Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Samenvatting

Nauwkeurige kwantificering van kopieën van het vectorgenoom van adeno-geassocieerd virus (AAV) is van cruciaal belang, maar er moet nog een gestandaardiseerd protocol worden opgesteld. Dit protocol beschrijft een gevalideerde methode voor het bereiden van gezuiverde AAV-monsters en het uitvoeren van een digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd_PCR) om de virale genoomtiter betrouwbaar te kwantificeren.

Samenvatting

Adeno-geassocieerd virus (AAV) is een niet-pathogeen virus dat wordt gebruikt als toedieningsmiddel om therapeutische genen over te dragen aan patiënten. Nauwkeurige kwantificering van het aantal AAV-genoomkopieën in vectorpreparaten is essentieel voor bioprocesoptimalisatie en doseringsberekening in zowel preklinische als klinische studies van op AAV gebaseerde gentherapieproducten. Momenteel ontbreekt een consensusprotocol voor titratie van het AAV-virale genoom. Hier presenteren we een digitaal druppel PCR (dd_PCR) protocol voor de kwantificering van virale genomen in gezuiverde vectormonsters. Monsters worden behandeld met DNase I om onverpakte verontreiniging DNA te verwijderen. Met DNase behandelde monsters worden vervolgens gemengd met een geschikte primer-sondeset (ontworpen volgens het doel-AAV-genoom) en PCR-reagentia en vervolgens in een druppelgenerator geladen. De voorbereide druppeltjes worden overgebracht naar een PCR-plaat, waar PCR-amplificatie wordt uitgevoerd en geanalyseerd. De virale genoomtiter wordt berekend op basis van de concentratie (kopieën/μL), rekening houdend met monsterverdunningen. Een succesvolle meting toont een duidelijke scheiding van de positieve en negatieve druppelwolken, heeft ten minste 10.000 geaccepteerde druppels, toont een waarde tussen 10 kopieën/μL en 10.000 kopieën/μL, en heeft een variatiecoëfficiënt (CV) tussen herhalingen van minder dan 20%. Betrouwbare virale genoomtitratie zal helpen bij de ontwikkeling van veilige en effectieve op AAV gebaseerde gentherapieproducten.

Inleiding

Gentherapie is een therapeutische modaliteit die vaak wordt gebruikt om genetische aandoeningen te behandelen. Het ontwerp van een bepaalde gentherapie is specifiek voor de bijbehorende pathologie van de doelindicatie, maar alle gentherapieën omvatten de intracellulaire afgifte van genetisch materiaal aan doelcellen om een therapeutisch effect op te wekken¹. Gentherapie kan verder worden ingedeeld in verschillende categorieën, waaronder genvervanging voor mutaties met functieverlies, genuitschakeling voor functiewinstafwijkingen en technieken voor het bewerken van genen. Ongeacht de specifieke strategie die wordt gebruikt, moet het therapeutische nucleïnezuurmateriaal (een transgen genoemd) in een vector worden verpakt om gerichte intracellulaire afgifte te bereiken².

Hoewel er een verscheidenheid aan virale en niet-virale vectorsystemen beschikbaar is voor de ontwikkeling van gentherapie, wordt vaak gekozen voor adeno-geassocieerde virussen (AAV's) vanwege het brede virale tropisme en de lage immunogeniciteit die met deze groep virussen wordt geassocieerd ^1,2. Tot op heden hebben zeven gentherapieën die gebruik maken van AAV voor therapeutische genafgifte goedkeuring gekregen van het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) of de Food and Drug Administration (FDA) gericht op ziekten variërend van hemofilie (bijv. Roctavian) tot spinale musculaire atrofie (bijv. Zolgensma)³.

De productie van op AAV gebaseerde gentherapieën komt voort uit een goed begrip van het wildtype AAV zelf. AAV is een klein DNA-virus binnen de familie Parvoviridae dat bestaat uit 13 hoofdserotypen (AAV1-13)³. Het AAV-genoom bestaat uit een enkelstrengs DNA-molecuul van ~4,7 kb dat twee belangrijke open leesframes (ORF's) bevat die coderen voor de essentiële virale genen die nodig zijn voor genoomreplicatie, capside-assemblage en verpakking (rep, cap). Het virale genoom wordt zowel aan de uiteinden van 5' als 3' geflankeerd door palindromische nucleotidesequenties, ook wel omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) genoemd. Deze ITR's vormen haarspeldachtige structuren die een cruciale rol spelen bij genoomreplicatie en het verpakken van de novo virale genomen in nieuw gesynthetiseerde virale capsiden. AAV is een helper-afhankelijk virus en vereist daarom de expressie van ondersteunende genen van andere virussen, zoals het herpes simplex-virus (HSV) of adenovirus (AdV) om^{replicatiecompetent te} worden.

