Het huidige protocol beschrijft een stapsgewijs, reproduceerbaar model van eenzijdige ureterobstructie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een onrijp muizenmodel van omkeerbare unilaterale ureterobstructie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Unilaterale ureterobstructie (UUO) is een veel voorkomende oorzaak van chronische nierziekte (CKD), die leidt tot de progressie van interstitiële nierfibrose en uiteindelijk resulteert in onomkeerbare nierschade. De ontlasting van UUO is cruciaal. In de literatuur zijn verschillende diermodellen van omkeerbare unilaterale ureterobstructie (RUUO) opgesteld, die het mogelijk maken om structurele veranderingen en functionele schade te observeren en tegelijkertijd fysiologische en pathofysiologische veranderingen te simuleren na het opheffen van ureterobstructie. In deze studie werd een omkeerbaar obstructiemodel opgesteld in de unilaterale muizenurineleider met behulp van een siliconenbuis. Aanzienlijke nierbeschadiging werd waargenomen voorafgaand aan de verlichting van de obstructie, en gedeeltelijk herstel werd daarna opgemerkt. In tegenstelling tot UUO voorkomt dit model progressieve hydronefrose, wat leidt tot duidelijke pathologische resultaten. Deze eenvoudige chirurgische ingreep vertoont een hoog slagingspercentage en is veelbelovend als een klassiek model voor het onderzoeken van reversibele obstructieve nefropathie en mogelijke behandelingen voor renale interstitiële fibrose. Bovendien biedt het een praktisch platform voor het bestuderen van de mechanismen van herstel van obstructieve nefropathie, niercelregeneratie en weefselremodellering.
Inleiding
Urethrale obstructie draagt significant bij aan renale interstitiële fibrose en chronische nierziekte (CKD), wat mogelijk kan leiden tot onomkeerbare structurele schade en functionele stoornissen in de nier1. Hoewel unilaterale ureterobstructie (UUO) veel wordt gebruikt om nierbeschadiging en CKD te bestuderen, repliceert het niet nauwkeurig de spontane herstelmechanismen die optreden na het verwijderen van een obstructie. Het UUO-model omvat het afbinden van de linker urineleider met hechtingen, wat resulteert in permanente obstructie, ureterverwijding, hydronefrose, compressie van het nierparenchym en corticale verdunning. Histologisch onderzoek toont doorgaans tubulaire dilatatie, tubulaire epitheelcelnecrose, en progressieve interstitiële ontsteking en fibrose2. Dit model onderzoekt voornamelijk renale interstitiële fibrose en onomkeerbaar verlies van nierfunctie als gevolg van aanhoudende obstructie.
Veel nierziekten die in de klinische praktijk worden aangetroffen, zoals obstructie veroorzaakt door ureterstenen of tumoren, zijn echter omkeerbaar. Het omkeerbare unilaterale ureterobstructie (RUUO)-model maakt het gedeeltelijke herstel van de nierstructuur en de urinewegfunctie mogelijk, waardoor uiteindelijk hydronefrose wordt opgelost. Herstel kan worden beoordeeld door middel van beeldvormingstechnieken, histologisch onderzoek en biomarkeranalyse om de vermindering van nierbeschadiging en fibrose3 te kwantificeren. Dit model bootst de herstelfase van obstructieve nefropathie in klinische omgevingen nauwkeurig na en is geschikter dan UUO voor het bestuderen van belangrijke processen zoals ontsteking, immuunresponsen, celregeneratie en weefselremodellering 4,5,6,7,8.
Het RUUO-model stelt onderzoekers in staat om nierherstel en -regeneratie na blessureverlichting te analyseren, waarbij de beperkingen van UUO in dynamische studies worden aangepakt. Door verschillende tijdstippen voor en na obstructie te vergelijken, kunnen onderzoekers moleculaire routes onderzoeken die betrokken zijn bij letsel en herstel, waaronder ontsteking, apoptose, fibrose en regeneratie. Deze benadering verbetert het begrip van renale herstelmechanismen en identificeert potentiële therapeutische doelen 2,3,4,5,8,9,10. Hoewel nierfibrose vaak als onomkeerbaar wordt beschouwd, suggereren klinische observaties dat vroege verlichting van obstructie tijdens de eerste fibrosestadia de ziekteprogressie kan stoppen of zelfs omkeren. Het RUUO-model biedt een waardevol experimenteel platform om dit fenomeen te onderzoeken11.
