Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Uitgebreide karakterisering van weefselmineralisatie in een ex vivo model

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67235

⸱

27 september 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nantes Université, Univ Angers, Oniris, CHU Nantes, INSERM, Regenerative Medicine and Skeleton, RMeS, UMR 1229, 2CHU Angers, Departement pathologie cellulaire et tissulaire

In dit artikel

Samenvatting

Het voorgestelde protocol behelst een globale aanpak om botvorming in het kader van botregeneratie te beoordelen met behulp van multimodale analyses. Het heeft tot doel kwalitatieve en kwantitatieve informatie te verstrekken over de vorming van nieuw bot, waardoor de nauwkeurigheid en validiteit van basis- en preklinisch onderzoek wordt verbeterd.

Samenvatting

De uitgebreide karakterisering van weefselmineralisatie in de context van botregeneratie vormt een aanzienlijke uitdaging, gezien de talrijke modaliteiten die momenteel beschikbaar zijn voor analyse. Hier stellen we een workflow voor voor een uitgebreide evaluatie van nieuwe botvorming met behulp van een relevant groot dierlijk botachtig ex vivo explantaat. Een botdefect (diameter = 3,75 mm; diepte = 5,0 mm) wordt gecreëerd in een geëxplanteerde heupkop van een schaap en geïnjecteerd met een macroporeuze botvervanger geladen met een pro-osteogene groeifactor (botmorfogenetisch eiwit 2 - BMP2). Vervolgens wordt de explantatie gedurende een periode van 28 dagen in cultuur gehouden, waardoor cellulaire kolonisatie en daaropvolgende botvorming mogelijk zijn. Om de kwaliteit en structuur van nieuw gemineraliseerd weefsel te evalueren, worden de volgende opeenvolgende methoden opgezet: (i) Karakterisering en 3D-beelden met hoge resolutie van de gehele explantatie met behulp van micro-CT, gevolgd door deep learning-beeldanalyses om de discriminatie van gemineraliseerde weefsels te verbeteren; (ii) Nano-inkeping om de mechanische eigenschappen van het nieuw gevormde weefsel te bepalen; (iii) Histologische onderzoeken, zoals Hematoxyline/Eosine/Saffraan (HES), Goldner's trichroom en Movat's pentachroom om een kwalitatieve beoordeling van gemineraliseerd weefsel te geven, met name met betrekking tot de visualisatie van de osteoïde barrière en de aanwezigheid van botcellen; (iv) Back-scattering scanning elektronenmicroscopie (SEM) in kaart brengen met interne referentie om de mate van mineralisatie te kwantificeren en gedetailleerde inzichten te verschaffen in de oppervlaktemorfologie, de minerale samenstelling en de interface tussen bot en biomateriaal; (v) Raman-spectroscopie om de moleculaire samenstelling van de gemineraliseerde matrix te karakteriseren en om inzicht te verschaffen in de persistentie van BMP2 in het cement door de detectie van peptidebindingen. Deze multimodale analyse zal een effectieve beoordeling van nieuw gevormd bot opleveren en uitgebreide kwalitatieve en kwantitatieve inzichten in gemineraliseerde weefsels. Door de standaardisatie van deze protocollen willen we vergelijkingen tussen studies vergemakkelijken en de validiteit en betrouwbaarheid van onderzoeksresultaten verbeteren.

Inleiding

Botdefecten, of ze nu worden veroorzaakt door trauma, tumorresectie, aangeboren afwijkingen of infectie, vormen een grote uitdaging voor regeneratieve geneeskunde. Deze veranderingen brengen de structurele integriteit van het skelet in gevaar, wat leidt tot ongemak, functionele beperkingen en een vermindering van de kwaliteit van leven van de patiënt.

Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, zijn er innovatieve strategieën voor botherstel ontstaan, met een focus op het verbeteren van osteogenese en regeneratie van botweefsel. Deze benaderingen omvatten het gebruik van implanteerbare, injecteerbare of 3D-printbare botvervangers, die van natuurlijke oorsprong kunnen zijn (bijv. macromoleculen van biologische oorsprong, hydroxyapatiet van dierlijke oorsprong) of synthetisch (bijv. biobrillen, calciumfosfaten)1. Om hun lage inherente vermogen om botregeneratie te begeleiden en te stimuleren te verbeteren, kunnen botvervangers worden belast met osteoinductieve factoren, zoals botmorfogenetische eiwitten (BMP's), om osteogene differentiatie van voorlopercellen te bevorderen en de botvorming te verbeteren.

Botvorming is gebaseerd op de initiële vorming van een collageenmatrix, die vervolgens wordt gemineraliseerd door hydroxyapatietkristallen, waardoor de botstructuur wordt versterkt3. Dit proces verleent specifieke stijfheid en sterkte aan het bot. De kwaliteit van het gemineraliseerde weefsel wordt nauw bepaald door de microstructurele eigenschappen en de mate van mineralisatie4. Deze kwaliteit speelt een cruciale rol bij botgenezing en de functionaliteit van het geregenereerde bot5. Het karakteriseren van botmineralisatie blijft echter een uitdagende taak vanwege de inherente variabiliteit in multivariate studies 6,7,8.

