Method Article

Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

DOI:

10.3791/67257

⸱

September 6th, 2024

 ,  , 
1Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het bestuderen van reacties van exciteerbare cellen in vitro, beschrijft het protocol optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen, evenals veranderingen in transmembraanspanning met geautomatiseerde extractie van relevante parameters.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prikkelbare cellen zoals neuronale en spiercellen kunnen primaire doelwitten zijn in snel opkomende behandelingen op basis van elektroporatie. Ze kunnen echter worden beïnvloed door elektrische pulsen, zelfs bij therapieën waarbij ze niet de primaire doelen zijn, en dit kan nadelige bijwerkingen veroorzaken. Om de op elektroporatie gebaseerde behandelingen van exciteerbare en niet-prikkelbare weefsels te optimaliseren, is het daarom nodig om de effecten van elektrische pulsen op prikkelbare cellen, hun ionkanalen en prikkelbaarheid in vitro te bestuderen. Voor dit doel werd een protocol ontwikkeld voor optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen. Met behulp van een fluorescerende potentiometrische kleurstof werden de veranderingen in transmembraanspanning gevolgd onder een fluorescentiemicroscoop en werden relevante parameters van celresponsen automatisch geëxtraheerd met een MATLAB-toepassing. Op deze manier konden de exciteerbare celreacties op verschillende elektrische pulsen en de wisselwerking tussen excitatie en elektroporatie efficiënt worden geëvalueerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij elektroporatie veroorzaken elektrische pulsen met hoge spanning een toename van de permeabiliteit van het plasmamembraan voor moleculen die anders slecht permeabel zijn1. Op elektroporatie gebaseerde technieken worden tegenwoordig veel gebruikt in toepassingen in de geneeskunde2, biotechnologie3 en voedingstechnologie4.

Prikkelbare cellen zoals neuronale en spiercellen behoren tot de primaire doelwitten in snel opkomende op elektroporatie gebaseerde behandelingen in het hart, de hersenen en de skeletspieren5. Bovendien kunnen ze worden beïnvloed door elektrische pulsen, zelfs bij therapieën waarbij ze niet de primaire doelen zijn, en dit kan nadelige bijwerkingen veroorzaken zoals pijn, spiertrekkingen en zenuwbeschadiging6. Elektrische pulsen kunnen namelijk elektrische stimulatie van exciteerbare cellen veroorzaken: ze activeren spanningsafhankelijke ionenkanalen en activeren actiepotentialen (AP). Bij hogere elektrische velden wordt het plasmamembraan van de cellen echter permeabiliseerd en treedt er extra ionische stroom door poriën/defecten op7. Deze extra ionische stroom beïnvloedt de prikkelbaarheid van cellen in een complex samenspel tussen excitatie en elektroporatie. Om de op elektroporatie gebaseerde behandelingen van exciteerbare en niet-prikkelbare weefsels te optimaliseren, is het daarom nodig om de effecten van elektrische pulsen op prikkelbare cellen, hun ionkanalen en prikkelbaarheid in vitro te bestuderen.

In een recente studie8 hebben we genetisch gemanipuleerde menselijke embryonale niercellen (HEK) onderzocht, ontwikkeld door Cohen et al.9,10, als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van elektroporatie in prikkelbare cellen. In deze anders niet-prikkelbare cellen wordt een minimale aanvulling van natrium- en kaliumkanalen (NaV1,5 en Kir2,1) tot expressie gebracht die nodig is voor prikkelbaarheid. De expressie van Kir2.1 in deze cellen wordt gecontroleerd door een door doxycycline geïnduceerd tet-on-systeem dat het mogelijk maakt om twee celvarianten tot stand te brengen: exciteerbare spiking S-HEK (met NaV1.5 en Kir2.1) en niet-exciteerbare niet-spiking NS-HEK-cellen (met alleen NaV1.5-kanalen). Dit stelt ons in staat om de effecten van elektrische pulsen op exciteerbare en niet-prikkelbare varianten van hetzelfde type cellen te vergelijken. Vergeleken met geïsoleerde primaire prikkelbare cellen, exciteerbare cellen gedifferentieerd van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, en cellijnen afgeleid van prikkelbare weefsels, hebben S-HEK-cellen verschillende voordelen: ze zijn gemakkelijk te hanteren, te cultiveren en te vermeerderen, hebben goed gedefinieerde natrium- en kaliumkanalen en genereren robuuste AP's8.

