Methodenartikel

Een succesvolle sortering instellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes

DOI:

10.3791/67232

⸱

11 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1FRACTAL - Flow cytometry Resource, Advanced Cytometry Technical Applications Laboratory, IRCCS Ospedale San Raffaele, 2Laboratorio di Biotecnologie Applicate all'Ortopedia, IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, 3Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het sorteren van extracellulaire blaasjes (EV's) die vrijkomen door mesenchymale stromale cellen. Het richt zich met name op de instelling van het instrument en de optimalisatie van de sorteeromstandigheden. Het doel is om extracellulaire blaasjes te sorteren met behoud van hun kenmerken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) die worden vrijgegeven door mesenchymale stromale cellen (MSC's) bevatten een reeks microRNA's met regeneratieve en ontstekingsremmende rollen. Daarom worden gezuiverde MSC-EV's gezien als een therapeutische optie van de volgende generatie voor een breed scala aan ziekten. In dit protocol rapporteren we de strategie voor het succesvol sorteren van EV's uit het supernatans van van vet afgeleide MSC's (ASC's), die vaak worden gebruikt in toepassingen in de orthopedie voor regeneratieve geneeskunde.

Eerst beschreven we de monstervoorbereiding, met de nadruk op EV-isolatie en labelstappen met carboxyfluoresceïnesuccinimidylester (CFSE) voor fluorescentiedetectie; Vervolgens hebben we het sorteerproces in detail beschreven, dat het belangrijkste onderdeel van het protocol vormt.

Naast de regels die zijn gedefinieerd door de MISEV 2023- en MIFlowCyt EV-richtlijnen, hebben we specifieke experimentele voorwaarden toegepast met betrekking tot de grootte van de straalpijp, de frequentie en de manteldruk. Morfologische parameters worden bepaald met behulp van kralen met een diameter die zijn geselecteerd om het theoretische bereik van de EV-grootte te dekken. Na het sorteren van ASC-EV's voerden we een zuiverheidscontrole uit van de gesorteerde fractie door deze opnieuw te analyseren met de sorteerder en de EV-grootteverdeling te verifiëren met de analysetechniek voor het volgen van nanodeeltjes.

Vanwege het toenemende belang van EV's wordt het van cruciaal belang om een zuivere populatie te hebben om te bestuderen en te karakteriseren. Hier demonstreren we een winnaarsstrategie om sorteren op te zetten om dit doel te bereiken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn een heterogene groep membraangestructureerde blaasjes die door bijna alle cellen worden vrijgegeven, begrensd door een lipidedubbellaag, die niet in staat is om zichzelf te repliceren1. Ze zijn te vinden in verschillende biovloeistoffen, zoals bloedplasma, serum, speeksel, moedermelk, urine, bronchiale spoelvloeistof, vruchtwater, hersenvocht en kwaadaardige ascites2. Een van de belangrijkste functies van EV's is het transporteren van verschillende moleculen, waaronder nucleïnezuren, eiwitten, lipiden en koolhydraten, tussen een donor en een ontvangende cel. Dit kan gebeuren via verschillende mechanismen, zoals directe membraanfusie, receptor-ligandinteractie, endocytose en fagocytose 3,4. Om deze reden is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in veel fysiologische en pathologische processen, en ze zijn veelbelovend als nieuwe biomarkers van ziekten, als voertuigen voor medicijnafgifte en als therapeutische middelen 5,6.

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn multipotente cellen die kunnen worden geïsoleerd uit vele weefsels, waaronder vetweefsel, tandpulp, navelstrengbloed, placenta, vruchtwater, Wharton's gelei en zelfs de hersenen, longen, thymus, alvleesklier, milt, lever en nieren. In de afgelopen jaren hebben ze veel belangstelling gewekt voor regeneratieve geneeskunde7. Van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (ASC's) kunnen via een minder invasieve procedure uit vetweefsel worden geoogst in vergelijking met andere bronnen zoals beenmerg, wat resulteert in een lager risico op ernstige complicaties en het vermijden van ethische kwesties8.

Bovendien bevat vetweefsel een significant hogere concentratie MSC's dan beenmerg (1% versus >0,01%) en andere bronnen zoals de dermis, tandpulp, navelstreng en placenta. MSC's zijn cruciaal bij de regeneratie van beschadigde weefsels en cellen vanwege hun differentiatievermogen en hun afscheiding van een breed repertoire van groeifactoren, chemokinen en cytokines; Deze therapeutische voordelen zijn toe te schrijven aan hun differentiatievermogen, maar ook aan het feit dat ze een breed repertoire aan groeifactoren, chemokines en cytokines afscheiden. Een treffend voorbeeld is het therapeutisch potentieel van MSC's voor orthopedische aandoeningen, waarbij de term "musculoskeletale aandoeningen" het grootste aantal geregistreerde klinische onderzoeken heeft onder clinicaltrials.gov (geraadpleegd op 13mei 2024).

Bovendien kunnen MSC's ook EV's afscheiden die deelnemen aan weefselregeneratie door informatie over te dragen aan beschadigde cellen of weefsel en biologische activiteit uit te oefenen die vergelijkbaar is met de moedercellen 9,10. Om deze reden kunnen MSC-EV's een waardevol alternatief zijn voor celtherapie om een celvrije benadering te bereiken11, met twee klinische onderzoeken met MSC-EV's voor orthopedische aandoeningen (NCT05261360 en NCT04998058). Er zijn echter nog verschillende uitdagingen voor de klinische toepassingen van EV's. Er zijn bijvoorbeeld enkele zorgen over EV-isolatietechnieken: de meeste garanderen de zuiverheid of integriteit van de blaasjes niet. Bovendien zijn sommige isolatietechnieken complex, tijdrovend en hebben ze een lage herhaalbaarheid, waardoor ze ongeschikt zijn voor klinisch gebruik12.

Celsortering daarentegen is een veelgebruikte methode die het mogelijk maakt om afzonderlijke cellen te isoleren uit heterogene celsuspensies door gebruik te maken van specifieke fluorescerende markers13. Het kan voor vele toepassingen worden gebruikt en worden aangepast aan verschillende soorten monsters. Hoewel het sorteren van cellen een gevestigde en veelgebruikte technologie is, is het sorteren van EV's nog steeds een grote uitdaging omdat de meeste EV's onder de minimale detectiedrempel liggen voor zelfs de meest gevoelige flowcytometers. Er zijn enkele kenmerken die een sorteerder geschikter maken voor dit doel. Allereerst met behulp van een Jet-in-air-systeem waarbij de stroom die de deeltjes opschort wordt ondervraagd door lasers in lucht, in plaats van in een flowcel; Dit systeem bewaart het monster door de stress waaraan het wordt blootgesteld te verminderen. Een tweede belangrijk punt is de aanwezigheid van een "verduisteringsbalk" tussen de stream en de verzamellens die de optische achtergrondruis van het instrument vermindert. Hoewel het laag is, wordt het achtergrondgeluid niet volledig geëlimineerd en vormt het een referentie die een gedeeltelijk venster biedt op de gebeurtenissen die onder de drempel vallen: het is erg belangrijk voor de analyse van gebeurtenissen die dicht bij de "detectielimiet" van het instrumentliggen 14. Ten slotte is de sorteerder voorzien van een dual-path Forward Scatter (FSC) met twee verschillende maskers die een beter onderscheid tussen kleine en grote deeltjes in het monster mogelijk maken.