Bovendien worden de eerste evaluaties van de biocompatibiliteit, cytocompatibiliteit en differentiatiepotentieel van bottransplantaatvervangers doorgaans in vitro uitgevoerd. Methodologische verschillen belemmeren echter een naadloze vergelijking van de resultaten. Bovendien geven deze in vitro studies geen volledig beeld van de meercellige interacties en complexe dialoog tussen celpopulaties, waaronder beenmergcellen, die essentieel zijn voor het reguleren van hetbotregeneratieproces. Dit gebrek aan nauwkeurige weergave van de botmicro-omgeving kan de nauwkeurigheid van latere preklinische onderzoeken in gevaar brengen10.

Hoewel in-vivobeoordelingen een nauwkeurigere weergave geven van fysiologische contexten, worden ze beperkt door ethische, logistieke en financiële overwegingen. Bijgevolg spelen ex vivo evaluaties een cruciale rol als interface tussen in vitro en in vivo studies, en dienen ze als een noodzakelijke tussenstap voordat wordt overgegaan tot experimenten op levende proefpersonen 11,12,13.

In deze context is de implementatie van uitgebreide karakteriseringsmethodologieën nodig om de kwaliteit van geregenereerd botweefsel te beoordelen en om de relevantie van de strategie te waarborgen voordat wordt overgegaan op een preklinisch model. Daarom stellen we een protocol voor op basis van de analyse van een explantatiemodel met behulp van schapenkniegewrichtsweefsel. Deze innovatieve methodologie omvat het implanteren van BMP2-geladen cement in de explantaten en het uitvoeren van een gedetailleerde analyse van weefselmineralisatie na 28 dagen cultuur.

De technische benaderingen die in deze studie worden gebruikt, zijn divers en complementair en bieden samen een alomvattende benadering voor het evalueren van de kwaliteit van geregenereerd botweefsel (Figuur 1). Micro-CT-beeldvorming met hoge resolutie maakt gedetailleerde 3D-visualisatie van de botstructuur mogelijk en biedt waardevolle inzichten in de mineraaldichtheid, morfologie en integriteit van het nieuw gevormde weefsel. Deze techniek is cruciaal voor het beoordelen van de werkzaamheid van botregeneratie en het volgen van de progressie van mineralisatie in de loop van de tijd. Nanoindentatie is een nauwkeurige benadering voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van het weefsel, zoals de hardheid en sterkte. Door de reactie van het materiaal op een uitgeoefende kracht op nanometrische schaal te meten, maakt deze methode het mogelijk om de robuustheid en kwaliteit van het gemineraliseerde weefsel te beoordelen. Histologische onderzoeken met behulp van veel voorkomende kleuringen zoals hematoxyline/eosine/saffraan (HES), Goldner's trichroom en Movat's pentachrome bieden onschatbare inzichten in de weefselstructuur en -samenstelling. Deze kleuringen maken differentiatie mogelijk van de verschillende weefselcomponenten, waaronder cellen, extracellulaire matrix en minerale afzettingen, waardoor een uitgebreide kwalitatieve beoordeling van het botregeneratieproces mogelijk wordt. Backscatter scanning elektronenmicroscopie (SEM) mapping biedt een visualisatie met hoge resolutie van het oppervlak van de monsters, waardoor een gedetailleerde analyse van de mate van mineralisatie van de botmatrix mogelijk is, evenals de interfaces tussen het geïmplanteerde materiaal en het gastheerweefsel. Ten slotte geeft Raman-spectroscopie informatie over de moleculaire samenstelling van het weefsel, met name door de identificatie van specifieke componenten zoals eiwitten, lipiden en mineralen. Deze benadering maakt de karakterisering van de gemineraliseerde matrix en de detectie van groeifactoren zoals BMP2 mogelijk, waardoor cruciale informatie wordt verkregen over de persistentie van pro-osteogene stimuli in het regeneratiemedium.

Met behulp van een multidisciplinaire aanpak, waarbij verschillende analytische technieken worden geïntegreerd, heeft onze studie tot doel een grondige en uitgebreide beoordeling van de kwaliteit van geregenereerd botweefsel te bieden, en zo een solide basis te bieden voor de evaluatie van bottransplantaatvervangers en hun mogelijke klinische toepassing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door een commissie voor ethiek en dierenwelzijn en door de Franse Nationale Veterinaire en Voedseladministratie onder nummer G44171.