Om AAV's te produceren, wordt een geschikt celgebaseerd expressiesysteem gebruikt om de expressie van de virale capside-eiwitten en de daaropvolgende assemblage tot de novo virale deeltjes te vergemakkelijken, gevolgd door inkapseling van een ITR-geflankeerd geselecteerd transgen (ook wel een vectorgenoom genoemd). Dit proces maakt gewoonlijk gebruik van een drievoudig plasmidesysteem, bestaande uit (1) een plasmide met helpergenen afkomstig van een helpervirus, (2) een plasmide dat codeert voor de essentiële virale elementen (rep/cap) en (3) een plasmide met de therapeutische expressiecassette (gewoonlijk een transferplasmide genoemd)⁴. De unieke aanwezigheid van inverted terminal repeat (ITR) verpakkingssignalen die de therapeutische expressiecassette in het transferplasmide flankeren, zorgt voor een specifieke verpakking van het transgen, terwijl de virale genen die aanwezig zijn op de andere plasmiden meestal worden uitgesloten. Co-transfectie van dit drie-plasmidesysteem in een op cellen gebaseerd expressieplatform (meestal HEK293T cellen) resulteert in de productie van transductiecompetente, replicatie-deficiënte virale deeltjes die geschikt zijn voor gebruik in gentherapietoepassingen ^3,4.

Er zijn een aantal kritische kwaliteitskenmerken (CQA's) die verband houden met de productie van op AAV gebaseerde gentherapieën die moeten worden beoordeeld om de potentie, zuiverheid en veiligheid van het beoogde geneesmiddel te waarborgen⁴. Deze CQA's omvatten virustiter, capside-inhoud en aggregatie. Virustiter zelf is een combinatie van het aantal virale deeltjes (capside-titer) en het aantal vectorgenomen (vectorgenoomtiter) dat in een bepaald preparaat aanwezig is. Idealiter zou de verhouding tussen deze twee titers 1:1 moeten zijn, aangezien elk viraal deeltje één vectorgenoom zou moeten bevatten, maar inefficiënties in de verpakking van het vectorgenoom tijdens de biosynthese resulteren in de coproductie van lege of gedeeltelijk gevulde capsiden (die gedeeltelijke vectorgenoomsequenties en/of niet-vectorgenoomsequenties bevatten)⁵. De aanwezigheid van dergelijke onzuiverheden kan mogelijk ongerechtvaardigde immuunresponsen oproepen en concurreren om vectorbindingsplaatsen, waardoor het risico op immunotoxiciteit toeneemt en de transductiesnelheid van volledige capsiden wordt verlaagd⁶. Nauwkeurige kwantificering van AAV-genomen is daarom essentieel voor het vaststellen van het virustiter- en capsidegehalte. Dit heeft gevolgen voor zowel fundamenteel onderzoek als de gentherapie-industrie, die een nauwkeurige dosering vereist om zowel de veiligheid als de werkzaamheid van geneesmiddelen te behouden.

Digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd_PCR) is nauw verbonden geraakt met de kwantificering van de virustiter, omdat het kan worden gebruikt om het aantal vectorgenomen te bepalen dat aanwezig is in een bepaald preparaat⁷. Digitale PCR zelf werd voor het eerst geïntroduceerd in de jaren 1990 ^8,9 en dd_PCR is een verbetering van deze technologie die monsterverwerking met hoge doorvoer mogelijk maakt^10,11. In dd_PCR wordt een real-time PCR-reactie van 20 μl verdeeld in ongeveer 20.000 met olie omhulde druppels, die tot 96 van dergelijke reacties opleveren wanneer ze worden ondergebracht op een standaardplaat met 96 putjes. Vergeleken met conventionele kwantitatieve PCR (qPCR) biedt dd_PCR verschillende voordelen, waaronder verbeterde gevoeligheid, verhoogde precisie en directere en absolute kwantificering van doelsequenties zonder dat er standaardcurven nodig zijn. Bovendien vermindert het hoge niveau van partitionering in dd_PCR de impact van PCR-remmers en minimaliseert het de kans op vertekening door preferentiële amplificatie van bepaalde sjablonen, waardoor het een aantrekkelijke optie is voor analytische meting van vectorgenoomtitratie.

