Methodenartikel

Analyse van telomere eiwit-DNA-interacties met behulp van een magnetisch pincet met één molecuul

DOI:

10.3791/67251

⸱

30 augustus 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol demonstreert het gebruik van een magnetisch pincet met één molecuul om interacties te bestuderen tussen telomere DNA-bindende eiwitten (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] en TRF2) en lange telomeren die uit menselijke cellen worden geëxtraheerd. Het beschrijft de voorbereidende stappen voor telomeren en telomere repeat-bindingsfactoren, de uitvoering van experimenten met één molecuul en de methoden voor gegevensverzameling en -analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeren, de beschermende structuren aan de uiteinden van chromosomen, zijn cruciaal voor het behoud van de cellulaire levensduur en genoomstabiliteit. Hun goede werking hangt af van streng gereguleerde processen van replicatie, rek en schaderespons. Het shelterine-complex, met name Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) en TRF2, speelt een cruciale rol bij de bescherming van telomeren en is naar voren gekomen als een potentieel doelwit tegen kanker voor de ontdekking van geneesmiddelen. Deze eiwitten binden zich aan het repetitieve telomere DNA-motief TTAGGG, waardoor de vorming van beschermende structuren en rekrutering van andere telomere eiwitten wordt vergemakkelijkt. Structurele methoden en geavanceerde beeldvormingstechnieken hebben inzicht verschaft in telomere eiwit-DNA-interacties, maar het onderzoeken van de dynamische processen vereist benaderingen met één molecuul. Hulpmiddelen zoals magnetische pincetten, optische pincetten en atoomkrachtmicroscopie (AFM) zijn gebruikt om telomere eiwit-DNA-interacties te bestuderen, waarbij belangrijke details zoals TRF2-afhankelijke DNA-vervorming en telomerase-katalyse worden onthuld. De bereiding van constructies met één molecuul met telomere repetitieve motieven blijft echter een uitdagende taak, waardoor de breedte van studies die gebruik maken van mechanische methoden met één molecuul mogelijk wordt beperkt. Om dit aan te pakken, hebben we een methode ontwikkeld om interacties te bestuderen met behulp van menselijk telomeer-DNA over de volledige lengte met een magnetisch pincet. Dit protocol beschrijft hoe TRF2 tot expressie kan worden gebracht en gezuiverd, telomisch DNA kan worden voorbereid, mechanische tests met één molecuul kunnen worden opgezet en gegevens kunnen worden geanalyseerd. Deze gedetailleerde gids zal ten goede komen aan onderzoekers op het gebied van telomeerbiologie en de ontdekking van telomeergerichte geneesmiddelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeren zijn beschermende structuren aan de uiteinden van chromosomen 1,2,3. Telomeererosie tijdens celdeling leidt tot celveroudering en -veroudering, terwijl abnormale verlenging van telomeren bijdraagt aan kanker 4,5. Om telomeren goed te laten functioneren, moeten hun replicatie, rek en schadereacties sterk worden gereguleerd 6,7,8. Shelterine, samengesteld uit zes subeenheden, speelt een centrale rol bij de bescherming van telomeren 9,10,11. Een beter begrip van telomeren zal waardevolle inzichten opleveren in de biologie van telomeren.

TRF1 en TRF2, kernsubeenheden van shelterine, zijn telomeerbindende eiwitten12,13. Zowel TRF1 als TRF2 binden aan het repetitieve DNA-motief TTAGGG in telomeren via hun Myb-domeinen14. Ze vormen dimeren via hun gedeelde TRFH-domeinen, waardoor ze telomeren dubbelstrengs DNA en telomeereiwitten kunnen rekruteren 15,16,17,18,19. TRF2 is vooral belangrijk voor de vorming van telomere D-lussen en T-lussen20,21. Vanwege hun cruciale rol bij de bescherming van telomeren, zijn TRF1 en TRF2 naar voren gekomen als potentiële doelwitten voor geneesmiddelen tegen kanker 22,23,24,25.

Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om de eiwit-DNA-interacties bij telomeren te onderzoeken. Biochemische methoden zoals Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) en Surface Plasmon Resonance (SPR) zijn gebruikt om bindingsaffiniteiten te onderzoeken20,26. Talrijke structuren van telomere bindende eiwitten gecomplexeerd met DNA zijn opgehelderd met behulp van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), röntgenkristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR)27,28,29. Beeldvormingstechnieken met superresolutie, zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), hebben TRF2-afhankelijke T-lusvorming21 onthuld. Onlangs is nanopore-sequencing ontwikkeld om telomere sequentieste profileren 4,30,31. Deze structurele inzichten hebben ons begrip van telomere eiwit-DNA-interacties sterk verbeterd. Om de dynamiek van telomere eiwit-DNA-interacties verder te onderzoeken, is de ontwikkeling van nieuwe technologieën essentieel.

Single-molecule tools zijn krachtige technieken voor het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties bij telomeer 32,33,34. Single-molecule mechanische methoden, zoals magnetische pincetten, optische pincetten en AFM, zijn gebruikt om TRF2-afhankelijke DNA-vervorming te onderzoeken, TRF2-gemedieerde kolomvormige stapeling van menselijk telomerisch chromatine te onthullen en processieve telomerase-katalyse te observeren, onder andere toepassingen 35,36,37,38,39,40. Deze methoden zijn vooral nuttig voor het onderzoeken van topologische conformaties en de kinetiek van eiwit-DNA-associatie en dissociatie.

De bereiding van constructies van één molecuul met telomere repetitieve motieven brengt echter nog steeds uitdagingen met zich mee, wat studies met mechanische methoden met één molecuul beperkt. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een mechanische methode met één molecuul ontwikkeld om wereldwijde eiwit-DNA-interacties op menselijke telomeren over de volledige lengte te bestuderen41. Deze methode extraheert rechtstreeks telomisch DNA uit menselijke cellen, waardoor de moeizame bereiding van kunstmatig telomeer-DNA wordt omzeild. Het vergemakkelijkt het onderzoek naar kinetische processen op lange natuurlijke telomeren die zich uitstrekken over meerdere kilobasen.

