Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen

DOI:

10.3791/67234

⸱

20 september 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen (Exo) zijn lipide-dubbellaagse structuren die worden uitgescheiden door verschillende cellen, waaronder die van dieren, planten en prokaryoten. Eerdere studies hebben aangetoond dat Exo afgeleid van humoraal of celsupernatans veelbelovende doelen zijn voor nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers, wat hun belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte onderstreept. Van weefsel afgeleide Exo (Ti-Exo) heeft steeds meer aandacht getrokken vanwege het vermogen om weefselspecificiteit en de micro-omgeving nauwkeurig weer te geven. Ti-Exo, aanwezig in de interstitiële ruimte, speelt een cruciale rol in intercellulaire communicatie en signalering tussen organen. Ondanks hun erkende waarde bij het ophelderen van ziektemechanismen, blijft het isoleren van Ti-Exo een uitdaging vanwege de complexiteit van weefselmatrices en variabiliteit in extractiemethoden. In deze studie ontwikkelden we een praktisch protocol voor het isoleren van exosomen uit miltweefsel van muizen, waardoor een reproduceerbare techniek wordt geboden voor daaropvolgende identificatieanalyse en functionele studies. We gebruikten Type I collagenasevergisting in combinatie met differentiële ultracentrifugatie om van milt afgeleide Exo te isoleren. De kenmerken van geïsoleerde Exo werden bepaald door middel van elektronenmicroscopie, de nano-flowcytometer en de western blot. De geïsoleerde, van milt afgeleide Exo vertoonde de typische morfologie van lipide dubbellaagse blaasjes, met deeltjesgroottes variërend van 30 nm tot 150 nm. Bovendien bevestigde het expressieprofiel van exosoommarkers de aanwezigheid en zuiverheid van exosomen. Samen hebben we met succes een praktisch protocol opgesteld voor het isoleren van milt-afgeleide Exo bij muizen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen (Exo) zijn een subgroep van extracellulaire blaasjes (EV's), variërend van 30 tot 150 nm groot, die een breed scala aan biomoleculen inkapselen, waaronder eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Deze biomoleculen zijn afkomstig van de oudercellen en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte. Exo vergemakkelijkt de uitwisseling van biomoleculaire informatie tussen cellen en hun omringende micro-omgeving en speelt een rol in zowel prokaryote als eukaryote systemen. De kenmerken van exosomen, zoals inhoud, grootte, membraancomponenten en cellulaire oorsprong, zijn zeer variabel en worden beïnvloed door het oorspronkelijke celtype, de cellulaire toestand en de omgevingsomstandigheden.

Exosomen worden gewoonlijk ingedeeld in drie categorieën op basis van hun bron: afgeleid van celcultuur, afgeleid van lichaamsvloeistof en afgeleid van weefsel (Ti-Exo). Hoewel exosomen afkomstig van celcultuur uitgebreid zijn bestudeerd vanwege hun toegankelijkheid en consistente opbrengst, wordt het gebruik ervan beperkt door mogelijke veranderingen in celkenmerken na langdurige kweek, die hun biologische functies verkeerd kunnen voorstellen 3,4,5. Bovendien worden de meeste celculturen onderhouden in tweedimensionale omgevingen die de complexe in vivo intercellulaire interacties niet nabootsen, wat mogelijk van invloed kan zijn op de interpretatie van de gegevens6. Omgekeerd bieden exosomen geïsoleerd uit biologische vloeistoffen een minimaal invasieve optie om de progressie van de ziekte in realtime te volgen7. Deze monsters bevatten echter vaak een mengsel van exosomen van verschillende oorsprong, wat de nauwkeurige identificatie van hun primaire bron bemoeilijkt8. Gezien deze uitdagingen is er een toenemende belangstelling voor Ti-Exo, die zich in het extracellulaire interstitium bevinden en belangrijke mediatoren zijn van intercellulaire signalering.

