Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Exosomen (Exo) zijn lipide-dubbellaagse structuren die worden uitgescheiden door verschillende cellen, waaronder die van dieren, planten en prokaryoten. Eerdere studies hebben aangetoond dat Exo afgeleid van humoraal of celsupernatans veelbelovende doelen zijn voor nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers, wat hun belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte onderstreept. Van weefsel afgeleide Exo (Ti-Exo) heeft steeds meer aandacht getrokken vanwege het vermogen om weefselspecificiteit en de micro-omgeving nauwkeurig weer te geven. Ti-Exo, aanwezig in de interstitiële ruimte, speelt een cruciale rol in intercellulaire communicatie en signalering tussen organen. Ondanks hun erkende waarde bij het ophelderen van ziektemechanismen, blijft het isoleren van Ti-Exo een uitdaging vanwege de complexiteit van weefselmatrices en variabiliteit in extractiemethoden. In deze studie ontwikkelden we een praktisch protocol voor het isoleren van exosomen uit miltweefsel van muizen, waardoor een reproduceerbare techniek wordt geboden voor daaropvolgende identificatieanalyse en functionele studies. We gebruikten Type I collagenasevergisting in combinatie met differentiële ultracentrifugatie om van milt afgeleide Exo te isoleren. De kenmerken van geïsoleerde Exo werden bepaald door middel van elektronenmicroscopie, de nano-flowcytometer en de western blot. De geïsoleerde, van milt afgeleide Exo vertoonde de typische morfologie van lipide dubbellaagse blaasjes, met deeltjesgroottes variërend van 30 nm tot 150 nm. Bovendien bevestigde het expressieprofiel van exosoommarkers de aanwezigheid en zuiverheid van exosomen. Samen hebben we met succes een praktisch protocol opgesteld voor het isoleren van milt-afgeleide Exo bij muizen.
Inleiding
Exosomen (Exo) zijn een subgroep van extracellulaire blaasjes (EV's), variërend van 30 tot 150 nm groot, die een breed scala aan biomoleculen inkapselen, waaronder eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Deze biomoleculen zijn afkomstig van de oudercellen en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte. Exo vergemakkelijkt de uitwisseling van biomoleculaire informatie tussen cellen en hun omringende micro-omgeving en speelt een rol in zowel prokaryote als eukaryote systemen. De kenmerken van exosomen, zoals inhoud, grootte, membraancomponenten en cellulaire oorsprong, zijn zeer variabel en worden beïnvloed door het oorspronkelijke celtype, de cellulaire toestand en de omgevingsomstandigheden.
Exosomen worden gewoonlijk ingedeeld in drie categorieën op basis van hun bron: afgeleid van celcultuur, afgeleid van lichaamsvloeistof en afgeleid van weefsel (Ti-Exo). Hoewel exosomen afkomstig van celcultuur uitgebreid zijn bestudeerd vanwege hun toegankelijkheid en consistente opbrengst, wordt het gebruik ervan beperkt door mogelijke veranderingen in celkenmerken na langdurige kweek, die hun biologische functies verkeerd kunnen voorstellen 3,4,5. Bovendien worden de meeste celculturen onderhouden in tweedimensionale omgevingen die de complexe in vivo intercellulaire interacties niet nabootsen, wat mogelijk van invloed kan zijn op de interpretatie van de gegevens6. Omgekeerd bieden exosomen geïsoleerd uit biologische vloeistoffen een minimaal invasieve optie om de progressie van de ziekte in realtime te volgen7. Deze monsters bevatten echter vaak een mengsel van exosomen van verschillende oorsprong, wat de nauwkeurige identificatie van hun primaire bron bemoeilijkt8. Gezien deze uitdagingen is er een toenemende belangstelling voor Ti-Exo, die zich in het extracellulaire interstitium bevinden en belangrijke mediatoren zijn van intercellulaire signalering.