1. Bereiding en kweek van osteochondrale explantaten

  1. Oogst gezamenlijke exemplaren van schapen van vers geëuthanaseerde dieren in een aseptische omgeving. Leg het schaap in rugligging en scheer de linker achterpoot. Bereid voor door te desinfecteren met alcohol rond het kniegewricht. Gebruik laterale parapatellaire arthrotomie om de voorste en achterste kruisbanden bloot te leggen, gevolgd door patelladislocatie om de dijbeentrochlea te onthullen.
    1. Creëer na het oogsten van weefsel een defect met een diameter van 4,75 mm in de laterale condylus met behulp van een osteochondraal autotransplantaattransfersysteem.
  2. Maak met een orthopedische hamer een defect van 10 mm diep en haal de explantatie uit de condylus. Voer vervolgens een tweede defect met een diameter van 8 mm uit, gecentreerd rond het eerste, met behulp van een osteochondraal autotransplantaattransfersysteem. Dit levert osteochondrale explantaten op van 8 mm x 10 mm, met een centraal defect van 4,75 mm x 10,0 mm.
  3. Indien nodig om logistieke redenen, de explantaten vervoeren in Hank's Balanced Salt Solution (hBSS) aangevuld met 1% penicilline-streptomycine en bewaren bij 4 °C.
  4. Spoel de explantaten 3x af met Fosfaatgebufferde Zoutoplossing (PBS) en injecteer vervolgens het defect van 4,75 mm x 10,0 mm met een calciumfosfaatcement aangevuld met 40 μg/ml BMP2. Bereid het cement voor zoals hieronder beschreven.
    1. Produceer α-tricalciumfosfaat (α-TCP) door warmtebehandeling van apatietische tricalciumfosfaatstaven (isostatische pers bij 120 MPa) bij 1364 °C gedurende ten minste 12 uur, gevolgd door luchtafschrikking14.
    2. Maal de α-TCP-staven in absolute ethanol met een planetaire molenkogel 2x gedurende 5 minuten bij 500 tpm om een fijn poeder van 13,1 ± 1,7 μm te produceren (gemeten met behulp van laserdiffractie, zoals eerder beschreven14).
    3. Steriliseer het α-TCP-poeder door het droog te verhitten op 180 °C gedurende 45 minuten. Bereid het calciumfosfaatcement voor door α-TCP-poeder te mengen met een 2,5% (w/v) Na2HPO4 0,22 μm gefilterde oplossing (vloeistof/poederverhouding van 0,35) gedurende 1 min.
    4. Doe de cementpasta vóór de injectie in een spuit van 3 ml met behulp van een naald van 18 G.
  5. Breng de explantaten na 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) over in een kolf van 25 cm² en voeg voorzichtig 10 ml volledig kweekmedium toe, bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
  6. Bewaar de explantaten tot 28 dagen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en vervang elke 2 dagen het volledige kweekmedium onder een laminaire stromingskap.
  7. Spoel de explantaten 3x af met PBS. Breng ze over in buisjes van 50 ml, voeg 20 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe en houd ze 3 dagen op 4 °C. Spoel de explantaten vervolgens af met PBS en bewaar ze in 70% ethanol voordat u ze vervolgens analyseert.

2. Micro-CT-analyse

  1. Voer microtomografieanalyses uit met behulp van een micro-CT-röntgenfoto. Verkrijg röntgenprojecties met een resolutie van 10,7 μm, met een belichtingstijd van 1200 ms en een aluminiumfilter van 1 mm (80 kV en 125 μA). Gemiddeld drie beelden voor elke rotatiestap van 0,45° om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
  2. Reconstrueer driedimensionale (3D) beelden met behulp van de reconstructiesoftware van de fabrikant na een X/Y-uitlijning met een referentiescan, met de volgende parameters - Gladmaken: 0, Ringartefact: 3, Straalverharding: 35%. Reinig de beeldstapels met beeldverwerkingssoftware en observeer met tweedimensionale (2D) en 3D-visualisatietools.

3. Deep-learning beeldanalyses

  1. Voer beeldsegmentatie uit met behulp van speciale gespecialiseerde software. Gebruik de geïntegreerde segmentatiewizard om een deep-learningmodel te trainen voor bot- en cementdiscriminatie.
  2. Selecteer een representatieve zone (d.w.z. frame) met bot, cement en achtergrond uit de gereconstrueerde micro-CT-beelden. Segmenteer dit eerste frame handmatig met behulp van eenvoudige (bijv. drempelwaarde) of krachtige tools (bijv. propagatie) die door de software worden geleverd.
  3. Genereer een deep learning-model op het tabblad Model en selecteer 3D-Unet-routine in het vervolgkeuzemenu. Definieer de experimentele parameters in vergelijking met de te analyseren afbeeldingen door met de rechtermuisknop op het gegenereerde model te klikken; hier: diepte van 5, patchgrootte 32 x 32, Adadettla-algoritme, pasverhouding van 0,25, datavergroting x10.
  4. Gebruik het gesegmenteerde frame om de deep-learning-routine te trainen (klik op de treinknop), waarvan wordt erkend dat deze relevant is vanwege de snelle en nauwkeurige beeldsegmentatiemogelijkheden 3,15. Zodra de training is voltooid, definieert u een tweede werkzone (frame) en segmenteert u automatisch met behulp van de voorspellingsfunctie.
    1. Pas indien nodig handmatige correctie toe om nauwkeurigere trainingsgegevens te genereren. Train routine nog een keer. Herhaal het proces totdat een bevredigend resultaat is verkregen; Het aantal gegevensvergrotingen neemt geleidelijk af naarmate het aantal trainingsframes toeneemt.
      OPMERKING: De DICE-index die tijdens de modeltraining wordt verstrekt, geeft een indicatie van de nauwkeurigheid van het model (vergeleken met de invoerinformatie), maar is niet voldoende. Bevestiging van de relevantie van het model moet worden uitgevoerd door validatie van de automatisch gesegmenteerde gegevens door 3 onafhankelijke doorgewinterde onderzoekers.
  5. Publiceer het model door op de knop Exporteren te klikken en pas het toe op de volledige micro-CT-dataset door te klikken op Segmenteer > geëxporteerd model > Segmenteer volledige dataset.

