Methodenartikel

Generatie van 3D-organoïden in de middenhersenen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/67228

⸱

14 februari 2025

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor het maken van 3D-organoïden in de middenhersenen van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen, waarbij hun vorming wordt geleid om natuurlijk middenhersenweefsel na te bootsen, waardoor wordt geholpen bij de studie van ontwikkeling en stoornissen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van organoïden in de middenhersenen (MO's) uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in het begrijpen van de ontwikkeling van de hersenen, het mogelijk maken van nauwkeurige ziektemodellering en het bevorderen van therapeutisch onderzoek. Dit protocol schetst een methode voor het genereren van middenhersenspecifieke organoïden met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), waarbij gebruik wordt gemaakt van een strategische differentiatiebenadering. Belangrijke technieken zijn onder meer dual-SMAD-remming om SMAD-signalering te onderdrukken, toediening van fibroblastgroeifactor 8b (FGF-8b) en activering van de Sonic Hedgehog-route met behulp van de agonist purmorfine, die iPSC's naar het lot van de middenhersenen leidt.

De organoïden die met deze methode worden geproduceerd, bereiken een diameter tot 2 mm en bevatten een breed scala aan neuro-epitheelceltypen, die de inherente cellulaire diversiteit van de middenhersenen weerspiegelen. Validatie van deze organoïden als authentieke middenhersenstructuren omvat de expressie van middenhersenspecifieke markers, die hun identiteit bevestigen. Een opmerkelijk resultaat van deze methodologie is de effectieve differentiatie van iPSC's in dopaminerge neuronen, die kenmerkend zijn voor de middenhersenen.

Het belang van dit protocol ligt in het vermogen om functioneel volwassen, middenhersenspecifieke organoïden te produceren die essentiële aspecten van de middenhersenen nauwkeurig repliceren, en biedt een waardevol model voor diepgaande verkenning van ontwikkelingsprocessen in de middenhersenen en de pathofysiologie van verwante aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson. Dit protocol dient dus als een cruciale hulpbron voor onderzoekers die ons begrip van het menselijk brein willen vergroten en nieuwe behandelingen voor neurodegeneratieve ziekten willen ontwikkelen, waardoor het een onmisbaar hulpmiddel is op het gebied van neurologisch onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het menselijk brein, met zijn ingewikkelde architectuur en complexe cellulaire en moleculaire samenstelling, vormt een formidabele uitdaging in neurowetenschappelijk onderzoek, met name in de context van ziektemodellering en de ontwikkeling van cellulaire therapie1. Deze uitdagingen worden verder bemoeilijkt door de beperkte beschikbaarheid van geavanceerde in-vitromodellen die echt de complexiteit van het menselijk brein vertegenwoordigen. Recente ontwikkelingen in de door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-technologie, die gecontroleerde differentiatie in specifieke neuronale subtypes mogelijk maken, hebben echter veelbelovende wegen geopend voor het onderzoeken van de ontwikkeling van het menselijk brein, ziektepathogenese en celgebaseerde therapeutische strategieën.

Traditioneel zijn tweedimensionale (2D) neuronale culturen afgeleid van iPSC's de hoeksteen geweest van in vitro studies gericht op het nabootsen van menselijke neuronale fysiologie en pathologie. Deze monolaagculturen hebben een belangrijke rol gespeeld bij het vergroten van ons begrip van neurologische aandoeningen en bij de ontdekking van neuroprotectieve middelen 2,3,4,5,6,7. Ondanks hun nut schieten deze 2D-systemen tekort in het nabootsen van de ware cellulaire diversiteit en driedimensionale (3D) structuur van het menselijk brein.

De komst van de hersenorganoïdetechnologie betekent een belangrijke sprong voorwaarts in in-vitromodellering, die een hulpmiddel biedt dat de ingewikkelde biologie van het menselijk brein nauwkeurig nabootst binnen een fysiologisch relevant kader8. Vroege technieken in de ontwikkeling van hersenorganoïden maakten gebruik van de inherente regulerende eigenschappen van iPSC's om spontaan ectoderm-derivaten te vormen, waardoor de vroege stadia van hersenontwikkeling werden nagebootst 5,9,10,11,12. Gezien de complexe netwerken die worden gevormd door neuronen met andere neuronale en niet-neuronale cellen, wordt 3D-modellering essentieel voor het nauwkeurig bestuderen van neurodegeneratieve ziekten. 3D-culturen zorgen voor een meer representatieve in vivo omgeving, waardoor versnelde neuronale differentiatie en netwerkvorming mogelijk zijn 12,13,14, en bevorderen een bredere expressie van neuronale genen in vergelijking met 2D-culturen15. Neuronen die in 3D-contexten worden ontwikkeld, bereiken morfologieën en fysiologische kenmerken die meer doen denken aan hun in vivo tegenhangers16.