We hebben een protocol ontworpen voor het monitoren van veranderingen in transmembraanspanning (TMV) veroorzaakt door elektrische pulsen van verschillende amplitudes met behulp van een fluorescerende potentiometrische kleurstof. Op deze manier kunnen we bestuderen hoe elektroporatie de AP-generatie in S-HEK-cellen en andere veranderingen in de TMV in zowel S-HEK- als NS-HEK-cellen beïnvloedt. Kortom, de S-HEK- of NS-HEK-cellen worden elke 2 minuten blootgesteld aan een enkele elektrische puls van 100 μs, en relatieve veranderingen in fluorescentie worden geregistreerd gedurende ongeveer 3 s rond elke pulstoepassing. De toegepaste pulsen hebben een toenemende spanning, waarbij eerst AP's in cellen worden geactiveerd en, bij een hoger elektrisch veld, elektroporatie. Het interval van 2 minuten tussen pulstoepassingen werd gekozen om de mogelijke cumulatieve effecten van opeenvolgende pulsen te minimaliseren en tegelijkertijd de experimenten kort genoeg te houden om de cellen niet te verslechteren. De beeldverwerking werd geautomatiseerd met een aangepaste MATLAB-applicatie om relevante parameters van de fluorescentieresponsen van de potentiometrische kleurstof te extraheren, waardoor de veranderingen in TMV (AP's en aanhoudende depolarisatie als gevolg van elektroporatie) in S-HEK- en NS-HEK-cellen werden geëvalueerd.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van reagentia en celcultuur

  1. Bereid het celkweekmedium voor door Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose aan te vullen met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine, penicilline-streptomycine (penicilline 100 E/ml, streptomycine 100 μg/ml), 2 μg/ml puromycine, 5 μg/ml blasticidine en 200 μg/ml geneticine.
  2. Bereid een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4. Filtreer het door een steriliserend membraanfilter met een poriegrootte van 0,22 μm.
  3. Bereid Tyrode-oplossing met 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM glucose, pH 7,3. Bereid Tyrode-oplossing met een laag kaliumgehalte met 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM glucose, pH 7,3. Filtreer beide oplossingen door een steriliserend membraanfilter met een poriegrootte van 0,22 μm.
  4. Bereid 1 mg/ml poly-L-lysine stockoplossing door 5 ml PBS toe te voegen aan een injectieflacon met 5 mg poly-L-lysine.
  5. Bereid 2 mg/ml doxycycline-stockoplossing in gedestilleerd water en filtreer het door een steriliserend membraanfilter met een poriegrootte van 0,22 μm.
  6. Bereid 4 mM potentiometrische kleurstof ElectroFluor630 stockoplossing in pure ethanol (voeg 25 μL pure ethanol toe aan de buis met 100 nM - 73 μg van de kleurstof).
  7. Kweek genetisch gemanipuleerde HEK-cellen in een T25-kolf in 6 ml van het celkweekmedium zoals eerder beschreven8. De ingrediënten van het kweekmedium zijn lichtgevoelig; Houd het medium dus beschermd tegen licht (wikkel de mediumkolf in aluminiumfolie) en voer het passeren uit bij weinig licht.
  8. Voer de cellen om de 3-4 dagen door 3 x 105 of 5 x 105 cellen in een verse T25-kolf te zaaien. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Bewaar cellen in een masterkolf als niet-exciteerbare NS-HEK-cellen zonder toevoeging van doxycycline, omdat ze geen aanhoudende Kir2.1-expressie verdragen. Gebruik cellen uit passages lager dan 14 in de experimenten.