De milt speelt een cruciale rol bij de immuunfunctie en het handhaven van de interne homeostase. Ondanks bestaande protocollen voor het isoleren van Ti-Exo uit organen zoals de hersenen, lever en tumoren, worden praktische methoden voor milt-afgeleide exosomen beperkt gerapporteerd 9,10. Deze studie had tot doel een praktisch protocol op te stellen voor het isoleren van exosomen uit miltweefsel bij muizen, aangepast ten opzichte van een eerder rapport11. We beschrijven een methode met collagenasevergisting gevolgd door ultracentrifugatie, die de verstoring van het celmembraan minimaliseert en zorgt voor een hoge zuiverheid en opbrengst van milt-afgeleide Exo. De kenmerken van geïsoleerde Exo met behulp van dit gevestigde protocol werden gevalideerd door middel van elektronenmicroscopie (TEM), de nano-flowcytometer (Nano-FCM) en western blot, wat de werkzaamheid van het protocol voor verder experimenteel onderzoek bevestigt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De monsters werden verkregen van muizen, met ethische goedkeuring verleend door de ethische commissie van de Guangdong Medical University. Gedetailleerde beschrijvingen van materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt, vindt u in de Tabel met materialen. De details van het preparaat voorafgaand aan de extractie worden geïllustreerd in figuur 1, terwijl het proces van Spleen-Exo-extractie en -verrijking wordt beschreven in figuur 2.
1. Voorbereiding
- Koel high-speed en ultra-high-speed centrifuges voor op 4 °C en stel de temperatuur van een desktopshaker in op 37 °C.
- Bereid celkweekschaaltjes (
100 mm), steriele centrifugebuisjes van 50 ml, ijs en steriele celzeef (70 μm) voor zoals weergegeven in figuur 1A, B. - Steriliseer een schaar en tang met een alcoholspray van 75%, gevolgd door sterilisatie op hoge temperatuur. Deze hulpmiddelen zijn weergegeven in figuur 1C.
- Plaats het miltweefsel in een steriele petrischaal van 100 mm op ijs en spoel het oppervlaktebloed af met 1x ijskoude steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Droog de miltweefsels af met steriel gaas en weeg ze na het drogen.
NOTITIE: Als het weefsel is ingevroren, ontdooi het dan 15 minuten in een schaal op ijs voordat u verder gaat. - Bevochtig de celzeef (70 μm) door 1 ml steriele PBS in de zeef te druppelen met behulp van een steriele transferpipet.
- Bereid de spijsverteringsbuffer (0,1% type I collagenase) voor met behulp van 1x PBS met een vortexmixer.
OPMERKING: Gebruik 10 ml spijsverteringsbuffer voor elke 100 mg miltweefsel. De collagenaseconcentratie werd in dit onderzoek gekozen op basis van de productinstructies. Voor andere weefseltypes moeten onderzoekers deze parameters mogelijk aanpassen op basis van weefseldichtheid en -samenstelling. Voorafgaande experimenten met variërende concentraties en verteringstijden worden aanbevolen om de optimale omstandigheden voor elk weefseltype te bepalen.
2. Vertering van weefsel
- Snijd het weefsel in uniforme kleine stukjes met een schaar in een kweekschaaltje op ijs (figuur 3A) en breng het over naar een centrifugebuis van 50 ml met een steriele transferpipet.
- Voeg de spijsverteringsbuffer toe aan de buis volgens het gewicht van het miltweefsel, zoals hierboven aangegeven (figuur 3B), en schud de buis vervolgens onder een hoek van 45° op een horizontale schudder bij 37 °C. Houd de voortgang van de spijsvertering in de gaten en stop de vertering wanneer weefselbrokken zich hebben verspreid en de meeste hun vorm hebben verloren. De verteringstijd moet variëren tussen weefsels. Onder de experimentele omstandigheden in deze studie is de verteringstijd ongeveer 30 minuten.