In dit protocol geven we een gedetailleerde beschrijving van de stappen voor het onderzoeken van telomere eiwit-DNA-interacties met behulp van een magnetisch pincet, een populair mechanisch hulpmiddel voor één molecuul 42,43,44. We laten zien hoe telomere eiwitten tot expressie kunnen worden gebracht en gezuiverd, met TRF2 als voorbeeld, en hoe telomeer-DNA uit menselijke cellen kan worden bereid. Daarnaast laten we zien hoe je een single-molecule assay op een magnetisch pincet opzet om telomere eiwit-DNA-interacties te bestuderen, en behandelen we de daaropvolgende data-analyse van single-molecule experimenten. Dit protocol zal ten goede komen aan onderzoekers op het gebied van telomeerbiologie en telomeergerichte medicijnontdekking.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Algemene materialen en methoden

  1. Raadpleeg het bestand met de materiaaltabel voor de zouten, chemicaliën, antibiotica, enzymen, antilichamen en harsmaterialen die in dit protocol worden gebruikt.
  2. Bereid Luria-Bertani (LB) vloeibaar medium, LB-agarplaten, HEPES-buffer, SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), Tris-EDTA (TE)-buffer volgens de recepten uit de protocollen van de koude lentehaven 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Verkrijg de pET28a-vector (Addgene), prokaryote en eukaryote cellijnen (ATCC) via commerciële bronnen. Kweek ze vervolgens continu en passeer ze in het laboratorium.
  4. Voor grote hoeveelheden vloeistof, autoclaaf bij 120 °C gedurende 20 min. Gebruik voor kleine volumes een steriel filter met een poriegrootte van 0,22 μm.
  5. Pas de pH van de oplossingen aan tot het gewenste niveau met behulp van HCl of NaOH voordat u ze naar hun uiteindelijke volume brengt.
    OPMERKING: Magnetische pincetten worden op maat gemaakt en uitgevoerd in een omgeving van LabVIEW 2017, terwijl data-analyse van één molecuul wordt uitgevoerd in MATLAB 2017 2,54,55.
  6. Draag om veiligheidsredenen laboratoriumjassen met lange mouwen, nitrilhandschoenen (of handschoenen gemaakt van een materiaal dat ondoordringbaar en bestand is tegen de stof), een veiligheidsbril of -bril en schoenen met gesloten neus.

2. Eiwitexpressie en zuivering van telomere DNA-bindende eiwitten

  1. Voer celkweek uit en induceer eiwitexpressie.
    1. Voeg de coderende sequentie voor de telomere DNA-bindende eiwitten (Figuur 1A), TRF2 als voorbeeld in dit geval, in de pET28a-vector in door enzymvertering en ligatie, met SUMO als fusietag. Invoegen tussen de restrictieplaatsen van BamHI en HindIII, wat het plasmide van pET28a-SUMO-TRF2 oplevert (Figuur 1B).
    2. Transformeer BL21(DE3) cellen met het pET28a-SUMO-TRF2 plasmide.
      1. Ontdooi een aliquot van 50 μl competente BL21(DE3)-cellen op ijs.
      2. Voeg 1 μL DNA van het pET28a-SUMO-TRF2-plasmide (met 50 ng DNA) toe aan de bevoegde cellen. Draai voorzichtig om te mengen zonder op en neer te pipetteren.
        OPMERKING: Niet vortexen.
      3. Incubeer het mengsel 30 minuten op ijs.
      4. Verwarm voor een hitteschok het celmengsel op 42 °C gedurende precies 45 s in een waterbad. Zet de cellen onmiddellijk 2 minuten terug in het ijs om de getransformeerde cellen te stabiliseren.
      5. Voeg 950 μL LB-medium op kamertemperatuur (RT) toe aan de cellen om het herstel te vergemakkelijken.
      6. Incubeer de getransformeerde cellen bij 37 °C gedurende 1 uur terwijl ze schudden bij 220 tpm.
      7. Verdeel 100 μl van het transformatiemengsel over een LB-agarplaat met 50 μg/ml kanamycine (85,8 μM).
      8. Incubeer de uitgeplaatde cellen een nacht bij 37 °C. Selecteer na incubatie verschillende kolonies voor gebruik bij de inoculatie van starterculturen.
        OPMERKING: Kolonies op platen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
    3. Pak een kolonie van de getransformeerde BL21(DE3)-cellen op en kweek deze in 5 ml LB-medium aangevuld met 50 μg/ml kanamycine (85,8 μM). Incubeer gedurende 18 uur bij 37 °C met schudden bij 220 tpm.
    4. Om op te schalen, brengt u 2 ml van de nachtelijke cultuur over op 200 ml LB-medium dat 50 μg/ml kanamycine (85,8 μM) bevat. Ga door met incuberen bij 37 °C met schudden bij 220 tpm totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) 0,6-0,8 bereikt.
    5. Neem 1 ml van de cultuur als een niet-geïnduceerd controlemonster.
    6. Induceer de resterende cultuur met isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een eindconcentratie van 1 mM en incubeer bij 20 °C gedurende 17 uur om de eiwitexpressie te bevorderen.