Protocol

Het hier beschreven protocol is ontworpen om de virale genoomtiter van een gezuiverde, in eigen huis geproduceerde AAV9-vector met groen fluorescerend eiwit (GFP) als het transgen¹² met een hoge mate van precisie te kwantificeren (tabel 1). Dit protocol is echter van toepassing op elk AAV-serotype en elk vectorgenoomontwerp, op voorwaarde dat de primer-/sondesets zijn ontworpen om zich te richten op het specifieke vectorgenoom van belang. Details van de reagentia, primers, sondes en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van voorraadoplossingen

OPMERKING: Bereid alle voorraadoplossingen die nodig zijn voor monsterverdunning voor op een PCR-werkstation om besmetting door vreemd DNA te voorkomen.

1. Bereid 10x PCR-analysebuffer voor, die bestaat uit 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂ en 0,01 % (w/v) BSA. Meet de pH van de oplossing en stel deze in op 8,3.
   NOTITIE: Deze oplossing kan maximaal 1 maand bij kamertemperatuur worden bewaard.
2. Bereid de AAV-verdunningsbuffer voor, die bestaat uit 1x PCR-testbuffer, 0,2 ng/μL zalmsperma geschoren (sss) DNA en 0,1% pluronisch F-68. Maak deze oplossing vers bij elke test en houd deze op 4 °C.
   OPMERKING: Als pluronisch F-68 niet beschikbaar is, kan een alternatief zoals Poloxamer 188 niet-ionische oppervlakteactieve stof worden gebruikt.

2. Voorbereiding van monsters - DNase I-behandeling en seriële verdunning

OPMERKING: Om DNA-verontreinigingen te verwijderen die de nauwkeurigheid van de vectorgenoomtitratie zouden kunnen verminderen, kan vrij DNA dat aanwezig is in het AAV-monster (inclusief resterend plasmide-DNA of niet-ingekapselde virale genomen) worden verwijderd voorafgaand aan PCR-amplificatie met behulp van DNase. Dit is mogelijk omdat de vectorgenomen zijn ingekapseld in de AAV-capsiden en daarom niet toegankelijk zijn tot de denatureringsstap van de PCR-reactie zelf (zie stap 5). Aangezien het vectorgenoomnummer in een bepaald monster onbekend is, is het bovendien noodzakelijk om een seriële verdunning van de monsters uit te voeren om ervoor te zorgen dat de metingen binnen de bovenste en onderste detecteerbare limieten blijven. Voer alle monstermanipulaties uit op een PCR-werkstation. Bewaar alle monsters op ijs, tenzij anders aangegeven.

1. Meng het voor analyse geselecteerde AAV-monster door het kort te vortexen en vervolgens te centrifugeren om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem van de buis met het monster achterblijft.
2. Voeg voor DNase-behandeling 45 μL van een oplossing met 1x DNase I-buffer, 0,1% pluronisch F-68 en 0,04 E/μL DNase I in DNasevrij water toe aan een PCR-stripbuis met 8 buizen van 0,2 ml.
3. Breng 5 μL monster over in het buisje met de DNAse-oplossing. Draai de monsters en centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem blijft.
4. Incubeer de monsters in een thermocycler gedurende 1 uur bij 37 °C en koel vervolgens af tot 4 °C. Plaats zo snel mogelijk na het bereiken van 4 °C op ijs.
5. Maak met behulp van een verse PCR-strip met 8 buisjes van 0,2 ml de juiste verdunningen van het met DNase behandelde monster in de AAV-verdunningsbuffer. Aanbevolen monsterverdunningen zijn afhankelijk van de verwachte vg-titer (tabel 2), maar streef naar ten minste 2 verschillende verdunningen per monster en voer elke verdunning in tweevoud uit. Zorg ervoor dat de monsters rigoureus (2.000-3.000 tpm) gedurende 5 s worden gedraaid voordat u een volume verwijdert.
6. Na seriële verdunning vortex u de monsters en centrifugeert u ze om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem van de buizen achterblijft.
7. Voeg een positieve controle toe waarvan de vg-titer bekend is, en een negatieve controle (alleen AAV-verdunningsbuffer) die ook wel de geen sjablooncontrole (NTC) wordt genoemd.
   OPMERKING: De positieve controle kan een in eigen huis geproduceerde AAV zijn of een in de handel verkrijgbaar AAV-referentiemateriaal, dat de doelvolgorde van de primers/sonde omvat.

