirurgische anesthesie. De verdovende cocktail is maximaal 2 weken houdbaar bij kamertemperatuur.

4. Transcardiale perfusie en kleuring met concanavalin A

  1. Plaats de muis in rugligging op de perfusiefase om de borst- en buikholte bloot te leggen.
  2. Identificeer het xiphoid-proces visueel en met de hemostaat in de dominante hand, speld u de huid vast en vergrendelt u deze. Zodra de hemostaat is vastgezet, brengt u deze over naar de niet-dominante hand en tilt u de huid op.
  3. Gebruik een schaar in de dominante hand en knip, in een hoek van 90° ten opzichte van de wervelkolom, een stukje huid af om de buitenste buikwand te onthullen.
  4. Nu de processus xiphoid en de ribbenkast zichtbaar zijn, snijdt u bilateraal door de buikwand en zorgt u ervoor dat u geen organen of grote bloedvaten snijdt.
  5. Nu het middenrif zichtbaar is, visualiseert u de hartventrikels en longen door het middenrif. Knip met de punt van de schaar door het middenrif in een van de flanken, dicht bij de ruggengraat, en zorg ervoor dat u geen organen of grote bloedvaten snijdt.
    OPMERKING: Dit "gat" in het middenrif zal de negatieve intrathoracale druk in evenwicht brengen met de atmosferische druk, en er zal een pneumothorax optreden die de longen doet inklappen en het hart terugtrekt, waardoor de dissectie van het middenrif wordt vergemakkelijkt zonder de longen of het hart te beschadigen.
  6. Ga door met het ontleden door de ribben en evenwijdig aan de longen om een borstflap te creëren. Laat de hemostaat los en snijd het xiphoid-proces in het sagittale vlak af. Open het xiphoid-proces voorzichtig handmatig. Observeer de vier kamers van het hart.
  7. Pak met de niet-dominante hand en met behulp van een tang het hart vast in de buurt van de top. Houd met de dominante hand de gavagenaald vast (bevestigd aan de infuuskatheter) en prik de top van het hart door. Om volledige perforatie van de linkerventrikel of het bereiken van het longvaatstelsel en vervolgens een slechte perfusie van het systemische vaatstelsel te voorkomen, controleert u de plaatsing van het uiteinde van de kogelpunt van de maagsondenaald, die zich aan de rand van de prikplaats moet bevinden die iets uit het hart steekt. Klem de sondenaald op zijn plaats met behulp van een gebogen muggentang of houd hem gewoon met de hand vast terwijl u de infuuskraan bedient.
  8. Open de kraan tot de zoutoplossing van 0,9% en snijd bijna tegelijkertijd de rechterventrikel open met een schaar; Perfuse gedurende 2-3 min. Beweeg tijdens de perfusietijd de naald voorzichtig heen en weer en op en neer om knikken van het vaatstelsel te verminderen en de bloedafvoer uit het hart te vergroten.
  9. Na het doordrenken met zoutoplossing, draait u aan de kraanhendel om de stroom van de zoutoplossing af te sluiten en laat u de stroom van de spuit naar de sondenaald stromen. Bevochtig met de hand met de concanavalin A-oplossing met een constante snelheid. Zorg ervoor dat de 10 ml concanavalin A-oplossing in 30-35 s wordt gedoseerd.
  10. Draai na het perfunderen met concanavalin A aan de klep om de stroom uit de spuit af te sluiten en laat weer stroom van de 0,9% zoutoplossing naar de sondenaald stromen. Verstijk met de 0,9% zoutoplossing gedurende nog 2-3 minuten. Verwijder de sondenaald uit het hart.
    OPMERKING: Het concanavalin A dat in dit protocol wordt voorgesteld, is geconjugeerd met fluoresceïne (groen); concanavalin A gehecht aan andere fluorchromaten is echter ook beschikbaar.

