Het onderzoek werd uitgevoerd in het kader van een door de IACUC goedgekeurd protocol voor het gebruik van dieren in een door AAALAC International geaccrediteerde faciliteit met een Public Health Services Animal Welfare Assurance en in overeenstemming met de Animal Welfare Act en andere federale statuten en voorschriften met betrekking tot proefdieren. Alle benodigdheden die voor deze procedure nodig zijn, staan vermeld in de materiaaltabel. De procedure is onderverdeeld in zeven componenten.
VOORZICHTIGHEID. Zorg ervoor dat de juiste veiligheidsprotocollen worden gevolgd bij het werken met vloeibare stikstof om weefsel te homogeniseren. Het laboratoriumpersoneel droeg diepvrieshandschoenen, een diepvriesschort, een chirurgisch gezichtsmasker en een gelaatsscherm tijdens de homogenisatie van bevroren weefsel. Deze homogenisatietechniek kan worden gebruikt voor elk weefseltype, inclusief extreem taaie stoffen zoals bot, simpelweg door de grootte van de vijzel en stamper dienovereenkomstig aan te passen. Zie afbeelding 1A voor de eerste opstelling van de werkbank. Raadpleeg de materiaaltabel voor de maten die worden gebruikt bij het homogeniseren van muizen- en frettenweefsels.
1. Cryogeen malen van weefsels met een vijzel en stamper
- Neem het gewicht van een lege opvangbuis en noteer het. Weeg in de verzamelbuis het weefsel met behulp van een analytische balans en noteer het gewicht in een laboratoriumnotitieboekje. Trek het gewicht van een lege buis af van het weefsel plus het gewicht van de buis om de mg gebruikt weefsel te krijgen.
OPMERKING: De weefsels die zijn beoordeeld voor proteomische onderzoeken zijn onder meer hersenen, longen, lever en milt. Het hele weefsel werd cryogeen vermalen tot poedervorm met behulp van een vijzel en stamper.
- Giet vloeibare stikstof in de cryopod, maar zorg ervoor dat deze voor minder dan de helft gevuld is.
- Breng de buis met het monster en de lege, eerder geautoclaveerde microcentrifugebuis(en) van 1,5 ml over op het buizenrek in de cryopod. Dit zorgt ervoor dat het monster bevroren blijft tijdens het afkoelen van de vijzel en stamper, waardoor wordt voorkomen dat het monster ontdooit wanneer het gehomogeniseerde weefsel in de lege microcentrifugebuis(en) van 1,5 ml wordt overgebracht.
- Giet vloeibare stikstof op de vijzel en stamper om deze instrumenten voor gebruik af te koelen. De vijzel en stamper zitten buiten de cryopod (Figuur 1A,B).
- Breng het weefsel over in de afgekoelde mortel met vloeibare stikstof (Figuur 1B).
- Oefen herhaaldelijk druk uit op het bevroren weefsel met behulp van de stamper en maak een roterende, slijpende beweging met de stamper tegen het weefsel totdat het weefsel is vermalen tot een fijn poeder (Figuur 1C).
- Zorg ervoor dat er geen overmatige kracht wordt uitgeoefend, dit loopt het risico dat er monsters uit de mortel lopen. Zorg ervoor dat je de stamper goed onder controle hebt.
- Voeg extra vloeibare stikstof toe aan de mortel terwijl u grote weefsels homogeniseert om de kans te verkleinen dat het monster ontdooit tijdens het malen.
- Controleer tijdens het slijpen van het weefsel of het niet ontdooit. Als het aan het ontdooien is, doe dan extra vloeibare stikstof in de mortel.
- Dompel de uiteinden van de metalen spatels in de vloeibare stikstof om ze af te koelen. Dit helpt om het gehomogeniseerde weefsel gemakkelijk over te brengen in de buis van 1,5 ml. Dit voorkomt dat het weefsel tijdens de overdracht ontdooit en aan de spatel blijft plakken.
- Zodra het weefsel is gehomogeniseerd tot een fijn poeder en de metalen spatels zijn afgekoeld, brengt u het gehomogeniseerde weefselpoeder voorzichtig over in de nieuwe buisjes van 1,5 ml.
- Splits het monster op in aliquots, afhankelijk van het aantal tests dat moet worden voltooid.
OPMERKING: Er moesten bijvoorbeeld vier tests worden uitgevoerd voor de monsters in dit onderzoek, dus het gehomogeniseerde weefsel werd gelijkelijk verdeeld in vier buisjes van 1,5 ml.
- Bewaar eventueel extra gehomogeniseerd weefsel in een geautoclaveerde 5 ml snap-top opvangbuis.
- Bewaar de gedoseerde weefsels in een vriezer van -80 °C tot toekomstige analyse, met een realistisch gebruik binnen 1 jaar om lucht en lichte oxidatie van eiwitten te minimaliseren.
- Weeg de lege opvangbuis.
- Trek het gewicht van de lege verzamelbuis af van de eerste meting (verzamelbuis plus monster) om het gewicht van het weefselmonster te verkrijgen.
2. Weefsellysis voor eiwitisolatie
- Schep droogijs in een ijspancontainer.
- Plaats een buizenrek in het droogijs en laat het afkoelen.
- Haal de gehomogeniseerde weefselmonsters uit de vriezer van -80 °C en plaats ze in het gekoelde buisrek. Dit voorkomt dat de monsters ontdooien, wat tijdens het weegproces zou kunnen leiden tot eiwitafbraak en/of veranderingen in de fosforylering.
- Zorg ervoor dat de buisjes van 1.5 ml met het monster bevroren blijven op het buizenrek in droogijs.
- Plaats een nieuwe canonieke buis van 50 ml in het droogijs.
- Verwijder de dop van de canonieke buis van 50 ml en plaats plastic wegwerpspatels in de canonieke buis van 50 ml om ze koel te houden. Dit voorkomt dat het monster aan de spatels blijft plakken tijdens hun overdracht naar de homogenisatiebuizen.
- Gebruik voor weefsellyse en eiwitisolatie buisjes van 2 ml met vijf keramische kralen van 2,8 mm (in dit protocol homogeniserende buisjes genoemd).
- Label de dop en de zijkant van de homogenisatiebuis met de monster-ID met behulp van een markeerpen met permanente inkt.
- Plaats de geëtiketteerde, homogeniserende buizen in het buizenrek in het droogijs om de buizen koud te houden en te voorkomen dat het monster ontdooit.
- Plaats een homogenisatiebuis op een analytische weegschaal en tarra de weegschaal.
- Plaats de homogeniseerbuis terug in het buizenrek op droogijs.
- Verwijder het deksel van de homogenisatiebuis met de korrels en breng met behulp van een van de afgekoelde plastic spatels 5 tot 10 mg weefselmonster in poedervorm over in de betreffende homogenisatiebuis.
- Plaats het deksel terug op de homogenisatiebuis.
- Weeg de homogenisatiebuis op de analytische balans en noteer de hoeveelheid monster in de homogenisatiebuis.