Bovendien vergemakkelijkt het RUUO-model de studie van fibrose-omkering na verlichting van obstructie, en biedt het inzicht in herstelmechanismen en mogelijke antifibrotische therapieën 3,4. Dit model is dan ook zeer praktisch voor translationeel onderzoek. Het primaire doel van dit experimentele model is het induceren van obstructieve nefropathie door middel van uretercanulatie, gevolgd door gestandaardiseerde verlichting op een vooraf bepaald tijdstip om consistentie te garanderen. Het is geoptimaliseerd voor eenvoud, reproduceerbaarheid en veiligheid, waardoor het een effectief hulpmiddel is voor experimenteel onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze dierstudie voldeed aan de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van het Children's Hospital van de Chongqing Medical University. In totaal werden 27 mannelijke Sprague Dawley (SD) ratten commercieel verkregen en gehuisvest in het Laboratory Animal Center van het Children's Hospital van Chongqing Medical University (SPF, licentienummer: SYXK (Chongqing) 2007-0016). De ratten werden gehouden onder gecontroleerde temperatuuromstandigheden met een licht/donker-cyclus van 12 uur en hadden ad libitum toegang tot voedsel en water.
Het protocol werd uitgevoerd op mannelijke SD-ratten in de leeftijd van 6-8 weken en is van toepassing op ratten van alle leeftijden met bilaterale urineleiders. In deze studie werden vijftien 6 weken oude mannelijke SD-ratten willekeurig toegewezen aan drie groepen: de inheemse groep (n = 5), de UUO-groep (n = 5) en de RUUO-groep (n = 5). Daarnaast werden vijf 8 weken oude SD-ratten (n = 5) opgenomen als een extra controlegroep. Om het RUUO-model vast te stellen, werden 12 ratten gebruikt, waarbij 7 extra ratten werden aangeschaft om rekening te houden met mogelijke risico's zoals intraoperatieve en postoperatieve mortaliteit, chirurgisch falen, onvolledige obstructie en mislukte omkering. Dit zorgde voor een minimum van 5 ratten per groep voor latere analyses.
Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Chirurgisch personeel hield zich aan de protocollen voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder chirurgische maskers, handschoenen en jassen. Voor elke procedure werden steriele chirurgische instrumenten gebruikt die voor en na gebruik werden geautoclaveerd om de steriliteit te behouden. Afvalstoffen, waaronder scherpe voorwerpen en biologische monsters, werden verwijderd in overeenstemming met de protocollen voor het beheer van gevaarlijk afval om besmettingsrisico's te beperken en de veiligheid te waarborgen.
1. Voorbereiding van dieren en instrumenten
- Voer alle procedures uit met behulp van steriele (geautoclaveerde) instrumenten en verbruiksartikelen. Snijd de gesteriliseerde siliconenslang (binnendiameter: 1,5 mm, buitendiameter: 2,5 mm) in segmenten van ongeveer 1 cm. Maak een longitudinale incisie langs één kant van de buiswand voor later gebruik.
- Verdoving de ratten via intraperitoneale injectie van pentobarbital (40 mg/kg) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig voldoende anesthesie door te controleren of er geen reflexreacties zijn, zoals de terugtrekkingsreflex van het pedaal, bij het beknellen van de teen. Breng veterinaire oogzalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de anesthesie te voorkomen.
- Onthar de buik van de rat van de processus xiphoid naar de symfyse van de schaamstreek en strek bilateraal uit tot aan de middellijn.
- Plaats de rat in rugligging op een verwarmd chirurgisch kussen en zet zijn ledematen vast met rubberen touwen.
- Drapeer een steriel gefenestreerd laken om een steriel veld te behouden. Bereid de huid voor met een povidon-jodiumoplossing. Maak een incisie in de middellijn van de huid langs de buik, die zich uitstrekt van het subxiphoïde gebied tot net onder de navel, om voldoende blootstelling van de nieren en bovenste urineleiders te bieden.
- Snijd de onderhuidse weefsels en fascia langs de middellijn in met behulp van een chirurgische schaar. Ontleed de huid en de onderliggende weefsels minutieus laag voor laag en leg de retroperitoneale ruimte volledig bloot met behulp van een weefseltang.
2. Obstructieve chirurgie voor omkeerbare unilaterale ureterobstructie
- Trek de darm terug naar de rechterkant van de buikholte met behulp van een steriel wattenstaafje om directe visualisatie van de linker urineleider te vergemakkelijken. Bedek de urineleider met met zoutoplossing doordrenkt gaas om uitdroging te voorkomen.
- Ontleed en mobiliseer de linker urineleider met behulp van een microscopisch kleine tang, waarbij ongeveer 1,5 cm van de omliggende weefsels wordt vrijgemaakt.
- Plaats een 1 cm lange siliconen slang (binnendiameter: 1,5 mm, buitendiameter: 2,5 mm) onder de bevrijde urineleider. Gebruik een tang om ervoor te zorgen dat de buis volledig wordt omhuld.