    7. Voer SDS-PAGE uit met een 5% stapelgel en een 10% scheidingsgel. Laad monsters met de SDS-PAGE-laadbuffer en voer SDS-PAGE in eerste instantie uit op 100 V gedurende 30 minuten, gevolgd door 120 V gedurende 50 minuten in een Tris-Glycine-buffer. Kleur met Coomassie blauw om de eiwitexpressie te visualiseren (zie recepten in aanvullende tabel 1) (Figuur 1C).
      OPMERKING: Zie Discussie voor het oplossen van problemen als expressie niet wordt waargenomen.
  2. Zuiver het eiwit.
    1. Oogst de cellen door centrifugeren bij 4 °C, 8500 x g gedurende 10 min. Gooi het supernatans weg en was de pellet in 200 ml PBS. Centrifugeer opnieuw, gooi het supernatant weg en resuspendeer de celpellet in 25 ml lysisbuffer (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, 10% glycerol, 0,5 mM DTT, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF]).
      LET OP: PMSF is bijtend en giftig en veroorzaakt brandwonden. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en oog-/gelaatsbescherming.
      NOTITIE: Bevries bij -80 °C als u niet onmiddellijk doorgaat.
    2. Voeg 5 μl 100 mg/ml lysozym, 5 μl 1 E/μl DNase I en 5 μl 10 mg/ml RNase A toe aan de geresuspendeerde cellen.
    3. Voer sonicatie uit op ijs, met bursts van 1 s bij 250 W gevolgd door een pauze van 2 s, gedurende in totaal 30 minuten.
    4. Centrifugeer bij 38.000 x g, 4 °C gedurende 40 minuten (30-60 min is acceptabel) en filtreer het supernatans door een spuitfilter van 0,22 μm.
    5. Bereid 500 ml Ni-kolombindingsbuffer voor door 8,76 g NaCl (eindconcentratie 300 mM) en 0,68 g imidazool (eindconcentratie 20 mM) op te lossen in 20 mM HEPES (pH 8,0). Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm.
      LET OP: Imidazol is gevaarlijk en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Het kan ook schadelijk zijn voor een ongeboren kind. Vermijd contact met ogen, huid en kleding. Niet inslikken of inademen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief gelaatsbescherming.
    6. Bereid Ni-kolom-elutiebuffers (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl) met toenemende concentraties imidazol (100 mM, 200 mM, 300 mM en 500 mM) voor voor stapsgewijze elutie, waarbij u ervoor zorgt dat alle buffers op de juiste manier worden gefilterd.
    7. Laad het gefilterde supernatans op de vooraf gebalanceerde Ni-kolom in bindingsbuffer (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazool). Was met bindingsbuffer en elueer het eiwit met de bereide imidazoolgradiënt, verzamel 12 fracties, elk met 1 ml (Figuur 1C). Combineer fracties met een zuiverheid van >95%.
    8. Meet de concentratie van het geëlueerde 6xHis-sumo-TRF2 fusie-eiwit door A280 in een spectrofotometer.
    9. Voor het eiwit dat wordt gebruikt in tests met één molecuul, voegt sumoprotease toe volgens de instructies van de fabrikant (meestal 0,125 U protease per 2 μg fusie-eiwit) en laat het een nacht vergisten bij 4 °C.
    10. Na de behandeling met sumoprotease laadt u het mengsel terug op een Ni-kolom om eventueel onverteerd fusie-eiwit en het His-gelabelde sumo te binden, zodat het tag-vrije TRF2-eiwit erdoorheen kan stromen. Verzamel de doorstroom.
  3. Bepaal de eiwitconcentratie en sla het eiwit op.
    1. Concentreer het gezuiverde TRF2-eiwit met behulp van een centrifugaalfiltereenheid met een 30 kDa cutoff-cutoff-centrifugaalfilter en vervang het in een opslagbuffer met 20 mM HEPES (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, om de imidazoolconcentratie onder 150 mM te verlagen.
    2. Herhaal het concentratieproces totdat het volume is teruggebracht tot minder dan 1 ml.
    3. Analyseer monsters van elke zuiveringsstap door SDS-PAGE om de zuiverheid en integriteit van het eiwit te beoordelen (Figuur 1C).
      OPMERKING: Affiniteitchromatografie wordt gebruikt om eiwitten te zuiveren, geëlueerde monsters te verzamelen en te wassen, en SDS-PAGE uit te voeren om de eiwitintegriteit te beoordelen en kwaliteitscontrole te garanderen. Wanneer affiniteitschromatografie alleen niet aan de zuiverheidseisen voldoet, wordt grootte-uitsluitingschromatografie gebruikt om de eiwitzuiverheid verder te verbeteren. UV-absorptiecurven helpen bij het beoordelen van elutiefracties en SDS-PAGE verifieert de eiwitintegriteit en zorgt voor een strikte kwaliteitscontrole gedurende het hele proces.
    4. Voeg glycerol in een eindconcentratie van 50% toe aan het geconcentreerde en buffer-uitgewisselde eiwit voor opslag.
    5. Bewaar het eiwit bij -80 °C.

