Methodenartikel

Schaalbare bioproductieworkflow voor het produceren en isoleren van Natural Killer-cellen afgeleide extracellulaire kankerbiotherapeutica op basis van vesikels

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67227

⸱

16 augustus 2024

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Van natuurlijke killercellen afgeleide extracellulaire blaasjes (NK-EV's) hebben een veelbelovend potentieel als biotherapeutica tegen kanker. Deze op methodologie gebaseerde studie presenteert een schaalbare closed-loop bioproductieworkflow die is ontworpen om continu grote hoeveelheden zeer zuivere NK-EV's te produceren en te isoleren. Tijdens het proces worden controletests uitgevoerd tijdens de bioproductieworkflow, zodat de EV's voldoen aan de kwaliteitsnormen voor productvrijgave.

Samenvatting

Van natuurlijke killercellen afgeleide extracellulaire blaasjes (NK-EV's) worden onderzocht als biotherapeutica tegen kanker. Ze bezitten unieke eigenschappen als cytotoxische nanoblaasjes gericht tegen kankercellen en als immunomodulerende communicatoren. Een schaalbare workflow voor bioproductie maakt de productie mogelijk van grote hoeveelheden zeer zuivere NK-EV's om te voldoen aan de preklinische en klinische eisen. De workflow maakt gebruik van een holle-vezelbioreactor met gesloten lus, waardoor continue productie van NK-EV's uit de NK92-MI-cellijn mogelijk is onder serumvrije, xenovrije, feedervrije en antibioticavrije omstandigheden in overeenstemming met de normen voor goede productiepraktijken. Deze protocolgestuurde studie schetst de bioproductieworkflow voor het isoleren van NK-EV's met behulp van chromatografie met uitsluiting van grootte, ultrafiltratie en sterilisatie op basis van filter. Essentiële NK-EV-productkarakterisering wordt uitgevoerd via analyse van het volgen van nanodeeltjes en hun functionaliteit wordt beoordeeld door middel van een gevalideerde, op cellevensvatbaarheid gebaseerde potentietest tegen kankercellen. Dit schaalbare bioproductieproces heeft een aanzienlijk potentieel om de klinische vertaling van op NK-EV gebaseerde kankerbiotherapeutica te bevorderen door vast te houden aan best practices en reproduceerbaarheid te garanderen.

Inleiding

In de 21eeeuw zijn er opmerkelijke vorderingen gemaakt in de strijd tegen kanker. Dit is voornamelijk te wijten aan de opkomst van immunotherapeutica tegen kanker, een klasse geneesmiddelen die het immuunsysteem gebruikt om kanker te bestrijden. Van natuurlijke killercellen afgeleide extracellulaire blaasjes (NK-EV's) vertegenwoordigen veelbelovende kanshebbers in het groeiende domein van immunotherapie. NK-cellen zijn integratief voor aangeboren en adaptieve immuniteit en spelen een cruciale rol in de afweer van het lichaam tegen met virus geïnfecteerde, gestreste en kwaadaardige cellen. Ze maken gebruik van een uitgebreid arsenaal aan antikankermachines om abnormale cellen te elimineren door middel van cytotoxische middelen 1,2,3. Een van deze mechanismen is de productie en afscheiding van EV's, dubbellaagse structuren op nanoschaal die verschillende biomoleculen bevatten, zoals eiwitten, RNA's en DNA's, die cruciaal zijn voor het vergemakkelijken van intercellulaire communicatie 4,5,6. NK-EV's komen naar voren als veelbelovende celvrije therapieën vanwege hun unieke dragereigenschappen. Deze omvatten hun kleine formaat, waardoor sterilisatie op basis van filters mogelijk is, hoge biocompatibiliteit, preferentiële accumulatie in tumoren, breed spectrum voor vrachtafgifte, vermogen om biologische barrières zoals de bloed-hersenbarrière te overwinnen en minimaal toxiciteitsprofiel. Om verschillende redenen maken NK-EV's de noodzaak van lymfodepletie bij de patiënt via chemotherapie vóór toediening overbodig: 1) conventioneel wordt lymfodepletie gebruikt om een meer gastvrije omgeving te creëren voor celtherapie, waardoor geïnfuseerde cellen zich kunnen vermenigvuldigen en hun therapeutische effecten kunnen uitoefenen; 2) in tegenstelling tot cellen missen EV's de replicatiecapaciteit en zijn ze aanzienlijk kleinschaliger; 3) EV's werken via verschillende mechanismen en vertonen een verminderde immunogeniciteit in vergelijking met cellen 5,6,7. Bovendien vertoonden NK-EV's consequent in vitro werkzaamheid tegen verschillende kankermodellen en hebben ze ook immunomodulerende effecten op immuuncellen aangetoond die antikankerreacties bevorderen 8,9. In vivo resultaten bevestigen deze bevindingen, met kankerregressie na behandeling met NK-EV en verwaarloosbare toxiciteiten 10,11,12. Daarom zijn op NK-EV gebaseerde therapieën veelbelovend om de uitdagingen van de behandeling van koude, immunologisch inerte solide tumoren aan te pakken 13,14,15,16,17.

Onze recente studie richt zich op een belangrijk knelpunt voor de klinische vertaling van NK-EV's door middel van bioproductie7. Het artikel presenteert een proof-of-concept voor een kosteneffectieve en schaalbare bioproductieworkflow van NK-EV's die zorgvuldig is ontworpen om kwaliteitscontroletests tijdens het proces te garanderen. Deze aanpak produceerde continu grote hoeveelheden zeer zuivere NK-EV-gebaseerde kankerbiotherapeutica, met een grondige productkarakterisering uitgevoerd volgens de MISEV2018-richtlijnen18. De schaalbaarheid van de bioproductieworkflow kan worden bereikt door de cartridgegrootte te vergroten of door meerdere bioreactoren parallel te laten draaien. Evenzo kan de schaalbaarheid van de EV-isolatieworkflow gemakkelijk worden bereikt met behulp van technieken zoals Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) op basis van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), ultrafiltratie (UF) en sterilisatie op basis van filter. Het closed-loop holle-vezel bioreactor (HFB) -systeem groeide de IL-2-zelfvoorzienende NK-cellijn (NK92-MI-cellen) zonder dat serumsuppletie, een feedersysteem en antibiotica nodig waren. Dit werd bereikt met behulp van een in de handel verkrijgbaar chemisch gedefinieerd en xenovrij medium (een GMP-versie is nu in de handel verkrijgbaar). Als gevolg hiervan werden grote hoeveelheden NK-cellen (109 levensvatbare cellen) en NK-EV's (1012 EV's) binnen 5 - 7 dagen met succes geproduceerd met behulp van een enkele middelgrote bioreactorpatroon, waarbij beide producten uitgebreid werden gekarakteriseerd. Tijdens het bioproductieproces werd de celgezondheid dagelijks gecontroleerd met behulp van kwantificeerbare statistieken zoals pH-, glucose- en lactaatniveaus, samen met visuele indicatoren zoals mediakleur en elk teken van besmetting, die essentiële voorspellers zijn van cel- en EV-kwaliteit. Evaluatie na de oogst van de levensvatbaarheid en functionaliteit van NK-cellen gegenereerd in het HFB-systeem, met name cytotoxiciteit, onthulde een significante verbetering in vergelijking met culturen op basis van kolven7. Evenzo vertoonden gezuiverde NK-EV's een zeer zuiver profiel, verstoken van bacteriën, mycoplasma, gemeenschappelijke virale entiteiten en cellulaire componenten, en met verwaarloosbare endotoxineniveaus. Belangrijk is dat gezuiverde NK-EV's meer dan 99,9% van alle nanodeeltjes in het eindproduct uitmaakten7. Ten slotte behielden deze gezuiverde NK-EV's belangrijke NK-kenmerken, waaronder oppervlaktemarkers (CD2, CD45, CD56), cytokine-payload (GzmB, PFN, IFN-g) en vertoonden ze krachtige cytotoxiciteit tegen leukemische K562-cellen, de gouden standaardlijn voor het beoordelen van NK-celcytotoxiciteit7.