Op basis hiervan hebben we een protocol ontwikkeld dat gericht is op het scheiden van carboxyfluoresceïne-succinimidylester (CFSE) gelabelde MSC-EV's met behulp van een hooggevoelige celsorteerder. Om de manipulatie van EV's tot een minimum te beperken en hun integriteit en kwantiteit te behouden, hebben we ultracentrifugatiestappen tijdens de monstervoorbereiding vermeden. Bovendien werden de sorteeromstandigheden aangepast om de belasting van de blaasjes te minimaliseren, inclusief verdere optimalisatie van ons instrument door de sorteerdruk te verminderen die verband houdt met de grootte van de nozzle (70 μm nozzle voor een druk van 35 psi).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol bestaat hier uit vier delen: (1) Monstervoorbereiding, (2) Karakterisering van ASC-EV's, (3) Sortering van ASC-EV's en (4) Analyse na sortering. Een schema dat de workflow weergeeft, wordt weergegeven in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Protocol Stroomschema. Het stroomschema toont de stappen van het protocol. (1) monstervoorbereiding, (2) karakterisering van blaasjes vóór sortering, (3) sortering en (4) analyse van blaasjes na sortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Met extracellulaire blaasjes (EV) verrijkte verzameling van supernatans
    1. Ontdooi of verzamel vet-MSC's (ASC's) die de passage vóór het verzamelen van EV's zijn gekweekt (meestal passage 1 tot 5) en zaad per ASC isoleer een identiek aantal cellen (bijv. 1 miljoen cellen per 175cm2 kolfoppervlak resulteert in ongeveer 60%-70% samenvloeiing).
    2. Kweek ASC's in het juiste kweekmedium (DMEM-F12 voor dit protocol) aangevuld met EV-vrij foetaal runderserum (FBS) of humaan bloedplaatjeslysaat (hPL), volgens het gevraagde protocol, gedurende 48-72 uur.
      1. Om EV-vrije FBS of hPL te verkrijgen, ultracentrifugeert u 's nachts bij 120.000 x g bij 4 °C en gebruikt u de supernatant.
        OPMERKING: Vanaf dit punt is de aangegeven middelpuntvliedende kracht altijd bedoeld als gemiddelde voor het gebruikte instrument, de rotor en de buizen. Houd er rekening mee dat verschillende rotoren of buizen een variabele g-kracht per tpm en k-factor kunnen hebben. Voor een eenvoudige manier om rotors te vergelijken en g-kracht en snelheid aan te passen, raadpleegt u een van de beschikbare conversietabellen https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator.
    3. Bij 90% celsamenvloeiing ASC's losmaken en tellen, en suspenderen in een geschikt volume serumvrij medium, idealiter 1 ml per 1 x 106 ASC's. Zaad ASC's in suspensie in platen met 24 putjes met 1 ml per putje. Zonder serum blijven cellen in suspensie en vormen ze een sferoïde. Verzamel na 96 uur de supernatant.
    4. Verwijder drijvende cellen en vuil door serieel centrifugeren bij 4 °C: 400 x g gedurende 10 min, 1.000 x g gedurende 10 min, 2.000 x g gedurende 10 minuten en tweemaal 4.000 x g gedurende 10 min.
    5. Filtreer het bovenstaande door een filter van 0,22 μm om de resterende deeltjes groter dan 220 nm te verwijderen.
      OPMERKING: Onmiddellijk gebruiken voor downstream-toepassingen, of maximaal één nacht bewaren bij 4 °C of invriezen bij -80 °C als er geen verdere stappen binnen 24 uur worden uitgevoerd.
  2. EV's kleuring voor sortering
    1. Bereid een 5 mM-oplossing van 5(6)-carboxyfluoresceïnediacetaat N-succinimidylester (CFSE). Gebruik het vers bereid of vries het in bij -20 °C beschermd tegen licht.
    2. Ga direct verder met stap 1.1.1-1.1.5 (binnen 24 uur) of ontdooi -80 °C opgeslagen EVs-bevattende supernatanten bij 4 °C.
    3. Verwarm vóór het kleuren de supernatanten bij 37 °C en voeg CFSE toe voor een eindconcentratie van 10 μM (500-voudige verdunning). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C in het donker.
    4. Voeg tijdens de incubatie 2 ml PBS toe aan een centrifugaalconcentrator (membraan van geregenereerde cellulose, MWCO 100 kDa), dop en centrifugeer gedurende 10 minuten op 4.000 x g in een draaiende emmerrotor. Verwijder de ongefilterde PBS van de onderkant van het filterapparaat en zuig het filtraat uit de opvangbuis.
      OPMERKING: Het beschreven protocol voor centrifugale ultrafiltratie is gebaseerd op de verwerking van maximaal 15 ml van het monster (maximaal volume).
    5. Voeg tot 15 ml monster toe aan de centrifugaalconcentrator en sluit het apparaat af. Centrifugeren op 4.000 x g gedurende maximaal 30 minuten.
      OPMERKING: Dit levert een eindmonster op van gemiddeld 500 μL. Afhankelijk van factoren zoals de aard van het monster en het debiet, kan de centrifugatietijd die nodig is om de gewenste concentratie te bereiken echter variëren.
    6. Haal het apparaat uit de centrifuge en leeg de opvangbuis. Voeg 14 ml PBS toe aan het filterapparaat. Centrifugeren op 4.000 x g gedurende maximaal 30 minuten.
    7. Herhaal stap 1.2.6.
    8. Verzamel geconcentreerd CFSE-gekleurd EVs-monster uit het filterapparaat, ongeveer 500 μL, en bewaar 100 μL bij 4 °C in het donker terwijl u doorgaat met het sorteren van het resterende monster.