4. Inbedding

  1. Dehydrateer de botexplantaten door ze in een glazen injectieflacon van 40 ml te doen met 25 ml dehydratatieoplossing bestaande uit 70% aceton en 30% xyleen. Plaats de glazen flacon op een draaiend wiel gedurende 1 uur bij RT. Herhaal deze stap 3x.
  2. Vervang de dehydratatieoplossing door 25 ml xyleen en plaats de glazen injectieflacon gedurende 1 uur op het draaiende wiel bij RT.
  3. Vervang de xyleenoplossing door 25 ml methylmethacrylaat verrijkt (MMA) met 10% benzoylperoxide (BPO) en 10% dibutylftalaat (DBP). Plaats deze 1 uur op het draaiende wiel bij RT. Herhaal deze stap 2x.
  4. Vervang de MMA-oplossing door 25 ml MMA verrijkt met 10% BPO, 10% DBP en 450 μl N, N-dimethylaniline verdund 1:20 in propaan-2-ol. Plaats de glazen injectieflacon een nacht bij -20 °C. De oplossing wordt gelig.
  5. Plaats de explantatie in een middelgrote inbeddingsvorm en giet de MMA-BPO-DBP-N, N aniline in de vorm. Plaats de vorm in een plastic doos en ventileer gedurende 5 minuten met stikstofstroom. Sluit de doos hermetisch af en plaats deze gedurende 48 uur bij 4 °C voor MMA-polymerisatie en -uitharding.
  6. Verwijder de hars met de explantatie uit de mal en houd deze op 4 °C totdat deze wordt verwerkt voor verdere analyse.

5. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) - kwantitatieve terugverstrooide elektronenbeeldvorming (qBEI)

  1. Snijd het pMMA-blok met de explantatie af met een diamantzaag langs de lange as. Bewaar de eerste helft van het blok voor histologische analyse. Snijd de andere helft verder af om een stuk van 1,5 mm dik te krijgen. Voer de snede uit met 3000 tpm met een snelheid van 3 mm/min.
  2. Slijp het gedeelte met siliciumcarbidepapier met oplopende nummers die overeenkomen met de onderste korrelgrootte: SiC 320 gedurende 10 s, SiC 1000 gedurende 15 s, SiC 2000 gedurende 30 s en SiC 4000 gedurende 30 s.
  3. Polijst het gedeelte met diamantpasta en specifieke kleding: polijstdoek met 3 μm Mol B3 diamantoplossing gedurende 1 minuut en vliesdoek met 1 μm Nap B1 diamantoplossing gedurende 1 min.
  4. Spoel het gedeelte af onder dubbel gedestilleerd water en verwijder diamantdeeltjes met een wattenstaafje. Droog het gedeelte onder stikstofgas.
  5. Carbon smeer het dikke gedeelte (10 nm carbon film dikte) en monteer het op een aluminium stomp met zilververf. Maak een zilverkleurige verfbrug tussen de bovenkant van de sectie en de stomp om de evacuatie van elektronenlading naar de grond mogelijk te maken.
  6. Plaats de stub op het SEM-podium. Plaats naast het monster een controlestomp bestaande uit een Faraday-beker met koolstof-, aluminium- en siliciumstandaarden in de SEM-kamer. Dit zal worden gebruikt om de elektronenbundel te kalibreren en de grijswaarden om te zetten in percentages van Ca. Sluit de SEM-kamer en vacuüm.
  7. Schakel de elektronenbundel in en pas de SEM-parameters aan om in de terugverstrooide elektronenmodus te werken. Op backscatter-afbeeldingen is het grijsniveau van de koolstofstandaard 25, de aluminiumstandaard 225 en de siliciumstandaard 253. Ter indicatie: op het gebruikte systeem zijn SEM-parameters versnellingsspanning 20 keV, sondestroom gemeten met de Faraday-beker: 250 pA, werkafstand: 15 mm, diafragma: 30 μm, beeldresolutie: 1024 x 768 pixels, vacuüm: < 4,10-4 Pa, verblijftijd van 100 μs/pixel, helderheid ~38 en contrast ~72.
  8. Wanneer de SEM is gekalibreerd met de standaarden, maakt u beelden van het monster in de terugverstrooide elektronenmodus.
  9. Gebruik het terugverstrooide elektronenbeeld van het monster om de grijswaarden om te zetten in calciumgehalte, zoals beschreven in Roschger et al.16. Voer dit uit met behulp van beeldanalysesoftware.
  10. Plot de verdeling van het calciumgehalte. De verdeling van het calciumgehalte vertoont een Gaussiaanse verdeling. Er worden drie belangrijke parameters berekend die van belang zijn:Ca-gemiddelde, als het gemiddelde calciumgehalte op het beeld,Ca-piek als de meest voorkomende calciumconcentratie die op het beeld wordt aangetroffen enCa-breedte als de volledige breedte op maximaal de helft van de calciumgehalteverdeling.
    OPMERKING: De reproduceerbaarheid van qBEi is onderzocht door gedurende 5 opeenvolgende dagen hetzelfde interessegebied in beeld te brengen (één acquisitie per dag). Dit betekent dat de elektronenbundel tussen de sessies door werd in- en uitgeschakeld. Het foutenpercentage inCa-gemiddelde,Ca-piek en Cawidth werd geschat op respectievelijk 0,5%, 0,7% en 1,2%. Het calciumgehalte werd ook onderzocht door middel van Energy dispersive X-ray analysis (EDS). Er werd een zeer goede lineaire relatie vastgesteld tussen hetCa-gemiddelde en het door EDS geschatte calciumgehalte met een R²-waarde van 0,99, vergelijkbaar met gegevens die eerder door Roschger et al. waren verkregen17.