Het huidige protocol beschrijft de schaalbare bioproductieworkflow die hierboven is besproken. Het verduidelijkt de methodologie voor het isoleren van NK-EV's geproduceerd met behulp van FPLC-SEC in combinatie met UF en filtergebaseerde sterilisatie. Daarnaast beschrijft het protocol cruciale stappen, waaronder productkarakterisering met behulp van nanoparticle tracking analysis (NTA), kwaliteitsbeoordeling met behulp van verschillende tools (eiwit/dsDNA-kwantificering en microbiële testen) en functionele validatie van het gezuiverde NK-EV-product tegen kankercellen door middel van cellevensvatbaarheidstest. Doorgaans levert deze workflow 1,0 - 1,5 ml NK-EV-product op met een gemiddelde concentratie van 1,18 x 1012 EV's/ml7, met een totaal van minimaal 1 x 1012 EV's op basis van ongeveer 40 ml EV-rijke CM. Dit proces maakt productvrijgave mogelijk voor verschillende downstream-toepassingen, zoals onderzoeker, preklinisch en multi-omics (proteomics, transcriptomics, genomica, metabolomics, lipidomics en epigenomics) studies die grote hoeveelheden EV's van hoge kwaliteit vereisen en tegelijkertijd potentieel hebben voor klinische vertaling, met aangetoonde reproduceerbaarheid.

Protocol

1. NK-EV biofabricage van NK92-MI-cellen met behulp van een gesloten bioreactor

OPMERKING: NK-EV's worden vervaardigd met behulp van een schaalbare bioproductieworkflow die voldoet aan Good Manufacturing Practices (GMP) en gebruik maakt van de NK92-MI-cellen (zie figuur 1). Onze recente publicatie bevat gedetailleerde inzichten in de bioproductieprocedure en de identiteits- en veiligheidsprofielen van NK-EV-producten7.

figure-protocol-1
Figuur 1: Bioproductie van van natural killer cellen afgeleide extracellulaire blaasjes (NK-EV's) in een gesloten holle-vezel bioreactor (HFB) met schaalbare isolatieworkflow. Schematische weergave van de bioproductieworkflow om grote hoeveelheden NK-EV-producten met een hoge zuiverheid te genereren. IL-2 zelfvoorzienende NK92-MI-cellen worden gezaaid in een gesloten HFB-cartridge en gekweekt onder serumvrije (SF), xenovrije (XF), feedervrije en antibioticavrije omstandigheden, waar ze worden gekweekt voor continue EV-rijke geconditioneerde mediumverzameling. NK-EV-isolatie van EV-rijke CM wordt uitgevoerd door middel van op Fast Protein Liquid Chromatography gebaseerde grootte-uitsluitingschromatografie (FPLC-SEC) in combinatie met ultrafiltratie (UF). NK-EV's worden gekarakteriseerd en beoordeeld door middel van meerdere assays, en hun functionaliteit tegen K562-leukemiecellen wordt geëvalueerd met behulp van een levensvatbaarheidspotentietest. Dit cijfer is gewijzigd van7 (gemaakt met Biorender.com). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Uitgaande van 1 - 5 x 106 NK92-MI-cellen en met behoud van een celdichtheid tussen 3 - 8 x 105 cellen/ml, kweekt u de cellen in T25 - T175-kolven met behulp van een voorverwarmd kweekmedium. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 (zie materiaaltabel). Vervang het medium elke 2 - 3 dagen totdat er 1 x 108 NK92-MI-cellen zijn geproduceerd met een levensvatbaarheid van ten minste 70%.
    OPMERKING: Bewaar 1/5e-1/3evan het geconditioneerde medium (CM) bij het opnieuw inzaaien van de cellen, omdat het gunstige groeifactoren bevat.
  2. Voer een medium voorbereiding van de HFB-patroon en NK-celinoculatie uit zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Alle manipulaties moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II om de steriliteit te garanderen en te behouden. Voordat u het patroonsysteem in de bioveiligheidskast plaatst, moet u royaal 70% ethanol besproeien, waarbij u speciale aandacht besteedt aan de flessenhals van het reservoir en de spuitaansluitingen.
    1. Bereid de HFB-cartridge voor volgens de instructies van de fabrikant19 (zie materiaaltabel; zie afbeelding 2) zoals hieronder beschreven.
      1. Wikkel Luer Lock-verbindingen in met wasfilm en pas het pompdebiet aan volgens de instructies van de fabrikant19. Conditioneer de HFB-patroon door 150 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zie materiaaltabel) gedurende ten minste vijf dagen te laten circuleren.
      2. Om de lucht uit de extracellulaire capillaire ruimte (ECS; volume is ongeveer 29 ml) te verwijderen, injecteert u ongeveer 40 ml PBS via de linker ECS-poort en laat u de lucht ontsnappen via de rechter ECS-poort. Sluit daarbij de linker- en rechtereindpoortklemmen. Zorg ervoor dat de spuit altijd is aangesloten op de linker en rechter ECS-poorten.
      3. Als u klaar bent, plaatst u de patroon op de stromingspomp (zie materiaaltabel) in de incubator die is ingesteld op 37 °C en 5% CO2. Zorg ervoor dat er na een paar dagen circulatie geen lekken zijn.
    2. Vervang de PBS door 150 ml kweekmedium in de reservoirfles en de ECS 2 dagen voordat u de cellen in de patroon zaait. Herhaal de vorige conditioneringsstappen (stap 1.2.1.) met behulp van de voedingsbodem, maar gedurende 2 dagen circulatie.
    3. Vervang voor het zaaien van cellen de inhoud in de reservoirfles en het ECS door 250 ml vers kweekmedium.
    4. Haal de kweekkolf uit de broedmachine en breng de cellen over in een buisje van 50 ml. Centrifugeer 5 minuten op 300 x g . Resuspendeer de celpellet met 21 ml kweekmedium.
    5. Bereid twee aliquots van elk 20,5 μl uit de celsuspensie voor het tellen van cellen op een geautomatiseerde cellenteller (zie materiaaltabel). Voeg aan elke hoeveelheid celsuspensie van 20,5 μl een gelijke hoeveelheid AO/PI-kleurstof toe (zie materiaaltabel) en meng ten minste 10x op en neer.
      OPMERKING: We raden Trypan Blue niet aan voor een nauwkeurige telling van NK-cellen. U kunt ook een hemocytometer gebruiken voor handmatig tellen.
    6. Laad 20 μL in elke telkamer van de teldia en voer een geautomatiseerde celtelling uit met behulp van het juiste programma. Bereken de gemiddelde concentratie van levende cellen en noteer de levensvatbaarheid.
    7. Meng de NK-celoplossing een paar keer voordat u deze opzuigt met behulp van een spuit van 20 ml en een naald van 18 G om de steriliteit te behouden. Deze oplossing moet ongeveer 1 x 108 levende NK-cellen bevatten in ongeveer 20 ml of ongeveer 5 x 106 cellen/ml.
    8. Nadat u de naald uit de spuit hebt gehaald, injecteert u de NK-cellen voorzichtig in de patroon via de linker ECS-poort. Om een gelijkmatige celspreiding door de cartridge te garanderen, moet u de celoplossing ten minste 10x voorzichtig heen en weer sturen met behulp van de spuiten die zijn aangesloten op de linker en rechter ECS-poorten.
      OPMERKING: de oplossing moet over beide spuiten even troebel zijn, met de linker- en rechtereindpoorten gesloten.
    9. Open de linker- en rechtereindpoort en injecteer wat er in de spuiten overblijft. Sluit de linker en rechter ECS-poorten af met behulp van de clamps.
    10. Breng de cartridge over naar de broedmachine en laat deze 30 minuten staan voordat u deze correct op de stromingspomp installeert. Laat de cartridge erin voor bioproductie. Pas het debiet aan volgens de fabrikant.
    11. Om de celgezondheidsstatistieken te controleren, haalt u dagelijks een aliquot van 0,5 ml medium uit het grondig gemengde medium in de reservoirfles en bewaart u dit bij -20 °C na verificatie van de glucose- en pH-waarden. L-lactaatspiegels kunnen later worden geverifieerd (zie Materiaaltabel).
    12. Vervang het medium in het reservoir (250 - 500 ml) elke 1 - 2 dagen om het glucosegehalte boven 50% van de oorspronkelijke niveaus in het medium te houden en de pH boven 7,0 (bereik van 7,0 - 8,0).
  3. Voer de NK-EV-rijke CM-inzameling dagelijks uit na 1 dag rust bij het eerste zaaien van de cartridge, zoals hieronder beschreven.
    1. Verplaats het cartridgesysteem naar de bioveiligheidskast. Injecteer voorzichtig ongeveer 21 ml kweekmedium via de linker ECS-poort om een gelijkwaardige hoeveelheid EV-rijke CM door het rechter ECS te duwen - niet mengen (zie figuur 3).
      OPMERKING: Gebruik altijd nieuw plastic servies om vervuiling te voorkomen.
    2. Breng de EV-rijke CM-oplossing over in een buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g . Verplaats intussen het patroonsysteem terug in de broedmachine op de stromingspomp.
    3. Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2000 x g . Breng het bovenstaande opnieuw over in een nieuw buisje. Verdeel vervolgens de EV-rijke CM gelijkmatig over 3, 50 ml tubes (~7 ml/tube) en bewaar bij -80 °C tot verdere verwerking.
      OPMERKING: Opeenvolgend geoogste EV-rijke CM wordt over deze drie buizen gepoold, waardoor drie technische replicatiebuisjes worden gegenereerd.
  4. Voer HFB-NK-celoogst uit om EV-rijke CM te blijven produceren met dezelfde HFB-cartridge zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: NK-cellen kunnen worden geoogst uit het ECS van de HFB door het HFB-NK-celoogstprotocol uit te voeren "zodra de cartridge samenvloeit (maximaal 1 x 109 cellen). Dit gebeurt na 5 - 7 dagen voor elke partij of wanneer het glucosegehalte gedurende 2 opeenvolgende dagen onder de detectielimiet van de glucosemeter blijkt te liggen (bijv. geen meting of metingen van ~ 0). Als dit de laatste celoogst is, kan het medium worden vervangen door PBS om de cartridge te spoelen en de cellen op te halen.
    1. Oogst EV-rijke CM precies zoals hierboven beschreven in stap 1.3.
    2. Injecteer ongeveer 50 ml van het medium via de linker ECS-poort. Om een homogene celdispersie door de cartridge te garanderen, duwt u de celoplossing voorzichtig heen en weer met behulp van de spuiten die zijn aangesloten op de linker en rechter ECS-poorten, ten minste 10x om cellen los te maken voordat u ze uiteindelijk met een spuit door de rechter ECS-poort duwt en verzamelt. Breng de geoogste EV-rijke CM over in een buis van 50 ml. Zet voorlopig opzij bij 37 °C (waterbad of broedmachine).
      OPMERKING: De push-back-actie helpt de cellen los te maken voordat ze volledig zijn verdreven en verzameld door een spuit via de rechter ECS-poort. De oplossing moet over beide spuiten even troebel zijn, waarbij de linker- en rechtereindpoort gesloten zijn. Door op de bioreactorpatroon te tikken (fysieke verstoring) kan de celcluster aan de onderkant van de patroon preventief worden losgemaakt. Agressief heen en weer mengen van de celsuspensie kan de levensvatbaarheid van de herstelde cellen negatief beïnvloeden. Zorg en geduld moeten worden toegepast om de levensvatbaarheid te maximaliseren.
    3. Herhaal de laatste stap 2x. In totaal moet 150 ml celsuspensie worden teruggewonnen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Gooi supernatant weg.
    4. Resuspendeer beide celpellets in elk 20 ml vers medium en combineer ze. Verzamel twee aliquots van elk 20,5 μl van de celsuspensie voor het tellen van cellen op een geautomatiseerde cellenteller (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Doorgaans zijn er meerdere celverdunningen nodig met PBS als verdunningsmiddel om binnen het dynamische bereik van de celteller te vallen.
    5. Voeg aan de celsuspensie van 20,5 μl een gelijke hoeveelheid AO/PI-kleurstof toe (zie materiaaltabel) en meng minstens 10x op en neer. Laad 20 μL in elke telkamer van de teldia en voer een geautomatiseerde celtelling uit met behulp van het juiste programma.
    6. Neem het gemiddelde van de concentratie van levende cellen van alle voor verdunning gecorrigeerde tellingen, bepaal de totale hoeveelheid levende cellen en registreer de levensvatbaarheid. Zoals hierboven beschreven, om continu EV-rijk CM te produceren met behulp van dezelfde bioreactorpatroon, zaait u 1 x 108 HFB-geproduceerde NK-cellen opnieuw in.
      OPMERKING: Indien gewenst kunnen HFB-geproduceerde NK-cellen worden opgeslagen met behulp van een cryopreservatie vriesmedium en een vriescontainer om de vriessnelheid te regelen (zie Materiaaltabel).

figure-protocol-2
Figuur 2: Hollow-Fiber Bioreactor (HFB) systeemcomponent en opstelling. De reservoirfles (1) bevat het volledige medium dat door de bioreactorpatroon (2) circuleert door de werking van een peristaltische pomp (niet afgebeeld) die inwerkt op de pompslang (3). Cellen worden in de extracellulaire capillaire ruimte (ECS) ingebracht via de linker (4) en rechter (5) ECS-zijpoorten. Zodra de ECS-schuifklemmen zijn gesloten, zijn de linker (6) en rechter (7) zijpoorten open om het medium door het systeem te laten circuleren. Let op de toevoeging van wasfilm op de Luer Lock-aansluiting bij de reservoirdop van de middelgrote fles om mogelijke besmetting te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Schematische weergave van het NK-EV isolatieproces. Na dagelijkse verzameling van EV-rijk geconditioneerd medium (CM), werd de oplossing differentieel gecentrifugeerd om cellen te verwijderen (eerste centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten) en cellulair afval (tweede centrifuge op 2000 x g gedurende 10 minuten). Geklaarde EV-rijke CM werd opgeslagen bij -80 °C tot verdere verwerking. Eenmaal klaar voor NK-EV-isolatie, wordt ingevroren EV-rijke CM ontdooid en nog een keer gecentrifugeerd om de verwijdering van cellulair afval te garanderen (derde centrifuge op 10.000 x g gedurende 30 minuten). Vervolgens wordt de EV-rijke CM gedurende 2 - 4 uur bij 37 °C behandeld met endonuclease om nucleïnezuren te verteren die als gastheercelcontaminanten worden beschouwd. Vervolgens wordt de EV-rijke CM verwerkt door middel van Fast Protein Liquid Chromatography-based size-exclusion chromatografie (FPLC-SEC) voor EV-zuivering met behulp van een bimodale hars. Geëlueerde fracties van ongeveer 10 - 15 ml worden gecombineerd en gefilterd met filters van 0,22 μM om de steriliteit van het uiteindelijke NK-EV-product te garanderen. Door ultrafiltratie kan het product worden geconcentreerd met een factor van ongeveer 35 - 50X, wat een gegarandeerde concentratie oplevert van meer dan 1 x 1012 EVs/ml, in totaal 1,0 - 1,5 ml. Dit cijfer is gewijzigd van7 (gemaakt met Biorender.com). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. NK-EV-zuivering door FPLC-SEC in combinatie met UF en sterilisatie op basis van filters