2. Voorbereiding van het monster

  1. Poly-L-lysine-coating van glazen afdekplaatjes
    1. Pipetteer 1 ml PBS in één putje van de glazen kamerglaasjes met 2 putjes, voeg 10 μl steriele 1 mg/ml poly-L-lysineoplossing toe en meng goed met een pipet.
    2. Incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap. Verwijder de PBS met poly-L-lysine zonder verder te wassen.
  2. Zaaien van de cellen
    1. Bereid een verdunning van 1:10 van de doxycyclinestockoplossing in een kweekmedium in een tube van 1,5 ml. Voor elk putje is 30 μl 1:10 doxycyclineverdunning nodig (3 μl doxycyclinestockoplossing en 27 μl kweekmedium), bereid het uiteindelijke volume voor afhankelijk van het totale aantal experimentele putjes.
    2. Verwijder het kweekmedium uit de T25-kolf en trypsiniseer de cellen met 2,5 ml trypsine-EDTA-oplossing in een CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 2 min.
    3. Voeg 2,5 ml vers kweekmedium toe en maak de cellen door voorzichtig pipetteren los van het oppervlak. Meng de celsuspensie goed.
    4. Tel de cellen met een hemocytometer en bepaal de dichtheid van cellen in suspensie.
    5. Bereken het volume trypsine-celsuspensie dat nodig is om de cultuur tot stand te brengen. Voor een 2-daagse kweek zaai je 2,5 x 105 cellen en voor een 3-daagse kweek 1 x 105 cellen per putje. Pas indien nodig het exacte aantal cellen aan.
    6. Bereken het volume van het kweekmedium door het eerder berekende celsuspensievolume af te trekken van 1470 μL. De resterende 30 μL vertegenwoordigt het volume van 1:10 doxycyclineverdunning. Het totale volume in elke put is 1500 μL (cellen, doxycycline en kweekmedium).
    7. Voor het bereiden van monsters met exciteerbare S-HEK-cellen pipetteert u het berekende volume kweekmedium en trypsinische celsuspensie in één putje en voegt u 30 μl 1:10 doxycyclineverdunning toe. Gebruik slechts één putje van de kamers met twee putjes, aangezien het experiment lang duurt (ongeveer 40 minuten). Meng goed door voorzichtig te pipetteren vlak voordat u de kamers in de CO2 -incubator plaatst.
    8. Voor het voorbereiden van monsters met niet-exciteerbare NS-HEK-cellen, pipettert u het berekende volume kweekmedium in een putje en voegt u 90% van het berekende volume celsuspensie toe voor S-HEK-cellen zonder doxycycline. NS-HEK-cellen groeien iets sneller dan S-HEK-cellen.
    9. Incubeer de kamers in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 2-3 dagen voorafgaand aan het experiment. Voor monsters met doxycycline is deze incubatietijd voldoende om de cellen prikkelbaar te maken.
  3. De cellen labelen
    1. Pipetteer vóór het experiment 3 μl potentiometrische kleurstofoplossing in een buis van 1,5 ml en laat de open buis bij kamertemperatuur in een laminaire stromingskap staan om de ethanol te laten verdampen en de potentiometrische kleurstof te laten drogen (ongeveer 15 minuten). Voeg 997 μL koud kweekmedium (uit een koelkast bij 4 °C) toe aan de tube en los de kleurstof op tot een uiteindelijke concentratie van 12 μM.
    2. Verwijder het kweekmedium uit het putje en voeg 1 ml potentiometrische kleurstofoplossing toe aan de cellen. Zet ze in de koelkast bij 4 °C en broed gedurende 20 min.
    3. Verwijder de potentiometrische kleurstofoplossing en bewaar deze in de tube voor verder hergebruik (voor maximaal zes opeenvolgende experimenten op 1 dag).
    4. Was de cellen voorzichtig 3x met Tyrode-oplossing en pipetteer na de laatste wasbeurt 1 ml Tyrode-oplossing met een laag kaliumgehalte in het putje.