2. Karakterisering van ASC-EV's

  1. Western blot-analyse van EV-markers
    1. Pellet ASC's (1 x 106) bij 376 x g bij RT gedurende 5 minuten en suspendeer in de juiste lysisbuffer aangevuld met proteaseremmers. Voer eiwitkwantificering uit met de test van uw keuze.
      OPMERKING: Zoals ervaren in deze studie, worden de beste kwantificeringsresultaten verkregen met de bicinchoninezuurtesttechniek.
    2. Kwantificeer ASC's-geconcentreerd supernatans equivalent aan 1 x 106 ASC's met Bradford-techniek of pellet-EV's die overeenkomen met 1 x 106 ASC's bij 100.000 x g bij 4 °C gedurende 1 uur en suspendeer in de juiste lysisbuffer aangevuld met proteaseremmers. Voer eiwitkwantificering uit met de test van uw keuze.
      OPMERKING: Zoals ervaren in deze studie, worden de beste kwantificeringsresultaten voor EV-pellets verkregen met de bicinchoninezuurtesttechniek.
    3. Als geconcentreerd supernatans wordt gebruikt in plaats van gezuiverde EV's, lyseer de monsters dan in 5% 2-Mercaptoethanol en 2x Laemmli-buffer.
      OPMERKING: Zoals ervaren in deze studie, geven zowel geconcentreerde supernatante als gezuiverde EV's vergelijkbare resultaten voor positieve en negatieve EV-markers.
    4. Laad en scheid monsters (1-10 μg) in een 10% polyacrylamidegel bij 110 V gedurende 90 min.
    5. Breng over naar een nitrocellulosemembraan bij 250 mA gedurende 120 min.
    6. Bevlek het membraan met Ponceau S om monsters en ladderoverdracht te visualiseren. Verwijder Ponceau S met PBS onder voorzichtig schudden.
    7. Blokkeer membranen met 5% magere gedroogde melk en 0,1% tween in PBS gedurende 60 minuten.
    8. Sondemembranen met geschikte antilichamen bij werkende verdunningen, inclusief positieve (bijv. in dit werk CD9, CD81, TSG101 en Flotillin) en negatieve (bijv. in dit werk Calnexin) EV-markers, bij 4 °C 's nachts.
    9. Wassen met 0,1% Tween in PBS en incuberen met geschikte peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 45 minuten bij RT voordat de band wordt onthuld met het ECL-systeem naar keuze. Verkrijg afbeeldingen met een beschikbaar beeldvormingssysteem (Afbeelding 2A).
  2. Flowcytometrie-analyse van EV-markers: oppervlaktekleuring
    1. Centrifugeer voor gebruik elk monoklonaal antilichaam (mAb) bij 15.000-17.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om aggregaten te verwijderen, die vals-positieve signalen kunnen veroorzaken. Filtreer verder mAbs in afzonderlijke centrifugaalfilterbuisjes van 0,22 μm bij 1.000 x g bij 4 °C totdat al het mengsel door het filter is gegaan en er geen antilichaamvloeistof meer op het oppervlak van het filter achterblijft. Bewaar mAbs bij 4 °C.
    2. Bereid een verdunning van 1:10 van met CFSE gekleurde EV's (zie stap 1.2.1-1.2.8) in 0,22 μm gefilterde PBS.
    3. Incubeer 100 μL aan monsters, of 0,22 μm-gefilterde PBS, met of zonder EV-specifieke mAbs (anti-CD9/63/81) of MSC-specifieke mAbs (anti-CD44), eerder getitreerd. Voer de incubatie uit bij 4 °C in het donker gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Dit protocol, ontwikkeld om typische EV's en MSC-afstammingsmarkers te detecteren, kan worden uitgebreid naar alle andere cellijn- of EV's-subtypespecifieke oppervlaktemarkers. Gebruik geen fluorchromen die in het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-kanaal vallen om overlapping met CFSE-kleuring van EV's te voorkomen. Voer een enkele kleuring uit door elke mAb te gebruiken die is geconjugeerd met één fluorchroom, bijvoorbeeld allophycocyanine (APC). Meerkleurige kleuring is mogelijk, maar er moeten controles worden opgenomen om mogelijke sterische hinderproblemen met antilichamen aan te pakken. Het is noodzakelijk om de afzonderlijke antilichamen alleen of binnen een mengsel te testen en ervoor te zorgen dat het signaal vergelijkbaar is. Bovendien moeten FMO's worden opgenomen in de controles.
    4. Stel scatterkalibratie in zoals beschreven in stap 3.2.
    5. Maak een puntdiagram van de side scatter (SSC) logschaal versus de FITC-logschaal en voer een buis uit van 0,22 μm gefilterde PBS of ongekleurde EV's; stel de drempel in op het FITC-kanaal en stel deze in op de hoogste waarden die het grootste deel van het achtergrondgeluid uitsluiten. Teken een regio die de positieve CFSE-gebeurtenissen identificeert.
    6. Maak een APC-histogramplot die is afgegend voor de regio met CFSE-positieve gebeurtenissen en voer een buis uit met 0,22 μm gefilterde PBS of ongekleurde EV's.
      OPMERKING: Gebruik voor APC-versterking de versterking die is vastgesteld met de instrument QC, hoewel het wordt aanbevolen om een specifieke gaintration uit te voeren om de instrumentprestaties te optimaliseren.
    7. Voeg 200 μL 0,22 μm gefilterde PBS toe aan gekleurde monsters en verkrijg. Gebruik een laag debiet (10 μL per min) voor acquisitie en opname. Noteer indien mogelijk ten minste 5.000 gebeurtenissen in de FITC-positieve poort.
    8. Gebruik de mAb-gekleurde PBS-regeling om mogelijke aspecifieke signalen van de mAbs te detecteren. Lees alle monsterbuisjes met hetzelfde debiet om consistentie tussen runs te garanderen.
    9. Om kruisbesmetting van het monster te voorkomen, laat u een reinigingsmiddel 10 s tussen elke geanalyseerde buis lopen, gevolgd door 10 s met gedeïoniseerd (DI) water (Figuur 2B).
      OPMERKING: Om instabiliteit van het fluïdische instrument te voorkomen, neemt u het monster gedurende 10 s op en begint u met opnemen.
  3. Flowcytometrie-analyse van EV-marker: Intracellulaire kleuring
    OPMERKING: Gebruik voor intracellulaire kleuring een specifieke kit met fixatie- en permeabilisatiereagentia. Anti-Caveolin mAb is geconjugeerd met Alexa 488. De IC-kleuring is uitgevoerd in afwezigheid van CFSE.
    1. Centrifugeer de mAb voor gebruik zoals eerder beschreven (stap 2.2.1).
    2. Volg voor intracellulaire kleuring de instructies van de fabrikant (Figuur 2C).
  4. Karakterisering van EV-concentratie en -grootte door nanodeeltjesvolganalyse (NTA)
    1. Maak de juiste verdunningen van de monsters om 20-120 gebeurtenissen te verkrijgen in het kijkkader van het NTA-instrumentendisplay.
    2. Injecteer de monsters in de monsterkamer van het NTA-instrument met behulp van een insulinespuit van 1 ml.
    3. Stel de NTA-software voor registratie als volgt in: 5 standaardmetingen van elk 60 s en een stromingspomp ingesteld op 30.
    4. Stel de lichtintensiteit in op een geschikte waarde om deeltjes duidelijk van de achtergrond te onderscheiden en voer het opnamescript uit op de NTA-software.
      OPMERKING: De instelling van het cameraniveau kan van invloed zijn op de deeltjesdetectie. Als de waarde te hoog is, ontstaan er een melkachtige achtergrond en een sterke lichtverstrooiing van deeltjes, die de meeste deeltjessignalen bedekken. Als de waarde te laag is, hoewel een donkerdere achtergrond wordt verkregen, is het mogelijk dat de meeste minder heldere gebeurtenissen worden gemist. Elk monster moet worden gecontroleerd voor een optimale instelling.
    5. Pas de verdunningsfactor aan als de deeltjes per frame lager zijn dan 20 of meer dan 80.
    6. Stel de drempel in op 4 om de gemiddelde modale grootte en deeltjesconcentratie van de supernatant te analyseren. Houd rekening met initiële verdunningsfactoren.
    7. Reinig de instrumentenkamer na elk monster met gedeïoniseerd water om kruisbesmetting te voorkomen.
    8. Open de NTA-analysesoftware en voer een analyse uit op verkregen monsters, rekening houdend met de verdunningsfactor (Figuur 2D).
  5. Karakterisering van EV-morfologie door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
    1. Verzamel ASC's-geconcentreerd supernatans of isoleer EV's door ultracentrifugatie (100.000 x g bij 4 °C gedurende 1 uur) gevolgd door pelletsuspensie in hetzelfde volume PBS.
    2. Laat 5 μL van het geconcentreerde supernatans of EV's gedurende 10 minuten absorberen op met koolstof beklede roosters. Dep overtollige druppels vloeistof af met filtreerpapier.
    3. Voer de negatieve kleuring uit met 2% uranylacetaat in waterige suspensie gedurende 10 minuten met een identiek volume van de monsterdruppel (5 μL). Verwijder het overtollige uranylacetaat door het rooster aan te raken met filtreerpapier.
    4. Droog het rooster bij kamertemperatuur (RT) en onderzoek het met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 120 kV (Figuur 2E).