6. Histologie

  1. Snijd voor elk monster secties van 7 μm met behulp van een microtoom van hard weefsel met een wolfraammes 18,19. Beitsen met Goldner trichrome, HES en MOVAT beits met behulp van een automatisch kleuringssysteem.
  2. Voor deplastificatie de monsters achtereenvolgens 5 minuten in aceton laten weken en 2x herhalen. Spoel de monsters 5 minuten af in gedestilleerd water en herhaal 2x.
  3. Voer de Goldner Trichrome-kleuring uit zoals hieronder beschreven.
    1. Plaats de monsters gedurende 20 minuten in Weigert ijzerhoudende hematoxyline. Wassen met kraanwater. Dompel de monsters onder in alcohol met een zuur van 0,5% gedurende 30 s-1 min. Wassen met kraanwater gedurende 20 min.
    2. Breng de monsters gedurende 5 minuten aan in Ponceau/fuchsinezuur/azophloxine-oplossing. Dompel onder in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
    3. Kleuring met fosfomolybdinezuur/Oranje G-oplossing gedurende 20 min. Dompel onder in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
    4. Beits met snelle groene oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur of 8 minuten bij 60 °C. Spoel grondig af met kraanwater; Herhaal 3x.
  4. Voer de Movat Pentachrome-kleuring uit zoals hieronder beschreven.
    1. Alcian Blue-kleuring: dompel de monsters 30 minuten onder in Alcian Blue-oplossing. Spoel de monsters gedurende 5 minuten af in kraanwater. Plaats de monsters gedurende 60 minuten in alkalische ethanol. Spoel de monsters gedurende 10 minuten af in kraanwater. Voer een laatste spoeling uit met gedestilleerd water.
    2. Weigert Hematoxyline-kleuring: plaats monsters in Weigert's Ferric Hematoxyline gedurende 20-30 minuten. Spoel de monsters gedurende 15 minuten af in kraanwater. Spoel opnieuw af met gedestilleerd water.
    3. Kleuring met Crocein Brilliant/fuchsinezuur: dompel de monsters gedurende 10 minuten onder in een oplossing van Crocein Brilliant/Acid Fuchsin. Spoel af met 0,5% azijnzuur. Dompel de monsters gedurende 20 minuten onder in een oplossing van 5% fosfotaalzuur. Spoel af met 0,5% azijnzuur gedurende 2 min. Voer drie opeenvolgende spoelingen uit met 100% ethanol, elk gedurende 5 minuten.
    4. Kleuring met Safran du Gatinais: neem de monsters 15 minuten aan in Safran du Gatinais. Voer een laatste spoeling uit met kraanwater.
  5. Voer HES-kleuring uit zoals hieronder beschreven.
    1. Kleuring met Weigert's Hematoxyline: dompel de monsters 30 minuten onder in Weigert's Hematoxyline. Spoel af met kraanwater gedurende 2 min.
    2. Ontkleuring: dompel de monsters gedurende 10 s in zoutzuuralcohol. Spoel af met kraanwater gedurende 2 min.
    3. Neutralisatie: dompel de monsters gedurende 1 minuut onder in een oplossing van lithiumcarbonaat. Spoel af met kraanwater gedurende 2 min. Voer een laatste spoeling uit met gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
    4. Kleuring met Eosine-Erythrosine: plaats de monsters gedurende 3 minuten in een oplossing van Eosine-Erythrosine. Spoel af met kraanwater gedurende 10 s.
    5. Uitdroging: Dompel de monsters 15 s onder in 95% alcohol. Breng over naar 100% alcohol gedurende 15 s. Herhaal de onderdompeling in 100% alcohol gedurende 30 s.
    6. Eindkleuring met alcoholische safeline: dompel de monsters 10 minuten onder in alcoholische saffine. Voer een laatste spoeling uit met kraanwater.
  6. Voer de diamontage uit zoals hieronder beschreven.
    1. Spoel de monsters af in 95% ethanol, dan 100% ethanol, dan methylcyclohexaan en herhaal dit 3x voor elke stap.
    2. Monteer de monsters met behulp van een montagekit en voeg een dekglaasje toe. Scan de afbeeldingen met behulp van een digitale diascanner.