3. Elektrostimulatie en elektroporatie

  1. Configureer de synchronisatie van de pulsafgifte met beeldacquisitie met behulp van een TTL-signaal van het microscoopsysteem dat de pulsgenerator activeert. Gebruik voor het genereren van hoogspanningspulsen een aangepaste pulsgenerator11 of een andere pulsgenerator die extern kan worden geactiveerd met een TTL-signaal.
    OPMERKING: In de gepresenteerde experimentele configuratie wordt LAS X-software gebruikt voor beeldacquisitie, die kan worden geconfigureerd om een TTL-signaal op een vooraf geselecteerd tijdstip te verzenden tijdens een time-lapse-acquisitie.
  2. Plaats twee parallelle Pt/Ir-draadelektroden, met een diameter van 0.8 mm en een afstand van 5 mm tussen de binnenranden, op de bodem van de kamer en bevestig de kamer onder de microscoop.
  3. Sluit de elektroden aan op de pulsgenerator. Sluit de uitgang van de pulsgenerator aan op een oscilloscoop met behulp van een spanning en een stroomsonde om te kunnen controleren of de pulsen tijdens het experiment correct zijn afgeleverd.
  4. Stel de cellen scherp in helderveld. Stel de cellen af die zich ongeveer in het midden tussen de elektroden bevinden.
  5. Begin met de eerste verwerving van fluorescentiebeelden in de time-lapse-modus met een 40x-objectief, waarbij het fluorescentiesignaal in het hele gezichtsveld wordt geregistreerd. De camera moet snel genoeg zijn om een duidelijk tijdsverloop van een actiepotentiaal te krijgen (idealiter hoger dan 25 frames/s).
    1. Verkrijg 80 foto's in een time-lapse-modus, met ten minste 25 frames/s om het real-time verloop van het actiepotentieel op te lossen. De totale duur van de beeldacquisitie resulteert in ongeveer 3 s. Belicht tijdens de beeldacquisitie de cellen met een excitatiegolflengte van 635 nm, een belichtingstijd van 10 ms en detecteer de emissie rond de 700 nm. Pas bij deze eerste acquisitie geen puls toe - deze acquisitie zal worden gebruikt om de volgende acquisities te corrigeren voor kleurstoffotobleken. Wacht na deze acquisitie 2 minuten.
      OPMERKING: Dit experiment gebruikt 27,8 frames/s, d.w.z. een periode van 36 ms, wat de tijd is vanaf het begin van de eerste beeldacquisitie tot het begin van de volgende beeldacquisitie in de time-lapse-opname).
  6. Neem elke 2 minuten een time-lapse op dezelfde manier op als in stap 3.5. Pas voor deze acquisities een enkele puls van 100 μs toe op het moment van acquisitie van het 10e beeld (bij 324 ms). Maak afbeeldingen met de volgende pulsspanningen: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V en 200 V. Schat het elektrische veld waaraan de cellen worden blootgesteld als de toegepaste spanning-tot-elektrode-afstandsverhouding (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 en 400 V/cm).
    OPMERKING: Bij lagere elektrische velden zullen de pulsen actiepotentialen activeren; Bij hogere elektrische velden zullen ze elektroporatie veroorzaken, die zich manifesteert als een langdurige depolarisatie. De duur van het experiment met elk celmonster is ongeveer 40 minuten (20 minuten voor labeling en 20 minuten voor microscopie).

4. Gegevensanalyse

  1. Exporteer de time-lapse-opnamen naar tiff-formaat.
  2. Plaats time-lapse-opnames van alle toegepaste spanningen tijdens een individueel experiment (één monster van cellen) in één map. Hernoem de time-lapse-opnames in een zodanige vorm dat elektrisch veld E kan worden herkend door de MATLAB-applicatie: Vcm (bijv. 126Vcm voor 126 V/cm). De overige delen van de naam kunnen willekeurig zijn. Voor de acquisitie aan het begin van het experiment waarbij geen puls wordt toegepast, wijzigt u de naam met de zin 000Vcm. Een voorbeeld van de namen van time-lapse-opnames: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, enz.
  3. Open de applicatie, die kan worden gedownload van
    https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Klik op Gegevensmap selecteren om de map met time-lapse-opnamen van één experiment te kiezen.
  4. Selecteer de pixels die moeten worden gebruikt voor verdere gegevensanalyse. Gebruik hiervoor twee schuifregelaars om de lage drempel te bepalen voor een duidelijk beeld van de membranen (in paars) en de hoge drempel voor het verwijderen van vuil (grote vlekken met hoge fluorescentie) uit de analyse (in groen).
  5. Selecteer Gegevens analyseren. Op het tabblad Analyse verschijnt een tabel met geëxtraheerde parameters. Aan de rechterkant van de tabel verschijnen grafieken van relatieve fluorescentie in de tijd voor elke gebruikte E. Selecteer grafieken voor een bepaalde E in het vervolgkeuzemenu aan de linkerkant boven de tabel.
  6. Bekijk alle grafieken en voer handmatige correctie uit in het geval van detectie van valse pieken. Selecteer AUTO-pieken wissen onderaan op het tabblad Analyse en de pieken die automatisch zijn gedetecteerd, worden gewist. Klik op de grafiek om handmatig een nieuw piekpunt te bepalen.
  7. Selecteer AUTO-piekdetectie opnieuw uitvoeren onder aan het tabblad Analyse om de automatische piekdetectie opnieuw uit te voeren. De geëxtraheerde parameters worden nu aangepast aan de nieuwe piek.
  8. Selecteer Gegevens exporteren rechtsonder op het tabblad Analyse om gegevens te exporteren naar dezelfde map in de vorm van een .mat-bestand, spreadsheetbestand en PNG-afbeeldingen voor elke gebruikte E.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veranderingen in TMV in exciteerbare cellen in vitro veroorzaakt door elektrische pulsen kunnen met dit protocol optisch worden gevolgd en de fluorescentiesignalen kunnen worden geanalyseerd om hun relevante parameters te extraheren.

De experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1A. Een typisch signaal van 100 μs elektrische puls dat in experimenten wordt gebruikt, wordt weergegeven in figuur 1B. Cellen in de kamers die onder de microscoop worden geplaatst, zien er meestal uit als de cellen in Figuur 1C (helderveldbeeld) en Figuur 1D (fluorescentiebeeld). We voeren een experiment uit waarbij elke 2 minuten een elektrische puls met toenemende spanning op dezelfde cellen wordt toegepast. Houd er rekening mee dat de interpulsatietijd van 2 minuten mogelijk niet lang genoeg is om de celmembranen volledig opnieuw af te sluiten en te herstellen, vooral bij gebruik van pulsen met de hoogste amplitude, die gepaard gaan met prominente elektroporatie. Er kunnen dus enkele cumulatieve effecten van de pulsen worden verwacht. Om deze cumulatieve effecten te voorkomen, kan de interpulsvertraging worden verlengd, maar ten koste van het verminderen van het aantal geteste pulsamplitudes en het voorkomen dat de cellen te lang op de microscoop worden gehouden.

Na het vastleggen van fluorescentiebeelden in experimenten, analyseert u ze met de aangepaste MATLAB-applicatie. Bepaal eerst de pixeldrempels (Figuur 2A); Door de lage drempel aan te passen, krijgen we een duidelijk beeld van de membranen rond de cellen (in paars), en door de hoge drempel aan te passen, verwijderen we het signaal van puin (groen). De applicatie bepaalt vervolgens de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van alle drempelpixels voor elke afgeleverde opeenvolgende puls om een tijdsafhankelijk signaal te verkrijgen van de relatieve verandering in fluorescentie F/F0. Dit signaal wordt gecorrigeerd voor fotobleken van kleurstof door de helling van de lineaire afname van F af te trekken van de time-lapse-registratie van de controle waarin geen puls werd toegepast (Figuur 2B). Na het corrigeren van het signaal worden de parameters van de reacties geëxtraheerd in de vorm van een in-app-tabel en een grafiek van het gecorrigeerde fluorescentiesignaal (Figuur 2C). In zeldzame gevallen detecteert het algoritme geen duidelijke piek of detecteert het valse ruissignalen als valse positieven. In deze gevallen heeft de gebruiker de mogelijkheid om handmatig het overeenkomstige punt in het fluorescentiesignaal als piek te selecteren of om de gedetecteerde valse piek te verwijderen (Figuur 2D - verwijdering van een kleine piek die abnormaal werd gedetecteerd voordat de elektrische puls werd toegepast).

Door de MATLAB-applicatie te gebruiken, kunnen we beelden krijgen van TMV-responsen op elektrische pulsen in zowel exciteerbare S-HEK- (Figuur 3A) als niet-exciteerbare NS-HEK-cellen (Figuur 3B). De volgende responsparameters worden geëxtraheerd (Tabel 1): aantal pieken (NoPeaks), gemiddelde piek-tot-piektijd (wanneer meer dan één piek wordt gedetecteerd, MPPT), maximale respons (MR), tijd tot eerste piek (TtFP) en tijd van piek tot 25%, 50%, 75% en 90% herstel (respectievelijk T25, T50, T75, T90). Deze parameters maken de evaluatie mogelijk van reacties op verschillende elektrische pulsen (bepalen bijvoorbeeld het aantal pieken dat wordt veroorzaakt door elektrische pulsen van verschillende E, Figuur 3C) en het samenspel tussen excitatie en elektroporatie.

figure-results-1
Figuur 1: De opstelling, golfvorm en S-HEK-cellen. (A) Het beeld van de kamer op de microscooptafel. (B) Voorbeeld van de golfvorm van een puls die in het onderzoek is gebruikt (spanning (U) in de tijd). (C, D) De afbeelding van S-HEK-cellen ((C): helderveld, (D): fluorescentie), schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Toepassing van data-analyse. (A) Het beeld van de applicatie-interface - drempelwaarde. (B) De grafiek van het ruwe en gecorrigeerde signaal van fluorescentieverandering. (C) De afbeelding van de applicatie-interface - geëxtraheerde gegevens. (D) Handmatige correctie van de piekdetectie (verwijdering van een kleine piek die abnormaal werd gedetecteerd voordat de elektrische puls werd toegepast, gemarkeerd met een rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve resultaten. (A, B) Triggerende veranderingen in TMV in (A) exciteerbare S-HEK en (B) niet-exciteerbare NS-HEK met 100 μs elektrische pulsen van verschillende amplitudes, resultaten van representatieve experimenten. Voor de duidelijkheid: alleen reacties op geselecteerde pulsen in de toegepaste pulssequentie worden weergegeven. (C) De parameters van TMV-responsen die worden geactiveerd door de pulsen van 100 μs met verschillende amplitudes: Voorbeeld toont het aantal pieken. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SE, aantal experimenten: N = 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

IndexE-sterkte
(V/cm)		Geen pieken
(-)		MPPT
(mevrouw)		MENEER
(-)		TtFP
(mevrouw)		Straat 25
(mevrouw)		T50
(mevrouw)		T75
(mevrouw)		T90
(mevrouw)
10
212692240.10436072108144180
315063540.09710872108144180
417621440.0893672108144180
520010.0750108144180252
625023960.06401082164322052
730010.059018011882448
835010.053010082340
940010.04701512

Tabel 1: Parameters van TMV-responsen veroorzaakt door de 100 μs-pulsen met verschillende amplitudes.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S-HEK-cellen zijn een eenvoudig prikkelbaar celmodel met goed gedefinieerde natrium- en kaliumkanalen, NaV1,5 en Kir2,19. Dit stelt ons in staat om diepgaande studies uit te voeren naar hoe exciteerbare cellen reageren op toegepaste elektrische pulsen en de experimentele gegevens te koppelen aan wiskundige modellen op basis van de bekende theoretische kenmerken van de kanalen die tot expressie komen in S-HEK-cellen. In onze vorige studie8 beschreven we de reacties van deze cellen op pulsen van 100 μs van toenemende E, zowel experimenteel als theoretisch. Bij een lagere E reageren de S-HEK-cellen met een enkele of meerdere actiepotentialen, terwijl bij een hogere E AP's langdurig worden en transformeren in een aanhoudende depolarisatie. Aangezien de aanhoudende depolarisatie ook duidelijk zichtbaar is in een niet-exciteerbare versie van deze cellen (NS-HEK), wordt dit toegeschreven aan elektroporatie en de daarmee gepaard gaande toename van de niet-selectieve ionische stroom.

Het gebruik van de fluorescerende potentiometrische kleurstof bleek een zeer effectieve manier te zijn om AP's en elektroporatie in prikkelbare cellen te bestuderen. In vergelijking met klassieke elektrofysiologische methoden, zoals patchklemmen, zijn optische metingen veel handiger, tijdbesparend en vereisen ze geen speciale technische vaardigheden. Bovendien interfereert het gebruik van elektrische pulsen met hoge spanning niet met de metingen, wat een probleem kan worden bij patchklemmetingen12. De belangrijkste nadelen van dit protocol hebben echter te maken met de aard van de kleurstof. Vanwege de fotobleking moet het opgevangen fluorescentiesignaal worden gecorrigeerd. De kleurstof diffundeert spontaan in de cel, zodat het signaal van de membranen na verloop van tijd afneemt. Om deze reden is de kleurstof geschikt voor het monitoren van actiepotentialen en andere kortetermijnveranderingen in TMV (~3 s in deze experimenten). Aangezien de kleurstof ratiometrische beeldvorming13 mogelijk maakt, zou een dergelijke beeldvorming sommige problemen met de kleurstofdiffusie kunnen voorkomen, maar ten koste van een lagere haalbare beeldvormingssnelheid. In deze experimentele configuratie zou ratiometrische beeldvorming te traag zijn om de vorm van actiepotentialen correct vast te leggen. Bovendien geven de gemeten veranderingen in de kleurstoffluorescentie kwalitatieve informatie over de verandering in TMV; Desalniettemin kan de kleurstof worden gekalibreerd om kwantitatieve metingen mogelijk te maken.