5. Enucleatie en isolatie van vers netvlies

  1. Draai de muis op zijn kant en plaats met de niet-dominante hand de wijsvinger en duim op respectievelijk de bovenste en onderste oogleden. Trek de oogleden en de huid voorzichtig terug met de vingers en proptose het oog, zodat het gedeeltelijk uit de oogkas uitpuilen.
  2. Terwijl het oog wordt ondersteund, gebruikt u een gebogen schaar in de dominante hand en schept u onder het oog in een hoek van 45°. Snijd de spieraanhechting en de oogzenuw door. Gebruik dezelfde schaar als een spatel om het oog over te brengen naar een klein bakje of rechtstreeks naar het podium van de ontleedmicroscoop.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de achterkant van het oog niet afsnijdt en trek tijdens deze stap niet aan het oog.
  3. Plaats het oog op een tandwas om de wereldbol te openen. Houd onder de ontleedmicroscoop en met behulp van de niet-dominante hand de sclerale plooi of de spierresten die nog aan de buitenkant van het achterste oog zijn bevestigd vast met een microtang en oriënteer het oog zo dat het hoornvlies naar een kant wijst.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat het oog beweegt/glijdt tijdens het openen van de wereldbol, kan een stuk natte, pluisvrije tissue op de tandwas worden geplaatst.
  4. Maak met een van de scherpe hoeken van een met teflon gecoat scheermesje een incisie 1-2 mm achter en evenwijdig aan de limbus (overgang hoornvlies-sclera). Houd de sclerale plooi of spier vast met de microtang en trek het mes met minimale neerwaartse kracht over de limbus. Blijf snijden met het scheermes om het voorste segment (hoornvlies, iris, lens en glasvocht) volledig te scheiden van het achterste segment (oogschelp).
    OPMERKING: Zaag niet heen en weer.
  5. Breng de doorgesneden oogschelp over naar een klein petrischaaltje met PBS.
    OPMERKING: Vermijd contact van het netvlies met het tissuepapier (opmerking in stap 5.3), omdat het stevig aan het papier blijft plakken en in wezen onmogelijk te herstellen wordt.
  6. Pak een sclerale plooi of de resterende spier aan de buitenkant van de sclera vast met een microtang. Maak het netvlies volledig los van de sclera door alle verbindingen bij de limbus rond de omtrek van de oogschelp te verbreken met behulp van een microspatel. Schep het netvlies uit de sclera met de microspatel. Als het netvlies nog steeds door de oogzenuw aan de sclera vastzit, schuift u de microschaar tussen het netvlies en de sclera om de oogzenuw door te knippen.
  7. Verwijder eventuele restanten van glasvocht en ciliaire spier in de periferie van het netvlies. Breng het geïsoleerde netvlies onmiddellijk over naar een objectglaasje met wat PBS.
    OPMERKING: Elke andere techniek voor netvliesisolatie kan worden gebruikt, afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker.

6. Vlakke montage van het netvlies

  1. Leg het niet-gefixeerde netvlies op een dia met een kleine hoeveelheid PBS. Richt met de microspatel het netvlies voorzichtig met de glasvochtkant naar boven. Als het netvlies naar binnen is gevouwen, gebruik dan een microtang om de randen van het netvlies vast te houden terwijl het netvlies wordt uitgevouwen met behulp van de microspatel.
  2. Maak 4-5 radiale sneden in het netvlies zodat het plat ligt (klaverbladpatroon).
  3. Gebruik een pluisvrij weefsel om het teveel aan PBS weg van het netvlies op te drogen.
    OPMERKING: Raak het netvlies niet aan met het weefsel; Anders gaat het monster verloren. Coverslipping is wenselijk om het netvlies plat te houden.

7. Microscopie

OPMERKING: Elke fluorescentiemicroscoop met een GFP/FITC-kanaal (480/530 nm) kan voor deze stap worden gebruikt. Voor dit werk gebruikten we de microscoop met referentie en 488-kanaal en bijbehorende software voor beeldacquisitie.