7. Raman microspectroscopie

  1. Gebruik hetzelfde gedeelte dat wordt gebruikt voor Raman-analyse als de SEM. Slijp en polijst het gedeelte kort zoals beschreven in stap 5.2 - 5.3 om de dunne koolstoflaag te verwijderen die is toegevoegd voor SEM en die de warmteafvoer van het monster belemmert.
  2. Plaats de sectie op de tafel van de Raman-microspectrometer. Kalibreer het golfgetal om nauwkeurigheid te garanderen en lijn de laser uit voordat u de meting uitvoert. Aangezien dergelijke procedures specifiek zijn voor elk instrument, worden ze in dit artikel niet beschreven.
  3. Lokaliseer interessante gebieden in het weefsel die moeten worden geanalyseerd. Plaats de te analyseren zone in het midden van de videotool en verzamel Raman-spectra met de volgende parameters: 785 nm laser gebruikt bij 30 mW, tijdstip van integratie: 20 s 3 keer herhaald, spectraal bereik: 350-1800 cm-1, rooster 1200 lijnen/mm.
  4. Verzamel 10 spectra van de inbeddingshars met dezelfde Raman-instellingen en neem het gemiddelde ervan. Gebruik dit om de harsbijdrage in stap 7.6 af te trekken.
  5. Bewerk de spectra als volgt om de bijdrage van fluorescentie, ruis en hars te verwijderen: basislijncorrectie met een polynoom van vijf ordes, Savitzky-Golay-filter met een graad van 4 en een venstergrootte tussen 17 en 21, digitale harsaftrekking met behulp van de ~812 cm-1 piek van de hars. Een dergelijke voorbewerking kan worden uitgevoerd met verschillende software die is ontworpen voor gegevensanalyse en visualisatie.
  6. Analyseer de voorbewerkte spectra verder om waardevolle parameters te extraheren door de piekintensiteit van de betreffende trilling te rantsoeneren met de piekintensiteit van de referentietrilling. Gebruik voor botanalyse bijvoorbeeld de volgende parameters om het te berekenen.
    1. Mineraal-tot-matrix verhoudingen: deel de piekintensiteit van de v1PO4-trillingen bij ~960 cm-1 door de piekintensiteit van de Amide I (~1668 cm-1), amide III (~1250 cm-1), CH2-wag (~1450 cm-1) of de som van de trillingsmodi proline (~854 cm-1) en hydroxyproline (Hyp, ~872 cm-1). De v2PO4, gelegen op ~430 cm-1, of de v4PO4, gelegen op ~600 cm-1, kan ook worden gebruikt en geproportioneerd met de Amide III vibratie20. Deze parameters vertegenwoordigen de mate van mineralisatie van de organische fase van de botmatrix.
    2. Carbonaat/Fosfaat: deel de piekintensiteit van de v1CO3, gelegen op ~1070 cm-1, door de v1PO4. Dit vertegenwoordigt de hoeveelheid type B-carbonaatsubstitutie in het apatietrooster. Hyp/Pro, vertegenwoordigt het hydroxyprolinegehalte, ~1375 cm-1/Amide III, vertegenwoordigt het proteoglycaangehalte, ~1150 cm-1/CH2-wag en ~1495 cm-1/CH2-wag, vertegenwoordigt de hoeveelheid van de geavanceerde glycatie-eindproducten carboxymethylysine en pentosidine, 1670 cm-1/1690 cm-1 en 1670 cm-1/1640 cm-1 vertegenwoordigen respectievelijk de ongeordende secundaire structuur van het collageen, ook bekend als collageenrijpheid, en geordende structuren in de vorm van α-helix in type I collageen.
  7. Evalueer de reproduceerbaarheid van Raman-metingen door hetzelfde interessegebied te onderzoeken in 5 opeenvolgende acquisities (één acquisitie per dag). Voor elke geanalyseerde parameter was de variantie minder dan 0,2% van de parameterwaarde, wat een goede reproduceerbaarheid ondersteunt. De specificiteit van elke onderzochte piek is uitgebreid besproken in het veld, en een overzicht wordt gepresenteerd in de recente review van Unal21.

8. Nano-indrukking

OPMERKING: Vanwege de destructieve aard van nanoindentatie wordt het meestal uitgevoerd aan het einde van de monsteranalyseroutine. Het nanoindentatiesysteem dat wij bezitten is uitgerust met een piramidale Berkovitch-diamantindenter. Er bestaan echter verschillende vormen van indruklichamen en er is geen consensus in de literatuur vastgesteld voor bot- of biomateriaalmonsters.

  1. Hydrateer het ingebedde botmonster gedurende 16 uur in zoutoplossing bij RT voorafgaand aan de nanoindentatietest.
  2. Kalibreer het nanoindentatiesysteem met behulp van gesmolten silica en registreer de resulterende indrukmodulus. Voor gesmolten silica is de indrukmodulus ongeveer 72 GPa met een Poisson-coëfficiënt van 0,17.
  3. Zodra het nanoindentatiesysteem is gekalibreerd, plaatst u het monster dat wordt gebruikt voor Raman-analyses in het optische systeem van het nanoindentatieapparaat om locaties aan te wijzen waar nanoindentatie zal worden uitgevoerd.
    OPMERKING: Deze modaliteit varieert van de ene apparatuur tot de andere; We geven geen details over hoe het nanoindentatiesysteem en de software werken, maar geven algemeen advies over de verschillende stappen die moeten worden uitgevoerd.
  4. Zodra de locatie van nanoindentatie is gekozen, verplaatst u het monster onder het indrukapparaat en voert u de inspringing uit. Voer nanoindentatie uit op een constante diepte van 900 nm, met een laad-/lossnelheid van 40 mm/min en een pauze van 15 s tussen laden en lossen. Stel de Poisson-coëfficiënt voor botweefsel in op 0,3.
  5. Haal de verschillende parameters uit de nanoindentatiecurven en bereken ze volgens de theorie van Oliver en Pharr22.
    1. De indrukmodulus (EIT) is afgeleid van de bekende eigenschappen van de indrukpunt en de gereduceerde modulus en combineert de lokale elastische modulus van het monster. Bereken de inspringing als:
      figure-protocol-1
      Met vs, vi, Ei en Er die de Poisson-coëfficiënt van het monster vertegenwoordigen, verondersteld 0,3 voor bot te zijn, de Poisson-coëfficiënt van het diamantindruklichaam, verondersteld 0,07 te zijn, de elastische modulus van het diamantindruklichaam, vastgesteld op 1140 GPa en de gereduceerde modulus, berekend als:
      figure-protocol-2
      Waarbij S de helling van het lossegment vertegenwoordigt en Ap het geprojecteerde gebied is en als volgt wordt berekend:
      figure-protocol-3
    2. Hardheid (HIT): komt overeen met de botweerstand tegen het ontstaan en de voortplanting van scheuren. Met andere woorden, het is een indicator van bottaaiheid. Bereken HIT als:
      figure-protocol-4
    3. Indrukkingskruipsnelheid (CIT): Dit weerspiegelt de botvervorming in de loop van de tijd bij constante belasting, indicatief voor de visco-elastische eigenschappen van het monster, berekend als:
      figure-protocol-5
    4. Maximale belasting (Lm): Dit komt overeen met de tegengestelde belasting die nodig is om de aangegeven diepte in de gemineraliseerde botmatrix door te dringen.
    5. Indrukkingswerk (Wplast): Dit komt overeen met het gebied onder de vervormingscurve van de belasting/ontlasting. Het is een directe weerspiegeling van de energie die wordt gedissipeerd om plastische vervorming te induceren.
      OPMERKING: De reproduceerbaarheid van nanoindentatie is moeilijker te beoordelen op botmonsters vanwege de destructieve aard van deze methodologie. Desalniettemin hebben we de reproduceerbaarheid van het standaard en uniforme gesmolten silicamonster geschat. Voor alle bovenstaande parameters werd de variantie geschat op minder dan 0,26% (5 opeenvolgende metingen op 5 afzonderlijke dagen), wat een zeer goede reproduceerbaarheid ondersteunt. Aan de andere kant is het vanwege de anisotrope aard van botmonsters moeilijker om hun reproduceerbaarheid te waarderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een micro-CT-beeld van de explantatie is weergegeven in figuur 2. Het gebruik van handmatige segmentatie kan bot niet optimaal scheiden van cement, aanwezig in het centrale kanaal, met behulp van globale drempels. Om de herkenning van trabeculair bot en cement te verbeteren, stellen we voor om deep learning in te zetten. Deep learning is krachtig voor het herkennen van biomateriaalkenmerken en helpt de scheiding tussen bot en cement te verbeteren, waardoor e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Herstel van botdefecten is een grote uitdaging in de regeneratieve geneeskunde om de mobiliteit te herstellen, pijn te verminderen en de kwaliteit van leven van getroffen personen te verbeteren. Het gebruik van explantatiemodellen biedt een aantal voordelen ten opzichte van in vivo studies voor het onderzoek naar het herstel van botdefecten. Naast ethische overwegingen maakt dit model de rigoureuze controle van experimentele omstandigheden en de vermindering van biologische vari...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

We willen de technische faciliteiten bedanken die betrokken zijn bij het verzamelen en verwerken van specimens, waaronder SC3M (SFR François Bonamy (UMS 016), Universiteit van Nantes), SFR ICAT (Universiteit van Angers), BIO3, HiMolA en SC4BIO. Het Inserm UMR_S 1229 RMeS wordt ondersteund door subsidies van de Franse regering via de instellingen Inserm, Nantes Université, Univ Angers en Oniris VetAgroBio. Ook HTL Biotechnology is CL dankbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.20 filtersVWR 28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)Sterican4665120
3 mL syringeHENKE-JECT8300005762
37% hydrochloric acid VWR 1.00317.1000 
Acetic acid (glacial) Sigma A6283 
Acetone VWR 20063-365 
Alcian Blue 8GXVWR 361186
Ammonium hydroxideVWR 318612
Apatitic tricalcium phosphate Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)TV26U 
AzophloxineSigma 210633
Benzoyl peroxideSigma 8.01641.0250
BMP2Medtronic InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein Aldrich 2107507
CTVox Bruker-
DataViewer Skyscan-
Diamond bladeStruersMOD13
Diamond sawStruersAccutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solutionStruers40600379
DiaPro Nap B1 diamond solutionStruers40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)Sigma 102404598
Dibutyl PhtalateChimie-Plus Laboratoires28656
DragonFly software ORS2022.1.0.1231. 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvateThermoFisher Scientific31966-021
Eosine Y- Surgipath Sigma 1002830105
Erythrosin BSigma 102141057
Ethanol absoluteVWR 20820362
Eukitt Dutscher6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O) Merck 1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS) EurobioCVFSVF00
Fuchsine acidMerck 1.05231.0025 
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)BioseraMS01NG100J
HematoxylinSigma 86.118.9 
Isostatic pressNova SuissePmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry MalvernMastersizer 3000
Light greenProlabo 28947135
Lithium carbonateSigma A13149 
MD-Mol polishing clothStruers40500077
MethylcyclohexaneVWR 8.06147.1000 
Methylcyclohexane VWR 8.06147.1000 
Methylcyclohexane VWR 8.06147.1000 
MethylmethacrylateSigma 8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner BrukerSkyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)Sigma 71496
MortarFritsch Pulverisette 6
N,N, DimethylanilinSigma 803060
Nanoindentation stationAnton PaarNHT2
ND-Nap polishing clothStruers40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mmArthrexAR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mmArthrexAR-1981-08S
Orange GRalM15
Paraformaldehyde (PFA)Sigma P6148
Peel-a-way disposable embbedding mouldsPolysciences, Inc18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)ThermoFisher Scientific15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Phosphomolybdic acid Sigma 221856-100 g
Phosphotungstic acidAldrich 12863-5 
Polishing machineSturersDap V
PoupinelMEMMERTTV26U 
Raman microspectrometerRenishawInVia Qontor
Safran du Gâtinais Labonord 11507737
Scanning electron microscopeCarl ZeissEvo LS 10
SEMZeissCarl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papersStruers40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paintElectron microscopy sciences12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standardsMicro-Analysis Consultants Ltd8602
T25

Referenties

  1. Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications. Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).
  2. Tsuji, K., et al. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).
  3. Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. Boneremodeling. Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).
  4. Boivin, G., Meunier, P. J. The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography. Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).
  5. Boivin, G., et al. Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue. Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).
  6. Zanghellini, B., et al. Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone. J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).
  7. Trento, G., et al. formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation. Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).
  8. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  9. Budán, F., et al. Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging. PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).
  10. Hulsart-Billström, G., et al. A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis. Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).
  11. Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation. Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).
  12. Chan, M. E., et al. A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology. Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).
  13. Doke, S. K., Dhawale, S. C. Alternatives to animal testing: A review. Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).
  14. Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. SSRN. , (2024).
  15. Paré, A., et al. Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept. Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).
  16. Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies. Bone. 23 (4), 319-326 (1998).
  17. Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities. Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).
  18. Porter, A., et al. Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses. Sci Rep. 7, 42505(2017).
  19. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707(2010).
  20. Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition. J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).
  21. Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy. Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).
  22. Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).
  23. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  24. Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep. Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).
  25. Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

BotregeneratieMicro-CT-beeldvormingDeep Learning-analyseNano-indentatieHistologisch onderzoekScanning-elektronenmicroscopieRaman-spectroscopieBotvervangingsmiddel
Uitgebreide karakterisering van weefselmineralisatie in een ex vivo model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.