Hier schetsen we de procedure voor het analyseren van replicatieprogressie door pathogene, structuurgevoelige herhalingen met behulp van 2-dimensionale gelelektroforese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Elektroforetische analyse van replicatie door middel van structuurgevoelige DNA-herhalingen binnen het op SV40 gebaseerde menselijke episoom
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tweedimensionale neutrale/neutrale gel-elektroforese (2DGE) kwam naar voren als een benchmarktechniek om DNA-replicatie door natuurlijke belemmeringen te analyseren. Dit protocol beschrijft hoe de progressie van de replicatievork kan worden geanalyseerd door middel van structuurgevoelige, uitbreidbare DNA-herhalingen binnen het op apenvirus 40 (SV40) gebaseerde episoom in menselijke cellen. Kortom, bij plasmidetransfectie in menselijke cellen worden replicatietussenproducten geïsoleerd door het gewijzigde Hirt-protocol en behandeld met het DpnI-restrictie-enzym om niet-gerepliceerd DNA te verwijderen. Tussenproducten worden vervolgens verteerd door geschikte restrictie-enzymen om de herhaling van interesse binnen de oorsprong-distale helft van een 3-5 kb lang DNA-fragment te plaatsen. De replicatietussenproducten zijn gescheiden in twee loodrechte afmetingen, eerst op grootte en vervolgens op vorm. Na Southern Blot-hybridisatie stelt deze benadering onderzoekers in staat om het vastlopen van de vork te observeren bij verschillende structuurvormende herhalingen op de aflopende helft van de replicatie Y-boog. Bovendien maakt deze positionering van de stall-site de visualisatie mogelijk van verschillende uitkomsten van repeat-gemedieerde fork stalling, zoals fork reverssal, de komst van een convergerende fork en recombinational fork herstart.
Inleiding
Korte tandemherhalingen (STR) zijn kleine, meestal 2-9 basenparen (bp), repetitieve DNA-sequenties die ongeveer 3% van het menselijk genoom vormen1. STR spelen een belangrijke rol bij genregulatie2; hun repetitieve samenstelling maakt ze echter vatbaar voor de vorming van secundaire DNA-structuren en de daaropvolgende genetische instabiliteit 3,4. Van linkshandige helices tot haarspelden/kruisvormen, tot drie- en vierstrengs helices, deze alternatieve DNA-structuren veroorzaken intrinsieke uitdagingen voor het replisoom. Een natu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het plasmide dat is ontworpen voor onze geschetste 2DGE-analyse in zoogdiercellen moet een SV40-oorsprong van replicatie bevatten die enkele kb stroomopwaarts van structuurgevoelige herhalingen is (Figuur 2). Leidende en achterblijvende synthese moeten in gedachten worden gehouden bij het kiezen van welke oriëntatie ten opzichte van de oorsprong de herhalingen in het plasmide moeten worden gekloond.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Als dit lukt, kan bij visualisatie een scherpe boog van replicatievorken worden waargenomen die zich omhoog en naar buiten uitstrekt vanaf de massieve 1n-plek (Figuur 5A). De grootte van een fragment, of het percentage dat wordt gerepliceerd, bepaalt de mobiliteit van het fragment in de eerste dimensie. Naarmate de tussenproducten een meer verbonden structuur ontwikkelen, zullen ze langzamer beginnen te reizen in de tweede dimensie. Daarom, als een tussenpro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
2DGE geeft een semi-kwantitatief en volledig beeld van de relatieve populaties van tussenproducten die ontstaan tijdens de replicatie van een bepaalde sequentie. Aangezien de fragiele moleculaire structuren van replicatievorken tijdens deze procedure moeten worden gehandhaafd, moet grote zorg worden besteed aan het voorkomen van fysieke afschuiving en chemische denaturatie. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om elke alkalische behandeling te vermijden tijdens plasmide-isolatie. Om d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
We danken Jorge Cebrian en Anastasia Rastokina die deze aanpak in ons lab zijn gaan ontwikkelen, Massimo Lopes voor het verstrekken van pML113-plasmide en advies van onschatbare waarde, Ylli Doksani voor inzichtelijke discussies en leden van het Mirkin-lab voor hun steun. Het werk in het Mirkin-lab wordt ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences [R35GM130322] en NSF-BSF [2153071].
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
| 20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
| BAS Storage Phosphor Screens | Fisher Scientific | 28956482 | |
| Church and Gibert's hybriddization buffer | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
| DecaLabel DNA labeling kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
| DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Aanvullende restrictie-enzymen moeten ook worden aangeschaft |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| Ethanol, 70% | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Hydrochloric acid solution, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer | VWR | 101000027 | |
| MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
| NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
| Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
| Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
| Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
| Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 09-016 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Millipore Sigma | 436143-25G | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S25548 | |
| Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
| Sub-cell Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad | 1704401 | |
| TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
| Tris-HCl 1 M, pH 7.5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Referenties
- Liao, X., et al. Repetitive DNA sequence detection and its role in the human genome. Commun Biol. 6 (1), 1-21 (2023).
- Fotsing, S. F., et al. The impact of short tandem repeat variation on gene expression. Nat Genet. 51 (11), 1652-1659 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