3. Bereiding van humane telomeerrestrictiefragmenten

  1. Genoom-DNA extraheren.
    1. Centrifugeer volgens het stroomschema (figuur 2A) 1 x 107 cellen bij 1000 x g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen voor het wassen in 200 μL PBS, centrifugeer opnieuw op 1000 x g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
    2. Voeg 760 μL buffer met 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA en 1% SDS toe aan de buis met 1 x 107 cellen en resuspendeer voorzichtig door te pipetteren om luchtbellen te voorkomen.
      OPMERKING: Niet vortexen.
    3. Voor de vertering van eiwitten en de eliminatie van DNases en RNases in het monster, voegt u proteïnase K toe tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml, overeenkomend met 40 μl van een 10 mg/ml bouillonoplossing. Tik op de bodem van de buis om te mengen (niet wervelen).
    4. 's Nachts incuberen bij 37 °C.
    5. Voeg 265 μL 5,4 M NaCl toe. Meng gedurende 5 minuten door de buis vijf keer per minuut om te keren en plaats deze vervolgens 20 minuten op ijs.
    6. Centrifugeer op maximale snelheid (bijv. 16.900 x g) gedurende 10 minuten bij RT.
    7. Breng het supernatans over in een centrifugebuis en voeg een gelijk volume isopropanol (ongeveer 750 μL) toe, vermijd zwevende lipiden of bezinksel. Het DNA zit in het bovenliggende.
    8. Keer de buis vijf keer om om te mengen. Bevestig visueel de aanwezigheid van een pellet DNA die neerslaat in de centrifugebuis.
    9. Centrifugeer bij RT op maximale snelheid gedurende 10 minuten.
    10. Gooi het supernatant weg. Was de DNA-pellet met 500 μL 70% ethanol door de centrifugebuis vijf keer om te draaien.
      OPMERKING: De korrel is DNA.
    11. Centrifugeer bij RT op maximale snelheid (bijv. 16.900 x g) gedurende 10 minuten.
    12. Verwijder voorzichtig al het overschot en laat de DNA-korrel achter. Laat de pellet 5 minuten aan de lucht drogen op RT.
      OPMERKING: Vermijd overdrogen, omdat genoom-DNA moeilijk op te lossen kan raken.
    13. Resuspendeer de DNA-pellet in 475 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA). Meng voorzichtig door op de bodem van de tube te tikken. Voor de vertering van RNA tijdens de DNA-bereiding voegt u 25 μl 10 mg/ml RNase A toe (eindconcentratie 0,5 mg/ml) en mengt u door zachtjes te tikken totdat de DNA-pellet volledig is opgelost.
      OPMERKING: Vermijd vortexen om DNA-afschuiving te voorkomen.
    14. Incubeer het DNA-monster een nacht bij 4 °C.
    15. Voer een extractie uit met een gelijk volume Tris-verzadigde fenol: voeg 500 μL fenol toe aan de centrifugebuis, meng voorzichtig met een pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten op maximale snelheid bij 4 °C.
      LET OP: Blootstelling aan fenol kan irritatie van de huid, ogen, neus, keel en zenuwstelsel veroorzaken. Vermijd contact met ogen, huid en kleding. Niet inslikken of inademen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief gelaatsbescherming.
      OPMERKING: DNA bevindt zich in de bovenste waterige fase, eiwitten bevinden zich in de interfase en de organische fase bevindt zich onderaan.
    16. Herhaal dit drie keer. Neem het supernatans DNA (ongeveer 280 μL).
    17. Voeg afhankelijk van het volume van het DNA-monster 1/10 volume (28 μL) 3 M natriumacetaat (eindconcentratie 0,3 M, pH 5,2) en 2 volumes (616 μL) koude 100% ethanol toe. Plaats de centrifugebuis gedurende 2-3 uur bij -80 °C.
    18. Centrifugeer op maximale snelheid (bijv. 16.900 x g) gedurende 10 minuten bij 4 °C. Ontdooi de oplossing op ijs als deze is ingevroren voordat u deze centrifugeert.
    19. Gooi het supernatans weg en was 3-4 keer met 70% ethanol door de centrifugebuis om te keren. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    20. Verwijder de ethanol en laat de pellet 5 minuten aan de lucht drogen bij RT.
    21. Voeg 100 μL TE-buffer toe, tik op de buis om te mengen en laat het 2 uur op 4 °C staan om volledig op te lossen.
      OPMERKING: Onderzoek de integriteit van het genomische DNA op een agarosegel van 1% (Figuur 2B).
    22. Bewaar het DNA bij -20 °C in de vriezer. Het blijft minimaal 1 jaar stabiel.
  2. Voer genomische DNA-vertering en -modificatie uit.
    1. Neem 4 μg genomisch DNA en combineer dit met 1 μl CviAII (10 E), 2 μl 10x verteringsbuffer (zie aanvullende tabel 1 voor recepten) en voeg water toe tot een totaal volume van 20 μl. Incubeer het mengsel bij 25 °C gedurende 12 uur.
      OPMERKING: FatI kan CviAII vervangen, dat nu door de NEB is stopgezet.
    2. Voeg 1 μL NdeI (20 E), 1 μL MseI (10 E) en 1 μL BfaI (10 E) toe aan hetzelfde buisje met het vorige mengsel (20 μL). Voeg ook 2 μL 10x digestiebuffer en 15 μL water toe om een totaal volume van 40 μL te bereiken. Incubeer bij 37 °C gedurende 12 uur en inactiveer vervolgens alle enzymen bij 80 °C gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: De vertering van genomisch DNA kan worden onderzocht met behulp van de Terminal Restriction Fragment (TRF)-methode (Figuur 2C). De combinatie van de vier restrictie-enzymen (CviAII, NdeI, MseI en BfaI) verteert het genomische DNA tot fragmenten van ongeveer 800 bp en levert de TRF's op met minimale subtelomere DNA-contaminatie.
    3. Neem voor digoxigeninemodificatie 40 μL van het verteerde genomische DNA en voeg 4 μL 1 mM dATP (eindconcentratie 0,08 mM), 4 μL 1 mM digoxigenine-11-dUTP (eindconcentratie 0,08 mM), 1 μL Klenow-fragment (5 E), 0,5 μL 100 mM DTT (eindconcentratie 1 mM) en 1 μL 10x verteringsbuffer toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 12 uur, gevolgd door verhitting bij 75 °C gedurende 20 minuten om het Klenow-fragment te inactiveren.
    4. Neem voor biotine-etikettering 12,5 μL van het digoxigenine-gemodificeerde genomische DNA (1 μg) en voeg 1 μL 1 μM gebiotinyleerde telomeersonde toe (d.w.z. 1 pmol) die complementair is aan de telomere enkelstrengs overhang. Voeg 611,5 μL TE Li-buffer toe (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) om de 50 mM K-ionen te verdunnen tot 1 mM, waardoor een totaal volume van 625 μL ontstaat, dat kan worden verdeeld in 16 buisjes van elk 39 μL.
    5. Verwarm gedurende 3 minuten op 75 °C in een thermische cycler en verlaag vervolgens de temperatuur elke 30 s met 0,1 °C tot 25 °C.
    6. Bewaar de DNA-monsters minimaal een jaar bij -20 °C.

4. Het opzetten van een flowcel voor telomere DNA-monsters op een magnetisch pincet

  1. Maak een flowcel voor tests met één molecuul.
    1. Gebruik een elektrische slijpmachine om gaten te boren als de inlaat en uitlaat op de bovenste dekglaasjes (# 2 afdekglas met een dikte van 0.2 mm).
    2. Reinig de dekglaasjes in afwasmiddel door middel van sonicatie gedurende 30 minuten.
    3. Was de dekslips 3 keer met ultrazuiver water.
    4. Reinig de dekglaasjes in isopropanol door sonicatie gedurende 30 minuten.
    5. Was de dekglaasjes 3 keer met ultrazuiver water.
    6. Reinig de dekglaasjes in ultrapuur door sonicatie gedurende 15-30 minuten.
    7. Droog de dekglaasjes af met stikstof.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gestopt en de gereinigde dekglaasjes kunnen worden opgeslagen voor later gebruik.
    8. Smeer de onderste dekglaasjes (zonder gaten) in met 20 μL 0,1% nitrocellulose en voeg referentiekorrels toe (20x verdunning, 3 μm diameter). Bak 4 minuten op 100 °C.
    9. Gebruik een scalpel om dubbellaagse parafilmafstandhouders te snijden volgens een metalen mal. De mal is een rechthoekig stuk van aluminiumlegering met dezelfde afmetingen als het dekglaasje, met een uitgehold midden om het snijden van kanalen te vergemakkelijken.
    10. Monteer de sandwich van de stroomcel (Figuur 3A). Verwarm op 85 °C en masseer met twee wattenstaafjes totdat de parafilm het kanaal afsluit.
    11. Smeer de flowcel in met een antilichaam. Injecteer 70 μL anti-digoxigenine-antilichaam (0,1 mg/ml) rechtstreeks in de stroomcel. Vertrek bij RT voor 1 uur.
    12. Passiveer de stroomcel. Injecteer 70 μL van 10 mg/ml BSA om het anti-digoxigenine-antilichaam te verdringen. Vertrek bij RT voor 12 uur. Ongebonden anti-digoxigenine-antilichamen worden in de volgende stappen weggespoeld met rigoureus spoelen.
      NOTITIE: Bewaar de flowcel 1-2 weken bij 4 °C.
    13. Test op niet-specifieke binding door 5 μL gewassen MyOne (10 mg/ml) (of 5 μl gewassen M270 (10 mg/ml)) parels zonder DNA in de flowcel te spoelen. Laat 10 minuten intrekken en spoel de korrels weg met behulp van een werkbuffer (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Tel het aantal kralen dat in één gezichtsveld op het oppervlak is geplakt. Een goed behandeld oppervlak mag geen of slechts een paar korrels vertonen.
  2. Isoleer en immobiliseer telomere DNA-kettingen in een flowcel.
    1. Neem 10 μL M270 parels (10 mg/ml) of 5 μl 10 mg/ml MyOne en was ze vijf keer met 50 μl werkbuffer (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) met behulp van een magneet.
    2. Neem 500 ng verteerd genoom-DNA en doe het in een centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg alle kralen (50 μL) toe aan het DNA-monster.
    3. Zonder te pipetteren, tikt u een paar keer voorzichtig met de centrifugebuis om de kralen en het DNA-monster te mengen. Laat het mengsel 1 uur op ijs staan. Was drie keer met 500 μL werkbuffer met behulp van een magneet om de kralen naar beneden te trekken, met tussenpozen van 10 minuten tussen de wasbeurten.
    4. Resuspendeer het monster met behulp van 30 μL werkbuffer en laad het mengsel in de flowcel. Laat 30 minuten intrekken. Spoel ongebonden magnetische kralen door.
      OPMERKING: Telomisch DNA wordt vastgemaakt tussen de onderste dekglaasje en de magnetische kraal door middel van affiniteitsinteracties gemedieerd door digoxigenine-antilichaam en biotine-streptavidine (Figuur 3B).
  3. Een flowcel instellen op een magnetisch pincet
    1. Reinig de flowcel met 70% ethanol en droog het oppervlak af met behulp van lensdoekjes. Plaats de gereinigde stroomcel op de onderste monsterhouder en monteer het bovenste monsterrek voorzichtig met een schroevendraaier.
    2. Breng een druppel lensolie aan op het onderoppervlak van de flowcel, waar deze is uitgelijnd met de objectieflens. Plaats vervolgens de monsterhouder op de objectieflens en zet deze vast met een schroevendraaier.
    3. Kies een paar kubusvormige magneten van 5 mm die in een verticale configuratie zijn gerangschikt. Lijn de magneethouder uit met de X-as van het lichtpad van het magnetische pincet voor beeldvorming.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap. De richting van het magnetisch veld wordt uitgelijnd en dus bepaald door de oriëntatie van de magneethouder.
    4. Start de grafische programmeersoftware en sluit de controllers voor het magnetische pincet aan. Pas het gezichtsveld aan om een referentiekraal aan de onderkant van de stroomcel te vinden en pas de objectieflens iets aan zodat de referentiekraal duidelijke diffractieringen vertoont.
    5. Verplaats de magneten naar de bovenkant van de stroomcel.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Plotselinge veranderingen in het druppeldiffractiepatroon geven aan dat de magneten zojuist het oppervlak van de stroomcel hebben geraakt. Deze positie wordt beschouwd als de offset voor het nulpunt van de meting.
      OPMERKING: Laat de magneten voorzichtig zakken, begin met grotere stappen en verschuif geleidelijk naar kleinere stappen. Beweeg in stappen van 0.1 mm om beschadiging van de stroomcel te voorkomen bij het naderen van de stroomcel.
    6. Til de magneten op naar de hoogste stand en verwijder de magneethouder.
    7. Zet de peristaltische pomp aan die op de afvalfles is aangesloten en gooi de vloeistof weg. Voeg 100 μL werkbuffer toe aan de inlaat en stel het debiet van de peristaltische pomp in op 100 μL/min om de stroomcel met buffer te vullen.

5. Metingen van een telomeer met behulp van een magnetisch pincet met één molecuul

  1. Stel de camera in.
    1. Stel de grijstinten van de CMOS-camera (Complementary metal-oxide semiconductor) in met een helderheidsaanpassing op 150 niveaus.
    2. Definieer de grootte van de interesseregio (ROI).
    3. Stel de framerate in op 200 Hz met een belichtingstijd van 5000 μs.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Zorg ervoor dat de dode tijd van de sluiter op nul staat.
    4. Verplaats de positie van de magneet naar 3 cm (ongeveer 8 pN) en pas de objectieffocus op de kralen aan.
  2. Stel de opzoektabel (LUT) in.
    1. Verplaats de magneten naar een positie die overeenkomt met 8 pN om de DNA-gebonden magnetische kraal strak uit te rekken.
    2. Stel de LUT in op 200 stappen met een stapgrootte van 0,05 μm.
    3. Gebruik een CMOS-camera om de profielen van de magnetische kralen op verschillende posities vast te leggen om de LUT vast te stellen.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Polystyreenkorrels die in de stroomcel zijn bevestigd, dienen als referentiekorrels om drift voor de interessante korrels te elimineren.
  3. Ontwerp een mechanisch experiment met één molecuul.
    1. Schrijf een script in MATLAB om motorische bewegingen te regelen voor krachthelling- of krachtsprongtests.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Dit script codeert de commando's voor magneetbewegingen. De krachtbelastingssnelheid wordt in deze stap ingesteld voor een krachthellingsbepaling. De niveaus en duur van krachtsprongassays worden hier ook bepaald (Figuur 4, Aanvullend Bestand 1, Aanvullend Bestand 2 en Aanvullend Bestand 3).
    2. Importeer het script in grafische programmeersoftware om de experimenten met één molecuul te testen.
    3. Controleer het totale aantal frames dat nodig is voor het uitvoeren van het experiment met één molecuul en zorg ervoor dat het beschikbare geheugen deze vereiste overschrijdt.
      OPMERKING: Gegevens gaan verloren als het toegewezen geheugen minder is dan vereist, omdat het opslaan van gegevens tijd kost.
    4. Controleer de maximale beeldvormingssnelheid om het maximale aantal kralen te bepalen dat tegelijkertijd kan worden gecontroleerd.
      OPMERKING: Het experiment wordt beëindigd als de limiet voor de beeldsnelheid wordt overschreden.
    5. Gebruik een krachtsprongtest als voorbeeld en voer het mechanische experiment met één molecuul uit. Er worden abrupt krachten uitgeoefend op de magnetische kraal, die deze krachten overbrengt op het DNA-molecuul, waardoor het onmiddellijk naar boven wordt uitgerekt.

6. Metingen van TRF1/2 op een telomeer met behulp van een magnetisch pincet

  1. Forceer helling test
    1. Als u TRF1 als voorbeeld gebruikt, laadt u 200 μL van 10 nM TRF1 in de flowcel met een langzame stroomsnelheid (bijv. 30 μL/min). Wacht 30 minuten totdat TRF1 zich bindt aan het telomere DNA.
    2. Kies een script voor een geforceerde hellingsexperiment met een geforceerde laadsnelheid van ±1 pN/s.
    3. Geef de gegevensbestanden de juiste naam en voer het experiment uit. De gegevens worden opgeslagen op de opgegeven bestemming voor analyse (Figuur 5).
      OPMERKING: Tijdens dit experiment wordt de kracht lineair verhoogd en afgenomen tussen 0 pN en 17 pN, waardoor het telomeer-DNA wordt uitgerekt en ontspannen en de DNA-lussen die door TRF1/2 worden gemedieerd, worden verbroken.
  2. Force Jump-test
    1. Selecteer een script om een test voor geforceerde sprongen uit te voeren.
      OPMERKING: Er worden verschillende krachten uitgeoefend om het telomeer-DNA uit te rekken, bijvoorbeeld "Rustkracht" (Frest) bij 0 pN gedurende 40 s, "Testkracht" (Ftest) variërend van 2-8 pN gedurende 60 s, "Hoge kracht" (Fhigh) bij 10 pN gedurende 30 s en "Maximale kracht" (Fmax) bij 20 pN gedurende 30 s.
    2. Geef de gegevensbestanden de juiste naam en voer het experiment uit. De gegevens worden opgeslagen op de opgegeven bestemming voor analyse (Figuur 5).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1A illustreert de schematische domeinen en structuren van TRF1 en TRF2, bestaande uit respectievelijk 439 en 542 aminozuren, die tot expressie kunnen worden gebracht in prokaryote cellen. De bereiding van TRF1 is eerder beschreven in de literatuur41. Hier geven we een uitgebreide beschrijving en representatieve resultaten van de voorbereiding van TRF2. Figuur 1B toont de plasmidekaart die wordt gebruikt voor het tot expressie brengen van TRF2 in E. coli. We evalueerden TRF2-expressie voor en na inductie in E. coli, zoals weergegeven in figuur 1B. De zuiverings- en tag-splitsingsprocessen werden ook geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE (Figuur 1C). Volgens dit protocol werden beide telomere bindende eiwitten, TRF1 en TRF2, met succes tot expressie gebracht in E. coli.

Telomisch DNA, in de vorm van terminale restrictiefragmenten (TRF's), wordt gegenereerd uit menselijke genomen met behulp van een combinatie van vier restrictie-enzymen. Aan de hand van het stroomdiagram in figuur 2A hebben we genomen uit menselijke cellen geëxtraheerd. De enzymen verteren selectief genomisch DNA terwijl ze het telomeer-DNA over de volledige lengte intact laten, waardoor ze materiaal leveren voor tests met één molecuul. We hebben het TRF-DNA-preparaat uitgebreid getest met behulp van verschillende menselijke cellijnen. De integriteit van het genomische DNA werd onderzocht met behulp van agarosegelelektroforese, zoals weergegeven in figuur 2B. De TRF's werden vervolgens geanalyseerd door Southern blotting, waarbij gebruik werd gemaakt van fluorescerend gelabelde oligonucleotiden die complementair waren aan de telomere herhalingssequentie TTAGGG (Figuur 2C), volgens een methode die elders werd beschreven41,56. Gemiddeld is de lengte van menselijke TRF's ongeveer een paar kilobasen.

Tests met één molecuul vinden plaats in een flowcel die is geassembleerd zoals beschreven in figuur 3A. Een nitrocellulosecoating bedekt het negatief geladen glasoppervlak en biedt een hydrofiele matrix voor antilichaamadsorptie. BSA-passivering blokkeert gebieden van de nitrocellulosematrix die niet zijn gebonden door anti-digoxigenine-antilichamen. Polystyreenkorrels, die geen ijzeren nanodeeltjes bevatten, dienen als referentiekorrels. TRF-kettingen worden gevormd door affiniteitsinteracties tussen het digoxigenine-antilichaam op de nitrocellulosematrix en biotine-streptavidine op het magnetische pareloppervlak (Figuur 3B). TRF1 of TRF2 worden in de flowcel ingebracht en binden zich via vrije diffusie aan de TRF-DNA-bindingen. Magnetische pincetten worden gebruikt om het magnetische veld te moduleren, waarbij krachten op de magnetische kralen worden gegenereerd om de TRF-kettingen uit te rekken en te ontspannen, waardoor het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties mogelijk wordt.

Een mechanische test met één molecuul wordt ontworpen door een script te ontwikkelen om de bewegingen van de motoren van het magnetische pincet te regelen. Een stroomdiagram biedt een gestructureerde aanpak voor het maken van dit script in MatLab voor een test met één molecuul met behulp van een magnetisch pincet (Figuur 4A). De magneten bewegen langs de z-as binnen een bereik van 0-25 mm. Krachten worden berekend op basis van de magnetposities, volgens de magneetconfiguratie, met behulp van vergelijkingen die in de literatuur worden beschreven54. Voor een specifieke krachtbelastingssnelheid worden de magneetposities en bewegingssnelheden in MatLab ontworpen en geprogrammeerd om het gewenste krachtmanipulatieprofiel te bereiken, zoals aangetoond in het voorbeeld van de krachthellingtest (Figuur 4B-D).

Met TRF1 als voorbeeld hebben we de telomere DNA-eiwitinteracties onderzocht met een magnetisch pincet met één molecuul. De experimentele opstelling kan worden geconfigureerd als een kracht-hellingstest, zoals weergegeven in figuur 5A, waarbij de kracht-extensiecurven zigzagkenmerken vertonen tijdens het uitrekken als gevolg van het verbreken van eiwit-DNA-interacties en gladde sporen tijdens ontspanning, die de DNA-vezel weerspiegelen zonder eiwit-gemedieerde lussen. De opstelling kan ook worden geconfigureerd als een krachtsprongtest, zoals weergegeven in figuur 5B,C, waardoor we veranderingen in extensie en de duur van eiwit-DNA-interacties onder specifieke krachten kunnen meten. Uit deze metingen kan de dissociatiekinetiek van de telomere DNA-eiwitcomplexen worden afgeleid (Figuur 5D). Bovendien kan de vorming van lussen in de DNA-eiwitcomplexen worden aangetoond door veranderingen in extensie (Figuur 5E). Bovendien kan de eiwitconcentratie worden getitreerd binnen deze telomere DNA-experimentele opstelling. Bovendien stelt de lengteheterogeniteit van telomisch DNA van menselijke cellen ons in staat om het lusvormingsmechanisme in telomeren van verschillende lengtes te onderzoeken (Figuur 6).

figure-results-1
Figuur 1: De expressie en zuivering van TRF1/2. (A) De domeinarchitectuur van TRF1 en TRF2. (B) De plasmidekaart van pET28a-SUMO-TRF2 voor het tot expressie brengen van TRF2 in E. coli. (C) SDS-PAGE-analyse van de monsters die in verschillende stadia van expressie en zuivering zijn verkregen. Baan 1: Niet geïnduceerd door IPTG. Baan 2: IPTG-geïnduceerd precipitaat verkregen door cellyse. Baan 3: IPTG-geïnduceerd supernatans verkregen na cellyse. Baan 4: Stroom door Ni-kolom. Baan 5: Wassen met een lage imidazoolbuffer om onzuiverheidseiwitten te verwijderen. Baan 6: Elutie van 6xHis-SUMO-TRF2 met een buffer die 300 mM imidazool bevat. Baan 7: Vertering van SUMO-tags door het SUMO-protease-enzym. Baan 8: Herzuivering met Ni-kolom en elutie van TRF2 (6xHis en SUMO-tags verwijderd) met een buffer die 20 mM imidazool bevat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bereiding van terminale restrictiefragmenten (TRF). (A) Stroomschema voor de bereiding van TRF's uit menselijke cellen. (B) Onderzoek van de integriteit van genoom-DNA met behulp van een 1% agarosegel voor 5 menselijke cellijnen. (C) TRF-analyse uitgevoerd door Southern blotting voor 5 menselijke cellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbereiding van mechanische tests met één molecuul. (A) Stroomdiagram van de voorbereiding van een flowcel voor mechanische tests met één molecuul. (B) Schematische weergave van mechanische tests met één molecuul met behulp van een magnetisch pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Ontwerp van een mechanische test met één molecuul. (A) Stroomschema voor het genereren van een script voor het uitvoeren van een kracht-ramp-test. (B) Het bewegingsprofiel van magneten langs de z-as. (C) Het krachtprofiel dat overeenkomt met de beweging van de magneet. (D) De correlatie tussen de posities van de magneten en de daaruit voortvloeiende krachten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Telomere DNA-eiwitinteracties onderzocht met een magnetisch pincet met één molecuul. (A) TRF1-telomeerinteracties werden onderzocht in kracht-ramp-assays (N = 10) in een buffer met 20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA en 100 mM NaCl bij 23 °C. De concentratie van TRF1 was 10 nM, met een krachtbelastingssnelheid van ±1 pN/s. (B) De TRF-kabel werd uitgerekt en ontspannen in krachtsprongtests. Het toegepaste krachtprotocol was Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN en Fmax = 20 pN. De buffer- en temperatuuromstandigheden waren hetzelfde als in (A). Framesnelheid = 200 Hz. (C) TRF1-telomeerinteracties werden onderzocht in krachtsprongtests met een TRF1-concentratie van 10 nM. (D) Dissociatiekinetiek van TRF1-telomeercomplexen. De logaritme van de dissociatiesnelheid bij geteste krachten (gemiddelde ± SD, n = 206) volgt het Kramer-Bell-Evans-model (rode curve en legendevergelijking). De inzet toont de gemiddelde dissociatietijd (<τ>) bij Ftest. (E) Verdeling van veranderingen in extensie (ΔL) bij ruptuurgebeurtenissen van TRF1-telomeercomplexen. Zwarte en rode rondingen vertegenwoordigen Gaussiaanse fittingen. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Li et al.41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Het aantal en de grootte van de DNA-lussen gevormd door TRF1 in een telomeer. (A) Telomeerlengte-afhankelijkheid van DNA-lusgroottes (ΔL) bij [TRF1] = 20 nM. Curven vertegenwoordigen Gaussiaanse fittingen. (B) Telomeerlengte-afhankelijkheid van ΔL bij [TRF1] = 40 nM. (C) Correlatie tussen ΔL en het aantal breuken per telomeer, N. De nul-orde correlatie is r = -0,20, met p < 0,001 (steekproefomvang = 1496). (D) Een cartoon die een mogelijk mechanisme illustreert dat de negatieve correlatie tussen ΔL en N verklaart, wat suggereert dat TRF1 een enkel telomeer met primaire lusdomeinen kan comprimeren tot een topologie van hoge orde. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Li et al.41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: MatLab-code voor het genereren van scripts.m Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Script voor constante kracht assay.txt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Script voor assay.txt van de geforceerde ramp. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Recepten Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van een magnetisch pincet voor de manipulatie van TRF's op het niveau van één molecuul 57,58,59. We gebruiken magnetische kralen om TRF's te scheiden van genomische DNA-fragmenten. Na restrictievertering binden TRF's zich aan de magnetische kralen, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden gescheiden van genomische DNA-fragmenten. Deze aanpak maakt manipulatie mogelijk met behulp van een magnetisch pincet, dat magnetische kralen effectief kan vangen, in tegenstelling tot optische pincetten die worden beperkt door transparantieproblemen. Bovendien, terwijl AFM voor manipulatie van één molecuul kan worden gebruikt, zijn extra stappen nodig om TRF's van magnetische kralen te dissociëren en ze tussen een mica-oppervlak en een uitkragende tip te immobiliseren. Daarentegen bieden magnetische pincetten een eenvoudigere en efficiëntere methode voor manipulatie van TRF's met één molecuul, waardoor deze extra stappen niet nodig zijn41.