Recente ontwikkelingen in 3D-hersenmodellen zijn van cruciaal belang geweest om de ruimtelijke en functionele complexiteit van het menselijk brein effectiever vast te leggen. In het afgelopen decennium is de vooruitgang van diverse protocollen voor het genereren van zowel organoïden van het hele brein als regiospecifieke hersenmodellen 11,17,18,19,20,21,22 van onschatbare waarde gebleken bij het modelleren van neurologische aandoeningen zoals microcefalie 11, de ziekte van Alzheimer14,23 en de ziekte van Parkinson24. Het doel van dit protocol is het ontwikkelen en verfijnen van een methode voor het maken van 3D menselijke MO's afgeleid van menselijke iPSC's. Dit protocol is specifiek gericht op het genereren van organoïden die verrijkt zijn met dopaminerge neuronen en ruimtelijk zijn georganiseerd op een manier die de natuurlijke structuur en functionaliteit van de menselijke middenhersenen nauw nabootst. Het primaire doel van deze organoïden is om te dienen als geavanceerde in vitro modellen voor het bestuderen van de ziekte van Parkinson, en een nauwkeuriger en fysiologisch relevanter systeem te bieden voor het onderzoeken van de neurologische ontwikkelingsprocessen en pathologieën die verband houden met deze aandoening. Door gebruik te maken van van de patiënt afgeleide iPSC's om deze middenhersenspecifieke organoïden te genereren, probeert het protocol het begrip van de mechanismen van de ziekte van Parkinson te vergroten, de ontdekking van potentiële therapeutische doelen te vergemakkelijken en de ontwikkeling van celgebaseerde therapieën te verbeteren. Door deze innovatieve aanpak wil het protocol de beperkingen van traditionele 2D-neuronale culturen overwinnen en een belangrijke bijdrage leveren aan het onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten door een krachtig hulpmiddel te bieden voor in vitro ziektemodellering en de verkenning van nieuwe behandelingsstrategieën.

In de afgelopen 10 jaar hebben verschillende onderzoeksteams organoïden in de middenhersenen (MO's) ontwikkeld8,21,25,26,27,28, waarbij gebruik wordt gemaakt van methodologieën die verschillende belangrijke overeenkomsten vertonen. In ons streven om het begrip van de ziekte van Parkinson te verdiepen, hebben we een protocol ontwikkeld voor het maken van 3D menselijke MO's afgeleid van menselijke iPSC's. Deze organoïden, verrijkt met ruimtelijk gerangschikte dopaminerge neuronen, vormen een ideaal model voor het bestuderen van de ziekte van Parkinson. Onze ontwikkeling en verfijning van midhersenspecifieke organoïde protocollen hebben geavanceerde in vitro modellen opgeleverd die aanzienlijk hebben bijgedragen aan ons begrip van neurologische ontwikkelingsprocessen en neurodegeneratieve ziekten. Deze modellen, met name wanneer ze worden toegepast op van patiënten afgeleide MO's, hebben hun werkzaamheid aangetoond als krachtige hulpmiddelen voor in vitro ziektemodellering en bieden nieuwe perspectieven en methodologieën op het gebied van geavanceerde 3D-celcultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De iPSC's gegenereerd uit menselijke normale fibroblasten Detroit 551 en menselijke embryonale stamcellen (ESC's) hESC-lijn 360 zoals eerder beschreven4. De iPSC's werden verkregen met de goedkeuring van het Western Norway Committee for Ethical Health Research REK nr. 2012/919. Alle cellen werden regelmatig gecontroleerd op Mycoplasma-besmetting met behulp van MycoAlert Mycoplasma Detection Kit. De materiaaltabel bevat informatie over alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. Tabel 1 geeft een overzicht van de gebruikte media en andere voorraden.