De milt speelt een cruciale rol bij de immuunfunctie en het handhaven van de interne homeostase. Ondanks bestaande protocollen voor het isoleren van Ti-Exo uit organen zoals de hersenen, lever en tumoren, worden praktische methoden voor milt-afgeleide exosomen beperkt gerapporteerd 9,10. Deze studie had tot doel een praktisch protocol op te stellen voor het isoleren van exosomen uit miltweefsel bij muizen, aangepast ten opzichte van een eerder rapport11. We beschrijven een methode met collagenasevergisting gevolgd door ultracentrifugatie, die de verstoring van het celmembraan minimaliseert en zorgt voor een hoge zuiverheid en opbrengst van milt-afgeleide Exo. De kenmerken van geïsoleerde Exo met behulp van dit gevestigde protocol werden gevalideerd door middel van elektronenmicroscopie (TEM), de nano-flowcytometer (Nano-FCM) en western blot, wat de werkzaamheid van het protocol voor verder experimenteel onderzoek bevestigt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De monsters werden verkregen van muizen, met ethische goedkeuring verleend door de ethische commissie van de Guangdong Medical University. Gedetailleerde beschrijvingen van materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt, vindt u in de Tabel met materialen. De details van het preparaat voorafgaand aan de extractie worden geïllustreerd in figuur 1, terwijl het proces van Spleen-Exo-extractie en -verrijking wordt beschreven in figuur 2.

1. Voorbereiding

  1. Koel high-speed en ultra-high-speed centrifuges voor op 4 °C en stel de temperatuur van een desktopshaker in op 37 °C.
  2. Bereid celkweekschaaltjes (figure-protocol-1100 mm), steriele centrifugebuisjes van 50 ml, ijs en steriele celzeef (figure-protocol-270 μm) voor zoals weergegeven in figuur 1A, B.
  3. Steriliseer een schaar en tang met een alcoholspray van 75%, gevolgd door sterilisatie op hoge temperatuur. Deze hulpmiddelen zijn weergegeven in figuur 1C.
  4. Plaats het miltweefsel in een steriele figure-protocol-3petrischaal van 100 mm op ijs en spoel het oppervlaktebloed af met 1x ijskoude steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Droog de miltweefsels af met steriel gaas en weeg ze na het drogen.
    NOTITIE: Als het weefsel is ingevroren, ontdooi het dan 15 minuten in een schaal op ijs voordat u verder gaat.
  5. Bevochtig de celzeef (figure-protocol-470 μm) door 1 ml steriele PBS in de zeef te druppelen met behulp van een steriele transferpipet.
  6. Bereid de spijsverteringsbuffer (0,1% type I collagenase) voor met behulp van 1x PBS met een vortexmixer.
    OPMERKING: Gebruik 10 ml spijsverteringsbuffer voor elke 100 mg miltweefsel. De collagenaseconcentratie werd in dit onderzoek gekozen op basis van de productinstructies. Voor andere weefseltypes moeten onderzoekers deze parameters mogelijk aanpassen op basis van weefseldichtheid en -samenstelling. Voorafgaande experimenten met variërende concentraties en verteringstijden worden aanbevolen om de optimale omstandigheden voor elk weefseltype te bepalen.

2. Vertering van weefsel

  1. Snijd het weefsel in uniforme kleine stukjes met een schaar in een kweekschaaltje op ijs (figuur 3A) en breng het over naar een centrifugebuis van 50 ml met een steriele transferpipet.
  2. Voeg de spijsverteringsbuffer toe aan de buis volgens het gewicht van het miltweefsel, zoals hierboven aangegeven (figuur 3B), en schud de buis vervolgens onder een hoek van 45° op een horizontale schudder bij 37 °C. Houd de voortgang van de spijsvertering in de gaten en stop de vertering wanneer weefselbrokken zich hebben verspreid en de meeste hun vorm hebben verloren. De verteringstijd moet variëren tussen weefsels. Onder de experimentele omstandigheden in deze studie is de verteringstijd ongeveer 30 minuten.
  3. Breng het verteerde mengsel over in een celzeef (Ф70 μm) bij kamertemperatuur (RT) om vezelachtige en grotere weefselresten te verwijderen.
    OPMERKING: Volledige filtratie onmiddellijk na de vertering.
  4. Vang het filtraat op in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml.

3. Exosoomisolatie door differentiële centrifugatie

  1. Centrifugeer filtraten bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Een pellet met resterende cellen, celresten en kernen is te zien na centrifugeren, zoals weergegeven in figuur 3C.
  2. Breng het supernatans over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 3000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Een pellet met apoptotische lichamen en microsomen is te zien na centrifugeren, zoals weergegeven in figuur 3D.
  3. Breng het supernatans over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Pellet met microblaasjes en plasmamembraan is te zien na centrifugatie, zoals weergegeven in figuur 3E.
  4. Ultracentrifugeer het resulterende supernatans bij 120.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C. Na het centrifugeren is een pellet te zien op de bodem van de buis, zoals weergegeven in figuur 3F.
  5. Gooi het supernatant weg, was de pellet met PBS en ultracentrifugeer opnieuw bij 120.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C om exosomen te verkrijgen. Na het centrifugeren is een pellet te zien op de bodem van de buis, zoals weergegeven in figuur 3G.
  6. Los de geïsoleerde exosomen op met steriel PBS (200 μl per milt) en bewaar de geïsoleerde exosomen in een nieuwe centrifugebuis van 2 ml bij -80 °C.