- Gebruik dit gewicht om de hoeveelheid lysisbuffer te bepalen die nodig is voor een effectieve totale eiwitextractie.
- Zodra het gewicht is geregistreerd, plaatst u de homogenisatiebuis met het monster terug in het buizenrek op droogijs om het koud te houden.
- Gooi de gebruikte plastic spatel weg.
- Gebruik een nieuwe, schone plastic spatel voor elk monster dat moet worden overgebracht en gewogen om kruisbesmetting te voorkomen. Herhaal stap 2.9 tot en met 2.15 voor alle monsters.
- Nadat u alle monsters in individuele homogenisatiebuizen hebt overgebracht, berekent u de benodigde hoeveelheid Protein Lysis Master Mix.
- Bereid het vereiste volume Protein Lysis Master Mix voor, dat wordt berekend op basis van het aantal monsters dat moet worden verwerkt en het gewicht van elk monster in poedervorm. Voeg 100 μL Protein Lysis Master Mix per 5 mg tissue toe aan elke tube.
- Raadpleeg de bedrijfsrichtlijnen voor reagensvolumes om de Protein Lysis Master Mix te maken (zie Materiaaltabel).
- Plaats de homogenisatiebuizen met de gehomogeniseerde monsters in poedervorm in een koud blok van 4 °C. De homogenisatoren kunnen niet meer op droogijs blijven liggen. Door de homogenisatiebuizen op het koude blok te plaatsen, wordt voorkomen dat de lysisoplossing bevriest.
- Verwijder het deksel van de homogenisatiebuisjes en breng de berekende hoeveelheid Protein Lysis Master Mix die nodig is over in de betreffende homogenisatiebuis met behulp van de pipet met de juiste capaciteit.
- Plaats het deksel terug op de homogeniseerbuizen en draai de deksels totdat ze goed vastzitten.
- Plaats de monsterbuisjes in de homogenisator en stel deze in op een programma voor zacht weefsel (snelheid 4500 RPM, 2 x 30 s per cyclus, 30 s pauze) bij 4 °C voor homogenisatie.
- Zodra de homogenisatiecyclus is voltooid, verwijdert u de buizen uit het instrument en plaatst u ze terug in het koude blok van 4 °C.
- Inspecteer de monsterbuisjes visueel. Zorg ervoor dat er geen poedermonster meer zichtbaar is. Als het monster nog steeds zichtbaar is tijdens de Protein Lysis Master Mix, voltooit u de weefsellysis opnieuw op het instrument.
- Optimaliseer de instellingen voor het type weefsel dat wordt gebruikt. Weefsel in poedervorm afkomstig van vezelige organen (bijv. hart) kan bijvoorbeeld extra cycli of een hoger toerental nodig hebben.
- Breng de homogenisatiebuizen over in een centrifuge. Voer de volgende instellingen in op de centrifuge: 16.000 g gedurende 10 minuten bij 4 °C en druk op Start op de centrifuge.
- Zodra het centrifugeren is voltooid, brengt u de homogenisatiebuizen voorzichtig terug in het koude blok van 4 °C.
- Label nieuwe tubes van 1.5 ml op het deksel en de zijkant met de monster-ID en alle andere relevante informatie. Eenmaal geëtiketteerd, plaatst u deze tubes van 1,5 ml in een koud blok van 4 °C.
OPMERKING: De buisjes waren gelabeld met ten minste het volgende: dier-ID, studietijdstip, diertype en weefseltype.
- Breng het overeenkomstige eiwitlysaat van de homogenisatiebuizen over naar de respectievelijke geëtiketteerde buisjes van 1,5 ml die op een koud blok van 4 °C worden bewaard.
- Bewaar monsters bij -80 °C voor verdere analyse. Dit is een veilige stopplaats.
3. Kwantificering van het totale eiwit
- Haal de monsters uit de vriezer van -80 °C en ontdooi de monsters op nat ijs in een ijsemmer.
- Eenmaal ontdooid, vortex je alle monsters en standaarden uit de eiwitkwantificeringskit gedurende ten minste 3 s.
- Voeg 10 μL van elke replicaat van standaard, monsters en geschikte blanco's toe aan een microtiterplaat met 96 putjes op basis van de schematische lay-out (Figuur 2A).
OPMERKING: Voor elk weefselmonster wordt in de eiwittestanalyse een verdunning van 1:100 van het eiwitlysaat in bij voorkeur fosfaatgebufferde zoutoplossing gebruikt. De schematische lay-out kan worden gewijzigd afhankelijk van het aantal monsters dat in de eiwittest wordt gebruikt. De monsters, standaarden en geschikte blanco's worden in drievoud in een microtiterplaat met 96 putjes geladen om de nauwkeurigheid van de eiwitconcentratie te beoordelen, maar als er veel monsters op een plaat moeten passen, zijn duplicaten acceptabel.
- Voor de monsters met een lage hoeveelheid startweefsel (d.w.z. minder dan 5 mg), gebruikt u slechts een enkele replicaat of duplicaten voor de eiwittest om de hoeveelheid eiwitlysaat die beschikbaar is voor de daaropvolgende eiwitvertering te maximaliseren.
- Zorg ervoor dat nauwkeurig pipetteren en gekalibreerde pipetten worden gebruikt.
- Keer de fles met eiwittestreagens meerdere keren om om goed te mengen en giet deze vervolgens in een reagensreservoir van 10 ml.
- Voeg met behulp van een meerkanaalspipet met een maximale capaciteit van 200 μl 150 μl van het eiwittestreagens toe aan kolom 1.
- Pipetteer meerdere keren op en neer om het eiwitanalysereagens te mengen met de 10 μL inhoud die zich al in de put bevindt om neerslag in de putjes te helpen verminderen.
- Gooi de pipetpunten weg en plaats nieuwe punten op de meerkanaalspipet met maximale capaciteit van 200 μl.
- Herhaal stap 3.5-3.7 totdat het eiwitanalysereagens is toegevoegd aan de volledige plaat met 96 putjes.
- Gebruik verse pipetpunten voor elke kolom putjes om kruisbesmetting te voorkomen.
- Zorg ervoor dat ten minste één putje leeg blijft en dat er geen reagentia of monster worden toegevoegd om te gebruiken als blanco absorptiewaarde voor eiwitkwantificering.
- Zodra het eiwitanalysereagens aan alle benodigde putjes is toegevoegd, bedek u de plaat met 96 putjes met een aluminiumfolieplaatafdichting.
- Vortex de plaat met 96 putjes op een vortexinstrument gedurende 1 minuut op gemiddelde snelheid en incubeer deze vervolgens 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) voordat u de plaat leest.
- Inspecteer de plaat met 96 putjes en de afdichting van aluminiumfolie. Als het reagens aan de aluminiumfolieafdichting blijft kleven, plaats het dan met een geschikte balans in een centrifuge.
- Houd de snelle centrifuge ingedrukt tot deze ongeveer 200 g bereikt.