1. Ontdooien van iPSC's

  1. Matrix-gecoate plaat en essentiële 8 (E8) medium voorbereiding
    1. Ontdooi de injectieflacon met de basaalmembraanmatrix een nacht op ijs. Verdun 1:100 in koude Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1% eindconcentratie) (zie materiaaltabel en tabel 1). Bewaar aliquots bij -20 °C voor langdurig gebruik.
    2. Ontdooi het verdunde basaalmembraan bij 4 °C; bedek een plaat met 6 putjes met 1 ml oplossing per putje. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Haal de plaat uit de broedmachine en laat deze op kamertemperatuur komen (RT).
      NOTITIE: Platen kunnen maximaal 2 weken in de koelkast worden bewaard (zorg ervoor dat ze voor gebruik worden opgewarmd tot RT). Voeg voor langdurige opslag 1 ml E8 Medium (zie materiaaltabel en tabel 1) toe aan de gecoate plaat om te voorkomen dat de gel uitdroogt.
  2. E8 medium bereiding
    1. Combineer in een steriele omgeving E8 basaal medium met E8 supplement (zie Tabel met materialen en Tabel 1).
      LET OP: Dit kan 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Ontdooi het bevroren E8-supplement een nacht bij 4 °C voordat u het volledige medium bereidt. Niet ontdooien bij 37 °C, omdat dit de stabiliteit in het gedrang kan brengen. Verwarm voor gebruik alleen het benodigde volume E8 Medium tot kamertemperatuur (RT) totdat het niet meer koel aanvoelt.

2. Zaaien van iPSC's

  1. Verwarm de matrixplaten en E8 Medium voor bij RT of incubator bij 37 °C.
  2. Aspireren van cultuurmedium; spoel iPSC's, die een samenvloeiing van 60%-70% hebben, af met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (DPBS Ca2+/Mg2+-vrij, 4 ml per putje in een plaat met 6 putjes).
  3. Voeg ethyleendiaminetetra-azijnzuur toe (EDTA, 0,5 mM, 1 ml per putje, zie materiaaltabel en tabel 1); broed bij 37 °C tot de randen van de kolonie loskomen (3-5 min).
  4. Aspireer de dissociatieoplossing; om kolonies los te maken, pipettert u het voorverwarmde E8 Medium (4 ml per putje) voorzichtig rechtstreeks op de kolonies met een sterker dan gebruikelijke kracht van de pipet, die een plaatselijke vloeistofbeweging over het celoppervlak genereert.
  5. Splits de cellen in een verhouding van 1:2 door ze over te brengen in twee nieuwe putjes van een matrix-gecoate plaat met 6 putjes, en voeg 2 ml medium per putje toe. Incubeer vervolgens bij 37 °C.
  6. Wissel de media dagelijks uit totdat de koloniën 80% samenvloeiing bereiken.
  7. Gebruik een microscoop met een vergroting van 10x om de kolonies te observeren om er zeker van te zijn dat ze de juiste grootte hebben, meestal gekenmerkt door een duidelijke, ronde vorm met een diameter van 0,5 tot 1 mm. Controleer of kolonies dichte, compacte structuren zijn met afgebakende, gladde randen.

3. Neurale inductie

  1. Gemiddelde voorbereiding en installatie van dag 0
    1. Bereid 500 ml chemisch gedefinieerd medium (CDM), neuraal inductiemedium (NIM) en neuraal stamcelserumvrij (NSC SF) medium voor, verwijzend naar de materiaaltabel en tabel 1.
    2. Spoel de cellen in een plaat met 6 putjes met 4 ml DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+- vrij) per putje, gevolgd door de toevoeging van 3 ml NIM per putje voor de opstelling op dag 0.
    3. Vervang NIM (3 ml per putje) op dag 1, 3 en 5; Observeer dagelijks onder een microscoop.
    4. Maak op dag 6 de neurale rozetten los in een suspensiecultuur met behulp van de volgende stappen.
      1. Was voorzichtig een keer met DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een bord met 6 putjes). Voeg collagenase IV toe (1 ml per putje in een plaat met 6 putjes) en incubeer gedurende 1 minuut. Verwijder de collagenase IV en spoel één keer voorzichtig met DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een plaat met 6 putjes).
      2. Voeg 2 ml NSC SF Medium toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes. Maak de cellen los door de bodems van de putjes te schrapen en maak roosters met een pipetpunt van 200 μL.
      3. Breng de celsuspensie van de plaat met 6 putjes over in een niet-klevende schaal van 10 cm. Stel het volume in op 12 ml met NSC SF Medium.
      4. Plaats de niet-klevende schaal op de schudder (ssm1 compacte orbitale schudder) op 85 tpm in een hoek van 0° in een broedmachine die is ingesteld op 37 °C met 5% CO2 om aggregatie te voorkomen.