  1. Bereid de volgende oplossingen en filtreer ze twee keer met een filter van 0,1 μm (zie materiaaltabel): water (geleidbaarheid van 0 mS/cm), PBS: 50 ml 10x PBS + 450 ml water (geleidbaarheid ongeveer 14,7 mS/cm), 20% ethanol, reinigingsoplossing (0,5 M NaOH en 30% isopropylalcohol in water).
  2. Voer de initiatie van het FPLC-systeem uit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Voer voor en na het uitvoeren clean-in-place (CIP) stappen uit volgens de instructies van de fabrikant. Was alle leidingen en de kolomhars en spoel af met dubbel gefilterd (DF) water, reinigingsoplossing, DF-water en DF-PBS.
    OPMERKING: Het is vermeldenswaard dat CIP indien nodig op een andere dag kan worden gedaan.
  3. Gebruik een chromatografiekolom gevuld met een bimodale hars (zie materiaaltabel) met een bedhoogte van 20 cm. Maak verbindingen met behulp van de druppel-tot-druppel-methode om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de kolom wordt gebracht.
  4. Stel de fractiecollector in met de juiste opvangbuizen en wijzig de fractioneringsinstellingen in het gewenste opvangvolume (bijv. 15 ml). Plaats voldoende buisjes en twee extra buisjes om het volledige monstervolume te verzamelen.
  5. Voer de monstervoorbereiding uit zoals hieronder beschreven.
    1. Neem 40 - 80 ml EV-rijke CM uit de vriezer van -80 °C en ontdooi snel bij 37 °C. Laad het monster in de ultracentrifuge en draai gedurende 30 minuten bij 4 °C op 10.000 x g .
      OPMERKING: Buizen moeten nauwkeurig worden uitgebalanceerd op gewicht, niet op volume.
    2. Verzamel na het centrifugeren het bovenstaande en breng het over in een nieuwe buis. Om de dsDNA-spiegels te verlagen, behandelt u de EV-rijke CM met 50 E/ml endonuclease en 1,5 mM MgCl2 (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 2 - 4 uur in een broedmachine (37 °C) en laat een matige menging toe.
  6. Zodra het systeem (lijnen en kolom) klaar is voor EV-isolatie, laadt u de EV-rijke CM in een spuit van 60 ml en sluit u deze aan op de monsterlijn. Start het systeem door op Handmatig uitvoeren te klikken en stel het debiet in op 0. Volg de aanwijzingen van de software om de uitvoering preventief op te slaan en klik vervolgens op Start.
  7. Selecteer Lijn B (DF-PBS) en draai met een stroomsnelheid van 150 cm/h (debiet van 2,0 ml/min). Zorg ervoor dat de oplossing door de kolom loopt.
  8. Zodra de geleidbaarheid is gestabiliseerd, drukt u op Auto Zero UV. Verander het stroompad om het monster naar de afvalfles vóór de kolom te leiden. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem terechtkomen.
  9. Richt het monster na maximaal 5 - 20 s op de kolom. Klik op Fractionering zodra de UV-metingen ongeveer 230 mAU hebben bereikt.
  10. Zodra het monster volledig door het systeem is geïnjecteerd, schakelt u het buffersysteem over op DF-PBS (bij de monsterklep) om de zuivering voort te zetten. Klik nogmaals op Fractionering wanneer de UV-waarde ongeveer 1600 mAU bereikt.
    OPMERKING: Dit komt overeen met het snijpunt tussen UV-metingen en geleidbaarheidsmetingen. Langere fractionering verdunt alleen het retentaat zonder de EV-opbrengst te verhogen.
  11. Combineer alle fracties (verdunde NK-EV's) en bewaar ze bij 4 °C tot ze klaar zijn voor sterilisatie en ultrafiltratie (UF) op basis van filter.
  12. Blijf DF-PBS gebruiken totdat de UV-waarde ongeveer 1000 mAU bereikt. Hierna stopt u met hardlopen en slaat u het chromatogram op als een PDF-document.

3. Sterilisatie en concentratie op basis van NK-EV-productfilters door UF

  1. Laat de centrifuge afkoelen tot 10 °C. Ontsmet elk onderdeel van het UF-apparaat (zie Materiaaltabel) door te spoelen met 20 - 30 ml 90% ethanol. Centrifugeer op 4000 x g gedurende 5 - 10 min.
    OPMERKING: Het filter is gemaakt van 10 kDa MWCO geregenereerde cellulose.
  2. Gooi de doorstroming weg en herhaal vervolgens de spoeling met behulp van steriele PBS om het apparaat in evenwicht te brengen. Herhaal dit in totaal 2x.
  3. Om de steriliteit te maximaliseren, filtreert u de verdunde NK-EV-oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm dat vooraf is bevochtigd met DF-PBS (zie materiaaltabel). Verzamel het filtraat rechtstreeks in het gesteriliseerde concentratieapparaat.
  4. Draai 15 - 40 minuten op 4000 x g (de centrifugetijd is afhankelijk van het monster). Meng de oplossing na het centrifugeren in het bovenste filtercompartiment met behulp van een serologische pipet. Draai nog 10 minuten op 4000 x g .
    OPMERKING: De mengstap is optioneel omdat het de concentratiestap eenvoudig vereenvoudigt door te voorkomen dat het membraan verstopt raakt door EV's.
  5. Zet de doorstroming tijdelijk opzij en verzamel het NK-EV-monster door het filterapparaat om te keren en aan het opvangapparaat te bevestigen.
  6. Draai 2 minuten op 2000 x g . Breng het gezuiverde NK-EV-product over in een buis van 2 ml. Bewaar het gezuiverde NK-EV-product bij 4 °C voor kortdurend gebruik (≤ 7 dagen) of ingevroren bij -20 °C voor langdurig gebruik.