- Haal de plaat met 96 putjes eruit en inspecteer de aluminiumfolieafdichting visueel om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof op de folie achterblijft.
- Verwijder langzaam de aluminiumfolieafdichting en plaats het doorzichtige deksel terug op de plaat met 96 putjes (Figuur 2B).
- Lees de plaat met 96 putjes af op een spectrofotometer bij 660 nm, nadat u de colorimetrische reactie gedurende 5 minuten hebt laten ontwikkelen.
OPMERKING: De absorptiemetingen met behulp van een UV/zichtbare spectrofotometer worden gemeten bij kamertemperatuur. De 660-nm eiwittest is gebaseerd op de binding van een gepatenteerd kleurstof-metaalcomplex aan eiwit in zure omstandigheden dat een verschuiving veroorzaakt in het absorptiemaximum van de kleurstof, dat wordt gemeten bij 660 nm.
- Gebruik de extinctiemetingen van de bekende standaarden om de standaardcurve te maken met behulp van grafische software (Figuur 2C-E), die verder wordt toegepast om de eiwitconcentraties voor alle monsters te berekenen.
4. Eiwit vertering
VOORZICHTIGHEID. Zorg ervoor dat de juiste veiligheidsprotocollen worden gevolgd bij het werken met de gevaarlijke chemicaliën die in het onderstaande protocol worden gebruikt. Het laboratoriumpersoneel droeg persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en voltooide deze stappen in een chemische zuurkast. Bekijk alle veiligheidsinformatiebladen voordat u met deze chemicaliën gaat werken.
- Label een nieuwe set microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met de monster-ID's op het deksel en de zijkant van de buisjes in permanente inkt. Voeg alle andere relevante informatie toe.
- Bereken op basis van de standaardcurvevergelijking, de monsterextinctiemetingen en de verdunningsfactor de eiwitconcentratie van elk monster in microgram per microliter (μg/μL). Gebruik deze waarde om het vereiste volume van het monsterlysaat te berekenen dat 100 μg eiwit bevat (Figuur 2C-E). Breng dit berekende volume monsterlysaat over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Vul het uiteindelijke volume aan tot 100 μl met de lysisbuffer; Dit is het startvolume dat nodig is voor het verteringsprotocol.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van het eiwitmonster plus lysisbuffer moet gelijk zijn aan 100 μL.
- Gebruik volgens eerder gepubliceerde literatuur 1,5 μL van het plasma voor de spijsvertering, wat ongeveer gelijk is aan 100 μg eiwit.
- Voeg 50 μL reductieoplossing (10 mM dithiothreitol) toe aan elke microcentrifugebuis van 1,5 ml, sluit de toppen en draai kort gedurende 3 s. Voeg vervolgens 50 μL alkyleringsoplossing (30 mM jodoacetamide) toe aan elk monster, sluit de toppen en vortex gedurende 3 s.
- Incubeer de monsters gedurende 11 minuten bij 95 °C met behulp van een warmteblok om het eiwitmonster te verkleinen en te alkyleren. Dit splitst alle disulfidebruggen en bedekt ze met een acetamidegroep, waardoor hun reformatie wordt voorkomen, en zo het eiwit denatureert in een volledig ontvouwde toestand en de blootstelling van peptideverteringsplaatsen wordt gemaximaliseerd.
- Verwijder na de incubatie de monsters uit het warmteblok en laat ze afkoelen tot RT.
- Terwijl u wacht tot de monsters zijn afgekoeld, reconstitueert u de gelyofiliseerde trypsine/Lys-C proteasemix (verhouding 1:1, elk 50 μg) met enzymreconstitutieoplossing door 515 μl van de vloeistof toe te voegen aan 1 injectieflacon van het vaste reagens, d.w.z. elk 0,1 μg/μl. Vermijd direct huidcontact met de proteaseoplossing en alle stappen daarna, aangezien trypsine een ernstige irriterende stof en allergeen kan zijn.
- Zodra de monsters zijn afgekoeld tot RT, voegt u 50 μl gereconstitueerde trypsine/Lys-C Protease Mix (elk 2,5 μg) toe aan de gereduceerde en gealkyleerde eiwitmonsteroplossing en vortex kort.
- Incubeer op een thermomixer bij 37 °C en stel gedurende 3 uur in op 1000 tpm om het eiwitmonster te verteren.
OPMERKING: Het Lys-C-protease is inbegrepen om te helpen bij het splitsen van plaatsen die resistent zijn tegen vertering door trypsine, als gevolg van vouwing of aminozuursequentie (bijv. Lys-Pro-bindingen). Dit reduceert niet alleen elk eiwit tot talrijke kenbare peptiden van een redelijk kleine omvang en totale lading, maar is ook zeer reproduceerbaar als dezelfde verteringsomstandigheden nauwlettend worden gevolgd. De incubatietijd van 3 uur tijdens de spijsvertering is de minimale tijd die we aanbevelen om de volledige splitsing van alle eiwitten te garanderen.
- Haal na de incubatie van 3 uur met een tang uit de thermomixer om brandwonden aan uw vingers te voorkomen.
- Voeg 50 μL Digestion Stop Solution (6% trifluorazijnzuur of mierenzuur in water) toe aan het monster en draaikolk kort.
OPMERKING: Dit remt de reactie, aangezien de twee proteasen maximale activiteiten hebben bij een neutrale pH van 7-8.
- Bewaar monsters in een vriezer van -80 °C, omdat dit ook de resterende protease-activiteit stopt. Dit is een veilige stopplaats.
5. Peptiden opruimen, drogen en resuspenseren
OPMERKING: Deze procedure is voornamelijk bedoeld om de spijsverteringsreagentia te verwijderen, met name niet-vluchtige zouten, die het LC/MS-MS-instrument gemakkelijk kunnen beschadigen, en om de geproduceerde peptiden te helpen isoleren en concentreren. Het opruimen van peptiden wordt bereikt met behulp van door een kit geleverde ontzoutingsspinkolommen, die vooraf zijn verpakt met een hars zonder grootte (gelfiltratie) die in eerste instantie de peptiden opvangt en vervolgens vooral zouten doorspoelt. Volledige overdracht van de kitreagentia naar de spinkolommen in een chemische zuurkast, omdat ze giftige organische oplosmiddelen bevatten.
VOORZICHTIGHEID. Zorg ervoor dat de juiste veiligheidsprocedures, waaronder het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en voorschriften voor het insluiten van gevaarlijk afval, worden gevolgd bij het werken met de gevaarlijke chemicaliën in het onderstaande protocol. Voltooi deze stappen in een chemische zuurkast en bekijk alle veiligheidsinformatiebladen voordat u met deze chemicaliën gaat werken.
- Haal de monsters uit de vriezer van -80 °C en laat de monsters naar RT komen.
- Verwijder de witte dop onderaan de Peptide Clean-Up-kolom, maak de groene dop los en plaats deze in een opvangbuis van 2 ml.
- Plaats deze in de centrifuge, sluit het deksel, druk op start en centrifugeer gedurende 3000 minuten op 2 g om alle conditioneringsvloeistof vóór verzending te verwijderen.