3. Bereiding van dd_PCR mastermix

OPMERKING: Selecteer een geschikte doelsequentie binnen het vectorgenoom en ontwerp een voorwaartse primer, omgekeerde primer en hydrolysesondes die zijn gelabeld met FAM- of HEX-reporterfluoroforen volgens gepubliceerde richtlijnen¹³. Primers die zich richten op het transgen hebben de voorkeur boven primers die zich richten op de ITR's, aangezien het transgen specifiek is voor het ontwerp van het vectorgenoom en de secundaire structuur die verband houdt met de haarspeldvorming van de ITR's een efficiënte primerbinding kan belemmeren. Bovendien kunnen ITR-primers de AAV-titers overschatten als er gedeeltelijk gevulde capsiden aanwezig zijn die afgekapte vectorgenoomfragmenten bevatten en nog steeds een van de ITR-sequenties bevatten¹⁴. Bereid de dd_PCR mastermix voor in een speciale, aparte werkplek (pre-PCR-ruimte). Deze ruimte moet gescheiden zijn van de ruimte waar de monsters worden voorbereid om kruisbesmetting te voorkomen.

1. Laat de primer, sonde en dd_PCR supermix-reagentia op kamertemperatuur komen (20-25 °C). Draai daarna alle reagentia en centrifugeer de buisjes kort om alle vloeistof op de bodem van de buis op te vangen.
2. Bereid een volume van dd_PCR mastermix in een afzonderlijke microcentrifugebuis volgens het vereiste aantal reacties door de voorwaartse en achterwaartse primers, sonde, dd_PCR supermix en DNasevrij water te combineren volgens de volumes en concentraties beschreven in tabel 3.
   1. Draai de mastermix en centrifugeer de buis vervolgens kort om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem van de buis blijft.
      OPMERKING: Bereid altijd meer dd_PCR mastermixvolume voor dan nodig is (n + 1) om rekening te houden met het verlies van het pipetteervolume.
3. Breng 19,8 μl van de mastermix over in elke tube op een verse PCR-strip van 8 tubes van 0,2 ml.

4. Druppel generatie

OPMERKING: Samples en dd_PCR mastermix worden afzonderlijk gemengd voordat ze in een druppelgenererende cartridge worden geplaatst. Voer alle manipulaties uit op een PCR-werkstation, bij voorkeur een ander werkstation dan waar de monsters zijn voorbereid, om besmetting met amplicons te voorkomen. U kunt het PCR-werkstation ook grondig reinigen na het voorbereiden van de monsters.

1. Breng 2,2 μL van het verdunde monster over in het volume van 19,8 μL van dd_PCR mastermix in elk buisje van de PCR-strip met 8 buisjes en meng goed. Draai en centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem blijft.
2. Breng 20 μl van deze oplossing over in de putjes in de middelste rij "monsters" van een druppelgenererende patroon. Vermijd luchtbellen in de druppelgenererende cartridge; Dit kan ertoe leiden dat het instrument fouten geeft en dat er geen druppels worden gegenereerd.
   OPMERKING: Aangezien de patronen in 8-wells-formaat zijn, evenals de PCR-buisstrips, wordt aanbevolen om een 8-kanaals pipet te gebruiken.
3. Breng 60 μl van de druppelgenererende olie over naar de putjes in de onderste rij "olie" van de druppelgenererende patroon.
   OPMERKING: Laat nooit een putje van de druppelgenererende cartridge leeg; Vul het lege monsterputje met dd_PCR bufferregeling voor sondes (met het overeenkomstige volume zoals hierboven beschreven).
4. Plaats een rubberen pakking over de druppelgenererende cartridge en plaats deze in de druppelgenerator.
5. Nadat de druppeltjes zijn gegenereerd, gebruikt u een 8-kanaals pipet om langzaam 42,5 μl oplossing van de dd_PCR chip over te brengen naar een PCR-plaat met meerdere putjes.
   OPMERKING: Pipeteer langzaam en in een hoek van 45 graden om te voorkomen dat de druppels tijdens het pipetteren in de vloeistof terechtkomen. Inspecteer de plaat visueel zodat alle putjes gevuld zijn met dezelfde hoeveelheid vloeistof en druppeltjes zichtbaar zijn als een ondoorzichtige laag in het putje.
6. Sluit de plaat af met een aluminiumfoliedeksel in een heatsealmachine gedurende 5 s bij 180 °C.
   NOTITIE: Inspecteer visueel of alle putjes zijn afgedicht. Zo niet, herhaal dan nog eens 5 s bij 180 °C. De verzegelde plaat kan tot 4 uur bij 4 °C worden bewaard voordat deze wordt dd_PCR versterkt in een thermische cycler.

5. dd_PCR versterking

OPMERKING: De thermische cycler moet in een aparte ruimte van de pre-PCR-kamer worden geplaatst om pre-PCR-activiteiten ruimtelijk te scheiden van PCR-amplificatie en vals-positieve resultaten als gevolg van ampliconbesmetting te voorkomen.

1. Plaats de plaat in een thermische cycler (met een 96-deep well-reactiemodule) voor PCR-amplificatie en sluit deze goed af.
2. Configureer de thermocycler om te werken onder de omstandigheden beschreven in tabel 4 en met een reactievolume van 40 μL. Neem een voorverwarmingsstap op in de programma-instellingen en zorg ervoor dat het deksel wordt verwarmd tot 99 °C.
3. Wanneer het PCR-programma is afgelopen, houdt u de plaat minimaal 15 minuten op 4 °C om ervoor te zorgen dat de plaat volledig is afgekoeld.
   OPMERKING: De plaat kan 48-72 uur bij 4 °C worden bewaard voordat de druppels moeten worden afgelezen.

6. Druppel lezen

1. Plaats de plaat in een druppellezer, voer de volgende informatie in de systeemsoftware in en ga verder met lezen.
   OPMERKING: Experimenttype = Directe kwantificering; Supermix = dd_PCR supermix voor sondes (geen dUTP); Analysetype = enkel doel per kanaal; Doelinformatie, signaalkanaal 1 = FAM-kanaal of HEX-kanaal volgens de gebruikte sonde.
2. Annoteer de monsters zodat de positie van elk monster effectief kan worden bepaald en geïdentificeerd uit het gegevensbestand.

7. Analyse van de gegevens

1. Voer de gegevensanalyse uit met behulp van de compatibele software die door de fabrikant van de druppellezer wordt geleverd.
2. Voer een systeemgeschiktheidstest uit om de algehele prestaties (en dus betrouwbaarheid) van de test te evalueren.
   1. Controleer het aantal events (aantal druppels) dat voor elk putje op de PCR-plaat is gemeten. Idealiter ligt het aantal evenementen tussen de 15.000 en 20.000. Als het aantal gebeurtenissen <10.000 is, moet deze waarde worden uitgesloten van de analyse.
   2. Evalueer de 1D- of 2D-amplitudeplot en controleer op de aanwezigheid van druppelregen.
   3. Ga naar het tabblad gegevenstabel en exporteer de gegevens naar een Excel-bestand.
3. Bereken de vg-titer aan de hand van de onderstaande stappen:
   1. Het werkbereik van dd_PCR is 10-10 000 kopieën/μL. Sluit elke waarde die <10 kopieën/μL is uit van de analyse. Het aanbevolen bereik voor de dd_PCR apparatuur die hierin wordt gebruikt, is 25-5000 kopieën/μL.
      OPMERKING: De software voor gegevensanalyse levert een vectorgenoomnummer in overeenstemming met het PCR-reactievolume (40 μL), maar dit houdt geen rekening met de verdunningsfactoren die worden toegepast tijdens de monstervoorbereiding.
   2. Bereken de vg-titer van het monster per volume (meestal uitgedrukt als vg/ml) door rekening te houden met de verschillende verdunningsfactoren tijdens de monstervoorbereiding aan de hand van de volgende relatie:
      OPMERKING: Concentratie (waarde verkregen uit gegevensanalyse) x 10 (DNase I verdunning vóór de behandeling) x 10 (PCR-mastermixverdunning) x 1000 (μL tot ml) geselecteerde monsterverdunning (in AAV-verdunningsbuffer - bijv. tabel 2).
   3. Bereken de variatiecoëfficiënt (%CV) tussen de replicaten en tussen de verschillende verdunningen van hetzelfde monster.
      OPMERKING: %CV wordt berekend door de standaarddeviatie te delen door het gemiddelde. Als de %CV tussen de verschillende verdunningen >20 % bedraagt, moet de waarde niet als nauwkeurig worden beschouwd.
   4. Controleer de waarden van de negatieve en positieve controle. De negatieve controle moet minder dan 5 kopieën/μl zijn.

Resultaten

Resultaten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de juiste software. Voor elke put geeft de 1D-amplitudeplot alle druppels weer ten opzichte van hun amplitude. Er wordt een duidelijke scheiding verwacht tussen positieve en negatieve druppels. Als meer dan 10% van het totale aantal druppels wordt gevonden tussen de positieve en negatieve druppelwolken (een fenomeen dat druppelregen wordt genoemd), is het noodzakelijk om het monster opnieuw te meten (zie figuur 1). Aanvullende informatie over druppelregen is beschikbaar in de discussie.

Er kan een gegevenstabel worden gemaakt om alle geregistreerde informatie samen te vatten, inclusief de naam van het monster, het aantal geaccepteerde druppels (gebeurtenistellingen) en de concentratie (kopieën/μL). Idealiter zou het aantal gebeurtenissen tussen de 15.000 en 20.000 geaccepteerde druppels moeten vallen. Als het aantal gebeurtenissen voor een put lager is dan 10.000, moet het gegevenspunt worden uitgesloten van de analyse. Een voorbeeld van de outputgegevens is te vinden in tabel 5.

De vg-titer kan worden berekend op basis van de concentratie (kopieën/μl), waarbij rekening wordt gehouden met monsterverdunningen. Het werkbereik van dd_PCR is 10-10.000 kopieën/μL. Waarden onder de 10 kopieën/μL moeten worden uitgesloten van de analyse. De vg-titer voor monsters, evenals de positieve en negatieve controles, moeten worden berekend. De gemeten waarde van de positieve controle moet een variatiecoëfficiënt (%CV) hebben die lager is dan 20% ten opzichte van de theoretische waarde. De negatieve controle moet minder dan 5 kopieën/μl zijn. Bovendien moet voor elk monster de %CV tussen herhalingen en verschillende verdunningen worden berekend. Als de %CV tussen verschillende verdunningen meer dan 20% bedraagt, kan de waarde als onnauwkeurig worden beschouwd en moet het monster mogelijk opnieuw worden gemeten.

Een succesvolle meting wordt gekenmerkt door een duidelijke scheiding van de positieve en negatieve druppelwolken, ten minste 10.000 geaccepteerde druppels, een waarde tussen 10 kopieën/μL en 10.000 kopieën/μL, en een %CV tussen herhalingen lager dan 20%.