- Breng het verteerde mengsel over in een celzeef (Ф70 μm) bij kamertemperatuur (RT) om vezelachtige en grotere weefselresten te verwijderen.
OPMERKING: Volledige filtratie onmiddellijk na de vertering. - Vang het filtraat op in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml.
3. Exosoomisolatie door differentiële centrifugatie
- Centrifugeer filtraten bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Een pellet met resterende cellen, celresten en kernen is te zien na centrifugeren, zoals weergegeven in figuur 3C.
- Breng het supernatans over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 3000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Een pellet met apoptotische lichamen en microsomen is te zien na centrifugeren, zoals weergegeven in figuur 3D.
- Breng het supernatans over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Pellet met microblaasjes en plasmamembraan is te zien na centrifugatie, zoals weergegeven in figuur 3E.
- Ultracentrifugeer het resulterende supernatans bij 120.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C. Na het centrifugeren is een pellet te zien op de bodem van de buis, zoals weergegeven in figuur 3F.
- Gooi het supernatant weg, was de pellet met PBS en ultracentrifugeer opnieuw bij 120.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C om exosomen te verkrijgen. Na het centrifugeren is een pellet te zien op de bodem van de buis, zoals weergegeven in figuur 3G.
- Los de geïsoleerde exosomen op met steriel PBS (200 μl per milt) en bewaar de geïsoleerde exosomen in een nieuwe centrifugebuis van 2 ml bij -80 °C.
4. Exosoomkarakterisering door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
OPMERKING: TEM werd gebruikt om te bepalen of de geëxtraheerde Exo blaasjeskenmerken vertoonde. De Exo-monsters die met elektronenmicroscopie zijn geïdentificeerd, moeten verse monsters zijn of gedurende korte tijd kort bij 4 °C worden bewaard.
- Fixeer exosomen (2-6 μg/μL) met paraformaldehyde van 2% elektronenmicroscopie (EM) bij RT gedurende 2 uur.
- Plaats 10 μL exosoomoplossing op een koperen gaas, incubeer gedurende 10 minuten bij RT, spoel af met steriel gedestilleerd water en dep overtollige vloeistof met absorberend papier.
- Kleurig het koperen gaas met 2% uranylacetaat gedurende 1 minuut, dep overtollige vloeistof af met filtreerpapier en droog het 2 minuten onder een gloeilamp.
- Bekijk het geprepareerde monster onder een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 kV.
5. Grootteverdeling en deeltjesconcentratiemeting van exosomen
- Laad de standaard polystyreen nanodeeltjes (250 nm) op de nano-flow cytometer.
- Meet de eiwitconcentratie van Exo-monsters met behulp van een BCA-eiwittestkit. Verdun het Exo-monster met PBS volgens de resultaten van de BCA-eiwittest (verdun de exosomen tot 1-10 ng/μL) en laad vervolgens de Exo-monsters in de nanostroom om de zijverstrooiingsintensiteit (SSI) te meten.
- Bereken de Exo-concentratie volgens de verhouding tussen SSI en deeltjesconcentratie in de standaard polystyreen nanodeeltjes.
OPMERKING: Voor groottemeting wordt een standaardcurve gegenereerd door standaard silica-nanodeeltjes met gradiëntgroottes (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) op de nanoflowcytometer te laden. Hierna volgt het laden van de Exo sample. De maatverdeling van Exo is berekend aan de hand van de standaard uitharding.
6. Lysis en immunoblot bevestiging van exosoomeiwitten
- Voeg 100 μL radio-immunoprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer toe aan de exosoompellet voor eiwitanalyse.
- Draai krachtig, bedek met parafilm, schommel gedurende 20 minuten bij RT, dan weer draaikolk.
- Centrifugeer kort bij 1000 x g gedurende 30-60 s om het monster te verzamelen, breng over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C tot -80 °C tot analyse.
- Meng voor immunoblot monsters met een 5x laadbuffer om een concentratie van 1x te bereiken en bereid u voor op gelelektroforese.