figure-protocol-2
Figuur 2: Karakterisering van ASC-EV's. (A) Representatieve Western blot van EV's positieve (CD9, CD81, TSG101 en Flotillin) en negatieve (Calnexin) markers. Overeenkomstige molecuulgewichten worden gerapporteerd en ASC-lysaten zijn gebruikt als controle. (B) Flowcytometrie-analyse van EVs-markers. De expressie van de volgende markers werd geanalyseerd: CD9, CD63, CD81 en CD44. Alleen CFSE-positieve ASC-EV's werden geanalyseerd op markerexpressie. Histogrammen vertegenwoordigen ongekleurd (rode histogrammen) en gekleurd (blauwe histogrammen) ASC-EV's. (C) Flowcytometrie intracellulaire analyse van EVs-marker caveolin. Histogrammen vertegenwoordigen ongekleurde (grijze histogram) en gekleurde (blauwe histogrammen) ASC-EV's. (D) Karakterisering van ASC-EV's door NTA. Histogrammen geven de concentratie (deeltjes/ml)/grootte (nm) van het monster weer. (e) Visualisatie van ASC-EV's door TEM. Schaal staven = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. ASC-EV's sorteren

  1. Celsorteerder instellen
    OPMERKING: Een celsorteerder is een flowcytometer die het mogelijk maakt om een zuivere populatie te isoleren uit een heterogeen startmonster. Celsorteerder scheidt de doeldeeltjes door de stroom met een piëzo-elektrische stroom op een hoge frequentie te oscilleren om druppels te genereren die een gebeurtenis bevatten. De druppels die de interessante deeltjes bevatten, zoals cellen of blaasjes, worden geladen en afgebogen door metalen afbuigplaten. De gesorteerde breuk wordt gebruikt om downstream-analyse uit te voeren.
    1. Open de persleiding en vacuüm.
      OPMERKING: Sommige sorteerders hebben een automatische opstart, terwijl andere een handmatige opstart hebben. Een sorteerder met een handmatige opstart heeft de voorkeur, omdat hiermee enkele technische kenmerken kunnen worden geoptimaliseerd, zoals frequentie, druk en de keuze van de nozzletip. In het bijzonder wordt aanbevolen om te werken met een frequentie van 66.000 Hz, een druk van 35 psi en een mondstuk van 70 μm.
    2. Schakel het instrument in, open de bioveiligheidskast en start de sorteersoftware.
    3. Breng de fluidics op druk en schakel vervolgens het fluidics systeem in.
    4. Activeer Drop Drive, het piëzo-elektrische kristal in het mondstuk dat trilt om druppels te krijgen.
    5. Voer de debuggelprocedure uit om de aanwezigheid van luchtbellen in het systeem te elimineren en laat vervolgens een tube van 5 ml reinigingsoplossing gedurende 5 minuten bij hoog drukverschil en een tube van 5 ml gedemineraliseerd water gedurende 5 minuten draaien.
    6. Voer de handmatige opstartprocedure uit.
      1. Druk op het tabblad Laserbediening op de knop Laservermogen om de laser in te schakelen.
        OPMERKING: Herhaal deze procedure voor alle lasers: Blauw 488 nm, Geelgroen 561 nm, Violet 405 nm en Rood 640 nm.
      2. Onderzoek de verticale uitlijning van de stroom.
        NOTITIE: Verplaats indien nodig de montagefase van het mondstuk, in het bijzonder de voor- en achtermicrometer, de linker- en rechtermicrometer en de gimbal om de verticale uitlijning aan te passen en controleer de verticale stroom met de micrometer omhoog en omlaag; Voor de beste uitlijning moet de stroom op elke laser verticaal zijn. Als dit de eerste keer is dat men een specifiek mondstuk gebruikt, moet er een laservertraging worden uitgevoerd. Selecteer op het aanraakscherm op het tabblad Laser en stream onderscheppen de juiste nozzlegrootte, druk op de knop Laservertraging en volg de instructies voor laservertraging om de laservertragingsprocedure uit te voeren. Over het algemeen wordt bij het wijzigen van de druk van de mantel en dus de mondstuktip de bepaling van de laservertraging uitgevoerd voordat de uitlijning wordt gevonden. Aan het einde van de laservertragingsprocedure wordt voorgesteld om de procedure voor het aftrekken van achtergrondafbeeldingen uit te voeren volgens de instructies op het scherm om het achtergrondsignaal te minimaliseren.
      3. Voer laserspotbepaling uit door op het tabblad Laserstream Intercept en de groene pijlknop te drukken en de instructies op de monitor met aanraakscherm te volgen.
    7. Initialiseer Intellisort. Stel de frequentie van de drop-drive en een standaardamplitudewaarde in, waardoor de stream een druppel vormt.
      1. Zodra deze stap is uitgevoerd, laadt u een opgeslagen configuratie. Als u een opgeslagen instellingsconfiguratie wilt laden, selecteert u Sorteerinstelling laden op de werkbalk van de sorteersoftware. Nadat u de verschillende frequenties en amplitudes hebt gecontroleerd, kiest u de beste die de beste valstabiliteit garandeert. Werk op een frequentie van 66.000 Hz en een amplitude van ongeveer 40-45 V.
    8. Voer een fijne laseruitlijningsprocedure uit.
      1. Laad in de sampler een buis van 5 ml QC-uitlijningsparels en laat deze draaien; selecteer op het tabblad Fijne uitlijning de gewenste parameter op de X- en Y-as om parels goed verdicht en gecollimeerd te visualiseren. Selecteer in het gegevensweergavegebied eerst 488 - 513/26-H voor de parameter Y-as en 488-FSC1-H voor de parameter X-as. Om vervolgens alle lasers te verfijnen, selecteert u 405-488/59-H voor de parameter Y-as en 640-795/70-H voor de parameter X-as.
        OPMERKING: De geselecteerde parameters zijn afhankelijk van de laserconfiguratie van de sorteerder. De suggestie van de instrumenthandleiding is de keuze van de lasers met de grootste ruimtelijke scheiding op de gaatjesstrip. Gebruik hiervoor een violette laser (405 nm) en een rode laser (640 nm).
      2. Zodra de handmatige uitlijning is gecontroleerd door de sorteerspecialist, voert u de automatische QC uit. Selecteer de diameter van de QC-kralen: 3 μm diameter.
        OPMERKING: Aan het einde van deze procedure kan het resultaat zijn dat QC niet is geslaagd of QC is geslaagd. In het geval dat de QC mislukt, is het noodzakelijk om de uitlijning handmatig te optimaliseren.
      3. Sla de QC-acquisitie op in het software Alignment-protocol.
    9. Intellisort-procedure voltooien
      1. Plaats de afbuigplaten op de juiste positie in de sorteerder en schakel de spanning in (3.000 V lading op afbuigplaten wordt aanbevolen).
      2. Kies 6 Tube Holder sorteer output, schakel de streams in en selecteer ze op de Stream Indicator en voer de Teststream uit.
        OPMERKING: Als de streams niet duidelijk gescheiden en gedefinieerd zijn, pas dan de laadfase aan, ontwaaier of wijzig andere parameters om een duidelijk gedefinieerde en niet-oscillerende stroom te verkrijgen.
      3. Schakel de knop Intellisort Automatic Drop Delay Determination in. Met deze stap kunt u de juiste valvertraging instellen. Controleer na deze stap de streams opnieuw.
      4. Activeer de Intellisort Maintain-modus. Controleer de valvertraging handmatig.
      5. Laad het handmatige Drop Delay-protocol op de sorteersoftware. Schaf fluorescerende controlekralen aan.
      6. Plaats de juiste schuifhouder. Selecteer in de sorteersoftware de optie Sorteren > wizard Vertragingsvertraging bij neerzetten. Selecteer Logica sorteren.
      7. Controleer met een fluorescerende microscoop de aanwezigheid van 97% fluorescerende parels op de vijfde plas.