Figuur 1: Visualisatie van dd_PCR druppels. (A) De 1D-amplitudegrafiek toont een duidelijke scheiding van positieve en negatieve druppels, wat wijst op een succesvolle druppelverdeling. (B) De grafiek toont een slechte scheiding van positieve en negatieve druppels, bekend als druppelregen, wat wijst op suboptimale partitionering of mogelijke problemen met de test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Workflow voor het kwantificeren van virale genomen met behulp van digitale druppel-PCR. (1) Buffers, reagentia en oplossingen worden bereid volgens de instructies van de fabrikant of stap 1 van het protocol (Bereiding van voorraadoplossingen). (2) 45 μL van de DNase I-oplossing wordt in elke buis van een PCR-strip met 8 buisjes gealiquoteerd. Na het vortexen en kort centrifugeren van de monsters, wordt 5 μL van het monster toegevoegd aan een van de buisjes. De DNase I en de monsterbevattende PCR-strip met acht buisjes worden gedurende 1 uur bij 37 °C in een thermocycler geïncubeerd, gevolgd door seriële verdunningen van de monsters. (3) De PCR-mastermix wordt bereid zoals beschreven en 19,8 μl wordt in elke buis van een PCR-strip met 8 buisjes gealiquoteerd. Sample seriële verdunningen uit stap 2 worden toegevoegd aan de mastermix. 20 μL van de mastermix plus
monsteroplossing wordt in de middelste rij van de cartridge geladen en 60 μl druppelgenererende olie wordt overgebracht naar de onderste putjes van een druppelgenererende cartridge. De cartridge wordt vervolgens in de druppelgenerator geplaatst en volgens de gespecificeerde voorwaarden uitgevoerd. Na het genereren van de druppel wordt 42,5 μl van de bovenste rij van de cartridge overgebracht naar een PCR-plaat met meerdere putjes. (4) De PCR-plaat wordt in een PCR-thermocycler geladen en uitgevoerd volgens de voorziene omstandigheden. De plaat wordt geanalyseerd met behulp van een dd_PCR lezer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Precisiegegevens. Deze tabel bevat precisiegegevens van vier sets kwaliteitscontrolemonsters (QC), elk met vijf concentraties (QC1-QC5). Elke QC werd vijf keer gemeten. De variatiecoëfficiënt (%CV) tussen verschillende reeksen, die de herhaalbaarheid (A) vertegenwoordigt, en tussen verschillende reeksen monsters, die de gemiddelde precisie vertegenwoordigt (B), wordt weergegeven. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Monsterverdunningen. De tabel toont de aanbevolen monsterverdunningen op basis van de verwachte virale genoomtiter (vg/ml). Er worden in totaal drie verdunningen aanbevolen om ervoor te zorgen dat ten minste twee waarden binnen het werkbereik van de test vallen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: dd_PCR samenstelling van de mastermix. Deze tabel geeft een overzicht van de samenstelling van de dd_PCR mastermix, die bestaat uit een voorwaartse en achterwaartse primer (909 nM), sonde (227 nM) en dd_PCR supermix voor sondes (zonder dUTP, 1x). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Thermocycling-omstandigheden. De tabel beschrijft het aanbevolen PCR-programma, dat omvat: (1) een incubatie van 10 minuten bij 95 °C voor capsideverstoring en enzymactivering, (2) 40 cycli van 30 s bij 94 °C voor DNA-denaturatie en 1 minuut bij 60 °C voor gloeien en extensie, (3) een incubatie van 10 minuten bij 98 °C voor enzymdeactivering, en (4) in bezit bij 4 °C. De gloeitemperatuur moet mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van de gebruikte primer-/sondeset. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Voorbeeld van uitvoergegevens van een werkelijke AAV-run. De tabel geeft een voorbeeld van uitvoergegevens van een werkelijke AAV-run, waarbij één monster werd gemeten in twee verschillende verdunningen, elk in tweevoud. De titer van het virale genoom (vg) (in vg/ml) wordt berekend met behulp van de volgende formule: 10 (DNase I voorbehandeling) x 10 (verdunning in de mastermix) x 1.000 (μL tot ml) x verdunning in AAV-verdunningsbuffer. STDEV staat voor de standaarddeviatie en CV geeft de variatiecoëfficiënt aan. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Nauwkeurige kwantificering van AAV-vectorgenoomkopieën in vectorpreparaten is essentieel voor de ontwikkeling van op AAV gebaseerde gentherapieproducten. Er bestaan verschillende methoden voor het bepalen van de vg-titer, waarbij kwantitatieve PCR (qPCR) en dd_PCR de twee meest gebruikte en geaccepteerde technieken zijn. dd_PCR heeft vaak de voorkeur boven qPCR vanwege de onafhankelijkheid van amplificatie-efficiëntie, hogere precisie en grotere robuustheid¹⁵. In de literatuur zijn talrijke protocollen beschikbaar voor vectorgenoomtitratie door dd_PCR, elk met zijn eigen monstervoorbereidingsmethoden 15,16,17. Er is echter een gebrek aan een gekwalificeerd consensusprotocol. Dit artikel presenteert een gevalideerd dd_PCR protocol voor de kwantificering van AAV-vectorgenomen in gezuiverde vectormonsters (Figuur 2).

Nauwgezette aandacht voor de behandeling van monsters is van cruciaal belang bij het uitvoeren van dit protocol. Kruisbesmetting kan een aanzienlijke uitdaging vormen bij het nauwkeurig beoordelen van vg-titers; daarom kunnen monsters het beste worden verwerkt onder een PCR-werkstation om besmetting met vreemd DNA te voorkomen. Bovendien is een goede uitvoering van DNase-incubatie van cruciaal belang om onverpakt verontreinigend DNA te elimineren zonder de capside te verstoren en mogelijk het verpakte vectorgenoom te verteren. Veel protocollen omvatten warmte-inactivatie en proteïnase K-behandeling 16,17,18. Tijdens de interne ontwikkeling van de methode werd echter vastgesteld dat overmatige verhitting schadelijk was voor vg-titratie en dat behandeling met proteïnase K niet nodig was (gegevens niet getoond).