4. NK-EV karakterisering door Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

  1. Bereid de oplossing voor en filtreer deze twee keer op 0,1 μm (zie materiaaltabel): water, PBS, reinigingsoplossing (10% bleekmiddel (LET OP) in water).
  2. Start het NTA-systeem volgens de instructies van de fabrikant. Voer op dezelfde manier de CIP-stappen (clean-in-place) voor en na het uitvoeren uit. Was alle lijnen en spoel af met dubbel gefilterd (DF) water, reinigingsoplossing en DF-water. Breng de lijnen in evenwicht met behulp van DF-PBS.
  3. Controleer de stroomcel en controleer op luchtbellen. Verwijder bubbels indien aanwezig. Zodra dit duidelijk is, plaatst u de flowcel voorzichtig terug in het NTA-instrument.
    OPMERKING: Hoewel niet aanbevolen door de fabrikant, kunnen zeer moeilijk te verwijderen luchtbellen gemakkelijk worden verwijderd door te spoelen met 20% ethanol en vervolgens DF-water.
  4. Zodra de flowcel op zijn plaats zit en de deur gesloten is, klikt u op Camera starten. Met de lijnen gevuld met DF-PBS, moet het scherm een absoluut minimum aantal deeltjes tonen.
  5. Wijzig de opname-instellingen in een schermversterking van 2 en een cameraniveau van 14. Zet ook de verwarming aan om de stroomcel op temperatuur te stabiliseren.
  6. Klik op Standaardmeting om een script te maken onder het tabblad SOP voor het verzamelen van één opname gedurende 1 minuut met een debiet van 30 deeltjes/frame en 23 °C.
  7. Voeg hieronder de map en bestandsnaam toe aan de padnaam om de gegevens op te slaan.
  8. Bereid vooraf verdunningen van het gezuiverde NK-EV-product met DF-PBS. Bij het uitvoeren van NTA vereist nauwkeurige kwantificering 30 - 80 deeltjes/frame.
  9. Draai het monster voordat u het in de spuit laadt (zie materiaaltabel).
  10. Sluit de acquisitiespuit van 1 ml voorzichtig aan op de laadleiding van het instrument. Er mag geen lucht aanwezig zijn, omdat dit de acquisitie en analyse negatief zal beïnvloeden. Duw langzaam de helft van het monster erdoor, zodat er ongeveer 0,5 ml in de spuit overblijft.
  11. Zodra deeltjes zichtbaar zijn op het scherm, stelt u de camera scherp om maximaal één halo rond elk deeltje te hebben. Klik op Infuseren onder het tabblad Hardware met een snelheid van 1000 gedurende 5 s. Verlaag het vervolgens tot een snelheid van 30.
  12. Druk op Script uitvoeren en volg de aanwijzingen. De software zorgt ervoor dat de temperatuur is ingesteld en vraagt of de instellingen correct zijn. Klik op Ja en volg de aanwijzingen van de software.
  13. Nadat u de opname hebt voltooid, klikt u op Annuleren wanneer de software vraagt om bestanden te verwerken of te exporteren. Klik op Infuseren onder het tabblad Hardware met een snelheid van 1000 gedurende 10 - 15 s. Zet intussen de kachel en de camera weer aan. Verlaag vervolgens de snelheid tot 30 totdat de deeltjes bewegen.
  14. Verzamel nog vier opnames door de vorige stappen te herhalen. Zodra in totaal vijf vangsten per verdunning zijn geregistreerd, voert u een analyse uit nadat u alle vijf de vangsten hebt geïmporteerd.
  15. Selecteer de bestanden die moeten worden verwerkt door ze te markeren. Klik op Geselecteerde bestanden verwerken. Stel op het tabblad Proces de analyse-instellingen in op een schermversterking van 2 en een detectiedrempel van 15.
    Instellingen zijn afhankelijk van de steekproef; Zorg ervoor dat er 30 - 80 deeltjes per frame zichtbaar zijn.
  16. Vink deze optie aan en klik op OK voor analyse.
  17. Zodra de bestanden zijn verwerkt, zal de software vragen om ze te exporteren. Klik op Ja zonder op extra vakjes te klikken of klik op Exporteren.
  18. Herhaal dit voor alle EV-verdunningen of monsters. Sluit het NTA-instrument af nadat alle monsters zijn voltooid en CIP is voltooid.

5. Testen van de kwaliteitsborging

  1. Voer microbiële tests uit met behulp van twee tests: 1) een klein aliquot gezuiverde NK-EV's wordt verrijkt in geautoclaveerd LB-bouillonmedium, en 2) een klein aliquot gezuiverde NK-EV's wordt gebruikt voor mycoplasma PCR-detectie (zie Materiaaltabel).
    1. Test 1: kweek LB-medium bij 37 °C gedurende maximaal 5 dagen, inclusief positieve en negatieve controles. Noteer de OD600, indien nodig.
    2. Test 2: voer mycoplasma PCR-detectie uit volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Kwantificeer eiwit en dsDNA op gezuiverde NK-EV-verdunningen met behulp van op fluorometers gebaseerde assays volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).

6. Evaluatie van de potentie van met NK-EV behandelde kankercellen met behulp van een gevalideerde, zeer gevoelige levensvatbaarheidstest op basis van resazurine 20

  1. Kweek menselijke K562-leukemiecellen met behulp van RPMI-1640 met 10% door warmte geïnactiveerde FBS gedurende een paar dagen voordat de potentietest wordt uitgevoerd (zie materiaaltabel). Houd de dichtheid aan tussen 2 - 8 x 105 cellen/ml en vervang de media elke 2 - 3 dagen.
  2. Verkrijg een plaat met platte bodem met 96 putjes (zie Materiaaltabel) en voeg preventief het volume analysemedium toe (aangevuld met 5% EV-verarmd FBS) dat nodig is voor normalisatiedoeleinden (zie Materiaaltabel). Het uiteindelijke volume is 150 μL/putje.
    OPMERKING: Gebruik een repeaterpipettor om well-to-well variatie te verminderen.
  3. Verkrijg de celcultuur en breng de cellen over naar een buisje. Centrifugeer 5 minuten op 300 x g . Resuspendeer de celpellet in een eencellige oplossing met behulp van 2 - 5 ml analysemedium.
  4. Verzamel een hoeveelheid van 20,5 μl van de celsuspensie voor het tellen van cellen op een geautomatiseerde cellenteller (zie materiaaltabel).
  5. Voeg aan de celsuspensie van 20,5 μl een gelijke hoeveelheid AO/PI-kleurstof toe (zie materiaaltabel) en meng minstens 10x op en neer.
    OPMERKING: We raden AO/PI aan voor een nauwkeurige celtelling. U kunt ook een hemocytometer gebruiken voor handmatig tellen.
  6. Laad 20 μL in elke telkamer van de teldia en voer een geautomatiseerde celtelling uit met behulp van het juiste programma. Gemiddelde van de concentratie van levende cellen en registreer de levensvatbaarheid.
  7. Breng ongeveer 1 x 106 cellen over in een secundaire buis. Verdun de cellen tot precies 7 ml analysemedium en herhaal de celtelling. De concentratie moet ongeveer 1,2 - 1,5 x 105levende cellen/ml zijn.
  8. Zoals hierboven beschreven, past u de concentratie van de eencellige suspensie aan op 1 x 105 levende cellen/ml en herhaalt u de celtelling indien nodig.
    OPMERKING: De variatiecoëfficiënt tussen technische dubbele tellingen moet minder dan 25% zijn; meestal is het minder dan 5% met AO/PI-telling.
  9. Zodra de gewenste concentratie is bereikt, brengt u 50 μL (± 1 μL) van deze oplossing over in elk putje om zo dicht mogelijk bij 5000 cellen/putje (4900 - 5100 cellen/putje) te komen. Bereid technische drievouden voor elke testtoestand voor en gebruik een repeaterpipettor om well-to-well variatie te verminderen.
  10. Breng de plaat gedurende 2 minuten over naar een orbitale schudder (350 - 500 RPM). Breng de cellen terug naar de incubator totdat ze klaar zijn om door te gaan met de NK-EV-behandeling.
  11. Bereid de vereiste NK-EV-verdunningen (1:5, 1:10 en 1:100) voor met behulp van een analysemedium.
  12. Test op basis van deze verdunningen de volgende EV-concentraties: 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 en 1 x 1011 deeltjes/ml. Het doseringsvolume is beperkt tot 20% van het totale analysevolume.
  13. Zodra u klaar bent, brengt u het vereiste volume van een bepaalde verdunning over naar de putjes die een gewenste EV-concentratie voor behandeling vereisen. Voeg 15 μl 10x Triton-X toe aan het positieve controleputje (zie materiaaltabel). Het uiteindelijke putvolume moet worden genormaliseerd naar 150 μL.
  14. Voeg de plaat toe aan een orbitale schudder (350 - 500 RPM) gedurende 2 min. Incubeer de cellen gedurende 3 uur bij 37 °C in de 5% CO2 -incubator.
  15. Verwarm de plaatlezer voor (zie Materiaaltabel) op 37 °C en laad het volgende script: 37 °C (vermindert temperatuurgerelateerde variatie), 450 RPM mengen gedurende 1 minuut (zorgt voor homogeniteit van het monster) en lezen.
  16. Voeg 15 μl van het reagens op basis van resazurine toe aan elk putje (zie materiaaltabel). Bescherm het reagens tegen licht en gebruik een repeaterpipettor om well-to-well variatie te verminderen.
  17. Voeg de plaat toe aan een orbitale schudder (350 - 500 RPM) gedurende 2 min. Breng de plaat over naar de broedmachine en incubeer gedurende 60 minuten. Verwijder luchtbellen met behulp van een in ethanol gedompelde pipetpunt. Lees de plaat af met een excitatie van 560 nm en een emissie van 590 nm.
  18. Gegevensanalyse: Gemiddelde technische replicaten werden gemiddeld en gecorrigeerd voor achtergrond voordat een dosis-responsanalyse werd uitgevoerd met behulp van een niet-lineaire regressie voor het remmingseffect die de log(remmer) versus genormaliseerde responsvariabele helling zonder beperking liet zien. Noteer de Hillslope- en EC50-waarden .

Resultaten

NK-EV's bezitten inherente cytotoxische functies en hebben een hoge werkzaamheid aangetoond tegen verschillende kankermodellen. Er moet echter meer standaardisatie komen in de huidige studies met betrekking tot een bioproductieworkflow die geschikt is voor de grootschalige productie van NK-EV's 6,21. Onze vorige studie beschreef de haalbaarheid van een gesloten holle-vezel bioreactor (HFB) systeem om grote hoeveelheden NK-EV-producten met een hoge zuiverheid te produceren7. Als follow-up beschrijft deze op protocol gebaseerde studie de workflow van bioproductie en demonstreert de reproduceerbaarheid ervan door het NK-EV-product te produceren en te isoleren (Figuur 1). Bovendien zijn essentiële productkarakterisering en -validatie vereist voordat het product wordt vrijgegeven, waarbij nieuwe en originele gegevens in dit onderzoek worden gepresenteerd.

Het HFB-systeem werd geselecteerd voor de productie van NK-EV vanwege het gebruiksgemak, de betrouwbaarheid, de schaalbaarheid en de GMP-conformiteit7. Met betrekking tot de opstelling van het HFB-systeem worden de NK-cellen geïnjecteerd via de linker ECS-poort en in de bioreactorpatroon geplaatst (Figuur 2). Tegelijkertijd wordt de mediafles via de zijpoorten aangesloten op de HFB en kan de media door het systeem stromen. De NK-cellen worden gekweekt in een serumvrij, xenovrij, feedervrij en antibioticavrij medium, waarbij de media worden vervangen wanneer het glucosegehalte onder de 50% daalt om de celgezondheid in de loop van de tijd te behouden en te maximaliseren. CM wordt dagelijks verzameld, verwerkt door middel van differentiële centrifugaties en ingevroren bewaard (-80 °C) tot het klaar is voor verdere verwerking. Daarna wordt EV-isolatie uitgevoerd door een combinatie van differentiële centrifugaties en FPLC-SEC in combinatie met UF en filtratie (Figuur 3). Dit resulteert in een geconcentreerd en steriel NK-EV product met een eindvolume van ongeveer 1,0 - 1,5 ml. Er wordt een representatief chromatogram van de FPLC-SEC-isolatie van NK-EV's verstrekt (Figuur 4). Vóór FPLC-SEC-verwerking wordt de NK-EV-rijke CM behandeld met endonuclease, waardoor de dsDNA-spiegels, een potentiële gastheer (NK) celcontaminant7, aanzienlijk worden verlaagd. De beschreven EV-isolatieworkflow verwijdert dus cellulair afval en RNA/DNA-contaminanten uit het NK-EV-product, wat essentieel is om een laag en ongewenst immunogeen potentieel te garanderen en ervoor te zorgen dat het eindproduct geschikt is voor downstream-studies.

figure-results-1
Figuur 4: NK-EV-isolatiechromatogram gegenereerd tijdens uitsluiting van de grootte van snelle eiwitvloeistofchromatografie. De blauwe lijn geeft de extinctie (mAU; maximale aflezing van 2000 mAU) weer, de rode lijn geeft de geleidbaarheid weer, de rode tekst vertegenwoordigt de runlog en het grijs gearceerde gebied vertegenwoordigt de gefractioneerde NK-EV's (aangeduid met breuken T2 - T7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na isolatie worden basiskarakterisering van NK-EV en kwaliteitsborgingstests gebruikt om te evalueren of het NK-EV-product kan worden vrijgegeven voor verdere stroomafwaartse experimenten. Het bereik en de concentratie van NK-EV-productdeeltjes worden gemeten met behulp van nanodeeltjestrackinganalyse (NTA), met groottes variërend van 76,30 - 174,30 nm in diameter (D10 van 78,38 ± 2,07 nm, D50 van 106,72 ± 2,43 nm en D90 van 169,80 ± 4,17 nm) en een gemiddelde concentratie van 1,39 x 1012 EV's/ml (Figuur 5A-B). Bovendien toonde de kwantificering van de fluorometer een eiwit- en dsDNA-concentratie van respectievelijk 298,90 ± 66,62 mg/ml en 225,60 ± 37,7 ng/ml voor het eindproduct (Figuur 5C-D). Dit komt overeen met een gemiddelde verhouding van 5,06 x 106 EV/μg eiwit en 6,16 x 1012 EV/μg DNA. Microbiële en mycoplasmatesten leverden beide negatieve resultaten op (gegevens niet weergegeven). Deze resultaten komen overeen met de karakterisering van NK-EV's uit eerder werk7. De eerdere publicatie7 biedt ook een verdere diepgaande karakterisering van de NK-EV-producten volgens de MISEV-richtlijnen (d.w.z. TEM, western blot, endotoxineniveau, virale entiteiten en flowcytometrie voor oppervlakte-antigenen en cytokines).

Ten slotte werd de functionaliteit van het NK-EV-product (d.w.z. cytotoxiciteit tegen kankercellen) beoordeeld met behulp van een gevalideerde, zeer gevoelige op resazurine gebaseerde cellevensvatbaarheidstest na NK-EV-behandeling tegen leukemische cellijn K562 7,20. K562-celbehandeling met NK-EV's gedurende 3 uur produceerde een dosisafhankelijk effect op de levensvatbaarheid van de cellen, overeenkomend met een EC50 van 9,33 x 109 EV's/ml (d.w.z. de dosering die overeenkomt met het doden van 50% van de celpopulatie; Figuur 6A-B). Volgens de geschetste criteria voor de productrelease wordt het NK-EV-product dus geschikt geacht voor verdere experimenten.