  2. Instrument instelling: Scatter kalibratie
    OPMERKING: Scatter-kalibratie wordt uitgevoerd met behulp van Verity Shells-kralen (hierna aangeduid als holle organo-silicakorrels). Deze organo-silicakorrels worden gekenmerkt door een brekingsindexverdeling en lichtverstrooiingseigenschappen die dichter bij EV's liggen dan polystyreenkorrels, waardoor de SSC- en FSC-spanning beter kunnen worden ingesteld om beter onderscheid te maken tussen EV-achtige gebeurtenissen en de elektronische ruis. De organo silica korrels worden gevormd door twee flesjes met kralenmengsels, VER01A (189 nm kralen) en VER01B (374 nm kralen). Elke injectieflacon bevat een mengsel van holle organo-silicakorrels en 380 nm groene fluorescerende kralen, ook wel referentiekorrels genoemd. De concentratie van de holle organo silica korrels is 1 x 108 korrels/ml.
    1. Bereid een monster van VER01A- en VER01B-kralen voor door één druppel (50 μL) van elk te verdunnen in 1 ml 0.22 μm-gefilterde PBS met een uiteindelijke concentratie van 5,000 kralen/μL.
      OPMERKING: Draai de kralen 5 s voor gebruik.
    2. Maak een puntdiagram van de SSC-logschaal versus de FITC-logschaal.
    3. Verkrijg VER01B-kralen en pas de spanning aan om de referentiekralen goed te onderscheiden in de rechterbovenhoek van de SSC/FITC-dotplot (Figuur 3A).
    4. Zet een regio rond deze populatie kralen.
    5. Maak een puntdiagram van de SSC-logschaal ten opzichte van de FSC-logschaal. Identificeer de referentiekralen en de VER01B-kralenpopulatie. Stel een gebied in rond de VER01B-kralenpopulatie (Figuur 3B).
    6. Verkrijg VER01A-kralen en creëer een gebied rond deze kralenpopulatie (Figuur 3C).
      LET OP: Deze populatie kralen overlapt gedeeltelijk met het achtergrondgeluid van het instrument.
    7. Verkrijg een PBS met een filter van 0,22 μm en pas de drempel aan om de achtergrondruis van het instrument te verminderen zonder de visualisatie van de kleinste kralen te verliezen.
      OPMERKING: Scatter-kalibratie kan worden gedaan met behulp van FSC Megamix-kralen (hierna FSC-polystyreenkorrels genoemd), een mix van fluorescerende kralen met de volgende diameters: 100 nm, 300 nm, 500 nm en 900 nm. Het gebruik van de holle organo-silicakorrels verdient de voorkeur boven FSC-polystyreenkorrels, omdat ze een brekingsindexverdeling en lichtverstrooiingseigenschappen hebben die vergelijkbaar zijn met die van EV's. De populatie van 300 nm FSC polystyreen korrels overlapt met de referentie van de holle organo silica korrels. Daarom selecteert een poort op basis van holle organo-silicakorrels EV's van vergelijkbare grootte op de flowcytometer.
  3. Sample acquisitie
    1. Maak een puntplot van de SSC-logschaal versus de FITC-logschaal, verkrijg een gefilterde PBS van 0,22 μm en definieer het referentieachtergrondgeluid (Figuur 4A).
      NOTITIE: Stel het debiet van de cytometer in op Laag en controleer het debiet. Het aantal evenementen mag niet meer zijn dan 2.000 evenementen. Debiet Laag betekent bij een laag drukverschil.
    2. Verkrijg het controlemonster (ongekleurde EV's) en controleer het debiet. Zorg ervoor dat het aantal evenementen rond de 5.000 evenementen ligt.
      OPMERKING: Als het aantal gebeurtenissen groter is dan voorgesteld, verdunt u het monster.
    3. Verkrijg PBS gekleurd en behandeld als het CFSE-monster en controleer of er geen positieve gebeurtenissen zichtbaar zijn (Figuur 4B).
    4. Verkrijg het CFSE-gekleurde monster. Verdun het op basis van het debiet. Teken een regio die de CFSE-positieve gebeurtenissen identificeert en een regio die de CFSE-negatieve gebeurtenissen identificeert. Gebruik een onkleurig monster als controle (Figuur 5A, B). Dit zijn de sorteergebieden.
  4. Sorteren van monsters
    1. Open een nieuw protocol in de sorteersoftware (selecteer op de werkbalk Bestand > Protocol > Nieuw).
    2. Klik in de sorteersoftware op Instellingen voor gegevensverzameling; in het venster Acquisitieparameter, selecteer de kanalen van interesse en schakel de andere uit. Voor dit specifieke paneel zijn de ingeschakelde signalen: 488-FSC1, 488-FSC2, 488-SSC en 488-513/26 (voor CFSE-signaal).
    3. Zoek op de monsternemer een tube van 5 ml monster. Klik op het aanraakscherm op de knop Laden en selecteer op de werkbalk van de sorteersoftware de optie Acquisitie > Start (of druk op de knop F2 ). Er verschijnt een venster met voorbeeldeigenschappen; Voer de naam van het voorbeeld in en klik op OK.
    4. Maak het paneel, met de plot van interesse en creëer de gating-strategie.
      1. Selecteer op de werkbalk van de sorteersoftware de optie Histogram > Histogram maken.
      2. Maak in de werkruimte drie puntdiagrammen, de eerste met op de x-as 488-FSC1 Height-Log-parameter en y-as 488-SSC Height-Log, de tweede met op de x-as 488-FSC2 Height-Log-parameter en y-as 488-SSC Height-Log, de derde met op de x-as 488-513/26 CFSE Height-Log parameter en y-as 488-SSC Height-Log.
    5. Identificeer op het tabblad Sorteren de regio('s) die moeten worden gesorteerd. Klik in de sorteersoftware op Sorteerinstelling. Selecteer in het venster Logica en statistiek sorteren de regio die moet worden gesorteerd in de bouwfunctie voor het maken van logica.
      OPMERKING: Om een sorteerbeslissing te nemen, zijn er verschillende instellingen waarmee u rekening moet houden: Sorteerlogica, Sorteermodus en Envelop neerzetten. De Sort Logic verwijst naar de poortstrategie. De gebeurtenissen die zich buiten de geselecteerde poort bevinden, worden niet gesorteerd. De sorteermodus is gerelateerd aan de uiteindelijke uitvoer. Werk in een Purify-modus, op deze manier bevatten alle gesorteerde druppels alleen de gewenste positieve gebeurtenissen. De Drop Envelope definieert hoeveel druppels er in rekening worden gebracht en gesorteerd op basis van de locatie in de drop van de positieve gebeurtenis: kies 1-2 druppels om er zeker van te zijn dat alle positieve gebeurtenissen worden gesorteerd.
    6. Wanneer het debiet stabiel is, stopt u de acquisitie (selecteer op de werkbalk van de sorteersoftware Acquisitie > Stop of druk nogmaals op de F2-knop ). Begin met sorteren (selecteer op de werkbalk van de sorteersoftware Sorteren > Start of druk op de F4-knop ).
      OPMERKING: Voordat u begint met sorteren, controleert u de Teststroom. Controleer of de gesorteerde fractie correct in de opvangbuis valt.
    7. Sla de sorteerinstelling op. Selecteer op de werkbalk van de sorteersoftware de optie Sorteren > Sorteerinstellingen opslaan.
  5. Zuiverheidscontrole van gesorteerde populatie
    1. Was het instrument door een tube van 5 ml reinigingsoplossing gedurende 10 minuten bij hoog drukverschil en een tube gedemineraliseerd water van 5 ml gedurende 10 minuten aan te schaffen.
    2. Verkrijg 0,22 μm-gefilterde PBS en controleer of er geen CFSE-positieve gebeurtenissen aanwezig zijn.
    3. Verdun 5 μl van het gesorteerde monster in 100 μl 0,22 μm gefilterd PBS.
    4. Verkrijg en registreer alle monstervolumes (Figuur 5C, D).
      OPMERKING: Heranalyse van zowel CFSE-positieve als negatief gesorteerde EV's wordt gerapporteerd.