- Gooi de doorstroom weg in een container voor gevaarlijk afval en plaats de peptide-opruimkolom in een nieuwe verzamelbuis van 2 ml.
- Label de groene deksels van de peptide-opruimkolom met de voorbeeld-ID's met behulp van een permeant inktmarkeerpen.
- Breng het eiwitdigestaatpreparaat, dat ongeveer 300 μL in volume is, voorzichtig over naar de droge peptide-opruimkolom, met behulp van een pipet van 200 μL (bijv. tweemaal 150 μL).
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden waargenomen aan de bovenkant van de hars van de spinkolom. Als er luchtbellen worden waargenomen, verwijder dan de luchtbellen door zachtjes op de kolom te tikken of door een schone pipetpunt van 10 μl te gebruiken om de luchtbel(s) te verspreiden.
OPMERKING: Ingesloten luchtbellen kunnen de soepele overgang van het monster naar de hars belemmeren en zo de efficiëntie van het opruimen en de opbrengst van peptiden negatief beïnvloeden.
- Plaats deze in de centrifuge, sluit het deksel, druk op Start en centrifugeer 2 minuten op 1.500 g .
- Gooi de doorstroom weg in een container voor gevaarlijk afval en plaats de peptide-opruimkolom in een nieuwe verzamelbuis van 2 ml.
- Voeg 300 μL van de wasoplossing A (water, 0,1% trifluorazijnzuur / TFA) toe aan de kolomhars, opnieuw met behulp van een pipet van 200 μL.
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden waargenomen aan de bovenkant van de hars van de spinkolom. Als er luchtbellen worden waargenomen, verwijder dan de luchtbellen door zachtjes op de kolom te tikken of gebruik een schone pipetpunt van 10 μl om de luchtbel(s) te verspreiden.
- Plaats deze in de centrifuge, sluit het deksel, druk op Start en centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.500 g .
- Gooi de doorstroom weg in een container voor gevaarlijk afval en plaats de peptide-opruimkolom in een nieuwe verzamelbuis van 2 ml.
- Voeg 300 μL wasoplossing B (5% methanol, 0,1% TFA) toe aan de kolomhars, opnieuw met behulp van een pipet van 200 μL.
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden waargenomen aan de bovenkant van de hars van de spinkolom. Als er luchtbellen worden waargenomen, verwijder dan de luchtbellen door zachtjes op de kolom te tikken of gebruik een schone pipetpunt van 10 μl om de luchtbel(s) te verspreiden.
- Plaats deze in de centrifuge, sluit het deksel, druk op Start en centrifugeer 2 minuten op 1.500 g .
- Gooi de doorstroom weg in een container voor gevaarlijk afval en plaats de peptide-opruimkolom in een nieuwe verzamelbuis van 2 ml.
- Herhaal stap 5.12-5.14 nog een keer, zodat de kolom twee keer wordt gewassen met wasoplossing B.
- Breng de peptide-opruimkolom over in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml.
- Zorg ervoor dat de microcentrifugebuisjes van 2 ml die in deze stap worden gebruikt, de door de kit geleverde eiwitbindende verzamelbuisjes zijn.
- Om de beschikbare hoeveelheid eiwitarme verzamelbuisjes te behouden, gebruikt u standaard laboratoriumbuisjes voor de vorige wasstappen.
- Voeg 300 μL Elutionoplossing (50% acetonitril, 0,1% TFA) toe aan de kolomhars, opnieuw met behulp van een pipet van 200 μL.
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden waargenomen aan de bovenkant van de hars van de spinkolom. Als er luchtbellen worden waargenomen, verwijder dan de luchtbellen door zachtjes op de kolom te tikken of gebruik een schone pipetpunt van 10 μl om de luchtbel(s) te verspreiden.
- Plaats deze in de centrifuge, sluit het deksel, druk op Start en centrifugeer gedurende 3 minuten op 1.500 g om het schone peptidemonster te verzamelen in de nieuwe eiwitarme verzamelbuis van 2 ml.
- Breng desgewenst 125 μl (ongeveer de helft) van de geëlueerde schone peptideoplossing over in een glazen injectieflacon van 1 ml met behulp van een pipet van 200 μl en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: Dit aliquot kan later worden gebruikt voor aanvullende analyse, zoals tandem mass tag (TMT) labeling van de peptiden, zoals gedaan door een in de handel verkrijgbare kit, voor een nauwkeurigere kwantificering van monsters, met name onafhankelijk bereide sets.
- Bewaar het resterende monster, ongeveer 175 μl, bij -30 °C in de eiwitbindende buisjes van 2 ml met een lage eiwitbinding tot het klaar is om verder te gaan met drogen en reconstitutie. Dit is een veilige stopplaats.
- Om het monster te drogen, ontdooit u het peptidemonster van -30 °C tot RT. Als u direct na het opruimen van peptiden doorgaat met drogen en reconstitutie, negeer dan deze stap.
- Open de microcentrifugebuisjes van 2 ml en plaats ze in een vacuümcentrifugeconcentrator.
- Zorg ervoor dat de vacuümcentrifugeconcentrator in evenwicht is als er een oneven aantal monsters tegelijkertijd wordt uitgevoerd.
- Sluit het deksel van de vacuümcentrifugeconcentrator en druk op Start.
- Laat de monsters 3 uur op de vacuümcentrifugeconcentrator draaien, zonder te verhitten.
- Inspecteer de buizen regelmatig om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof in achterblijft, aangezien dit de binding van de peptiden aan de scheidingskolom van het LC/MS-MS-instrument kan verstoren.
- Als er nog steeds vloeistof wordt waargenomen, ga dan door met het draaien van de monsters gedurende extra tijd.
- Controleer tussen 30 minuten en 1 uur of er vloeistof in de buis achterblijft.
OPMERKING: De peptiden zijn tijdens dit proces zeer stabiel omdat ze zich onder vacuümomstandigheden bevinden en niet zullen worden aangetast door een korte periode van droogte of matige warmte die alleen wordt gegenereerd door de werking van de vacuümcentrifugeconcentrator.
- Eenmaal droog, suspendeer het monster onmiddellijk in 50 μl 0,1% mierenzuur in water van MS-kwaliteit (bijv. 5 μl 100% mierenzuur in 5 ml water).
- Voeg 50 μL 0,1% mierenzuur toe aan de bodem van de 2 ml eiwitarme tube met het gedroogde peptidemonster, met behulp van een pipet van 200 μL.
- Sluit de doppen en draai vervolgens gedurende 15 s.
- Breng de gereconstitueerde monsters over in de respectieve glazen flesjes van 1 ml met behulp van een pipet van 200 μl.
- Bewaar de glazen flesjes met de gereconstitueerde monsters bij -30 °C en analyseer ze zo snel mogelijk met behulp van LC-MS/MS-gebaseerde benadering.
OPMERKING: De ingevroren peptidemonsters zijn stabiel bij -30 °C voor kortstondige opslag en -80 °C voor langere opslag.
6. Gegevensverzameling van peptidemonsters op een UHPLC/MS-MS-instrument
VOORZICHTIGHEID. Zorg ervoor dat de juiste veiligheidsprotocollen worden gevolgd bij het werken met een Ultra High-Performance Liquid Chromatography/Orbitrap tribrid tandem Mass Spectrometer-systeem. Het laboratoriumpersoneel droeg persoonlijke beschermingsmiddelen en onderging een formele, hands-on instrumenttraining die werd gegeven door de fabrikant van UHPLC/MS-MS. De belangrijkste voorzorgsmaatregelen zijn de juiste behandeling van de mobiele fasen van zure en organische oplosmiddelen voor de UHPLC en de hoogspanningsionisatiebron voor de MS.
- Voer peptidescheidingen uit met behulp van een Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC)-systeem. De LC-kolom is een elektrospray geschikt C18 reverse phase, rapid separation (RSLC) ontwerp, met afmetingen 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm, zoals in-line geplaatst na een beschermvoorkolom van hetzelfde materiaal.
- Gebruik de volgende UHPLC mobiele fasen: 0,1% mierenzuur in water (oplosmiddel A), 0,1% mierenzuur in acetonitril (oplosmiddel B) en 0,1% mierenzuur in 90% water en 10% methanol (oplosmiddel C).
OPMERKING: Alle oplosmiddelen en mierenzuur die worden gebruikt voor de bereiding van de mobiele fasen zijn gecertificeerd van LC/MS-kwaliteit en worden alleen gemaakt als dat nodig is. De UHPLC heeft een filtratie- en ontgassingseenheid voorafgaand aan de pompen, zodat de mobiele fasen niet handmatig worden gefilterd en ontdaan van lucht.
- Stel om te beginnen geprogrammeerde injecties in van het totale aantal peptiden dat voor de plasma- en weefselmonsters is bereid op 3 μl, wat overeenkomt met ~3 μg peptidemateriaal zoals bepaald door de gebruikte starthoeveelheid eiwit.
OPMERKING: Dit zou een ideale MS-signaalintensiteit moeten opleveren voor maximale eiwitidentificaties. Het injectievolume kan worden verhoogd tot maar liefst 15 μL om de signaaloutput verder te versterken of worden verlaagd tot slechts 1 μL als overbelasting duidelijk is.
- Houd de kolom en de autosampler op respectievelijk 40 °C en 10 °C.
- Stel het oplosmiddeldebiet voor de proteomics-acquisitie in op een constante 0,3 μL/min, met behulp van de UHPLC-nanopompen, met een lineaire scheidingsgradiënt van de mobiele fasen van water (A) naar acetonitril (B).
- Spoel de injectiespuit en de monsterlus (inhoud 20 μl) met behulp van de mobiele fase (C) met water en methanol, waarbij de UHPLC-laadpomp in eerste instantie is ingesteld op 5 μl/min.
- Stel tijdens de monsterscheiding over in totaal 80 minuten de LC-gradiënt (lineaire curven) als volgt in: Initieel - 5% B; 0-60 min - 32% B; 60-61 min - 95% B; 61-65 min - 95% B; 65-66 min - 2% B; en 66-80 min - 2% B. Laat de laadpomp ook op een constante 100% van A draaien, maar pas het debiet lineair als volgt aan: Initieel - 5 μL/min; 0-5 min - 1 μL/min; 5-61 min - 5 μL/min; en 61-80 min - 5 μL/min (Figuur 3A).
- Injecteer onbekende peptidemonsters als opeenvolgende dubbele runs.
- Om overdracht te voorkomen, moeten ten minste twee opeenvolgende blanco-injecties van 0,1% mierenzuur in water tussen de monsters worden uitgevoerd met behulp van een afgekapte LC-gradiënt (lineaire curves) over in totaal 35 minuten als volgt: Initieel - 5% B; 0-23 min - 32% B; 23-24 min - 95% B; 24-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; en 31-35 min - 2% B (Figuur 3B).
- Zorg ervoor dat de instellingen voor de LC-gradiënt van de beladingspomp ongewijzigd blijven.
- Voor peptidemonsters met een hoog gehalte aan endogene verontreinigingen, zoals lever (bijv. galzuren), moet u elke 3 tot 5 monsters een derde blanco opnemen en aan het einde van de run om de LC-kolom schoon te maken. Dit bestaat uit het injecteren van 1 tot 2 μL oplossing die elk 25% acetonitril, isopropanol, methanol en water bevat.
- Als alternatief, of in combinatie met de bovenstaande stap, voert u een procentuele verandering verbeterde LC-gradiënt uit (d.w.z. wip) over in totaal 35 minuten als een systeemuitspoeling als volgt: Initieel - 2% B; 0-3 min - 2% B; 3-4 min - 95% B; 4-10 min - 95% B; 10-11 min - 2% B; en 11-15 min - 2% B; 15-16 min - 95% B; 16-20 min - 95% B; 20-21 min - 2% B; 21-25 min - 2% B; 25-26 min - 95% B; 26-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; en 31-35 min - 2% B (Figuur 3C).
- Voer de detectie uit van de peptiden, d.w.z. overeenkomstige molecuulmassa's, terwijl ze worden gescheiden door en geëlueerd van de LC-kolom, met behulp van een Orbitrap en een ionenval combinatie tandem quadrupool massaspectrometer (MS-MS) systeem.
- Voordat u de monsterruns uitvoert, sluit u de LC-kolom rechtstreeks aan op de voorkant van de verwisselbare nano-sproei-ionisatiebron (NSI) van het MS-instrument, die zich in de linkerbovenhoek van het apparaat bevindt.
OPMERKING: Hierdoor wordt de ingebouwde elektrospraynaald van de LC-kolom blootgelegd die de peptiden, gesuspendeerd in geladen microdruppeltjes LC-oplosmiddel in de mobiele fase, in de inlaat van de ionenoverdrachtsbuis van de detector afgeeft.
- Om de vervluchtigingsefficiëntie van de elektrospray te verbeteren, schakelt u ook de ingebouwde verwarmingseenheid van de NSI-bron in en stelt u deze in op 40 °C.
- Controleer ook vóór de monsterrun of er een bevredigende externe toevoer van gecomprimeerd stikstof- en heliumgas in het MS-instrument is. Bereik dit met behulp van tanks met 300 stalen cilinders van elk gas met een ultrahoge zuiverheid, waarvan de regelaarmeters zijn ingesteld op een statische stromingsdruk van respectievelijk 60 en 40 psi.
- Als het MS-instrument waarschuwt voor instabiliteit van de stikstofgastoevoer, verhoog dan de druk tot een maximum van 100 psi. Zorg ervoor dat de tanks ten minste 10-20% vol zijn, dit is een bovenste klepmeterwaarde van ~250-500 psi; En zo niet, verander ze dan in nieuwe. Als u onder de 10% van de volledige capaciteit komt, bestaat het risico dat er verontreinigingen in het MS-instrument worden getrokken, die zich op de bodem van de gastanks kunnen nestelen.
- Maak vooraf de massaspectrometermethode met behulp van een door besturingssoftware geleverd sjabloon dat is ontworpen voor de optimale detectie van peptiden en de posttranslationele modificaties (Figuur 3D-H), en voer de volgende standaardvoorwaarden in:
- Stel de totale detectieperiode in op 80 min.
- Stel de algemene detectiemodus in op peptiden.
- Zet de NSI-bron in de positieve modus (d.w.z. lading van de peptide-ionen).
- Stel de spanning van de nano-spraynaald in op 2000 V en houd deze statisch.
- Stel de stikstofgasinvoer in op de NSI en zet de detectoren op statisch.
- Stel de temperatuur van de ionenoverdrachtsbuis in op 275 °C.
- Detecteer de massa's van de hele peptiden (d.w.z. ouderionen; MS1) door het scanbereik in te stellen op 350-2000 m/z, de RF-lens op 30%, de maximale injectietijd op Auto en de orbitrap-massaanalysator op een resolutie van 120.000.
OPMERKING: De alternatieve ionenvalmogelijkheid van het instrument wordt hier niet gebruikt om te screenen op de peptidemassa's, omdat het minder gevoelig is voor het monitoren van dit type molecuul in vergelijking met de orbitrap.
- Stel de ionenfilters in om onderscheid te maken tussen die peptiden met meerdere laadtoestanden in een bereik van 2-7. Hierdoor kan het instrument, tijdens het registreren van de gegevens, automatisch de inherent gedetecteerde massa-overladingsverhoudingen (m/z) van de moleculen omzetten in hun exacte massa's. Evenzo heeft een peptide met slechts een enkele ladingstoestand (m/z = 1) geen conversiefactor nodig om zijn exacte massa te verkrijgen.
- Stel de dynamische uitsluitingspoorten voor de ionen in op 1 doorgang met een duur van 60 s, ± massatolerantie van 10 ppm, en om alle moleculen met natuurlijke isotopische atomen (bijv. 14C) te verwijderen.
- Detecteer de massa's identiteitsbevestigingsfragmenten die zijn gegenereerd voor de peptiden (d.w.z. dochterionen; MS2) door het instrument in te stellen op de data-afhankelijke acquisitie (DDA-modus).
- Vang het geheel van peptiden (d.w.z. ouderionen) op door quadrupoolisolatie, met behulp van een instelling voor het tolerantievenster voor massavariabiliteit van m/z = 1,6.
- Voer de fragmentatie van de gevangen peptiden uit door de elektronenimpactmodus in te stellen op HCD (d.w.z. botsingsdissociatie met hogere energie waarbij stikstof- en heliumgas als elektronenoverdrachtsmiddel worden gebruikt), botsingsenergie op 30%, scanbereik op Auto, maximale injectietijd op Auto en de Orbitrap-massaanalysator op een resolutie van 30.000.
- Verkrijg de uiteindelijke gegevens (MS1- en MS2-ionen) door de signaalpiekvorm in te stellen op een zwaartepuntformaat.
- Handhaaf nauwkeurige massabepalingen voor gedetecteerde peptiden door het instrument routinematig te kalibreren, meestal voorafgaand aan elke monsterbatch, zoals hieronder beschreven.
- Plaats het MS-instrument in de uitschakelstatus van de ionenbron, met behulp van de besturingssoftware, en schakel de NSI-bron uit naar de alternatieve intern verwarmde elektrospray-ionisatiebron (HESI) van het apparaat. Dit is de bron die wordt gebruikt voor toepassingen die zeer grote monsterinjectievolumes en een bijbehorend hoog debiet (1-2500 μL/min) voor de LC-pomp kunnen vereisen, bijv. metabolomics en farmacokinetische experimenten met geneesmiddelen.
- Selecteer de optie voor volledige kalibratiecontrole op de besturingssoftware.
- Vul een glazen spuit van 500 μl met een met teflon beklede zuiger en roestvrijstalen stompe naald met een in de handel verkrijgbare MS-standaardoplossing en sluit vervolgens de PTFE-capillaire slangleiding aan op de HSEI-bron (terwijl uitgeschakeld).
OPMERKING: De hier gebruikte standaard bevat een mengsel van natuurlijke en synthetische moleculen (16 in totaal, bijv. cafeïne) die een massabereik van m/z = 50-2800 bestrijken en een breed scala aan mogelijke soorten chemische bindingen bestrijken, vooral die welke geassocieerd zijn met peptiden (bijv. amidegroepen).
- Start een constante infusie van de MS-standaard in de HSEI-bron (terwijl deze is ingeschakeld), met een snelheid van 3-5 μl/min, zoals gedaan met een spuitpomp. Zodra een stabiel patroon van standaardpieken is genoteerd in het liveweergavevenster van de besturingssoftware, activeert u de geautomatiseerde kalibratiecontrole.
OPMERKING: Als er geen problemen worden gevonden met de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de massabepalingen voor de standaard, duurt een succesvolle volledige kalibratie doorgaans < 40 minuten. Evenzo, alleen als het instrument alle MS-hardwareparameters doorstaat die worden gecontroleerd, wordt het als betrouwbaar beschouwd voor het uitvoeren van samples.
- Bevestig het succes van de kalibratie door de NSI-bron en LC-kolom opnieuw in te stellen en vervolgens een standaardoplossing van humaan [Glu 1]-Fibrinopeptide B (Glu-Fib) uit te voeren in totale geïnjecteerde hoeveelheden van 1-10 ng (bijv. 1, 2, 6 en 10 ng). Gebruik dezelfde LC-scheidings- en MS-detectiemethoden als hierboven beschreven voor de onbekende monsters.
- Controleer de Glu-Fib-standaard voor de juiste LC-retentietijd (~20 min), aanwezigheid van MS1- en MS2-ionen (m/z = 1285.54, 813.39, 785.84, 445.12, 333.19 en 175.12) en lineariteit van toenemende piekgebieden met geïnjecteerde hoeveelheid.
- Genereer vervolgens sequentietabellen, met behulp van de besturings- en gegevensvastlegsoftware, voor het uitvoeren van de onbekende peptide- en lege monsters die kolommen bevatten voor het invoeren van het monstertype, de bestandsnaam, de monster-ID, het gegevenspad, de LC/MS-instrumentmethode, de positie van de injectieflacon en het injectievolume (Figuur 3D-E).
- Sla de resulterende MS-gegevensbestanden (extensie: RAW; elk 500 - 800 GB) op in de daarvoor bestemde padmap op de harde schijf van de instrumentcomputer. Breng deze bestanden vervolgens over naar een werkstationcomputer die krachtig genoeg is om de bio-informaticasoftware aan te sturen, zoals later beschreven, die de extreem uitgebreide en complexe spectrale gegevens van peptidemassa (d.w.z. MS1- en MS2-signalen) omzet in overeenkomstige totale eiwitsamenstellingsprofielen.
7. Conversie van ruwe MS-gegevens naar representatieve totale proteoomresultaten
OPMERKING: De onbewerkte MS-gegevens die zijn vastgelegd voor peptidemonsters worden verwerkt tot totale eiwitsamenstellingsprofielen (proteoom), met behulp van bio-informaticasoftware. Kortom, de bio-informaticasoftware reconstrueert de originele eiwitten in het monster door de ruwe MS-gegevens te matchen met hun bekende peptide MS1- en MS2-spectra die te vinden zijn in een webgebaseerde soortspecifieke, proteoomreferentiebibliotheek, door middel van uitgebreide en unieke dekking van de aminozuursequentie van het eiwit. Relatieve abundanties van elk geïdentificeerd eiwit worden door het programma bepaald met behulp van de MS1-signaalintensiteiten van de gematchte unieke peptiden. Bepaalde abundanties kunnen op betrouwbare wijze worden vergeleken tussen monsters, maar alleen als ze binnen dezelfde voorbereidingsbatch worden uitgevoerd en met identieke LC- en MS-instellingen. Anders zullen de eerder genoemde absolute kwantitatieve technieken op basis van interne standaard/reporter-ionenterugwinning, zoals selectieve TMT-labeling van de peptiden in elk monster, moeten worden gebruikt.
- Download het proteoomreferentiebestand uit de webbibliotheek naar de harde schijf van de werkstationcomputer.
- Vind dit door gebruik te maken van de database op de website van Uniprot voor de voorbeeldsoorten die van belang zijn (bijv. fretten / Mustela furo). Dit wordt een FASTA-bestand genoemd. Gebruik de zoekfunctie voor proteomen en de tabelweergave om het proteoomreferentiebestand te zoeken en vervolgens te downloaden.
- Om het mogelijke aantal gegenereerde eiwitidentificaties te maximaliseren, selecteert u zowel de peer-reviewed (Swiss-Prot) als niet-beoordeelde (TrEMBL) vermeldingen van de commissie in de Uniprot-database bij het maken van het FASTA-bestand. Kies op dezelfde manier de optie om alle beoordeelde isovormen voor de eiwitten op te nemen.
- Open de bio-informaticasoftware, d.w.z. Proteome Discoverer, naar het tabblad Start Page en selecteer vervolgens het tabblad Beheer .
- Ga naar het subtabblad FASTA-bestanden onderhouden en download vervolgens het bovenstaande soortspecifieke FATA-bestand dat voor uw experimenten is gegenereerd naar het programma.
- Ga terug naar het tabblad Startpagina en klik op Nieuwe studie/analyse, en typ in het dialoogvenster een onderzoeksnaam in het veld Studienaam en selecteer een bestandsmap voor het opslaan van de studie in het veld Onderzoekshoofdmap .
- Laat de velden Verwerkingswerkstroom en Consensuswerkstroom voorlopig leeg, omdat deze voor later worden geselecteerd.
- Klik op OK om het dialoogvenster op te slaan en te verlaten, waarna de pagina Studiedefinitie wordt geopend.
- Ga naar het tabblad Studiedefinitie en typ de details van het project in het vak Studiebeschrijving in het linkermidden.
- Ga naar het tabblad Invoerbestanden en klik op Bestanden toevoegen.
- Er verschijnt een dialoogvenster waarin de vereiste onbewerkte gegevensbestanden die moeten worden verwerkt tot de resultaten van het totale eiwitsamenstellingsprofiel (proteoom) kunnen worden geselecteerd en gedownload van de harde schijf van de computer.
- Klik op de onbewerkte MS-gegevensbestanden die nu worden weergegeven onder het tabblad Invoerbestanden , die afzonderlijk of allemaal tegelijk kunnen worden geselecteerd en gemarkeerd.
- Sleep ze naar de overkant en zet ze neer in de sectie Bestanden voor analyse van het vak Analyse in het midden rechts als onderdeel van het subvak Verwerkingsstap .
- Ga naar het tabblad Werkstromen en klik op Bewerken, dat te vinden is naast de kop Verwerkingsstap van het vak Analyse in het midden rechts.
- Klik op Open Common en selecteer in de map ProcessingWF_Tribrid het verwerkingsworkflowbestand dat specifiek is aangewezen voor fosfoproteïne-subidentificaties, zoals verkregen onder MS-detectie op basis van HCD-fragmentatie (Figuur 4A).
OPMERKING: Een verwerkingsstapdiagram met bewerkbare knooppunten verschijnt dan in het vak Werkstroomstructuur . Er zijn twee knooppunten, zoals hieronder beschreven, die zijn gemarkeerd met uitroeptekens die aangeven dat de gebruiker experimentspecifieke informatie moet invoeren.
- Klik in het diagram van de verwerkingswerkstroomstructuur op en open het RC-knooppunt Spectrum Files .
- Zoek en selecteer in de categorie Parameters of Spectrum Files RC onder de parameter Protein Database het FASTA-bestand, dat eerder werd gegenereerd met behulp van de Uniprot-website, voor de soortspecifieke referentiebibliotheek van peptide MS-spectra die zullen worden doorzocht om de eiwitten van experimenteel belang te identificeren.
- Klik op en open het Sequest HT-knooppunt en breng de volgende drie wijzigingen aan:
- Selecteer onder de parameter Protein Database hetzelfde FASTA-bestand, zoals hierboven beschreven.
- Selecteer onder de parameter Enzymnaam de optie Trypsine (vol) of als alternatief Lys-C, de belangrijkste en back-upproteasen die worden gebruikt om het oorspronkelijke peptide-digestaat te bereiden.
- Zorg er onder de parameter Dynamic Modifications voor dat ten minste Phospho / +79.966 Da (S, T, Y) is geselecteerd.
- Gebruik de laatste instelling om peptiden te onthullen die geassocieerd zijn met eiwitten die posttranslationeel zijn gemodificeerd door fosforylering, door te zoeken naar overeenkomstige MS-spectraverliezen van een fosfaatgroep(en) (m/z = 79,97).
- Vind de door fosfaat bezette aminozuurplaatsen (d.w.z. serine, threonine of tyrosine) aan de hand van de verwachte veranderingen in hun MS2-fragmentatiepatronen.
- Voeg op dit punt op dezelfde manier andere posttranslationele eiwitmodificaties van routinematig belang toe aan de Sequest HT-knoop , bijv. methylering, acetylering, myristylatie, als het exacte massaverlies van de verwante groepen bekend is. Breid op dezelfde manier de zoektocht naar de fosforyleringsplaatsen uit naar andere, minder vaak gerapporteerde aminozuren, bijvoorbeeld histidine.
OPMERKING: De Spectrum Files RC - en Sequest HT-knooppunten van de workflowstructuur voor de verwerkingsstap zijn de enige twee waarvoor parameters moeten worden aangepast.
- Laat de rest als hun standaardinstellingen staan, aangezien deze al door de fabrikant zijn geoptimaliseerd om het hoogste aantal aangewezen eiwitidentificaties van belang te produceren. Dit geldt ook voor alle andere knooppunten in de werkstroomstructuur.
- Zorg ervoor dat Percolator- en IMP-ptmRS-knooppunten aan het einde van de workflowstructuur zijn opgenomen.
OPMERKING: Percolator maakt gebruik van herhaalde aanpassing om de eindresultaten aanzienlijk te verfijnen. IMP-ptmRS is essentieel voor het rapporteren van de juiste identificatie en lokalisatie van alle posttranslationele modificaties van eiwitten, inclusief die van fosforylering.
- Ga terug naar het tabblad Werkstromen en klik op Bewerken naast de kop Consensus Stap van het vak Analyse in de rechterbovenhoek. Hierdoor wordt het werkstroomstructuurdiagram voor de consensusstap weergegeven.
- Klik op Open Common en selecteer in de map ConsensusWF het consensusworkflowbestand dat het gewenste uitvoerformaat voor de resultaten van het eiwitsamenstellingsprofiel (proteoom) zal produceren (Figuur 4B).
OPMERKING: Een consensusstappendiagram met bewerkbare knooppunten wordt geopend in het vak Werkstroomstructuur . Het diagram dat wordt gebruikt voor het verwerken van de gegevens wordt gegenereerd door wijziging van de basisconsensusworkflow, waarbij in-line Feature Mapper en Precursor Ions Quantifier-knooppunten werden toegevoegd als een aftakking van het initiële MSF Files-knooppunt , om de kwantificering van relatieve eiwitabundanties te vergemakkelijken. Hoewel alle knooppunten in de workflow al geoptimaliseerde parameters bevatten die door de fabrikant zijn vastgesteld, zijn er enkele die zeer belangrijke vermeldingen bevatten die moeten worden gecontroleerd op de juiste selectie, zoals hieronder beschreven.
- Klik in het werkstroomstructuurdiagram op en open het knooppunt Precursor Ions Quantifier . Dit is het knooppunt dat essentieel is voor het kwantificeren van de relatieve abundanties van elk geïdentificeerd eiwit.
- Zoek en selecteer onder de categorie Algemene kwantificeringsinstellingen onder de parameter Peptiden om te gebruiken de optie Uniek + Scheermes .
OPMERKING: Unieke peptiden zijn peptiden die aminozuursequenties bevatten die exclusief zijn voor een enkel eiwit; en worden dus gebruikt om de hoeveelheid specifiek te bepalen op basis van de MS-signaalintensiteiten. Scheermespeptiden zijn peptiden die worden gedeeld tussen groepen eiwitten; en worden dus gebruikt om de berekende relatieve abundanties in overeenstemming te brengen.
- Wijzig in de categorie Normalisatie en Schalen zowel de parameters Normalisatiemodus als Schaalmodus in de optie Geen , omdat dit type aanpassing te beperkt is voor een betrouwbare toepassing op het hele proteoom.
OPMERKING: Deze instellingen worden alleen geactiveerd als het gewenst is om de berekende relatieve abundanties van geselecteerde eiwitten die van belang zijn te normaliseren ten opzichte van de eiwitten die stabiel intrinsiek zijn aan de cel, bijvoorbeeld huishoudgenen, en vervolgens de resulterende waarden uit te drukken als een geschaalde verhouding.
- Klik vervolgens op en open het knooppunt Peptide- en eiwitfilter en wijzig onder de categorie Peptidefilters de Peptide Confidence Ten minste en houd de lagere PSM-parameters op respectievelijk de opties Hoog en Onwaar . Dit stelt de peptide-matches die worden gebruikt bij het maken van de eiwitidentificaties in op het hoogste niveau van fit-significantie (d.w.z. ≥ 95%).
OPMERKING: Als alternatief kan de eerste parameter worden ingesteld op Medium om de strengheid van de peptideovereenkomsten te ontspannen en zo de output van eiwithits aanzienlijk te verhogen; Maar omgekeerd leidt dit tot een zeer hoog risico op het genereren van veel valse identificaties. Evenzo mag het nooit zo zijn dat een "Lage" waarde wordt gebruikt als een acceptabele optie voor beide parameters.
- Dit zijn de enige knooppunten van de consensusstap waarvan de parameters moeten worden aangepast, de rest laat de standaardinstellingen gebruiken.
OPMERKING: Over het algemeen behandelt de workflow voor consensusstappen alle post-hocanalyses, d.w.z. bepaling van de relatieve eiwitabundanties, identificatievertrouwelijkheden (d.w.z. valse ontdekkingspercentages en spectrale matchscores voor peptiden) en in kaart gebrachte peptidedekking. Resultaatstatistieken en gegevensverdelingen worden ook als eindtabellen aangeboden.
- Zodra de bovenstaande workflows voor verwerking en consensusstap zijn geïnstalleerd, slaat u het hele onderzoek op en klikt u vervolgens op het pictogram Uitvoeren (tandwielen) boven aan het vak Analyse . Als er meerdere onbewerkte MS-gegevensbestanden tegelijk worden verwerkt, klikt u voordat u met de verwerkingsrun begint op het nabijgelegen pictogram Per bestand (vierkant) en vinkt u het aan.
OPMERKING: De verwerking van één MS-bestand met onbewerkte gegevens tot een totaal proteoomresultaatbestand duurt doorgaans 20-40 minuten, maar het kan een lopende lijst opleveren van vele duizenden eiwitidentificaties, variërend van overeenkomsten met lage, gemiddelde tot hoge betrouwbaarheid (d.w.z. met een weging naar hoge treffers), samen met de fosfaatmodificaties die binnen elke entiteit aanwezig zijn (Figuur 4C). De belangrijkste resultaatuitvoerparameters voor de geïdentificeerde eiwitten zijn FDR (betrouwbaarheid), Master (als het FASTA-bestand / bibliotheekitem is beoordeeld), Toetreding #, Beschrijving, Dekking%, Sequentiedekking, Peptidespectrale overeenkomsten (bijv. aantal unieke peptiden), Fysische kenmerken (bijv. MW in kDa), Relatieve abundanties en Modificaties (d.w.z. fosforyleringsgroepen).
- Kolom rangschik de totale proteoomresultaten in oplopende of aflopende volgorde of volledig gefilterd, met behulp van het trechterpictogram op de werkbalk (Figuur 4C), op basis van onderzoeksinteresses, toon bijvoorbeeld alleen die met een hoge betrouwbaarheidsidentificatie (eiwit FDR) of een hoge mate van peptide-matching (bijv. op dekkingspercentage en/of aantal uniek gevonden).
- Als posttranslationele modificatie-informatie specifiek gewenst is, filter dan geïdentificeerde eiwitten met fosforylering uit voor verdere analyse.
- Sla de gefilterde resultaten op, zonder een wijziging van de bestandsnaam, omdat ze kunnen worden hersteld naar de oorspronkelijke uitvoer door simpelweg de toegepaste filters te verwijderen en het venster te verversen.