figure-results-2
Figuur 5: Karakterisering van het gezuiverde NK-EV-product. (A) NK-EV-productgrootteverdeling gemeten door NTA, weergegeven als gemiddelde van 5 onafhankelijke experimenten, elk met 10 technische replicaten (5 video-opnamen x 2 verdunningen). (B) NK-EV-deeltjesproductconcentratie (deeltjes/ml) gemeten door NTA, weergegeven als gemiddelde ± SD van 5 onafhankelijke experimenten, elk met technische duplicaten. (C) De eiwitconcentratie van het NK-EV-product (mg/ml) werd gemeten met behulp van een fluorometer, weergegeven als gemiddelde ± SD van 5 onafhankelijke experimenten, elk met technische drievouden. (D) NK-EV-product dsDNA-concentratie (ng/ml) gemeten met behulp van een fluorometer, weergegeven als gemiddelde ± SD van 5 onafhankelijke experimenten, elk met technische drievouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 6: Functionele validatie van het gezuiverde NK-EV-product. NK-EV's vertonen een dosisafhankelijke cytotoxiciteit tegen menselijke K562-leukemiecellen die gedurende 3 uur bij verschillende NK-EV-concentraties zijn behandeld met behulp van een zeer gevoelige op resazurine gebaseerde cellevensvatbaarheidstest. (A) Genormaliseerde testuitlezingen (groene lijn staat voor de onbehandelde K562-leukemiecelcontrole en de zwarte stippellijn staat voor gelyseerde K562-leukemiecontrole met dode cellen; met wasmiddel behandeld). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van 11 onafhankelijke experimenten met technische drievouden. (B) EC50-curveanalyse met een variabele helling voor NK-EV-behandeling met 95% betrouwbaarheidsinterval/voorspellingsbanden (rode stippellijn staat voor 50% respons). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Verschillende studies suggereren dat NK-EV's een enorm potentieel hebben als middel tegen kanker 4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Er is echter een schaalbaar GMP-conform bioproductiesysteem nodig dat in staat is om grote hoeveelheden NK-EV's met een hoge zuiverheid op te leveren voor verdere preklinische tests en toekomstige klinische toepassingen. Om dit probleem aan te pakken, gebruikte een eerdere studie een gesloten HFB-systeem om continu NK-cellen en NK-EV-rijke CM te produceren die geschikt zijn voor stroomafwaartse experimenten. Dankzij hun 3D-ontwerp weerspiegelen HFB-systemen nauwkeurig de omstandigheden van het vasculaire systeem en hebben ze een ongelooflijk hoge oppervlakte-volumeverhouding, waardoor meer dan een miljard cellen in cultuur kunnen blijven, wat uiteindelijk leidt tot een verbeterde EV-productie 7,31,32. Belangrijk is dat dit werk het eerste was dat ooit melding maakte van het gebruik van een HFB-systeem voor het kweken van NK-cellen, waarschijnlijk als gevolg van de zelfvoorziening van cellijn IL-27.

Er moeten aanvullende maatregelen worden genomen om de steriliteit van het HFB-systeem en de productie van zeer zuivere NK-EV's te waarborgen. Deze voorzorgsmaatregelen zijn vooral cruciaal bij het ontbreken van een steriele, schone ruimte, wat het geval kan zijn voor verschillende onderzoeksfaciliteiten. Voordat het HFB-systeem de bioveiligheidskast betreedt, wordt het zorgvuldig besproeid met 70% ethanol om alle externe oppervlakken te desinfecteren. Bovendien is er wasfilm om alle Luer Lock-verbindingen gewikkeld om het risico op besmetting te minimaliseren. Dit is met name belangrijk omdat in deze bioproductieworkflow geen antibiotica worden gebruikt, waarvan bekend is dat ze het biochemische profiel van cellen en van cellen afgeleide producten beïnvloeden33. Er werden verschillende maatstaven gebruikt om de gezondheid van cellen te beoordelen tijdens de bioproductie van celproducten. Er werden bijvoorbeeld dagelijkse beoordelingen van de pH-, glucose- en lactaatspiegels van de reservoirmedia uitgevoerd, aangezien dit essentiële surrogaten voor celgezondheid zijn voor monitoring. Naast kwantitatieve beoordelingen zijn ook kwalitatieve observaties van het HFB-systeem (bijv. mediakleur en visuele tekenen van besmetting zoals troebelheid) nuttig voor het bewaken van de gezondheid van cellen. Het aantal cellen op dagelijks opgehaalde CM is geen representatieve maatstaf gebleken voor de levensvatbaarheid van de cultuur (gegevens niet getoond). Dit is waarschijnlijk het gevolg van dode cellen die tijdens CM-bemonstering zijn opgehaald en die werden gevonden in de slang waar media niet mochten circuleren (het kleine gedeelte tussen het ECS en de ECS-spuitpoort), waardoor de levensvatbaarheid van de algehele celcultuur wordt onderschat. Alleen geoogste NK-cellen die door de HFB aan het einde van een productiepartij worden geproduceerd, kunnen een betrouwbare maatstaf zijn voor de gezondheid van de cultuur. Deze cellen vertoonden consequent levensvatbaarheidswaarden van meer dan 70% in productiepartijen7. Samen zorgen deze kwaliteitsbeoordelingsmethoden voor de continue productie van zeer zuivere NK-EV's.

Er zijn verschillende isolatietechnieken ontwikkeld om EV's34 te zuiveren en te isoleren. Eén methode, SEC, maakt gebruik van een kolom gevuld met een poreus materiaal - hars - waardoor moleculen kunnen worden gescheiden op basis van groottediscriminatie. Hier worden de grotere EV's sneller door de kolom geëlueerd; Deze methode staat bekend als doorstroomzuivering op basis van uitsluiting van grootte. Tegelijkertijd blijven kleinere verontreinigingen (dsDNA, vrij zwevende eiwitten zoals endonuclease, zouten, fenolrood, enz.) achter en worden ze verder vastgehouden in de hars door elektrostatische krachten (d.w.z. er werd een bimodale hars gebruikt). SEC-gebaseerde verwerking verwijdert niet-EV-gebonden eiwitten met behoud van de oorspronkelijke EV-structuur en functionaliteit35,36. Bovendien is op SEC gebaseerde zuivering gemakkelijk schaalbaar zonder afbreuk te doen aan de hoge opbrengst en zuiverheid, waardoor het een geschikte keuze is voor het isoleren van NK-EV's voor biotherapeutisch gebruik. Ondanks deze voordelen heeft SEC enkele nadelen, zoals de relatief verdunde doorstroom (eluent); UF is dus vereist voor productconcentratie, maar het maakt ook bufferuitwisseling mogelijk. Het niet-steriele UF-apparaat wordt gespoeld met 70% ethanol en PBS en vóór gebruik in de bioveiligheidskast bewaard om steriliteit te garanderen. Doorgaans kan de doorstroming worden geconcentreerd tot 35x-50x van het oorspronkelijke volume, terwijl kleine moleculen worden verwijderd die hun weg naar het verdunningsmiddel hadden kunnen vinden. Differentiële centrifugatie en endonucleasebehandeling worden uitgevoerd vóór FPLC-SEC in combinatie met UF om resterende cellen, cellulair puin en lange strengen antigeen dsDNA7 te verwijderen.