- Ligate de siliconenslang en het middelste gedeelte van de urineleider met behulp van 3-0 zijdedraad om ureterobstructie te induceren. Vermijd overmatige ligatiekracht. Trek de siliconenslang geleidelijk langs de lengteas van de urineleider om een veilige maar niet-glijdende ligatie te garanderen.
- Verplaats de darm voorzichtig in de peritoneale holte en zorg voor een goede uitlijning zonder spanning of obstructie.
- Hecht de buikspier en fasciale lagen met behulp van een 2-0 niet-resorbeerbare hechtdraad met een gebogen snijnaald op een continue manier om voldoende treksterkte te bieden. Sluit de huid af met een 4-0 niet-resorbeerbare hechtdraad, die zorgt voor anatomische uitlijning en gelijkmatige spanning om genezing te bevorderen en het risico op wonddehiscentie te minimaliseren.
- Desinfecteer de incisieplaats met povidon-jodiumoplossing. Laat de ratten 7 dagen lang onder gecontroleerde omstandigheden bij een constante temperatuur herstellen.
3. Noodoperatie van omkeerbare unilaterale ureterobstructie
- Bereid de nodige dieren en instrumenten voor en zorg voor een steriele opstelling voor het heropenen van de buik en volledige blootstelling van de buikholte.
- Ontleed de knoop van de siliconenbuis voorzichtig met behulp van een scalpelmesje. Verwijder de buis en irrigeer de buikholte met een normale zoutoplossing om hechting en infectierisico te minimaliseren.
- Verplaats de darm en hecht de incisie in de buikwand in lagen met behulp van 4-0 niet-resorbeerbare hechtingen. Steriliseer de incisieplaats met povidon-jodiumoplossing. Plaats de rat in een omgeving met gecontroleerde temperatuur gedurende een postoperatieve herstelperiode van 7 dagen.
- Verdoof de ratten op dag 14 na de operatie (volgens de procedure vermeld in stap 1.2) en verzamel niermonsters door de nieren dwars in twee helften te snijden9.
- Bewaar de ene helft in 4% paraformaldehyde voor histopathologisch onderzoek en vries de andere helft snel in vloeibare stikstof in voor opslag bij -80 °C voor daaropvolgende moleculaire analyse. Verzamel bloedmonsters voor biochemische analyses.
- Voer euthanasie uit via CO2 -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie volgens ethische richtlijnen.
4. Vervolg assessments
- Volg het lichaamsgewicht na RUUO om het algehele herstel te beoordelen. Vergelijk gewichtsveranderingen met de controle- en UUO-groepen.
- Meet het niergewicht en het niervolume om het herstel van de nieren te evalueren.
- Controleer de serumcreatininespiegels (Scr) als indicator voor verbetering van de nierfunctie9.
- Injecteer methyleenblauw in het nierbekken om de doorgankelijkheid van de ureter te bevestigen. Observeer de peristaltiek en kleur van de ureter om het herstel na obstructie te beoordelen.
- Voer H&E-kleuring uit om de tubulaire integriteit en nierstructuur te beoordelen na RUUO 8,10.
- Voer de trichrome kleuring van Masson uit om de regressie van interstitiële fibrose in de nier te evalueren 8,10.
- Vergelijk nierschadescores 3,8 tussen de UUO- en RUUO-groepen om weefselherstel te kwantificeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De effecten van UUO en de daaropvolgende afgifte (RUUO) op het lichaamsgewicht, het niergewicht, het niervolume en de serumcreatininespiegels (Scr) werden geëvalueerd, zoals samengevat in tabel 1. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), met n = 5 per groep.
Na 6 weken vertoonde de inheemse groep een gemiddeld lichaamsgewicht van 234 g ± 16 g, een niergewicht van 0,9107 g ± 0,0475 g en een niervolume van 0,8962 c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit model maakt gebruik van een siliconenbuis om de urineleider te omcirkelen en structurele ondersteuning te bieden, gevolgd door ligatie met een zijden draad om volledige ureterobstructie door compressie te induceren. Na zeven dagen worden de ligatie en de siliconenslang verwijderd om nierdecompressie en het herstel van de integriteit en functionaliteit van de urinewegen te vergemakkelijken.