- Als homogenaatcontroles van het hele weefsel gewenst zijn, gebruik dan een sterke lysisbuffer met een proteaseremmer om het weefsel te lyseren, zoals hierboven beschreven. Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 10,000 minuten bij 10.000 x g en gooi de resterende extracellulaire matrix, hele cellen of intact cellulair puin weg.
- Kook de monsterbuffer met exosomen of weefselhomogenaat gedurende 5-10 minuten bij 95 °C. Laad gelijk eiwit per baan in een 10% SDS-PAGE gel. Laad gelijk eiwit van weefselhomogenaat als controle.
- Ga verder met gelelektroforese onder een spanning van 80 V gedurende ongeveer 2 uur met behulp van de conventionele elektroforesebuffer. Voer een western blot-analyse uit om de expressie van Exo-eiwit in de gezuiverde lysaten te bevestigen en vergelijk de relatieve Exo-abundantie in fracties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Isolatie en zuivering van van milt afgeleide exosomen
Om exosomen uit miltweefsel van muizen te isoleren, gebruikten we een combinatie van collagenasevertering en differentiële ultracentrifugatie (Figuur 2). De eerste stappen bestonden uit het voorbehandelen van het miltweefsel om oppervlaktebloed te verwijderen, gevolgd door vertering met Type I collagenase. Deze enzymatische behandeling vergemakkelijkte de afbraak van extracellulaire ma...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Recent onderzoek heeft gemeld dat milt-afgeleide exosomen (Smilen-Exo) een cruciale rol spelen bij de behandeling van maagkanker12. Om de functies van Smilen-Exo verder op te helderen, is het noodzakelijk om een reproduceerbare en optimale methode vast te stellen voor hun extractie uit miltweefsel. Hoewel er protocollen bestaan voor het isoleren van exosomen van hersen- en leverkanker13,14, blijven methode...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82370281, 81870222), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2022A1515012103) en het Science, het Technology Development Special Fund Competitive Allocation Project van Zhanjiang City (2021A05086), en de Startup Foundation van het Second Affiliated Hospital van de Guangdong Medical University (23H03).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 70 µm Cell Strainer | Biologix Group Co., Ltd.USA | 15-1070 | |
| Anti CD9 antibody | Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA | 983275 | |
| Anti GM130 antibody | Proteintech Group, Inc.China | 66662-1-lg | |
| Anti TSG101 antibody | Abcam Plc, UK | 125011 | |
| Cell Culture Dish | Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China | 704001 | |
| Centrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China | 788211 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich Corp., USA | C2674 | |
| Desktop Thermostatic Shaker | Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China | THZ-100 | |
| Electrophoresis buffer | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China | G2081-1L | |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China | P0010S | |
| Flow NanoAnalyzer | NanoFCM Inc., China | N30E | |
| Fluorescence/Chemiluminescence imaging system | Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China | GelView 6000Plus | |
| HRP Goat anti-Mouse IgG | Proteintech Group, Inc.China | 15014 | |
| HRP Goat anti-Rabbit IgG | Proteintech Group, Inc.China | 15015 | |
| microplate reader | Molecular Devices, USA | CMax Plus | |
| Microscissors | Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China | WA1010 | |
| Microscopic tweezers | Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China | WA3010 | |
| Multifuge X1R Pro centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | 75009750 | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China | Y00030 | |
| Ophthalmic tweezers | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China | JD1060 | |
| Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge | Beckman Coulter, USA | A94469 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China | P1003 | |
| RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors) | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China | P0013K | |
| Ruler | Deli Manufacturing Company, China | ||
| SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China | P0015 | |
| Transfer Pipet | Biologix Group Co., Ltd.USA | 30-0238A1 | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi, Japan | H-7650 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter, USA | 355618 | |
| Western Transfer Buffer | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China | G2028-1L |
Referenties
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
- Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
- Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
- Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
- Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
- Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
- Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
- Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
- Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
- Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