Na NK-EV worden productisolatie, karakterisering en functionele validatie uitgevoerd volgens de richtlijnen in MISEV2018 en MISEV2023 om de geschiktheid van het product voor verder gebruik te bepalen 6,18. Elke isolatie levert 1,0 - 1,5 ml NK-EV-product met een hoge zuiverheid op bij een minimale concentratie van 1 x 1012 EV's/ml, met een gemiddelde concentratie van 1,39 x 1012 deeltjes/ml. Eerder bepaalden Gupta et al. dat de mediane EV-dosering in vivo 3,37 x 108 EV's/kg lichaamsgewicht van muizen37 is. Voor behandeling met de mediane dosering zouden 8,43 x 106 EV's/muis nodig zijn met een lichaamsgewicht van 25 g, een waarde die ver onder het gegarandeerde minimum (1 x 1012 deeltjes/ml) ligt dat via deze workflow wordt verkregen. De beschreven bioproductieworkflow kan dus meer dan genoeg NK-EV's produceren voor preklinische experimenten of om doseringsdoelen te halen. Elke isolatie wordt getest op mycoplasma en microbiële aanwezigheid als onderdeel van de kwaliteitscontrole van het product. Bovendien toonde een eerdere studie de afwezigheid van gemeenschappelijke virale entiteiten en endotoxine in het eindproduct aan en de afwezigheid van cellulaire componenten die als gastheercelcontaminanten worden beschouwd (volgens de westerse blot-analyse)7,34. Ten slotte werd een functionele beoordeling uitgevoerd met behulp van een gevalideerde, zeer gevoelige resazurine-gebaseerde cellevensvatbaarheidstest om de functionaliteit van de NK-EV's te beoordelen20. De beschreven levensvatbaarheidstest werkt door resazurine (zwak fluorescerend) te reduceren tot resorufin (sterk fluorescerend) door metabolisch actieve cellen, waardoor de levensvatbaarheid van de cellen na behandeling met NK-EV kan worden beoordeeld. In vergelijking met andere alternatieve tests voor de levensvatbaarheid van cellen, is de op resazurine gebaseerde test die in de studie werd gebruikt, zeer gevoelig voor veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen (zeer lage achtergrondruis) en zorgt voor een verkorte incubatietijd om resultaten te observeren (minder dan 30 minuten om statistisch significante resultaten te verkrijgen)20. Over het algemeen vertonen de NK-EV's een dosisafhankelijk effect op de levensvatbaarheid van K562. Samen vertegenwoordigen de gepresenteerde resultaten een NK-EV-product dat voldoet aan de productreleasecriteria voor preklinische evaluatie en geschikt is voor downstream-toepassingen.

Concluderend beschrijft deze op protocol gebaseerde studie de bioproductie van NK-EV's met potentieel van klinische kwaliteit. Zoals besproken, worden de NK-EV's geproduceerd met behulp van een gesloten HFB-systeem onder serumvrije, xenovrije, feedervrije en antibioticavrije omstandigheden7. Een combinatie van FPLC-SEC/UF isoleert en zuivert het NK-EV-product. Voordat de producten worden vrijgegeven voor downstream-toepassing, moeten de NK-EV's worden gekarakteriseerd en functioneel gevalideerd om er zeker van te zijn dat ze geschikt zijn voor gebruik. Zoals aangetoond, kan het volgen van dit bioproductieprotocol met succes een grote hoeveelheid zeer zuivere NK-EV's genereren die on-target cytotoxiciteit tegen kankercellen vertonen. Daarom kan het beschreven bioproductieprotocol een aanwinst zijn voor toekomstige studies die de productie van NK-EV's van klinische kwaliteit vereisen.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen belangenconflict of openbaarmaking.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Drs. Simon Sauvé, Roger Tam en Xu Zhang bedanken voor hun kritische manuscriptbeoordeling. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies van het Genomics Research and Development Initiative (GRDI) Fase VII (2019-2025) van de regering van Canada, verkregen door JRL, LW, evenals exploitatiesubsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council RGPIN-2019-05220, Cancer Research Society/University of Ottawa 24064, de Canadian Institutes of Health (CIHR) Research Operating Grant 175177 verkregen door LW, de CIHR MSc Scholarship behaald door MK, en de Queen Elizabeth II Scholarships in Science and Technology (QEII-GSST) behaald door FSDB.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 µm vacuum filtration unit Filtropur V50 Sarstedt83,3941,002
0.22 µm Acrodisc Syringe Filter Pall CorporationPN4612
1 mL syringe Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
10 kDa Centricon Plus-70 Centrifugal FilterSigmaUFC701008
60 mL syringe BD Biosciences309653
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Costar3603
Agarose Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA Fast Protein Liquid Chromatograph GE Lifesciences29022094
BD PrecisionGlide Needle - 18GBD Biosciences305196
Benzonase Nuclease SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 Multimode ReaderBioTek SH1M2G-SN
Blue Juice Gel Loading Buffer Invitrogen10816015
CaptoCore 700 resin Cytiva17548102
Cellometer Auto 2000 Viability Counter Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 freezing medium SigmaC2874
DPBS−/− FisherBP399-1
Dual LED Blue/White Light Transilluminator InvitrogenLB0100
Duet P3202 Flow Control Pump FiberCell Systems
Dulbecco's phosphate-buffered salineGibco14190250
Ethanol Commercial AlcoholsP006EAAN
Exosome-Depleted FBS GibcoA2720803
Fluorobrite DMEM GibcoA18967-01
Glucose meterAccuCheckModel 930
HiScale chromatography column 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (GMP medium alternative)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium StemCell Technologies10981
Isopropyl Alcohol EMDPX1834-1
K562 cellsATCCCCL-243
LB media BioBasicSD7002
L-Lactate Assay Kit Abcamab65331
Medium hollow-fibre cartridge FiberCell SystemsC2011
MgCl2 SigmaM1028
Mycoplasma PCR detection kit Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH SupelcoSX0607N-6
NK92-MI cells ATCCCRL-2408
pH Strips-Mquant Sigma1,09533
PrestoBlue HS Cell Viability Reagent Assay InvitrogenP50200
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ33262
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231 
Qubit Flex Assay Tube Strips InvitrogenQ33252
Qubit Flex Fluorometer InvitrogenQ33327
Qubit Protein BR Assay Kit InvitrogenA50669
Quick Load 1Kb Plus DNA ladder NEBN0469S
SYBRSafe DNA Gel Stain InvitrogenInvitrogenS33102
Syringe pump Harvard Apparatus984730
Triton-X 100 SigmaT-9284
UltraPure TAE Buffer Invitrogen15558042
ViaStain Acridine Orange and Propidium Iodide (AO/PI) Staining Solution ESBE ScientificCS2-0106

Referenties

  1. Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).
  2. Sheridan, C. Industry appetite for natural killer cells intensifies. Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).
  3. Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment. Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).
  4. Elsharkasy, O. M., et al. Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how. Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).
  5. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer. Cancers. 14 (2), 451(2022).
  6. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  7. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).
  8. Federici, C., et al. Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors. Front Immunol. 11, 262(2020).
  9. Lugini, L., et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).
  10. Zhu, L., et al. Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).
  11. Cochran, A. M., Kornbluth, J. Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity. Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).
  12. Kim, H. Y., et al. Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models. Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).
  13. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).
  14. El-Sahli, S., et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).
  15. Sulaiman, A., et al. Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy. Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).
  16. Farcas, M., Inngjerdingen, M. Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy. Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).
  17. Murphy, D. E., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking. Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. FiberCell-Systems. FiberCell systems user manual & quick start guide. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).
  20. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics. J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).
  21. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  22. Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  23. Federici, C., et al. Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One. 9 (2), e88193(2014).
  24. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  25. Neviani, P., et al. Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms. Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).
  26. Sun, H., et al. Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26. Front Immunol. 10, 2819(2019).
  27. Jiang, Y., et al. Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease. Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).
  28. Dosil, S. G., et al. Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses. Elife. 11, e76319(2022).
  29. Geeurickx, E., et al. The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material. Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).
  30. Nathani, A., et al. Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations. Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).
  31. Gobin, J., et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).
  32. Sun, L., et al. A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair. Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).
  33. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).
  34. Meng, W., et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).
  35. Yang, Y., et al. Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma. J Transl Med. 19 (1), 104(2021).
  36. Gamez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Sci Rep. 6, 33641(2016).
  37. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Natural Killer EV sextracellulaire vesikelsgrootte uitsluitingschromatografieholle vezelbioreactornanoparticle tracking analysecelviabiliteitsassayultrafiltratieNK92 MI cellijn

Gerelateerde artikelen