4. Exosoomkarakterisering door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

OPMERKING: TEM werd gebruikt om te bepalen of de geëxtraheerde Exo blaasjeskenmerken vertoonde. De Exo-monsters die met elektronenmicroscopie zijn geïdentificeerd, moeten verse monsters zijn of gedurende korte tijd kort bij 4 °C worden bewaard.

  1. Fixeer exosomen (2-6 μg/μL) met paraformaldehyde van 2% elektronenmicroscopie (EM) bij RT gedurende 2 uur.
  2. Plaats 10 μL exosoomoplossing op een koperen gaas, incubeer gedurende 10 minuten bij RT, spoel af met steriel gedestilleerd water en dep overtollige vloeistof met absorberend papier.
  3. Kleurig het koperen gaas met 2% uranylacetaat gedurende 1 minuut, dep overtollige vloeistof af met filtreerpapier en droog het 2 minuten onder een gloeilamp.
  4. Bekijk het geprepareerde monster onder een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 kV.

5. Grootteverdeling en deeltjesconcentratiemeting van exosomen

  1. Laad de standaard polystyreen nanodeeltjes (250 nm) op de nano-flow cytometer.
  2. Meet de eiwitconcentratie van Exo-monsters met behulp van een BCA-eiwittestkit. Verdun het Exo-monster met PBS volgens de resultaten van de BCA-eiwittest (verdun de exosomen tot 1-10 ng/μL) en laad vervolgens de Exo-monsters in de nanostroom om de zijverstrooiingsintensiteit (SSI) te meten.
  3. Bereken de Exo-concentratie volgens de verhouding tussen SSI en deeltjesconcentratie in de standaard polystyreen nanodeeltjes.
    OPMERKING: Voor groottemeting wordt een standaardcurve gegenereerd door standaard silica-nanodeeltjes met gradiëntgroottes (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) op de nanoflowcytometer te laden. Hierna volgt het laden van de Exo sample. De maatverdeling van Exo is berekend aan de hand van de standaard uitharding.

6. Lysis en immunoblot bevestiging van exosoomeiwitten

  1. Voeg 100 μL radio-immunoprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer toe aan de exosoompellet voor eiwitanalyse.
  2. Draai krachtig, bedek met parafilm, schommel gedurende 20 minuten bij RT, dan weer draaikolk.
  3. Centrifugeer kort bij 1000 x g gedurende 30-60 s om het monster te verzamelen, breng over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C tot -80 °C tot analyse.
  4. Meng voor immunoblot monsters met een 5x laadbuffer om een concentratie van 1x te bereiken en bereid u voor op gelelektroforese.
  5. Als homogenaatcontroles van het hele weefsel gewenst zijn, gebruik dan een sterke lysisbuffer met een proteaseremmer om het weefsel te lyseren, zoals hierboven beschreven. Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 10,000 minuten bij 10.000 x g en gooi de resterende extracellulaire matrix, hele cellen of intact cellulair puin weg.
  6. Kook de monsterbuffer met exosomen of weefselhomogenaat gedurende 5-10 minuten bij 95 °C. Laad gelijk eiwit per baan in een 10% SDS-PAGE gel. Laad gelijk eiwit van weefselhomogenaat als controle.
  7. Ga verder met gelelektroforese onder een spanning van 80 V gedurende ongeveer 2 uur met behulp van de conventionele elektroforesebuffer. Voer een western blot-analyse uit om de expressie van Exo-eiwit in de gezuiverde lysaten te bevestigen en vergelijk de relatieve Exo-abundantie in fracties.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatie en zuivering van van milt afgeleide exosomen
Om exosomen uit miltweefsel van muizen te isoleren, gebruikten we een combinatie van collagenasevertering en differentiële ultracentrifugatie (Figuur 2). De eerste stappen bestonden uit het voorbehandelen van het miltweefsel om oppervlaktebloed te verwijderen, gevolgd door vertering met Type I collagenase. Deze enzymatische behandeling vergemakkelijkte de afbraak van extracellulaire matrixcomponenten, waardoor de exosomen vrijkwamen met behoud van hun integriteit. Na de spijsvertering werd een reeks centrifugatiestappen gebruikt om achtereenvolgens cellulair afval, apoptotische lichamen en grotere blaasjes te verwijderen, met als hoogtepunt de ultracentrifugatie van het supernatans bij 120.000 x g om de exosomen te pelleteren. Daaropvolgende isolatieprocedures leverden PBS-oplosbare pellets op die waren verrijkt met van milt afgeleide Exo, zoals weergegeven in figuur 3G.