figure-protocol-3
Figuur 3: Fysische parameterinstelling met holle organo silica korrels. (A) SSC/FITC-puntplot: referentie groene, fluorescerende kralen zijn gebruikt om de SSC-parameter in te stellen. SSC/FSC dot plot van (B) VER01B en (C) VER01A kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4: Referentie achtergrondruis. (A) SSC/CFSE-puntplot van PBS-monster. (B) SSC/CFSE-puntplot van PBS + CFSE-steekproef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-5
Figuur 5: CFSE gekleurde ASC-EV's sorteren. (A) SSC/CFSE dot plot van ongekleurde EV's, (B) CFSE gekleurde EV's, (C) CFSE-negatieve EV's na sortering, en (D) CFSE-positieve EV's na sortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Analyses van nasortering

LET OP: Door de beperkte hoeveelheid materiaal na het sorteren kan het zijn dat het niet mogelijk is om alle analyses uit te voeren. Met het verkregen bedrag wordt het volgende uitgevoerd.

  1. Karakterisering van EV door flowcytometrie: oppervlaktekleuring (zie stap 2.2)
    OPMERKING: Zoals eerder beschreven voor het voorsorteren van monsters, met uitzondering van de monstervoorbereiding. Monsters mogen na sortering onverdund worden gebruikt.
    1. Gebruik onverdunde gesorteerde monsters en ga te werk volgens stap 2.2.3. (Figuur 6A)
  2. Karakterisering van EV-concentratie en -grootte door NTA (zie stap 2.4)
    OPMERKING: Zoals eerder beschreven voor het voorsorteren van monsters, met uitzondering van de monstervoorbereiding. Monsters mogen na sortering onverdund worden gebruikt.
    1. Gebruik onverdunde gesorteerde monsters en ga te werk volgens stap 2.4.2. (Figuur 6B)
  3. Karakterisering van EV-morfologie door TEM (zie stap 2.5)
    OPMERKING: Zoals eerder beschreven voor het voorsorteren van monsters, met uitzondering van de monstervoorbereiding.
    1. Voeg 2 ml PBS toe aan een centrifugaalconcentrator (membraan van geregenereerde cellulose, MWCO 100 kDa), dop en centrifugeer gedurende 10 minuten op 4.000 x g in een draaiende emmerrotor. Verwijder de ongefilterde PBS van de onderkant van het filterapparaat.
    2. Zuig het filtraat op uit de opvangbuis. Het beschreven protocol voor centrifugale ultrafiltratie is gebaseerd op de verwerking van monsters tot 15 ml (maximaal volume).
    3. Voeg tot 15 ml monster toe aan het AU-15-filter en sluit het apparaat af. Centrifugeren op 4.000 x g gedurende maximaal 30 minuten. Concentreer je tot het minimale volume dat het apparaat toelaat, ongeveer 100-150 μL.
    4. Haal het geconcentreerde gesorteerde EV-monster uit het filterapparaat en ga te werk zoals eerder beschreven voor het voorsorteren van monsters TEM (stap 2.5.2) ( Figuur 6C).