  1. Observeer het onlangs plat gemonteerde netvlies onder de microscoop met een vergroting van 100x (10x objectief) en tel fluorescerend gelabelde leukocyten (handmatig) door het hele weefsel methodisch te scannen (van rechts naar links of van boven naar beneden).
    OPMERKING: Leukocyten zijn enkele fluorescerende stippen die een ronde of ovale vorm kunnen hebben. Ze hebben een diameter van 12-15 μm en steken niet uit de retinale haarvaten (de structuur wordt volledig beperkt door het lumen van het vat).
  2. Verkrijg representatieve beelden met de gewenste vergroting en voer de nabewerking van de beelden uit met de software van uw keuze (bijv. ImageJ [Fiji]).
  3. Druk het aantal leukocyten per netvlies uit. Maak een grafiek van de gegevens op basis ± standaarddeviatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een goed uitgevoerd perfusie- en kleuringsprotocol zal het volledige retinale vaatstelsel laten zien, afgebakend met concanavalin A (Figuur 1). Slechte perfusie van de muis verhindert het labelen van de hele vasculaire boom en de daaropvolgende analyse van de leukocyten die aan het lumen hechten (Figuur 2), terwijl overmatige druk door een snelle knijp van een spuit (minder dan 30-35 s) vasculaire permeabiliteit en barsten van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukostase bij mensen verwijst naar symptomen en klinische bevindingen die verband houden met hyperleukocytose (totaal aantal leukocyten (WBC's) >100.000/μL) en is een medisch noodgeval20. De mechanismen die tot leukostase leiden, worden intensief onderzocht. Tot op heden is de studie van leukostase bij mensen in vivo nog niet mogelijk en moeten onderzoekers vertrouwen op diermodellen om dit proces te begrijpen. Verschillende ziekten vertonen leukostase e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health (NIH) Grants R01EY022938, R01EY022938-S1 en K99EY034928. De auteurs erkennen de diensten van de CWRU (P30EY11373) en UCI (P30EY034070) Visual Science Research Center Cores, evenals de ondersteuning van de afdeling van een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness aan het Gavin Herbert Eye Institute aan de University of California Irvine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL spuit
4-weg stopkraan Luer lock I.V. lijn klepBaxter2C6204
Concanavalin A oplossingVector FL-1001Bereid in PBS 1 mg/mL
Dissectiegereedschap setInclusief hemostatische klemmen, schaar en pincet
FIJISoftware voor beeldverwerking
FluorescentiemicroscoopNikonEclipse Ni
Pincet, Dumont #5, Biologisch grad tipElectron Microscopy Sciences (EMS)72700-D
Gavagenaald 1,25 mm OD vat tip x 30 mmFine Science18060-20
Halstead MuggenpincetFisher Scientific13-812-10
I.V. Katheter set met regelklauw 70 inchBaxter2C5417s
I.V. Paal
Lintvrij weefselKimpwipes is een optie
Micro dissectiesveer schaar, Vannas, 3 mm rechtROBOZRS-5620
Micro spatelFine Science Tools (FST)10091-12
NikonNIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)Software voor beeldacquisitie
Petrischaal (100 mmx15 mm)Corning351029
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
Roze tandheelkundige wasElectron Microscopy Sciences (EMS)72670
DrukinjecteurInfusurge4010
Vuilnisschaafjes, GEM enkelzijdige roestvrij staal, Teflon gecoatElectron Microscopy Sciences (EMS)71970
Zoutoplossing 0,9%, veterinair graad, 1000 mLBaxter04925-04-10
Kleine dissectieschaar, gebogen stompe punt 22 mmROBOZRS 5983