Omdat dd_PCR steeds populairder wordt voor het kwantificeren van virale genomen, hebben fabrikanten gedetailleerde toepassingsgidsen gepubliceerd met richtlijnen voor het ontwerpen en optimaliseren van dd_PCR assays¹⁹. Er is ook informatie beschikbaar voor het oplossen van problemen. In de praktijk, wanneer een test correct is ontworpen, zijn de meest voorkomende problemen druppelregen en een laag aantal druppels. Druppelregen wordt vaak veroorzaakt door slechte toegankelijkheid van de primer/sondes tot het amplicon, maar verschillende strategieën kunnen dit probleem aanpakken. Een experiment met temperatuurgradiënt kan bijvoorbeeld helpen bij het bepalen van de optimale gloeitemperatuur. Bovendien kan het verdunnen van monsters om de DNA-hoeveelheid te verlagen (aanbevolen om minder dan 66 ng te zijn) of het uitvoeren van een restrictievertering met specifieke enzymen die buiten het amplicongebied snijden, de toegankelijkheid van de sjabloon verbeteren. Een aanbeveling van 10 U restrictie-enzym per μg DNA is doorgaans effectief. Het probleem van een laag aantal druppels (minder dan 10.000) is vaak te wijten aan slecht pipetteren van het monster en de olie in de cartridges. Langzaam pipetteren met de juiste tips wordt aanbevolen om afschuiving van de druppels te voorkomen. Hoewel de dd_PCR-test robuust is, is een beperking de verlengde tijd tot resultaat. Het proces van monsterbehandeling tot druppelmeting duurt enkele uren, wat een nadeel kan zijn als er snel resultaten nodig zijn.

Nauwkeurige kwantificering van AAV-genoomkopieën in vectorpreparaten is noodzakelijk in alle stadia van de levenscyclus van AAV-gentherapie. Het is met name belangrijk voor het optimaliseren van productie- en zuiveringsprocessen, het uitvoeren van preklinische studies en het bepalen van klinische doseringen voor op AAV gebaseerde gentherapieproducten. Het hier gepresenteerde dd_PCR protocol is breed toepasbaar en kan worden gebruikt op gezuiverde AAV-producten met verschillende serotypen en transgenen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
8-kanaals pipette 10 µL	Eppendorf	3,12,50,00,010
8-kanaals pipette 200 µL	Eppendorf	3,12,50,00,036
8-kanaals pipette 300 µL	Eppendorf	3,12,50,00,052
8-well PCR strip	Sarstedt	72.991.002
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
C1000 Touch Thermal Cycler met 96–Deep Well Reactie Module	Bio-Rad	1851197
ddPCR Buffer Control voor Probes 9 mL (2 x 4,5 mL)	Bio-Rad	1863052
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP) (2 x 1 mL)	Bio-Rad	1863023
ddPCR 96-Well Platen (pakket van 25)	Bio-Rad	12001925
ddPCR Droplet Reader Olie (2 x 1L)	Bio-Rad	1863004
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad	1863051
DG8 Cartridges voor QX200/QX100 (pakket van 24)	Bio-Rad	1864008
DG8 Gaskets voor QX200/QX100 (pakket van 24)	Bio-Rad	1863009
DNase I (10U/µL) + buffer	Roche	4716728001
Droplet Generation Olie voor Probes (10 x 7 mL)	Bio-Rad	1863005
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 0,1-10 μL, 34 mm, Rack, PCR Clean, STERIEL	Eppendorf	30078500
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 20-300 μL, 55 mm, Rack, PCR Clean, STERIEL	Eppendorf	30078560
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 2-100 μL, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERIEL	Eppendorf	30078543
Forward gelyofiliseerd primers en respectieve master stocks bij 100 mM	IDT		GFP als doelsequentie. Forward primer: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'
Lyofilisaat sonde en master stock bij 100 µM	IDT		GFP als doelsequentie. PrimeTime Eco Sonde: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/
Magnesium Chloride (MgCl2)	Chemlab Analytical	CL00.1381
Nuclease vrij water	IDT	11-04-02-01
PCR Plate Heat Seal, folie, doorboorbaar (pakket van 100)	Bio-Rad	1814040
Pluronic F-68 niet-ionogene oppervlakteactieve stof (100x)	Thermo Fisher Scientific	24040032
Kalium Chloride (KCl)	Honeywell research chemicals	31248
QX manager software	Bio-Rad		Software om ddPCR data te analyseren
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Reagens reservoir	VWR	613-1181
Reverse gelyofiliseerd primers en respectieve master stocks bij 100 mM	IDT		GFP als doelsequentie. Reverse primer: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'
SafeSeal reactiebuis, 1,5 mL	Sarstedt	72.706.200
Salmon Sperm DNA, gescheurd (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM9680
TE buffer	IDT		Bij bestelling samen met primers
Tris hydrochloride (Tris-HCl)	Roche	10812846001