figure-protocol-6
Figuur 6: Karakterisering van gesorteerde ASC-EV's. Flowcytometrie-analyse van EV-markers. De expressie van de volgende markers werd geanalyseerd: CD9, CD63, CD81 en CD44. Alleen CFSE-positieve ASC-EV's werden geanalyseerd op markerexpressie. (A) Histogrammen vertegenwoordigen ongekleurde (rode histogrammen) en gekleurde (blauwe histogrammen) ASC-EV's. (B) Karakterisering van ASC-EV's door NTA. Histogrammen geven de concentratie (deeltjes/ml)/grootte (nm) weer van de voorsortering (links) en nasortering (rechts) monsters. (C) Visualisatie van ASC-EV's door TEM van voorsortering (links) en nasortering (rechts) monster. Schaalbalken = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De FSC-polystyreenkorrels zijn gesorteerd om de opstelling van het instrument en de sorteeromstandigheden te valideren. FSC polystyreen kralen zijn een mix van fluorescerende kralen variërend van 100 nm, 300 nm, 500 nm en 900 nm en zijn zichtbaar op het FITC-kanaal. Figuur 7A toont de SSC-logschaal versus de FITC-logschaal puntplot met de vier populaties kralen vóór sortering. De fluorescerende populaties van 100 nm, 300 nm en 500 nm werden omheind en gesorteerd. Gesorteerde kralen werden geanalyseerd op zuiverheid en verrijking als een eerste proof of concept (Figuur 7B). Alle populaties waren zuiver na sortering. De referentieachtergrondruis is altijd zichtbaar in de puntdiagrammen voor en na het sorteren.

Om te voldoen aan de eisen vermeld in MISEV2018/2023 en om de aard van blaasjes en hun zuiverheidsgraad aan te tonen, werden experimenten uitgevoerd om markers te analyseren die al dan niet aanwezig zijn op EV's. EV's zijn positief voor sommige specifieke oppervlaktemarkers15: CD9, CD63, CD81 en CD44. CD9, CD63 en CD81 behoren tot de tetraspaninefamilie van membraaneiwitten en zijn de meest voorkomende markers om exosomente identificeren 16. CD44 is een marker die sterk tot expressie komt door MSC's en ASC's17.

EV's zijn ook positief voor het cytosolische eiwit caveolin, zoals aangetoond door het intracellulaire flowcytometrie-experiment. Bovendien bevestigt de western blot de positiviteit voor CD9, CD81, TSG101, Flotillin en de negativiteit voor Calnexin (Figuur 2).

Vervolgens werden CFSE-gelabelde ASC-EV's gesorteerd zoals gerapporteerd in het protocol. Deze sorteerprocedure werd vier keer herhaald, waarbij exact dezelfde omstandigheden voor de voorbereiding, kleuring en sortering van het monster werden gehandhaafd (tabel 1). Op deze manier is de herhaalbaarheid van het protocol aangetoond.

Er werd een reeks experimenten uitgevoerd om de CFSE-gesorteerde ASC-EV's-populatie te analyseren en om aan te tonen dat hun kenmerken niet zijn veranderd door sortering. Met name de expressie van CD9, CD63, CD81 en CD44 verandert niet na sortering (Figuur 6A).

Een ander cruciaal punt betreft de afmetingen van de EV's en hoe deze na de sorteerprocedure kunnen veranderen als gevolg van de spanning die door de druk wordt veroorzaakt. De analyse na het sorteren was moeilijk uit te voeren vanwege de kleine hoeveelheid monster, maar de analyse van het volgen van nanodeeltjes toont aan dat de verdeling van de twee ASC-EVs-monsters (voor- en nasortering) hetzelfde was (Figuur 6B). Ten slotte toont de analyse van EV's via TEM aan dat hun morfologie niet significant lijkt te veranderen na sortering (Figuur 6C).

Merk op dat, zoals gesuggereerd door MIFlowCyt-EV framework guidelines18, een vermindering van de hoeveelheid CFSE-positieve EV's werd waargenomen na 0,1% Triton X-100 monsterbehandeling, waardoor hun vesiculaire oorsprong werd ondersteund (Figuur 8).

figure-results-1
Figuur 7: Sorteren van FSC-polystyreenkorrels. (A) SSC/FITC dot plot van kralen voor het sorteren. SSC/FITC dot plot van opnieuw geanalyseerde kralen na sortering: (B) 100 nm gesorteerde kralen, (C) 300 nm gesorteerde kralen en (D) 500 nm gesorteerde kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 8: Afbraak van het EV-membraan in aanwezigheid van Triton X-100. Triton X-100 met een concentratie van 0,1% is gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur aan het monster toegevoegd. Representatieve spreidingsdiagrammen van drie onafhankelijke experimenten met onbehandelde (links) en behandelde (rechts) monsters worden gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ExperimentAantal gesorteerde EV'sAantal CFSE+ gesorteerde EV'sDruk (psi)Mondstuk mmFrequentie (Hz)
174 x 1064,8 x 106357066000
244 x 1067 x 106357066000
338 x 1063 x 106357066000
416 x 1062 x 106357066000

Tabel 1: Herhaalbaarheid van de sorteerprocedure

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het analyseren en sorteren van EV's is een uitdaging vanwege hun kleine formaat en het feit dat ze zich in de buurt van de detectielimiet van de meeste flowcytometers bevinden. Ons doel was om een protocol te ontwikkelen voor het isoleren van EV's die zijn afgeleid van AMSC's met het label CFSE. CFSE werd geselecteerd als kleuringsmethode vanwege de gerapporteerde hoge etiketteringsefficiëntie van EV's (≥90%), zonder de vorming van ongewenste deeltjes zoals eiwitaggregaten die door antilichamen worden gegeven. Desalniettemin is het mogelijk dat er maar weinig EV's zonder esterase kunnen worden gemist en toekomstige studies zullen nodig zijn om kleuringsmethoden te identificeren die in staat zijn om deze deeltjes te labelen voor sorteerprotocollen19.

We wilden sorteervoorwaarden vaststellen die het mogelijk maken om zuivere EV's in te zamelen zonder hun fysieke eigenschappen te veranderen. Dit werd bereikt door gebruik te maken van de technische mogelijkheden van de gebruikte sorteerder en door specifieke maatregelen te implementeren, zoals het verlagen van de standaard sorteerdruk op basis van de grootte van de nozzle. We hebben deze sorteercondities vastgesteld en gevalideerd door gebruik te maken van FSC-polystyreenkorrels. Vervolgens hebben we dit protocol toegepast op ASC EV's, waarbij we het experiment vier keer hebben herhaald en consequent vergelijkbare resultaten hebben bereikt, waardoor de herhaalbaarheid van ons protocol is bevestigd.