4. Patroonvorming van de middenhersenen

  1. Voeg op dag 7 12 ml CDM toe met 100 ng/ml FGF-8b; Plaats op de orbitale schudbroedmachine.
  2. Vervang het medium op dag 8-13 elke 2 dagen; Observeer dagelijks onder een microscoop.
  3. Voeg op dag 14 12 ml CDM toe met 100 ng/ml FGF-8b en 1 μM purmorfinemine (PM); Plaats op orbitale schudder.
  4. Vervang het medium op dag 15-20 elke 2 dagen; Observeer dagelijks onder een microscoop.

5. Matrigel inbedding en MO beëindiging en rijping

  1. Ontdooi Matrigel op ijs bij een temperatuur tussen 2 °C en 8 °C gedurende 1-2 uur.
    OPMERKING: Ontdooi een voldoende hoeveelheid Matrigel om 15 μL voor elk embryoïde lichaam (EB) te leveren. Bewaar Matrigel gekoeld op ijs om vroege polymerisatie te voorkomen. Koel al het plastic servies dat in contact komt met Matrigel minimaal 30 minuten af bij -20 °C voordat u het gebruikt.
  2. Plaats een steriel organoïde inbeddingsvel in een lege schaal.
  3. Gebruik een pipetpunt van 200 μL met brede boring om de organoïde voorzichtig uit de schaal te halen en breng deze over op het inbeddingsoppervlak met één organoïde per putje. Herhaal dit proces totdat er 12-16 EB's zijn verzameld op het inbeddingsoppervlak.
  4. Verwijder voorzichtig het overtollige medium van elke EB en voeg vervolgens druppelsgewijs 15 μL koude Matrigel toe aan elke EB. Verplaats met behulp van een pipet de EB naar het midden van de Matrigel-druppel.
  5. Incubeer de plaat in een broedmachine op 37 °C gedurende 15-20 minuten om de Matrigel de kans te geven polymeriseren.
  6. Til met een steriele tang het inbeddingsvel met de Matrigel-druppels op. Houd het vel direct boven één putje in een 6-well ultra-laag hechtende plaat. Pipetteer 3 ml CDM op met 10 ng/ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) en 10 ng/ml Glial-cell line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) en spoel de Matrigel-druppels voorzichtig van het vel in elk putje. Herhaal dit proces totdat alle 6-8 Matrigel-druppels in één putje zijn overgebracht.
  7. Plaats de platen op een orbitale schudder in een incubator van 37 °C bij 85 tpm en vervang de CDM om de 3 dagen door 10 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF.
    OPMERKING: Behoud differentiërende culturen gedurende maximaal 3 maanden; Neurale morfologie verschijnt 2 weken na beëindiging. BDNF en GDNF zijn niet nodig voor de teelt langer dan 3 maanden.