Siliconenslangen, vervaardigd uit siliconenelastomeren, bieden uits...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Program for Youth Innovation in Future Medicine, Chongqing Medical University (W0056), Chongqing Science and Health Joint TCM Technology Innovation and Application Development Project (2020ZY023877).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Forceps | Shanghai Medical Devices Co.,Ltd | 20220032 | |
| Gaasjes | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20172140152 | |
| Hematoxyline en Eosine Färbekit | Solarbio | G1120 | |
| Insuline naalden | KDL Medical Devices | 20193140938 | |
| Massons Trichrome Färbekit | Solarbio | G1340 | |
| Medische katoenen bolletjes | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20170037 | |
| Medische katoenen staafjes | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20172140026 | |
| Methyeenblauw | Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory | 14038-43-8 | |
| Microscopische forceps | Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd | S50985 | |
| Naaldhouders | Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd | S7005 | |
| Povidon-jodium oplossing | Sichuan Kelun Co., Ltd | 514001 | |
| Zoutoplossing | Sichuan Kelun Co., Ltd | 20220004 | |
| SD-ratten | SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd | D025 | |
| Siliconen slang | Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd | CS356 | |
| Zijdedraad | Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd | SA84G | |
| Chirurgisch mesje | Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd | CE0434 | |
| Chirurgische schaar | Shanghai Medical Devices Co.,Ltd | J21130 | |
| Spuit | Tongmai medical devices | 20183140304 | |
| Weefselforceps | Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd | J36030 |
Referenties
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ t cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836989(2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Aranda-Rivera, A. K., et al. Sulforaphane protects from kidney damage during the release of unilateral ureteral obstruction (RUUO) by activating nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (nrf2): Role of antioxidant, anti-inflammatory, and antiapoptotic mechanisms. Free Radic Biol Med. 212, 49-64 (2024).
- Narváez Barros, A., et al. Reversal unilateral ureteral obstruction: A mice experimental model. Nephron. 142 (2), 125-134 (2019).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3623-3630 (2005).
- Kaeidi, A., et al. The therapeutic approaches of renal recovery after relief of the unilateral ureteral obstruction: A comprehensive review. Iran J Basic Med Sci. 23 (11), 1367-1373 (2020).
- Liu, Y., et al. A porcine model of relief of unilateral ureteral obstruction: Study on self-repairing capability over multiple time points. Mol Cell Biochem. 419 (1-2), 115-123 (2016).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Chevalier, R. L., Kim, A., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T. Recovery following relief of unilateral ureteral obstruction in the neonatal rat. Kidney Int. 55 (3), 793-807 (1999).
- Hesketh, E. E., et al. A murine model of irreversible and reversible unilateral ureteric obstruction. J Vis Exp. (94), e52559(2014).
- Klahr, S., Morrissey, J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 283 (5), F861-F875 (2002).
- Jin, B., et al. Loss of men1 leads to renal fibrosis and decreases HGF-ADAMTS5 pathway activity via an epigenetic mechanism. Clin Transl Med. 12 (8), e982(2022).
- Fischer, N. G., He, J., Aparicio, C. Surface immobilization chemistry of a laminin-derived peptide affects keratinocyte activity. Coatings (Basel). 10 (6), 560(2020).
- Song, J., et al. Losartan accelerates the repair process of renal fibrosis in UUO mouse after the surgical recanalization by upregulating the expression of tregs. Int Urol Nephrol. 51 (11), 2073-2081 (2019).
- Song, J., et al. Regulatory t cells accelerate the repair process of renal fibrosis by regulating mononuclear macrophages. Am J Med Sci. 361 (6), 776-785 (2021).
- Yao, Y., et al. Interferon-γ improves renal interstitial fibrosis and decreases intrarenal vascular resistance of hydronephrosis in an animal model. Urology. 77 (3), e768-e761.e713 (2011).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Chang, A. Y., Cachat, F., Lackey, A. Recovery from release of ureteral obstruction in the rat: Relationship to nephrogenesis. Kidney Int. 61 (6), 2033-2043 (2002).
- Lucarelli, G., et al. Delayed relief of ureteral obstruction is implicated in the long-term development of renal damage and arterial hypertension in patients with unilateral ureteral injury. J Urol. 189 (3), 960-965 (2013).
- Ito, K., et al. Renal damage progresses despite improvement of renal function after relief of unilateral ureteral obstruction in adult rats. Am J Physiol Renal Physiol. 287 (6), F1283-F1293 (2004).
- Song, J., et al. A modified relief of unilateral ureteral obstruction model. Ren Fail. 41 (1), 497-506 (2019).
- Morrissey, J., et al. morphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function. J Am Soc Nephrol. 13 (suppl_1), S14-S21 (2002).
- Ulm, A. H., Miller, F. An operation to produce experimental reversible hydronephrosis in dogs. J Urol. 88, 337-341 (1962).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (2), F357-F364 (2010).
- Forni, L. G., et al. Renal recovery after acute kidney injury. Intensive Care Med. 43 (6), 855-866 (2017).
- Varela, S., Omling, E., Borjesson, A., Salo, M. Resolution of hydronephrosis after pyeloplasty in children. J Pediatr Urol. 17 (1), e101-e102.e7 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