TEM resultaten
De morfologie van de geïsoleerde exosomen werd onderzocht met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie, een gouden standaardmethode om de karakterisering van exosomen te bestuderen. TEM wordt vaak gebruikt om de aanwezigheid van exosomen te valideren, de kwaliteit van exosomen te evalueren en de morfologie van exosomen te observeren. De TEM-beelden (figuur 4A) toonden de aanwezigheid van komvormige blaasjes, die kenmerkend zijn voor exosomen. Deze blaasjes vertoonden een duidelijke lipide dubbellaagse structuur, wat de succesvolle isolatie van exosomen uit het miltweefsel bevestigt.

Grootteverdeling van Smilen-Exo
De grootteverdeling en concentratie van de exosomen werden bepaald met behulp van een nano-flowcytometer. De resultaten (figuur 4B) gaven aan dat de diameter van de geïsoleerde exosomen varieerde van 30-150 nm, met een piekconcentratie van ongeveer 60 nm. De diameter van de geïsoleerde deeltjes was dominant van 50-80 nm, met een gemiddelde deeltjesconcentratie van 4,6 x 109 deeltjes/ml. Dit groottebereik komt overeen met eerder gerapporteerde kenmerken van exosomen, wat het isolatieprotocol verder valideert.

Analyse van Western blot
Om de aanwezigheid van exosomale markers te bevestigen, voerden we een western blot-analyse uit. De exosomale markers TSG101 en CD9 werden gedetecteerd in de Spleen-Exo-monsters, terwijl GM130, een Golgi-matrixeiwit dat als negatieve controle werd gebruikt, niet werd gedetecteerd (Figuur 4C). Ter vergelijking: het eiwit van deze markers werd tot expressie gebracht in miltweefsels van muizen (Milt-T). Dit wijst op de hoge zuiverheid van de geïsoleerde exosomen, aangezien ze vrij waren van cellulaire verontreinigingen.

figure-results-1
Figuur 1: Voorbereiding van de voorraad. (A) Centrifugebuisjes van 50 ml, kweekschaaltjes, ijs en chirurgische instrumenten werden in een bioveiligheidskast geplaatst. (B) Een steriele celzeef (figure-results-270 μm). (C) Gesteriliseerde chirurgische instrumenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 2: Spleen-Exo isolatieprocedure. Bereid miltweefsel voor en snijd het in kleine stukjes in ijskoude PBS, gevolgd door vertering met Type I collagenase en centrifugatie zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 3: Representatieve beelden van de isolatie van Milt-Exo. (A) Kleine miltblokkades klaar voor verdere vergisting. (B) Miltweefselblokkades met spijsverteringsbuffer. (C) Pellets na centrifugeren van 500 x g . (D) Pellets na centrifugeren van 3.000 x g . (E) Pellets na centrifugeren van 10.000 x g . (F) Pellets na centrifugeren 120.000 x g . (G) Exosoompellets na centrifugeren van 120.000 x g . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 4: Identificatie van Smilen-Exo. (A) TEM-resultaten die geïsoleerde deeltjes tonen als ronde of ovale vliezige blaasjes met komvormige morfologie. Schaalbalk = respectievelijk 200 nm en 50 nm. (B) De analyse van de grootteverdeling door de Analyzer van de Stroom Nano toonde aan dat de diameter van Milt-Exo dominant van 50 nm tot 80 nm varieerde, met een gemiddelde deeltjesconcentratie van 4.6 × 109 deeltjes/ml. (C) Western blot-analyse die de expressie van exosoomspecifieke markereiwitten (TSG101 en CD9) in Smilen-Exo aantoont, met negatieve expressie van GM130. Deze markers waren detecteerbaar in eiwitmonsters geëxtraheerd uit milten van muizen (Milt-T-groep). De representatieve western blot-beelden werden getoond (n = 6 weefsels). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recent onderzoek heeft gemeld dat milt-afgeleide exosomen (Smilen-Exo) een cruciale rol spelen bij de behandeling van maagkanker12. Om de functies van Smilen-Exo verder op te helderen, is het noodzakelijk om een reproduceerbare en optimale methode vast te stellen voor hun extractie uit miltweefsel. Hoewel er protocollen bestaan voor het isoleren van exosomen van hersen- en leverkanker13,14, blijven methoden voor andere weefsels onderontwikkeld en vereisen ze verdere validatie. In deze studie hebben we een praktische methode geschetst om Exo uit miltweefsel te isoleren.

In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden gebruikt om Exo te extraheren in wetenschappelijk onderzoek en toepassingen, waaronder ultracentrifugatie, dichtheidsgradiëntcentrifugatie, magnetische parelimmunoadsorptie, ultrafiltratie en polymeerprecipitatie15. Ultracentrifugatie blijft de gouden standaardmethode voor het extraheren van Exo uit verschillende bronnen. Eerdere studies hebben zich gericht op het verstoren van weefselstructuren om hogere concentraties van Exo te verkrijgen, dat bestaat uit intracellulaire en extracellulaire bronnen van Exo16. Collagenase minimaliseert de impact op de integriteit van het celmembraan en zorgt voor de zuiverheid van Ti-Exo3. Collagenase is gebruikt om extracellulaire blaasjes te extraceren uit menselijk gemetastaseerd melanoom, vet-, darmkanker- en leverkankerweefsels 5,10,13,17. De concentratie en verteringstijd van collagenase variëren echter tussen verschillende weefsels.

We hebben een specifiek protocol opgesteld voor het isoleren van Smilen-Exo met behulp van Type I collagenase voor de spijsvertering, gevolgd door filtratie door differentiële ultracentrifugatie, om Spleen-Exo van hoge kwaliteit te verkrijgen. Ultracentrifugatie kan restcellen, grote blaasjes, celresten en apoptotische lichamen effectief uit de monsters verwijderen16. Crescitelli et al. gebruikten collagenase D en gradiënt ultracentrifugatie om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren met een gemiddelde grootte van 75 nm in diameter5. Vergeleken met hun protocol gebruikte ons protocol type I collagenase en een extra ultracentrifugatiestap bij 120.000 x g om een optimale zuiverheid van exosomen te bereiken. In tegenstelling tot eerdere rapporten waarbij weefselhomogenisatie werd gebruikt om weefselsuspensie te verkrijgen14,18, behoudt onze aanpak de membraanintegriteit van cellen in weefsels. Bovendien pasten Vella et al. dichtheidsgradiëntcentrifugatie (een drievoudige sucrosegradiënt) toe om drie groepen deeltjes te genereren, wat extra tijd vergde voor de operatie10. Deze aanpak produceerde grote blaasjes met een grootte van meer dan 200 nm, een heterogene populatie blaasjes met een grootte variërend van 50 nm tot 200 nm, en kleine blaasjes van ongeveer 20 nm groot. Het protocol dat in dit onderzoeksprotocol wordt beschreven, omvat een reeks ultracentrifugatiestappen om achtergebleven cellen, celresten, apoptotische lichamen en grotere blaasjes methodisch te elimineren, waardoor de zuiverheid van de verkregen Exo wordt verbeterd. We leggen de nadruk op een zorgvuldige behandeling tijdens het verzamelen van bovendrijvend middel om verstoring van de gesedimenteerde pellets te voorkomen.

We beoordelen de morfologie en zuiverheid van de geïsoleerde Smilen-Exo door middel van TEM en analyse van nanodeeltjes. Beide analyses toonden aan dat de milt-afgeleide deeltjes die door dit protocol werden geïsoleerd, een lipidedubbellaag en komvormige blaasjes vertoonden met een grootte variërend van 30 nm tot 150 nm, wat de typische kenmerken zijn van exosomen19. CD9 en TSG101 zijn exosoommarkers19, en GM130, een Golgi-eiwit, wordt gebruikt als een negatieve marker voor exosoomidentificatie20. De resultaten toonden aan dat Smilen-Exo positief was voor CD9 en TSG101, terwijl GM130 niet werd gedetecteerd, wat de succesvolle isolatie van hoogwaardige, weefsel-afgeleide Exo uit milten bevestigt.

Om Ti-Exo van hoge kwaliteit te bereiken, is het selecteren van het juiste enzymtype, de juiste concentratie en verteringsduur, evenals de juiste weefselopslag, essentieel. We zagen geen significant verschil in eiwitconcentraties tussen Exo afkomstig van vers en bevroren miltweefsel (gegevens niet getoond), wat aangeeft dat het haalbaar is om grote hoeveelheden bevroren weefsels te verwerken om de workflow te verminderen. Het isoleren van Ti-Exo vereist een lange gebruiksduur voor ultracentrifuge, waardoor het onpraktisch is om het hele protocol binnen een geschikte periode af te ronden bij gebruik van verse weefsels in klinische toepassingen. Het gebruik van bevroren weefsels voor exosoomisolatie zou dus een betere optie zijn. Ontdooien bij 37 °C is niet geschikt voor bevroren weefsels vanwege onvolledige penetratie van cryoprotectieve middelen in weefsels. Er werd gemeld dat bij het uitvoeren van exosoomisolatie met behulp van bevroren weefsels die op ijs ontdooiden, de opbrengst van exosomen geen significante inhoud vertoonde in vergelijking met verse weefsels21. Daarom ontdooiden we de bevroren miltweefsels op ijs om exosoomisolatie uit te voeren bij gebruik van de opslagmonsters bij -80 °C.

Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, heeft echter verschillende beperkingen. De uitgebreide stappen die nodig zijn om te extraheren en te identificeren zijn tijdrovend. Gezien het uiteindelijke doel om Exo-onderzoek toe te passen op de klinische behandeling van ziekten, worden snellere en kosteneffectievere methoden steeds belangrijker. Bovendien, hoewel de resultaten zijn gebaseerd op weefselmonsters van muizen, moet de toepasbaarheid op menselijke weefsels nog worden bepaald.

Concluderend biedt het protocol een methode voor het extraheren van zeer zuiver Exo uit miltweefsel, geschikt voor gedetailleerde stroomafwaartse analyse. Van weefsel afgeleide Exo weerspiegelt de micro-omgeving van hun oorsprong nauwkeuriger en heeft een aanzienlijk potentieel voor het ophelderen van fysiologische en pathologische processen in levende organismen. Toekomstige studies zouden dit protocol kunnen aanpassen aan menselijke weefsels, waardoor de extractie van klinisch relevante exosomen voor diagnostische en therapeutische doeleinden mogelijk wordt. Deze techniek zou met name nuttig kunnen zijn bij het bestuderen van de rol van exosomen in immuunresponsen, gezien de kritieke functie van de milt in het immuunsysteem. Bovendien zou het protocol kunnen worden gewijzigd om exosomen uit andere weefsels te isoleren, wat mogelijk kan helpen bij de ontwikkeling van weefselspecifieke biomarkers en gerichte therapieën. Door ons begrip van de biologie van exosomen te verbeteren, kan dit protocol bijdragen aan de vooruitgang in precisiegeneeskunde en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82370281, 81870222), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2022A1515012103) en het Science, het Technology Development Special Fund Competitive Allocation Project van Zhanjiang City (2021A05086), en de Startup Foundation van het Second Affiliated Hospital van de Guangdong Medical University (23H03).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
70 µm Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 antibodyCell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Anti GM130 antibodyProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anti TSG101 antibodyAbcam Plc, UK125011
Cell Culture DishWuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China704001
Centrifuge tubeWuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China788211
Collagenase Type ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Desktop Thermostatic ShakerShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChinaTHZ-100
Electrophoresis bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay KitShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChinaN30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChinaGelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgGProteintech Group, Inc.China 15014
HRP Goat anti-Rabbit IgGProteintech Group, Inc.China 15015
microplate readerMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaWA1010
Microscopic tweezersShanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro centrifugeThermo Fisher Scientific, USA75009750
Ophthalmic scissorsShanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaY00030
Ophthalmic tweezersShanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifugeBeckman Coulter, USAA94469
phosphate buffered saline (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., ChinaP1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0013K
RulerDeli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0015
Transfer PipetBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Transmission Electron MicroscopeHitachi, JapanH-7650
Ultracentrifugation tubeBeckman Coulter, USA355618
Western Transfer Buffer Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2028-1L

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Milt exosomenisolatie van exosomenweefselafgeleide exosomendifferenti le ultracentrifugatietype I collagenasetransmissie elektronenmicroscopienano flowcytometrieexosomenmarkersimmuunresponsmiltweefsel van muizen

Gerelateerde artikelen