Het is echter belangrijk om enkele kritische aspecten en beperkingen op te merken, die we hier schetsen. (i) Zuiverheid van de gesorteerde steekproef: het is een uitdaging om de zuiverheid van de gesorteerde CFSE-positieve EV's onomstotelijk te bewijzen, aangezien de achtergrondruis van het instrument altijd verschijnt tijdens de heranalyse. We kunnen er echter van uitgaan dat we de CFSE-positieve populatie hebben verrijkt. De afwezigheid van CFSE-positieve gebeurtenissen in de CFSE-negatieve populatie geeft aan dat ons sorteerproces succesvol was, wat indirect de zuiverheid van de gesorteerde steekproef aantoont. (ii) Mogelijke contaminatie van het gesorteerde monster: we kunnen niet uitsluiten dat de gesorteerde fractie kleine blaasjes bevat die niet detecteerbaar zijn door het instrument en die per ongeluk in de sorteerdruppels kunnen worden opgenomen. (iii) Integriteit van EV's na het sorteren: We zijn ons ervan bewust dat de druk die door het instrument wordt uitgeoefend de blaasjes mogelijk kan beschadigen. Om dit te beperken, gebruikten we een nozzle van 70 μm met een lagere druk van 35 psi in plaats van de standaard 60 psi. Bovendien hebben we de monsters zorgvuldig voorbereid, waarbij we ultracentrifugatiestappen hebben vermeden die de fysieke kenmerken van EV's zouden kunnen veranderen. Ondanks deze voorzorgsmaatregelen kunnen we niet garanderen dat de gesorteerde EV's intact en ongewijzigd blijven. Daarom raden we aan om analyse na het sorteren en, indien mogelijk, functionaliteitstests op te nemen om de toestand van de EV's te beoordelen.

Hier zijn enkele mogelijke wijzigingen en probleemoplossing voor het protocol. Dit protocol is opgesteld met behulp van een instrument dat het mogelijk maakt om de druk te veranderen; voor instrumenten met strengere instellingen wordt echter aanbevolen om een mondstuk van 100 μm te gebruiken om een lagere druk te hebben om de integriteit van de EV's zoveel mogelijk te behouden.

Ondanks deze overwegingen beweren we dat ons protocol aanzienlijke voordelen biedt in vergelijking met andere methoden voor EV-scheiding. Ten eerste maakt het de isolatie van specifieke populaties EV's mogelijk. Hoewel we ervoor hebben gekozen om de blaasjes te kleuren met CFSE - een fluorescerende kleurstof die structuren met intacte celmembranen identificeert - is het ook mogelijk om specifieke EV-populaties te sorteren met behulp van monoklonale antilichamen. In dergelijke gevallen zijn aanvullende kleuringscontroles essentieel. De International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), de International Society for Advancement of Cytometry (ISAC) en de International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) bieden uitgebreide richtlijnen voor het uitvoeren van reproduceerbare flowcytometrie-experimenten. Gedetailleerde instructies zijn te vinden in de MISEV 20231 en MIFlowCyt -EV richtlijnen18. Ten tweede is deze procedure minder tijdrovend dan andere methoden waarbij meerdere ultracentrifugatiestappen nodig zijn.

Naar onze mening zou dit protocol een succesvolle strategie kunnen zijn voor het scheiden en verzamelen van een specifieke populatie EV's die mogelijk nuttig zou kunnen zijn voor therapeutische doeleinden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Emanuele Canonico voor technische ondersteuning. Een deel van dit werk werd uitgevoerd in ALEMBIC, een geavanceerd microscopielaboratorium dat is opgericht door IRCCS Ospedale San Raffaele en Università Vita-Salute San Raffaele. Het werk van Enrico Ragni en Laura de Girolamo werd gesteund door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid, "Ricerca Corrente".

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl esterMerck150347-59-4
Adipose Mesenchymal Stromal CellsWepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Grégoire, FrankrijkCellen gebruikt in dit onderzoek
Alexa 488 anti-CaveolinR&D SystemsIC5736GFlow cytometry antilichaam
APC anti-human CD44BioLegend338805Flow cytometry antilichaam
APC anti-human CD63BioLegend353007Flow cytometry antilichaam
APC anti-human CD81 (TAPA-1)BioLegend349509Flow cytometry antilichaam
APC anti-human CD9BioLegend312107Flow cytometry antilichaam
BC CytoFLEX SBeckman CoulterBC CytoFLEX S uitgerust met 3 lasers, Blauw, Rood en Violet
Flow-Check Pro FluorospheresBeckman CoulterA63493Fluorescente controle kralen voor MoFLO Astrios EQ
FlowJo software (versie 10.8.1)BDversie 10.8.1Analysesoftware
IntraSure kitBD Biosciences641776Fixatie en permeabilisatie voor intracellulaire kleuring
Megamix-Plus FSCBioCytex7802FSC polystyreen kralen 
MoFLO Astrios EQBeckman CoulterMoFLO Astrios EQ uitgerust met 4 lasers, Blauw, Geel - Groen, Violet en Rood
Mouse anti-FLOT1 antilichaamBD Transduction Laboratories610820Western Blot antilichaam
NanoSight NS300MalvernNS300
Rabbit anti-Calnexin antilichaamOrigeneTA336279Western Blot antilichaam
Rabbit anti-CD9 en CD81 antilichaam (ExoAb antilichaam kit)System BiosciencesEXOAB-KIT-1Western Blot antilichamen
Rabbit anti-TSG101 antilichaam MerckHPA006161Western Blot antilichaam
Triton X-100Merck9036-19-5
Ultra Rainbow Fluorescent ParticlesSpherotechURFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCOMerckUFC910024
VER01 - Verity ShellsExometryOrgano silica kralen voor scatter kalibratie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application. J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  3. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  4. Witwer, K. W., Wolfram, J. Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).
  5. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  6. Du, S., et al. Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).
  7. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  8. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).
  9. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  10. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).
  11. Galipeau, J., Sensébé, L. Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  12. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  13. Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining. BMC Cell Biol. 7, 25(2006).
  14. Morales-Kastresana, A., et al. High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).
  15. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).
  16. Andreu, Z., Yanez-Mo, M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front Immunol. 5, 442(2014).
  17. Mildmay-White, A., Khan, W. Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).
  18. Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments. Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).
  19. Maia, J., et al. Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control. Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extracellular Vesicle IsolationMesenchymal Stromal CellsEV SortingFlow CytometryAdipose Derived MSCsNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyCFSE LabelingGating StrategyEV Purity Check

Gerelateerde artikelen