Het handhaven van de integriteit van genoom-DNA en TRF's is cruciaal, aangezien manipulatie van één molecuul afhankelijk is van intacte TRF's. Met behulp van een magnetisch pincet rekken we TRF's uit en ontspannen ze door hun twee uiteinden vast te houden om eiwit-DNA-interacties te onderzoeken. Nauwkeurige krachtmeting op magnetische kralen is van fundamenteel belang voor mechanische tests met één molecuul54. Kubusvormige magneten moeten dus evenwijdig of loodrecht aan het lichtpad van de camera in een magnetisch pincet worden uitgelijnd (OPMERKING onder stap 4.3.3), zodat een nauwkeurige driedimensionale registratie van de hielpositie wordt gegarandeerd volgens vastgestelde vergelijkingen54,60. De offset van de magneet is cruciaal voor het bepalen van hun posities en de daaruit voortvloeiende krachten op magnetische kralen. We gebruiken #2 afdekglas met een dikte van ongeveer 0,2 mm voor consistentie of passen de offset in de vergelijking aan voor verschillende afdekglazen54. Framesnelheid is van vitaal belang voor het vastleggen van de dynamiek van eiwit-DNA-interacties, waardoor een sluitertijd van nul nodig is voor volledige gegevens over de verplaatsing van kralen. De motorische bewegingen, gecodeerd door een script, staan centraal bij het ontwerpen van mechanische tests met één molecuul. Kritieke parameters zoals krachtbelastingssnelheid, krachten en duur moeten iteratief worden ingesteld en geoptimaliseerd. Eiwitconcentraties die worden gebruikt in tests met één molecuul vereisen uitgebreide titratie om het optimale niveau te bepalen voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties. Initiële krachttesten kunnen worden uitgevoerd met behulp van kracht-ramp-assays met krachtspectroscopie, terwijl force-jump-assays interessante krachten op een constant niveau evalueren.

Bij het aanpassen van dit protocol kan men op enkele uitdagingen stuiten. Als TRF1 of TRF2 niet tot expressie wordt gebracht in E. coli, begin dan met een kleinschalig onderzoek, lyseer cellen en analyseer eiwitten via SDS-PAGE en kleuring, en bevestig met Western Blot met behulp van tag-specifieke antilichamen. Men moet het construct en het plasmide verifiëren om een correcte klonering te garanderen zonder mutaties, frameshifts of voortijdige stopcodons, en de geschiktheid van de promotor voor E. coli controleren. De expressie moet worden geoptimaliseerd door verschillende E. coli-stammen te testen (bijv. BL21(DE3), Rosetta), de groeitemperatuur (15-25 °C), de inductietijd (2-16 uur) en de IPTG-concentratie (0,1-1 mM) aan te passen. Inclusie-instanties moeten worden aangepakt door celpellets voor en na sonicatie te analyseren. Men moet codonbias aanpakken met stammen die zeldzame tRNA's of codonoptimalisatie leveren. Probeer verschillende groeimedia (LB, TB, automatische inductie) en verbeter de beluchting door de schudsnelheid en het kweekvolume aan te passen. Gebruik voor toxiciteitsproblemen streng gereguleerde promotors of vectoren met een lager aantal kopieën en voeg glucose (0,2%) toe om de expressie van lekkende lac-promotors te onderdrukken. Behoud de integriteit van het plasmide met de juiste antibioticaselectie en zorg voor volledige eiwitafgifte door de cellysemethodete optimaliseren 61,62.

Als er geen TRF-tethers worden gevonden in tests met één molecuul, is een mogelijkheid dat er niet genoeg initieel genoom-DNA is gebruikt. Probeer 500 ng genoom-DNA-equivalent van TRF's te gebruiken om een mechanische test met één molecuul op te zetten. Aanhoudende problemen met het vinden van TRF-kettingen in een magnetisch pincet kunnen te wijten zijn aan te lange verteringstijden van genomisch DNA. Houd de spijsverteringsprocedure onder de 12 uur om steractiviteit te voorkomen. Bovendien zou de vorming van G-quadruplexen bij de enkelstrengs overhang van telomisch DNA het gloeien van biotine-gelabelde oligonucleotiden voor binding aan magnetische kralen kunnen remmen. Om dit te voorkomen, moet u de kalium- of natriumionenconcentraties onder de 1 mM houden om de vorming van G-quadruplex te voorkomen en de kans op het vormen van TRF-tethers in de opstelling met één molecuul te vergroten. Bovendien helpt het verhogen van de verwarmingstemperatuur tijdens de gloeistap (stap 3.2.5) om G-quadruplexen te destabiliseren en vergemakkelijkt het de binding van biotine-gelabelde oligonucleotiden aan TRF's.

In aanwezigheid van TRF1- of TRF2-eiwitten kunnen TRF-DNA-tethers strak samengeperst raken en te moeilijk uit te rekken in een magnetisch pincet vanwege de overvloed aan bindingsplaatsen op het telomeer voor deze eiwitten. Het titreren van de eiwitconcentraties kan helpen bij het identificeren van optimale niveaus voor mechanische tests met één molecuul. De eiwit-DNA-bindingsaffiniteit kan worden beoordeeld met behulp van EMSA- of SPR-assays om de dissociatieconstante (Kd) te bepalen, die vervolgens geschikte concentraties kan bepalen voor tests met één molecuul.

De beperkte hoeveelheid TRF's die uit genoom-DNA worden gegenereerd, zou de efficiëntie van tests met één molecuul kunnen tegenhouden. Bijgevolg kan het verzamelen van gegevens over één molecuul langer duren in vergelijking met het gebruik van kunstmatig gesynthetiseerde telomere DNA-constructies. Het gebruik van telomeren die rechtstreeks afkomstig zijn van het menselijk genoom biedt echter verschillende voordelen die kunstmatig telomisch DNA, gewoonlijk bereid door plasmide in bacteriën of PCR-methoden, niet kan bieden. Een voordeel is dat menselijke TRF's heterogeen van lengte zijn, waardoor de afhankelijkheid van telomeerlengte in eiwit-DNA-interacties kan worden onderzocht. Kunstmatig telomeer-DNA daarentegen is meestal uniform van lengte, en het genereren van kunstmatig telomeer-DNA van verschillende lengtes zou tijdrovend en arbeidsintensief zijn. Bovendien bevatten menselijke TRF's originele sequenties van cellen, waaronder natuurlijke markers zoals modificaties, mutaties en schade. Dit maakt het mogelijk om eiwit-DNA-interacties onder fysiologische of pathologische omstandigheden te onderzoeken, wat niet mogelijk is met kunstmatig telomeer DNA.

Dit protocol is essentieel voor studies op het gebied van telomeerbiologie op het niveau van één molecuul en kan mogelijk ten goede komen aan de ontdekking van telomeergerichte geneesmiddelen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen of andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [Grant 32071227 to Z.Y.], Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 to Z.Y.), en State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Tianjin University) [Grant pilab2210 to Z.Y.].

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGrafische programmeersoftware 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrofotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86(2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148(2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148(2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685(2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328(2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503(2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114(2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712(2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Telomeric Protein DNAMagnetic TweezersSingle Molecule MethodsTRF2 PurificationTelomeric DNA PreparationShelterin ComplexForce Ramp AssayDNA Protein InteractionsDissociation KineticsSouthern Blotting

Gerelateerde artikelen