6. Immunofluorescentie kleuring

  1. Gebruik een pipet van 1.000 μL om de organoïde voorzichtig uit het medium te halen en plaats deze voorzichtig op een microscoopglaasje met minimaal medium.
  2. Laat het volledig aan de lucht drogen bij RT. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) (300 μL per monster) toe gedurende 30 min.
    OPMERKING: PFA is gevaarlijk en kan kankerverwekkende eigenschappen hebben. Behandel het met voorzorg, vermijd direct contact met huid en ogen en zorg voor gebruik in een chemische zuurkast.
  3. Voeg 30% sacharoseoplossing (300 μl per monster) toe aan de objectglaasjes en laat ze een nacht bij 4 °C incuberen.
  4. Blokkeer en doordring de organoïden door blokkerende buffer (BB) (300 μL per monster) toe te voegen, waaronder PBS (met Ca2+/Mg2+), 0,3% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum, gedurende 2 uur bij RT (of 's nachts bij 4 °C). Gebruik een hydrofobe barrièrepen om de organoïden af te bakenen en beperk de buffer op het objectglaasje.
  5. Bedek de monsters met een geschikt volume primair antilichaam in blokkerende buffer (300 μL per monster), anti-forkhead box eiwit G1 (FOXG1, 1:200), anti-orthodenticle homeobox 2 (OTX2, 1:100), anti-Forkhead Box A2 (FOXA2, 1:100), anti-Tyrosine Hydroxylase (TH, 1:100), anti-SRY (geslachtsbepalende regio Y)-box 2 (SOX2, 1:100), anti-paired box protein (PAX6, 1:100) en anti-microtubuli geassocieerd eiwit 2 (MAP2 1:500), en broeden ze een nacht bij 4 °C in het donker (zie Materiaaltabel).
  6. Was de monsters in 1x PBS gedurende 3 uur met twee tot drie bufferwissels op een zacht schommelend platform.
  7. Incubeer met het secundaire antilichaam (300 μL per monster), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) en anti-Alexa Fluor 647 (1:800) 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde donkere kamer. Voeg Hoechst 33342 (1:5.000) nucleaire beits tegelijkertijd toe (zie Materiaaltabel).
  8. Verwijder het antilichaam, spoel snel met PBS en voeg vervolgens PBS met 0,01% natriumazide toe gedurende 1-2 dagen bij 4 °C om besmetting te remmen.
  9. Zuig de PBS op, verwijder overtollige oplossing en monteer de organoïden met behulp van een montagemedium (zie de materiaaltabel). Plaats een dekglaasje, zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen wordt voorkomen, en bewaar het ten minste 12 uur in een donkere kamer bij RT om het montagemedium volledig te laten polymeriseren.
    OPMERKING: Het preparaat is nu klaar voor observatie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie introduceren we een baanbrekend protocol voor de afleiding van MO's uit iPSC's. Centraal in onze methodologie staat het innovatieve gebruik van dual-SMAD-remming, synergetisch gecombineerd met FGF-8b en sonic hedgehog (SHH) pathway-agonist purmorfamine (PM). Deze benadering is weergegeven in figuur 1. Het differentiatieproces begint met het sturen van iPSC's naar neuro-ectoderm-afstamming, waarbij neuro-epitheliale of neurale rozetkolonies wor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit onderzoek hebben we een methodologie ontwikkeld voor de differentiatie van MO van iPSC's. Ons protocol maakt gebruik van een dual-SMAD-remmingsstrategie versterkt met morfogene factoren, waaronder FGF-8b en de SHH-agonist PM. Deze benadering simuleert nauwkeurig de ontwikkelingssignalen die cruciaal zijn voor de ontogenie van de middenhersenen. De differentiatieroute die we hebben ingesteld, stimuleert de vorming van neuro-epitheliale structuren die doen denken aan neurale rozette...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 is gemaakt met behulp van BioRender.com. We danken de Universiteit van Bergen Meltzers Høyskolefonds (projectnummer: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson en Gerdt Meyer Nyquists legat (projectnummer: 103816102) voor financiering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagens voor zachte dissociatie van menselijke iPSC's
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspensiecultuur 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiatie basaal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Gebruikt voor een verscheidenheid aan celcultuur was
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagens voor zachte dissociatie van menselijke iPSC's
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basaal medium voor iPSC-cultuur
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement voor iPSC-cultuur
FCCPAbcamab120081Elimineert mitochondriale membraanpotentiaal en TMRE-kleuring
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiatie medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Celfixatie 
GDNFPeprotech450-10DA neuronen medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Gebruikt voor hechting en onderhoud van menselijke iPSC's
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement voor NSC-cultuur
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basaal medium voor CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural inductie medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel inbedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Gebruikt voor blokkerende buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel inbedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Gebruikt voor een verscheidenheid aan wassingen
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Beschikt op hechting en groei van neurale cellen in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Beschikt op hechting en groei van neurale cellen in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Monteren van de deksel voor confocale beeldvorming
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Beschikt op DA neuron differentiatie
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFBeschikt op DA neuron differentiatie 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Inductie Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Gebruikt voor cellen permeabilisatie in immunokleuring tests
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator voor organoid cultivering.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antilichamen gebruikt voor immunokleuring
Primair antilichaam
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Konijn; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Konijn; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Konijn; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Konijn; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392,RRID:AB_2138153Kip; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Konijn; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Konijn; 1:100 
Secundair antilichaamVerdunning (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463(2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223(2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5(2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555(2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604(2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482(2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dubbele SMAD inhibitieSonic Hedgehog routedopaminerge neuronenfibroblastgroeifactorneuroepitheliale celtypenziektemodelleringhersenontwikkelingziekte van Parkinson
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen