Uitgebreide karakterisering van weefselmineralisatie in een ex vivo model

Samenvatting

Het voorgestelde protocol behelst een globale aanpak om botvorming in het kader van botregeneratie te beoordelen met behulp van multimodale analyses. Het heeft tot doel kwalitatieve en kwantitatieve informatie te verstrekken over de vorming van nieuw bot, waardoor de nauwkeurigheid en validiteit van basis- en preklinisch onderzoek wordt verbeterd.

Samenvatting

De uitgebreide karakterisering van weefselmineralisatie in de context van botregeneratie vormt een aanzienlijke uitdaging, gezien de talrijke modaliteiten die momenteel beschikbaar zijn voor analyse. Hier stellen we een workflow voor voor een uitgebreide evaluatie van nieuwe botvorming met behulp van een relevant groot dierlijk botachtig ex vivo explantaat. Een botdefect (diameter = 3,75 mm; diepte = 5,0 mm) wordt gecreëerd in een geëxplanteerde heupkop van een schaap en geïnjecteerd met een macroporeuze botvervanger geladen met een pro-osteogene groeifactor (botmorfogenetisch eiwit 2 - BMP2). Vervolgens wordt de explantatie gedurende een periode van 28 dagen in cultuur gehouden, waardoor cellulaire kolonisatie en daaropvolgende botvorming mogelijk zijn. Om de kwaliteit en structuur van nieuw gemineraliseerd weefsel te evalueren, worden de volgende opeenvolgende methoden opgezet: (i) Karakterisering en 3D-beelden met hoge resolutie van de gehele explantatie met behulp van micro-CT, gevolgd door deep learning-beeldanalyses om de discriminatie van gemineraliseerde weefsels te verbeteren; (ii) Nano-inkeping om de mechanische eigenschappen van het nieuw gevormde weefsel te bepalen; (iii) Histologische onderzoeken, zoals Hematoxyline/Eosine/Saffraan (HES), Goldner's trichroom en Movat's pentachroom om een kwalitatieve beoordeling van gemineraliseerd weefsel te geven, met name met betrekking tot de visualisatie van de osteoïde barrière en de aanwezigheid van botcellen; (iv) Back-scattering scanning elektronenmicroscopie (SEM) in kaart brengen met interne referentie om de mate van mineralisatie te kwantificeren en gedetailleerde inzichten te verschaffen in de oppervlaktemorfologie, de minerale samenstelling en de interface tussen bot en biomateriaal; (v) Raman-spectroscopie om de moleculaire samenstelling van de gemineraliseerde matrix te karakteriseren en om inzicht te verschaffen in de persistentie van BMP2 in het cement door de detectie van peptidebindingen. Deze multimodale analyse zal een effectieve beoordeling van nieuw gevormd bot opleveren en uitgebreide kwalitatieve en kwantitatieve inzichten in gemineraliseerde weefsels. Door de standaardisatie van deze protocollen willen we vergelijkingen tussen studies vergemakkelijken en de validiteit en betrouwbaarheid van onderzoeksresultaten verbeteren.

Inleiding

Botdefecten, of ze nu worden veroorzaakt door trauma, tumorresectie, aangeboren afwijkingen of infectie, vormen een grote uitdaging voor regeneratieve geneeskunde. Deze veranderingen brengen de structurele integriteit van het skelet in gevaar, wat leidt tot ongemak, functionele beperkingen en een vermindering van de kwaliteit van leven van de patiënt.

Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, zijn er innovatieve strategieën voor botherstel ontstaan, met een focus op het verbeteren van osteogenese en regeneratie van botweefsel. Deze benaderingen omvatten het gebruik van implanteerbare, injecteerbare of 3D-printbare botvervangers, die van natuurlijke oorsprong kunnen zijn (bijv. macromoleculen van biologische oorsprong, hydroxyapatiet van dierlijke oorsprong) of synthetisch (bijv. biobrillen, calciumfosfaten)¹. Om hun lage inherente vermogen om botregeneratie te begeleiden en te stimuleren te verbeteren, kunnen botvervangers worden belast met osteoinductieve factoren, zoals botmorfogenetische eiwitten (BMP's), om osteogene differentiatie van voorlopercellen te bevorderen en de botvorming te verbeteren^.

Botvorming is gebaseerd op de initiële vorming van een collageenmatrix, die vervolgens wordt gemineraliseerd door hydroxyapatietkristallen, waardoor de botstructuur wordt versterkt³. Dit proces verleent specifieke stijfheid en sterkte aan het bot. De kwaliteit van het gemineraliseerde weefsel wordt nauw bepaald door de microstructurele eigenschappen en de mate van mineralisatie⁴. Deze kwaliteit speelt een cruciale rol bij botgenezing en de functionaliteit van het geregenereerde bot⁵. Het karakteriseren van botmineralisatie blijft echter een uitdagende taak vanwege de inherente variabiliteit in multivariate studies ^6,7,8.

Bovendien worden de eerste evaluaties van de biocompatibiliteit, cytocompatibiliteit en differentiatiepotentieel van bottransplantaatvervangers doorgaans in vitro uitgevoerd. Methodologische verschillen belemmeren echter een naadloze vergelijking van de resultaten. Bovendien geven deze in vitro studies geen volledig beeld van de meercellige interacties en complexe dialoog tussen celpopulaties, waaronder beenmergcellen, die essentieel zijn voor het reguleren van het^{botregeneratieproces.} Dit gebrek aan nauwkeurige weergave van de botmicro-omgeving kan de nauwkeurigheid van latere preklinische onderzoeken in gevaar brengen¹⁰.

Hoewel in-vivobeoordelingen een nauwkeurigere weergave geven van fysiologische contexten, worden ze beperkt door ethische, logistieke en financiële overwegingen. Bijgevolg spelen ex vivo evaluaties een cruciale rol als interface tussen in vitro en in vivo studies, en dienen ze als een noodzakelijke tussenstap voordat wordt overgegaan tot experimenten op levende proefpersonen 11,12,13.

In deze context is de implementatie van uitgebreide karakteriseringsmethodologieën nodig om de kwaliteit van geregenereerd botweefsel te beoordelen en om de relevantie van de strategie te waarborgen voordat wordt overgegaan op een preklinisch model. Daarom stellen we een protocol voor op basis van de analyse van een explantatiemodel met behulp van schapenkniegewrichtsweefsel. Deze innovatieve methodologie omvat het implanteren van BMP2-geladen cement in de explantaten en het uitvoeren van een gedetailleerde analyse van weefselmineralisatie na 28 dagen cultuur.

De technische benaderingen die in deze studie worden gebruikt, zijn divers en complementair en bieden samen een alomvattende benadering voor het evalueren van de kwaliteit van geregenereerd botweefsel (Figuur 1). Micro-CT-beeldvorming met hoge resolutie maakt gedetailleerde 3D-visualisatie van de botstructuur mogelijk en biedt waardevolle inzichten in de mineraaldichtheid, morfologie en integriteit van het nieuw gevormde weefsel. Deze techniek is cruciaal voor het beoordelen van de werkzaamheid van botregeneratie en het volgen van de progressie van mineralisatie in de loop van de tijd. Nanoindentatie is een nauwkeurige benadering voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van het weefsel, zoals de hardheid en sterkte. Door de reactie van het materiaal op een uitgeoefende kracht op nanometrische schaal te meten, maakt deze methode het mogelijk om de robuustheid en kwaliteit van het gemineraliseerde weefsel te beoordelen. Histologische onderzoeken met behulp van veel voorkomende kleuringen zoals hematoxyline/eosine/saffraan (HES), Goldner's trichroom en Movat's pentachrome bieden onschatbare inzichten in de weefselstructuur en -samenstelling. Deze kleuringen maken differentiatie mogelijk van de verschillende weefselcomponenten, waaronder cellen, extracellulaire matrix en minerale afzettingen, waardoor een uitgebreide kwalitatieve beoordeling van het botregeneratieproces mogelijk wordt. Backscatter scanning elektronenmicroscopie (SEM) mapping biedt een visualisatie met hoge resolutie van het oppervlak van de monsters, waardoor een gedetailleerde analyse van de mate van mineralisatie van de botmatrix mogelijk is, evenals de interfaces tussen het geïmplanteerde materiaal en het gastheerweefsel. Ten slotte geeft Raman-spectroscopie informatie over de moleculaire samenstelling van het weefsel, met name door de identificatie van specifieke componenten zoals eiwitten, lipiden en mineralen. Deze benadering maakt de karakterisering van de gemineraliseerde matrix en de detectie van groeifactoren zoals BMP2 mogelijk, waardoor cruciale informatie wordt verkregen over de persistentie van pro-osteogene stimuli in het regeneratiemedium.

Met behulp van een multidisciplinaire aanpak, waarbij verschillende analytische technieken worden geïntegreerd, heeft onze studie tot doel een grondige en uitgebreide beoordeling van de kwaliteit van geregenereerd botweefsel te bieden, en zo een solide basis te bieden voor de evaluatie van bottransplantaatvervangers en hun mogelijke klinische toepassing.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door een commissie voor ethiek en dierenwelzijn en door de Franse Nationale Veterinaire en Voedseladministratie onder nummer G44171.

1. Bereiding en kweek van osteochondrale explantaten

1. Oogst gezamenlijke exemplaren van schapen van vers geëuthanaseerde dieren in een aseptische omgeving. Leg het schaap in rugligging en scheer de linker achterpoot. Bereid voor door te desinfecteren met alcohol rond het kniegewricht. Gebruik laterale parapatellaire arthrotomie om de voorste en achterste kruisbanden bloot te leggen, gevolgd door patelladislocatie om de dijbeentrochlea te onthullen.
   1. Creëer na het oogsten van weefsel een defect met een diameter van 4,75 mm in de laterale condylus met behulp van een osteochondraal autotransplantaattransfersysteem.
2. Maak met een orthopedische hamer een defect van 10 mm diep en haal de explantatie uit de condylus. Voer vervolgens een tweede defect met een diameter van 8 mm uit, gecentreerd rond het eerste, met behulp van een osteochondraal autotransplantaattransfersysteem. Dit levert osteochondrale explantaten op van 8 mm x 10 mm, met een centraal defect van 4,75 mm x 10,0 mm.
3. Indien nodig om logistieke redenen, de explantaten vervoeren in Hank's Balanced Salt Solution (hBSS) aangevuld met 1% penicilline-streptomycine en bewaren bij 4 °C.
4. Spoel de explantaten 3x af met Fosfaatgebufferde Zoutoplossing (PBS) en injecteer vervolgens het defect van 4,75 mm x 10,0 mm met een calciumfosfaatcement aangevuld met 40 μg/ml BMP2. Bereid het cement voor zoals hieronder beschreven.
   1. Produceer α-tricalciumfosfaat (α-TCP) door warmtebehandeling van apatietische tricalciumfosfaatstaven (isostatische pers bij 120 MPa) bij 1364 °C gedurende ten minste 12 uur, gevolgd door luchtafschrikking¹⁴.
   2. Maal de α-TCP-staven in absolute ethanol met een planetaire molenkogel 2x gedurende 5 minuten bij 500 tpm om een fijn poeder van 13,1 ± 1,7 μm te produceren (gemeten met behulp van laserdiffractie, zoals eerder beschreven¹⁴).
   3. Steriliseer het α-TCP-poeder door het droog te verhitten op 180 °C gedurende 45 minuten. Bereid het calciumfosfaatcement voor door α-TCP-poeder te mengen met een 2,5% (w/v) Na₂HPO₄ 0,22 μm gefilterde oplossing (vloeistof/poederverhouding van 0,35) gedurende 1 min.
   4. Doe de cementpasta vóór de injectie in een spuit van 3 ml met behulp van een naald van 18 G.
5. Breng de explantaten na 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) over in een kolf van 25 cm² en voeg voorzichtig 10 ml volledig kweekmedium toe, bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
6. Bewaar de explantaten tot 28 dagen in een incubator van 37 °C met 5% CO₂ en vervang elke 2 dagen het volledige kweekmedium onder een laminaire stromingskap.
7. Spoel de explantaten 3x af met PBS. Breng ze over in buisjes van 50 ml, voeg 20 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe en houd ze 3 dagen op 4 °C. Spoel de explantaten vervolgens af met PBS en bewaar ze in 70% ethanol voordat u ze vervolgens analyseert.

2. Micro-CT-analyse

1. Voer microtomografieanalyses uit met behulp van een micro-CT-röntgenfoto. Verkrijg röntgenprojecties met een resolutie van 10,7 μm, met een belichtingstijd van 1200 ms en een aluminiumfilter van 1 mm (80 kV en 125 μA). Gemiddeld drie beelden voor elke rotatiestap van 0,45° om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
2. Reconstrueer driedimensionale (3D) beelden met behulp van de reconstructiesoftware van de fabrikant na een X/Y-uitlijning met een referentiescan, met de volgende parameters - Gladmaken: 0, Ringartefact: 3, Straalverharding: 35%. Reinig de beeldstapels met beeldverwerkingssoftware en observeer met tweedimensionale (2D) en 3D-visualisatietools.

3. Deep-learning beeldanalyses

1. Voer beeldsegmentatie uit met behulp van speciale gespecialiseerde software. Gebruik de geïntegreerde segmentatiewizard om een deep-learningmodel te trainen voor bot- en cementdiscriminatie.
2. Selecteer een representatieve zone (d.w.z. frame) met bot, cement en achtergrond uit de gereconstrueerde micro-CT-beelden. Segmenteer dit eerste frame handmatig met behulp van eenvoudige (bijv. drempelwaarde) of krachtige tools (bijv. propagatie) die door de software worden geleverd.
3. Genereer een deep learning-model op het tabblad Model en selecteer 3D-Unet-routine in het vervolgkeuzemenu. Definieer de experimentele parameters in vergelijking met de te analyseren afbeeldingen door met de rechtermuisknop op het gegenereerde model te klikken; hier: diepte van 5, patchgrootte 32 x 32, Adadettla-algoritme, pasverhouding van 0,25, datavergroting x10.
4. Gebruik het gesegmenteerde frame om de deep-learning-routine te trainen (klik op de treinknop), waarvan wordt erkend dat deze relevant is vanwege de snelle en nauwkeurige beeldsegmentatiemogelijkheden ^3,15. Zodra de training is voltooid, definieert u een tweede werkzone (frame) en segmenteert u automatisch met behulp van de voorspellingsfunctie.
   1. Pas indien nodig handmatige correctie toe om nauwkeurigere trainingsgegevens te genereren. Train routine nog een keer. Herhaal het proces totdat een bevredigend resultaat is verkregen; Het aantal gegevensvergrotingen neemt geleidelijk af naarmate het aantal trainingsframes toeneemt.
      OPMERKING: De DICE-index die tijdens de modeltraining wordt verstrekt, geeft een indicatie van de nauwkeurigheid van het model (vergeleken met de invoerinformatie), maar is niet voldoende. Bevestiging van de relevantie van het model moet worden uitgevoerd door validatie van de automatisch gesegmenteerde gegevens door 3 onafhankelijke doorgewinterde onderzoekers.
5. Publiceer het model door op de knop Exporteren te klikken en pas het toe op de volledige micro-CT-dataset door te klikken op Segmenteer > geëxporteerd model > Segmenteer volledige dataset.

4. Inbedding

1. Dehydrateer de botexplantaten door ze in een glazen injectieflacon van 40 ml te doen met 25 ml dehydratatieoplossing bestaande uit 70% aceton en 30% xyleen. Plaats de glazen flacon op een draaiend wiel gedurende 1 uur bij RT. Herhaal deze stap 3x.
2. Vervang de dehydratatieoplossing door 25 ml xyleen en plaats de glazen injectieflacon gedurende 1 uur op het draaiende wiel bij RT.
3. Vervang de xyleenoplossing door 25 ml methylmethacrylaat verrijkt (MMA) met 10% benzoylperoxide (BPO) en 10% dibutylftalaat (DBP). Plaats deze 1 uur op het draaiende wiel bij RT. Herhaal deze stap 2x.
4. Vervang de MMA-oplossing door 25 ml MMA verrijkt met 10% BPO, 10% DBP en 450 μl N, N-dimethylaniline verdund 1:20 in propaan-2-ol. Plaats de glazen injectieflacon een nacht bij -20 °C. De oplossing wordt gelig.
5. Plaats de explantatie in een middelgrote inbeddingsvorm en giet de MMA-BPO-DBP-N, N aniline in de vorm. Plaats de vorm in een plastic doos en ventileer gedurende 5 minuten met stikstofstroom. Sluit de doos hermetisch af en plaats deze gedurende 48 uur bij 4 °C voor MMA-polymerisatie en -uitharding.
6. Verwijder de hars met de explantatie uit de mal en houd deze op 4 °C totdat deze wordt verwerkt voor verdere analyse.

5. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) - kwantitatieve terugverstrooide elektronenbeeldvorming (qBEI)

1. Snijd het pMMA-blok met de explantatie af met een diamantzaag langs de lange as. Bewaar de eerste helft van het blok voor histologische analyse. Snijd de andere helft verder af om een stuk van 1,5 mm dik te krijgen. Voer de snede uit met 3000 tpm met een snelheid van 3 mm/min.
2. Slijp het gedeelte met siliciumcarbidepapier met oplopende nummers die overeenkomen met de onderste korrelgrootte: SiC 320 gedurende 10 s, SiC 1000 gedurende 15 s, SiC 2000 gedurende 30 s en SiC 4000 gedurende 30 s.
3. Polijst het gedeelte met diamantpasta en specifieke kleding: polijstdoek met 3 μm Mol B3 diamantoplossing gedurende 1 minuut en vliesdoek met 1 μm Nap B1 diamantoplossing gedurende 1 min.
4. Spoel het gedeelte af onder dubbel gedestilleerd water en verwijder diamantdeeltjes met een wattenstaafje. Droog het gedeelte onder stikstofgas.
5. Carbon smeer het dikke gedeelte (10 nm carbon film dikte) en monteer het op een aluminium stomp met zilververf. Maak een zilverkleurige verfbrug tussen de bovenkant van de sectie en de stomp om de evacuatie van elektronenlading naar de grond mogelijk te maken.
6. Plaats de stub op het SEM-podium. Plaats naast het monster een controlestomp bestaande uit een Faraday-beker met koolstof-, aluminium- en siliciumstandaarden in de SEM-kamer. Dit zal worden gebruikt om de elektronenbundel te kalibreren en de grijswaarden om te zetten in percentages van Ca. Sluit de SEM-kamer en vacuüm.
7. Schakel de elektronenbundel in en pas de SEM-parameters aan om in de terugverstrooide elektronenmodus te werken. Op backscatter-afbeeldingen is het grijsniveau van de koolstofstandaard 25, de aluminiumstandaard 225 en de siliciumstandaard 253. Ter indicatie: op het gebruikte systeem zijn ^{SEM-parameters} versnellingsspanning 20 keV, sondestroom gemeten met de Faraday-beker: 250 pA, werkafstand: 15 mm, diafragma: 30 μm, beeldresolutie: 1024 x 768 pixels, vacuüm: < 4,10-4 Pa, verblijftijd van 100 μs/pixel, helderheid ~38 en contrast ~72.
8. Wanneer de SEM is gekalibreerd met de standaarden, maakt u beelden van het monster in de terugverstrooide elektronenmodus.
9. Gebruik het terugverstrooide elektronenbeeld van het monster om de grijswaarden om te zetten in calciumgehalte, zoals beschreven in Roschger et ^al.16. Voer dit uit met behulp van beeldanalysesoftware.
10. Plot de verdeling van het calciumgehalte. De verdeling van het calciumgehalte vertoont een Gaussiaanse verdeling. Er worden drie belangrijke parameters berekend die van belang zijn:_{Ca-gemiddelde}, als het gemiddelde calciumgehalte op het beeld,_Ca-piek als de meest voorkomende calciumconcentratie die op het beeld wordt aangetroffen en_Ca-breedte als de volledige breedte op maximaal de helft van de calciumgehalteverdeling.
    OPMERKING: De reproduceerbaarheid van qBEi is onderzocht door gedurende 5 opeenvolgende dagen hetzelfde interessegebied in beeld te brengen (één acquisitie per dag). Dit betekent dat de elektronenbundel tussen de sessies door werd in- en uitgeschakeld. Het foutenpercentage in_{Ca-gemiddelde},_Ca-piek en Cawidth werd geschat op respectievelijk 0,5%, 0,7% en 1,2%. Het calciumgehalte werd ook onderzocht door middel van Energy dispersive X-ray analysis (EDS). Er werd een zeer goede lineaire relatie vastgesteld tussen het_{Ca-gemiddelde} en het door EDS geschatte calciumgehalte met een R²-waarde van 0,99, vergelijkbaar met gegevens die eerder door Roschger et al. waren verkregen¹⁷.

6. Histologie

1. Snijd voor elk monster secties van 7 μm met behulp van een microtoom van hard weefsel met een wolfraammes ^18,19. Beitsen met Goldner trichrome, HES en MOVAT beits met behulp van een automatisch kleuringssysteem.
2. Voor deplastificatie de monsters achtereenvolgens 5 minuten in aceton laten weken en 2x herhalen. Spoel de monsters 5 minuten af in gedestilleerd water en herhaal 2x.
3. Voer de Goldner Trichrome-kleuring uit zoals hieronder beschreven.
   1. Plaats de monsters gedurende 20 minuten in Weigert ijzerhoudende hematoxyline. Wassen met kraanwater. Dompel de monsters onder in alcohol met een zuur van 0,5% gedurende 30 s-1 min. Wassen met kraanwater gedurende 20 min.
   2. Breng de monsters gedurende 5 minuten aan in Ponceau/fuchsinezuur/azophloxine-oplossing. Dompel onder in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
   3. Kleuring met fosfomolybdinezuur/Oranje G-oplossing gedurende 20 min. Dompel onder in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
   4. Beits met snelle groene oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur of 8 minuten bij 60 °C. Spoel grondig af met kraanwater; Herhaal 3x.
4. Voer de Movat Pentachrome-kleuring uit zoals hieronder beschreven.
   1. Alcian Blue-kleuring: dompel de monsters 30 minuten onder in Alcian Blue-oplossing. Spoel de monsters gedurende 5 minuten af in kraanwater. Plaats de monsters gedurende 60 minuten in alkalische ethanol. Spoel de monsters gedurende 10 minuten af in kraanwater. Voer een laatste spoeling uit met gedestilleerd water.
   2. Weigert Hematoxyline-kleuring: plaats monsters in Weigert's Ferric Hematoxyline gedurende 20-30 minuten. Spoel de monsters gedurende 15 minuten af in kraanwater. Spoel opnieuw af met gedestilleerd water.
   3. Kleuring met Crocein Brilliant/fuchsinezuur: dompel de monsters gedurende 10 minuten onder in een oplossing van Crocein Brilliant/Acid Fuchsin. Spoel af met 0,5% azijnzuur. Dompel de monsters gedurende 20 minuten onder in een oplossing van 5% fosfotaalzuur. Spoel af met 0,5% azijnzuur gedurende 2 min. Voer drie opeenvolgende spoelingen uit met 100% ethanol, elk gedurende 5 minuten.
   4. Kleuring met Safran du Gatinais: neem de monsters 15 minuten aan in Safran du Gatinais. Voer een laatste spoeling uit met kraanwater.
5. Voer HES-kleuring uit zoals hieronder beschreven.
   1. Kleuring met Weigert's Hematoxyline: dompel de monsters 30 minuten onder in Weigert's Hematoxyline. Spoel af met kraanwater gedurende 2 min.
   2. Ontkleuring: dompel de monsters gedurende 10 s in zoutzuuralcohol. Spoel af met kraanwater gedurende 2 min.
   3. Neutralisatie: dompel de monsters gedurende 1 minuut onder in een oplossing van lithiumcarbonaat. Spoel af met kraanwater gedurende 2 min. Voer een laatste spoeling uit met gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
   4. Kleuring met Eosine-Erythrosine: plaats de monsters gedurende 3 minuten in een oplossing van Eosine-Erythrosine. Spoel af met kraanwater gedurende 10 s.
   5. Uitdroging: Dompel de monsters 15 s onder in 95% alcohol. Breng over naar 100% alcohol gedurende 15 s. Herhaal de onderdompeling in 100% alcohol gedurende 30 s.
   6. Eindkleuring met alcoholische safeline: dompel de monsters 10 minuten onder in alcoholische saffine. Voer een laatste spoeling uit met kraanwater.
6. Voer de diamontage uit zoals hieronder beschreven.
   1. Spoel de monsters af in 95% ethanol, dan 100% ethanol, dan methylcyclohexaan en herhaal dit 3x voor elke stap.
   2. Monteer de monsters met behulp van een montagekit en voeg een dekglaasje toe. Scan de afbeeldingen met behulp van een digitale diascanner.

7. Raman microspectroscopie

1. Gebruik hetzelfde gedeelte dat wordt gebruikt voor Raman-analyse als de SEM. Slijp en polijst het gedeelte kort zoals beschreven in stap 5.2 - 5.3 om de dunne koolstoflaag te verwijderen die is toegevoegd voor SEM en die de warmteafvoer van het monster belemmert.
2. Plaats de sectie op de tafel van de Raman-microspectrometer. Kalibreer het golfgetal om nauwkeurigheid te garanderen en lijn de laser uit voordat u de meting uitvoert. Aangezien dergelijke procedures specifiek zijn voor elk instrument, worden ze in dit artikel niet beschreven.
3. Lokaliseer interessante gebieden in het weefsel die moeten worden geanalyseerd. Plaats de te analyseren zone in het midden van de videotool en verzamel Raman-spectra met de volgende parameters: 785 nm laser gebruikt bij 30 mW, tijdstip van integratie: 20 s 3 keer herhaald, spectraal bereik: 350-1800 ^cm-1, rooster 1200 lijnen/mm.
4. Verzamel 10 spectra van de inbeddingshars met dezelfde Raman-instellingen en neem het gemiddelde ervan. Gebruik dit om de harsbijdrage in stap 7.6 af te trekken.
5. Bewerk de spectra als volgt om de bijdrage van fluorescentie, ruis en hars te verwijderen: basislijncorrectie met een polynoom van vijf ordes, Savitzky-Golay-filter met een graad van 4 en een venstergrootte tussen 17 en 21, digitale harsaftrekking met behulp van de ~812 ^cm-1 piek van de hars. Een dergelijke voorbewerking kan worden uitgevoerd met verschillende software die is ontworpen voor gegevensanalyse en visualisatie.
6. Analyseer de voorbewerkte spectra verder om waardevolle parameters te extraheren door de piekintensiteit van de betreffende trilling te rantsoeneren met de piekintensiteit van de referentietrilling. Gebruik voor botanalyse bijvoorbeeld de volgende parameters om het te berekenen.
   1. Mineraal-tot-matrix verhoudingen: deel de piekintensiteit van de v1PO4-trillingen bij ~960 ^cm-1 door de piekintensiteit van de Amide I (~1668 ^cm-1), amide III (~1250 ^cm-1), CH2-wag (~1450 ^cm-1) of de som van de trillingsmodi proline (~854 ^cm-1) en hydroxyproline (Hyp, ~872 ^cm-1). De v2PO4, gelegen op ~430 ^cm-1, of de v4PO4, gelegen op ~600 ^cm-1, kan ook worden gebruikt en geproportioneerd met de Amide III vibratie²⁰. Deze parameters vertegenwoordigen de mate van mineralisatie van de organische fase van de botmatrix.
   2. Carbonaat/Fosfaat: deel de piekintensiteit van de v1CO₃, gelegen op ~1070 ^cm-1, door de v1PO4. Dit vertegenwoordigt de hoeveelheid type B-carbonaatsubstitutie in het apatietrooster. Hyp/Pro, vertegenwoordigt het hydroxyprolinegehalte, ~1375 ^cm-1/Amide III, vertegenwoordigt het proteoglycaangehalte, ~1150 ^cm-1/CH2-wag en ~1495 ^cm-1/CH2-wag, vertegenwoordigt de hoeveelheid van de geavanceerde glycatie-eindproducten carboxymethylysine en pentosidine, 1670 ^cm-1/1690 ^cm-1 en 1670 ^cm-1/1640 ^cm-1 vertegenwoordigen respectievelijk de ongeordende secundaire structuur van het collageen, ook bekend als collageenrijpheid, en geordende structuren in de vorm van α-helix in type I collageen.
7. Evalueer de reproduceerbaarheid van Raman-metingen door hetzelfde interessegebied te onderzoeken in 5 opeenvolgende acquisities (één acquisitie per dag). Voor elke geanalyseerde parameter was de variantie minder dan 0,2% van de parameterwaarde, wat een goede reproduceerbaarheid ondersteunt. De specificiteit van elke onderzochte piek is uitgebreid besproken in het veld, en een overzicht wordt gepresenteerd in de recente review van Unal²¹.

8. Nano-indrukking

OPMERKING: Vanwege de destructieve aard van nanoindentatie wordt het meestal uitgevoerd aan het einde van de monsteranalyseroutine. Het nanoindentatiesysteem dat wij bezitten is uitgerust met een piramidale Berkovitch-diamantindenter. Er bestaan echter verschillende vormen van indruklichamen en er is geen consensus in de literatuur vastgesteld voor bot- of biomateriaalmonsters.

1. Hydrateer het ingebedde botmonster gedurende 16 uur in zoutoplossing bij RT voorafgaand aan de nanoindentatietest.
2. Kalibreer het nanoindentatiesysteem met behulp van gesmolten silica en registreer de resulterende indrukmodulus. Voor gesmolten silica is de indrukmodulus ongeveer 72 GPa met een Poisson-coëfficiënt van 0,17.
3. Zodra het nanoindentatiesysteem is gekalibreerd, plaatst u het monster dat wordt gebruikt voor Raman-analyses in het optische systeem van het nanoindentatieapparaat om locaties aan te wijzen waar nanoindentatie zal worden uitgevoerd.
   OPMERKING: Deze modaliteit varieert van de ene apparatuur tot de andere; We geven geen details over hoe het nanoindentatiesysteem en de software werken, maar geven algemeen advies over de verschillende stappen die moeten worden uitgevoerd.
4. Zodra de locatie van nanoindentatie is gekozen, verplaatst u het monster onder het indrukapparaat en voert u de inspringing uit. Voer nanoindentatie uit op een constante diepte van 900 nm, met een laad-/lossnelheid van 40 mm/min en een pauze van 15 s tussen laden en lossen. Stel de Poisson-coëfficiënt voor botweefsel in op 0,3.
5. Haal de verschillende parameters uit de nanoindentatiecurven en bereken ze volgens de theorie van Oliver en Pharr²².
   1. De indrukmodulus (E_IT) is afgeleid van de bekende eigenschappen van de indrukpunt en de gereduceerde modulus en combineert de lokale elastische modulus van het monster. Bereken de inspringing als:
      
      Met v_s, v_i, E_i en E_r die de Poisson-coëfficiënt van het monster vertegenwoordigen, verondersteld 0,3 voor bot te zijn, de Poisson-coëfficiënt van het diamantindruklichaam, verondersteld 0,07 te zijn, de elastische modulus van het diamantindruklichaam, vastgesteld op 1140 GPa en de gereduceerde modulus, berekend als:
      
      Waarbij S de helling van het lossegment vertegenwoordigt en Ap het geprojecteerde gebied is en als volgt wordt berekend:
      
   2. Hardheid (H_IT): komt overeen met de botweerstand tegen het ontstaan en de voortplanting van scheuren. Met andere woorden, het is een indicator van bottaaiheid. Bereken H_IT als:
      
   3. Indrukkingskruipsnelheid (C_IT): Dit weerspiegelt de botvervorming in de loop van de tijd bij constante belasting, indicatief voor de visco-elastische eigenschappen van het monster, berekend als:
      
   4. Maximale belasting (L_m): Dit komt overeen met de tegengestelde belasting die nodig is om de aangegeven diepte in de gemineraliseerde botmatrix door te dringen.
   5. Indrukkingswerk (W_plast): Dit komt overeen met het gebied onder de vervormingscurve van de belasting/ontlasting. Het is een directe weerspiegeling van de energie die wordt gedissipeerd om plastische vervorming te induceren.
      OPMERKING: De reproduceerbaarheid van nanoindentatie is moeilijker te beoordelen op botmonsters vanwege de destructieve aard van deze methodologie. Desalniettemin hebben we de reproduceerbaarheid van het standaard en uniforme gesmolten silicamonster geschat. Voor alle bovenstaande parameters werd de variantie geschat op minder dan 0,26% (5 opeenvolgende metingen op 5 afzonderlijke dagen), wat een zeer goede reproduceerbaarheid ondersteunt. Aan de andere kant is het vanwege de anisotrope aard van botmonsters moeilijker om hun reproduceerbaarheid te waarderen.

Resultaten

Een micro-CT-beeld van de explantatie is weergegeven in figuur 2. Het gebruik van handmatige segmentatie kan bot niet optimaal scheiden van cement, aanwezig in het centrale kanaal, met behulp van globale drempels. Om de herkenning van trabeculair bot en cement te verbeteren, stellen we voor om deep learning in te zetten. Deep learning is krachtig voor het herkennen van biomateriaalkenmerken en helpt de scheiding tussen bot en cement te verbeteren, waardoor een betere beoordeling van cement-botinteracties mogelijk wordt. Dit is van het grootste belang om de hoeveelheid bot die wordt gevormd op het grensvlak met cement nauwkeurig te kwantificeren en geen valse pixels in deze berekening op te nemen.

Het simpelweg kwantificeren van bot aan het grensvlak is echter niet voldoende om nieuw gevormd bot te karakteriseren. Een meer diepgaande studie van de kwaliteit van de botmatrix en de cellulaire samenstelling is nodig om de sterkte van het nieuwe bot en de cellulaire mechanismen die tot de vorming van deze nieuwe matrix hebben geleid, beter te begrijpen. De botmatrix kan worden gekarakteriseerd met behulp van twee complementaire benaderingen: qBEI en Raman-microspectroscopie. Een voorbeeld van een qBEI-afbeelding wordt weergegeven in figuur 3. Met qBEI wordt elke grijswaardengecodeerde pixel omgezet in een calciumconcentratie. Dit is een voorwaarde voor het beoordelen van de verdeling van het calciumgehalte in trabeculair bot en voor het begrijpen van (i) de mate van mineralisatie van nieuw gevormd bot op het grensvlak met cement en (ii) of de aanwezigheid van cement de trabeculaire botmineralisatie verstoort. Het voordeel van qBEI is de mogelijkheid om in zeer korte tijd een beeld met hoge resolutie te verkrijgen, in tegenstelling tot Raman-microspectroscopie die een langere acquisitietijd vereist. qBEI-parameters zoals_{Ca-gemiddelde},_Ca-piek en_Ca-breedte kunnen vervolgens worden afgeleid uit de calciumverdeling en worden gebruikt om de respons tussen twee cementen of biomaterialen te vergelijken.

Aan de andere kant geeft qBEI geen informatie over de kwaliteit van de organische fase van de botmatrix op het grensvlak met het biomateriaal. Aanvullende informatie over de materiaaleigenschappen van de organische fase is ontleend aan Raman-microspectroscopie. Raman-microspectroscopie wordt uitgevoerd op hetzelfde monster als gebruikt voor qBEI na een snelle vlakslijping en polijsten om de geleidende koolstoflaag te verwijderen. Bij Raman-microspectroscopie worden spectra verkregen op elke pixellocatie. Voorbeelden van ruwe, onbewerkte en bewerkte Raman-spectra zijn te vinden in figuur 4. Elk spectrum bevat informatie over de samenstelling van de geanalyseerde pixel en bevat pieken die verband houden met de inbeddingshars, in dit geval pMMA, de minerale fase, pieken v1PO4 en v1CO3, en de organische fase, pieken Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. en Amide I. In het voorbeeld in figuur 4 toont het onbehandelde spectrum de bijdrage van de coatinghars bij ~812 ^cm-1 en een niet-nul gebogen basislijn als gevolg van fluorescentie, hoewel een nabij-infrarode laser wordt gebruikt. Spectrumverwerking is een voorwaarde voor een nauwkeurige berekening van de verschillende Raman-parameters, met name de eliminatie van achtergrondfluorescentie. Bij het verkrijgen van gegevens moet de gebruiker zorgen voor zowel een nauwkeurige positionering als het vermijden van detectorverzadiging om de aanwezigheid van de v1PO4-piek op ~960 ^cm-1 te bevestigen. Na de nabewerking worden de piekintensiteitsverhoudingen berekend op basis van de locatie van de karakteristieke trillingsmodus.

Het is echter de vraag of veranderingen in de materiaalsamenstelling hebben geleid tot veranderingen in de biomechanische respons. Om informatie te verzamelen over de biomechanica van nieuw gevormd bot, voeren we systematisch nanoindentatie-onderzoeken uit op hetzelfde monster dat wordt gebruikt voor Raman-microspectroscopie. Weefselmechanische informatie wordt verkregen uit nanoindentatiecurven die worden weergegeven door belastings- versus dieptecurven (figuur 5). Het is vermeldenswaard dat de diepte aan het einde van de test niet teruggaat naar nul, wat de plastische vervorming en de permanente schade aan het materiaal vertegenwoordigt. De kruipsnelheid van de inspringing wordt afgeleid van de diepte-versus-tijdcurve.

Ten slotte wordt histologische kleuring gebruikt om de weefselrespons op het biomateriaal op cellulair niveau te beoordelen (Figuur 6). De voorgestelde histologische kleuringen stellen ons in staat om de aanwezigheid van osteoïde weefsel te bepalen, maar ook de identificatie van cellen (macrofagen, meerkernige reuzencellen, osteoclasten, osteoblasten) en de mogelijke aanwezigheid van een vezelachtige capsule op het grensvlak met het biomateriaal. Dit is erg belangrijk voor het begrijpen van de biocompatibiliteit van een biomateriaal, maar ook voor de persistentie van nieuw bot wanneer het biomateriaal wordt afgebroken.

Over het algemeen maakt de multi-methodische benadering een diepgaande studie mogelijk van botvorming, de kwaliteit van nieuw gevormd bot en de cellulaire samenstelling. Wanneer ze in de voorgestelde sequentiële volgorde worden uitgevoerd, kunnen alle onderzoeken op hetzelfde monster worden uitgevoerd, waardoor de kosten en verwerkingstijd worden verminderd.

Figuur 1: Grafische samenvatting. Een samenvatting van de protocolstappen vindt u hier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Micro-CT en deep learning analyses. (A) 3D reconstructie van micro-CT beelden. (B) Segmentatie van bot en cement: vergelijking tussen handmatige segmentatie en deep learning. Schaalbalk = 5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kwantitatieve beeldvorming van terugverstrooide elektronen voor het bepalen van het calciumgehalte. (A) Het terugverstrooide beeld, bestaande uit grijswaarden verkregen in de scanning-elektronenmicroscopie (SEM), wordt door de beeldanalysesoftware omgezet in (B) een calciumkaart met de hotspots van het botmonster. (C) De verdeling van het calciumgehalte versus het botgebied wordt uitgezet en de drie belangrijkste qBEI-parameters, Camean, Capeak en_Ca-breedte, worden berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van Raman spectra. (A) Ruw onbewerkt Raman-spectrum verkregen in het spectrale bereik 800 - 1800 ^cm-1. De fluorescentieachtergrond is duidelijk zichtbaar omdat de spectra niet bij 0 beginnen. De harsbijdrage (pMMA) is duidelijk zichtbaar op ~812 ^cm-1. (B) Verwerkt spectrum. De positie van de verschillende trillingsmodi die van belang zijn, wordt aangegeven op het spectrum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Onderzoek naar de mechanische eigenschappen van weefsels door nanoindentatie. (A) Het nanoindentatie-apparaat bestaat uit een optisch onderdeel dat wordt gebruikt om de locatie van het interessegebied aan het oppervlak van het monsterblok te definiëren, en vervolgens wordt het blok vertaald onder het indrukkingsgedeelte. (B) Belasting versus tijd en diepte versus tijd worden uitgezet tijdens de indruktest en worden gebruikt om de (C) belasting versus dieptecurve. In dit voorbeeld is de gekozen diepte vastgesteld op 400 nm. De maximale belasting (L_m), de diepte aan het einde van de lading (h_l), de diepte na de pauzeperiode (h_m), de helling van het lossegment (S) en de oppervlakte onder de laad-losfase van de test (W_plast) worden afgeleid van de curve tussen belasting en diepte en worden gebruikt om de verschillende nanoindentatieparameters te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Histologische analyse van osteochondrale explantaten behandeld met cement na 28 dagen kweek. (A) Movat-kleuring toont de weefselstructuur aan, inclusief bot en het cement dat het defect opvult. (B) HES-kleuring illustreert de weefselintegratie en cellulaire respons rond het cement. Schaalbalk: 2,5 mm. (C) Vergroting van het gemarkeerde gebied in (B), dat het grensvlak tussen het cement en het omringende weefsel aangeeft, waar cellen kunnen worden waargenomen die het cement binnendringen. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Herstel van botdefecten is een grote uitdaging in de regeneratieve geneeskunde om de mobiliteit te herstellen, pijn te verminderen en de kwaliteit van leven van getroffen personen te verbeteren. Het gebruik van explantatiemodellen biedt een aantal voordelen ten opzichte van in vivo studies voor het onderzoek naar het herstel van botdefecten. Naast ethische overwegingen maakt dit model de rigoureuze controle van experimentele omstandigheden en de vermindering van biologische variabiliteit mogelijk, waardoor het genereren van nauwkeurigere en reproduceerbare resultaten wordt vergemakkelijkt. Bovendien zijn de mechanische en biologische eigenschappen van schapenbot nauw afgestemd op die van menselijk bot in vergelijking met andere dieren^23,24. Dit maakt het schapenexplantatiemodel een bijzonder relevante keuze voor preklinische studies en een representatief model voor klinische aandoeningen bij de mens.

Samen met de ontwikkeling van beeldvorming en methodologie voor materiaalwetenschappen, vertegenwoordigt het hier beschreven explantatiemodel een goed model om de effecten van regeneratieve geneeskunde op skeletweefsel in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken, waardoor experimentele vooringenomenheid wordt verminderd. De afmetingen en morfologie van de explantatie zijn optimaal voor gedetailleerde analyse van neo-osteogenese en materiaaleigenschappen, waardoor uitgebreide beoordeling en karakterisering mogelijk is²⁵. Deze bevindingen benadrukken het potentieel van het model voor klinische vertaling, bieden een robuust kader voor het evalueren van bottransplantaatvervangers en vergroten de kans op succesvolle klinische resultaten bij botregeneratietherapieën. Bovendien vergemakkelijkt het model een nauwkeurige evaluatie van osteo-integratie en biomateriaalprestaties, die cruciale factoren zijn bij het ontwikkelen van effectieve botherstelstrategieën.

Om het succes van het onderzoek te garanderen, is het van cruciaal belang om de belangrijkste stappen van het protocol nauwgezet te volgen. Een van de belangrijkste aspecten is ervoor te zorgen dat het monster volledig uitgedroogd is tijdens het inbeddingsproces. Eventueel achtergebleven vocht kan een goede inbedding van de hars belemmeren, wat leidt tot een wazige en niet-transparante hars, wat de helderheid en nauwkeurigheid van de resultaten in gevaar kan brengen en ook kan leiden tot gaten tijdens histologiesecties. Deze zorgvuldige aandacht voor detail is essentieel voor het produceren van betrouwbare en reproduceerbare bevindingen. Om een nauwkeurige omzetting van grijsniveaus in een calciuminhoudskaart te garanderen, is het essentieel om kalibratie toe te passen met behulp van een Faraday-cup en C-, Al- en Si-standaarden voor SEM-analyse. Het is van cruciaal belang om te zorgen voor consistentie in het gebruik van dezelfde SEM voor alle monsters, aangezien verschillen in terugverstrooide elektronendetectoren kunnen leiden tot variabiliteit in de resultaten. Bij Raman-spectroscopie zijn kalibratie van het golfgetal en grondige basislijncorrectie essentieel om de fluorescentieachtergrond uit te sluiten en onderscheid te maken tussen pieken van de inbeddingshars en het monster. Voor nanoindentatie is het bereiken van een perfect glad oppervlak van cruciaal belang, gezien de verplaatsingslimieten van indenters, en kalibratie met een bekende standaard, zoals gesmolten silica, is noodzakelijk om betrouwbare metingen te garanderen.

De aanpassingen en probleemoplossing van deze technieken hebben vaak betrekking op de anisotrope aard van botmateriaal, die de consistentie van de meting kan beïnvloeden. Ter illustratie: bij Raman-spectroscopie kan de polarisatie van de invallende laser een aanzienlijke impact hebben op de geregistreerde intensiteit. Het gebruik van een 20x objectief met een lage numerieke apertuur kan helpen dit probleem te verhelpen. Het is ook van het grootste belang om te zorgen voor consistente kalibratie- en meetomstandigheden voor alle monsters om de gegevensintegriteit te behouden. De inherente anisotropie van bot vormt een beperking van deze methodologieën, omdat het de uniformiteit van metingen kan beïnvloeden, met name in technieken zoals Raman-spectroscopie. Bovendien kan de noodzaak van nauwkeurige kalibratie en milieucontrole de algemene toepasbaarheid beperken als deze aspecten niet nauwgezet worden beheerd.

De potentiële toepasbaarheid van deze benaderingen strekt zich aanzienlijk uit tot de evaluatie van nieuwe biomaterialen en therapeutische strategieën voor botherstel. Het vermogen van het model om de menselijke botfysiologie nauwkeurig na te bootsen, biedt een robuust platform voor preklinische tests, waardoor een grondige beoordeling van de veiligheid en werkzaamheid van nieuwe behandelingen in een gecontroleerde omgeving mogelijk wordt. Het nut van dit model is met name relevant voor het versnellen van de translationele route van laboratoriumonderzoek naar de klinische praktijk, waardoor de vroege identificatie van veelbelovende kandidaten voor botregeneratietherapieën wordt vergemakkelijkt. Door een betrouwbare en reproduceerbare methode te bieden voor het evalueren van botherstelmaterialen, ondersteunt deze techniek de vooruitgang van regeneratieve geneeskunde en de ontwikkeling van klinisch levensvatbare oplossingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25