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swystun, L. L., Liaw, P. C. The role of leukocytes in thrombosis. Blood. 128 (6), 753-762 (2016).
  2. Barouch, F. C., et al. Integrin-mediated neutrophil adhesion and retinal leukostasis in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1153-1158 (2000).
  3. Macaron, W., Sargsyan, Z., Short, N. J. Hyperleukocytosis and leukostasis in acute and chronic leukemias. Leuk Lymphoma. 63 (8), 1780-1791 (2022).
  4. Kempen, J. H., et al. The prevalence of diabetic retinopathy among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 552-563 (2004).
  5. Kohner, E. M. Diabetic retinopathy. Br Med Bull. 45 (1), 148-173 (1989).
  6. Aouiss, A., Anka Idrissi, D., Kabine, M., Zaid, Y. Update of inflammatory proliferative retinopathy: Ischemia, hypoxia and angiogenesis. Curr Res Transl Med. 67 (2), 62-71 (2019).
  7. Tsalamandris, S., et al. The role of inflammation in diabetes: Current concepts and future perspectives. Eur Cardiol. 14 (1), 50-59 (2019).
  8. Adamis, A. P. Is diabetic retinopathy an inflammatory disease. Br J Ophthalmol. 86 (4), 363-365 (2002).
  9. Joussen, A. M., et al. A central role for inflammation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. FASEB J. 18 (12), 1450-1452 (2004).
  10. Serra, A. M., et al. CD11b+ bone marrow-derived monocytes are the major leukocyte subset responsible for retinal capillary leukostasis in experimental diabetes in mouse and express high levels of CCR5 in the circulation. Am J Pathol. 181 (2), 719-727 (2012).
  11. Kinukawa, Y., Shimura, M., Tamai, M. Quantifying leukocyte dynamics and plugging in retinal microcirculation of streptozotosin-induced diabetic rats. Curr Eye Res. 18 (1), 49-55 (1999).
  12. Linsenmeier, R. A., et al. Retinal hypoxia in long-term diabetic cats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (9), 1647-1657 (1998).
  13. Herdade, A. S., et al. Effects of diabetes on microcirculation and leukostasis in retinal and non-ocular tissues: Implications for diabetic retinopathy. Biomolecules. 10 (11), 1583(2020).
  14. Oakley, J., et al. Incorporating hemoglobin levels to map leukostasis risk in acute leukemia using microvasculature-on-chip technologies. Blood. 136 (Suppl 1), 9-10 (2020).
  15. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  16. Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
  17. Lester, T. J., Johnson, J. W., Cuttner, J. Pulmonary leukostasis as the single worst prognostic factor in patients with acute myelocytic leukemia and hyperleukocytosis. Am J Med. 79 (1), 43-48 (1985).
  18. Porcu, P., et al. Hyperleukocytic leukemias and leukostasis: a review of pathophysiology, clinical presentation and management. Leuk Lymphoma. 39 (1-2), 1-18 (2000).
  19. Giammarco, S., et al. Hyperleukocytosis and leukostasis: management of a medical emergency. Expert Rev Hematol. 10 (2), 147-154 (2017).
  20. Mank, V., Azhar, W., Brown, K. Leukocytosis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  21. Bernhard, W., Avrameas, S. Ultrastructural visualization of cellular carbohydrate components by means of concanavalin A. Exp Cell Res. 64 (1), 232-236 (1971).
  22. Oliver, J. M., Zurier, R. B., Berlin, R. D. Concanavalin a cap formation on polymorphonuclear leukocytes of normal and beige (chediak-higashi) mice. Nature. 253 (5491), 471-473 (1975).
  23. Pink, J. R., Hoessli, D., Tartakoff, A., Hooghe, R. Characterisation of Concanavalin A-binding glycoproteins from mouse splenic leukocytes by two-dimensional electrophoresis: preferential binding of incompletely glycosylated forms of H-2 antigen to the lectin. Mol Immunol. 20 (4), 491-497 (1983).
  24. Janssen, B., Debets, J., Leenders, P., Smits, J. Chronic measurement of cardiac output in conscious mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (3), R928-R935 (2002).
  25. Flecknell, P. A. Anaesthesia of common laboratory species: Special considerations. Laboratory Animal Anaesthesia. Flecknell, P. A. , 3rd Edition, Academic Press. 181-241 (2009).
  26. Seemann, S., Zohles, F., Lupp, A. Comprehensive comparison of three different animal models for systemic inflammation. J Biomed Sci. 24 (1), 60(2017).
  27. Lessieur, E. M., et al. ICAM-1 on the luminal surface of endothelial cells is induced to a greater extent in mouse retina than in other tissues in diabetes. Diabetologia. 65 (10), 1734-1744 (2022).
  28. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns: I. Normal architecture. Arch Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  29. Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. Histology, white blood cell. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

diabetische retinopathieleukocytenadhesiekwantificering van leukostasefluorescentiemicroscopieretinaalperfusieConcanavaline A kleuringcapillaire occlusieontstekingsmodellenwitte bloedcellen

Gerelateerde artikelen