De geautomatiseerde beeldanalyse met behulp van een op maat gemaakte MATLAB-applicatie stelt ons in staat om in korte tijd een grote hoeveelheid gegevens te analyseren en efficiënt waardevolle kenmerken van TMV-responsen te extraheren. De applicatie is geconfigureerd om het fluorescentiesignaal van membranen van alle cellen in het gezichtsveld op te vangen. Dit verbetert de signaal-ruisverhouding, maar gaat ten koste van het verlies van informatie over hoe TMV verandert op individueel celniveau. In de gegeven experimentele configuratie was het signaal van individuele cellen te luidruchtig om bruikbare metingen mogelijk te maken. Bovendien waren de membranen van aangrenzende cellen moeilijk te onderscheiden. Niettemin drukken HEK-cellen endogeen gap junctions uit waardoor ze elektrisch zijn verbonden. Wiskundige modellering, gepresenteerd in de vorige studie8, toonde aan dat de cellen binnen het gezichtsveld vanwege hun elektrische verbindingen dichtbij genoeg zijn om AP tegelijkertijd te activeren. Bovendien wordt AP met hoge snelheid langs de celmonolaag voortgeplant (ongeveer 34 mm/s, geschat op basis van beeldvorming met 5x objectiefvergroting)8,9. Gezien de zijdelengte van het gezichtsveld (~ 0,33 mm), zou de AP deze lengte in ongeveer 10 ms afleggen, wat korter is dan onze beeldacquisitieperiode. Het AP-voortplantingseffect is dus niet te zien met deze vergroting en opnamesnelheid. Desalniettemin kan de voortplanting van de AP van de elektroden naar het gezichtsveld een vertraging veroorzaken tussen de toegepaste puls en de vastgelegde AP8.

In de vorige studie8, evenals in deze publicatie, worden de effecten van pulsen met een duur van 100 μs op de wisselwerking tussen prikkelbaarheid en elektroporatie beschreven. Dit protocol kan echter worden aangepast om elektrische pulsen te bestuderen met andere parameters (van verschillende duur, spanning, aantal, herhalingsfrequentie of vorm) of andere exciteerbare cellen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Sloveense Agentschap voor Onderzoek en Innovatie (ARIS) in het kader van onderzoeksprogramma P2-0249, infrastructuurprogramma I0-0022 en onderzoeksproject J2-2503. Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door ARIS en de Universiteit van Ljubljana door middel van financiering voor start-up onderzoeksprogramma's. Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Europese Unie en ARIS via NextGenerationEU en NOO-financiering in het kader van project MN-0023. Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Europese Unie via de ERC Starting Grant (nr. 101115323 - REÏNCARNATIE) en de Marie Skłodowska-Curie-beurs (nr. 893077 - EPmIC). De geuite standpunten en meningen zijn echter alleen die van de auteur(s) en komen niet noodzakelijkerwijs overeen met die van de Europese Unie of de Europese Onderzoeksraad. Noch de Europese Unie, noch de subsidieverlenende autoriteit kan hiervoor verantwoordelijk worden gesteld. De auteurs danken de groep van Adam E. Cohen van de Harvard University voor het vriendelijk verstrekken van de tet-on spiking HEK-cellen en Duša Hodžić voor haar hulp in het celkweeklaboratorium.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeRatiolab 5615000
2-well Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass SystemThermo Fisher Scientific 155379
ADP305 Differentiële spanningssondeTeledyne LeCroy
AP015 StroomsondeTeledyne LeCroy
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903
CO2 incubator PHCbi MCO -230AICUV
Doxycycline Sigma-Aldrich/MerckD9891
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium hoge glucose groeimediumSigma-Aldrich/MerckD5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)Potentiometric Probes31795
Foetaal runderserumSigma-Aldrich/MerckF2442
GeneticineThermo Fisher Scientific 10131035
GlutamineSigma-Aldrich/MerckG7513
Laminare stroming kapIskra Pio MC 15-2
MATLABMathworks
Penicilline-streptomycineSigma-Aldrich/MerckP07681
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/MerckP9155-5MG  
Pulsgenerator Op maat gemaaktzie referentie11
PuromycineThermo Fisher Scientific A1113803
T25 25cm² weefselkweekkolfTPP 90026
Tet-on spiking HEK cellenAmerican Type Culture Collection ATCCCRL-3479
Thunder Imager Live Cell systeem voor fluorescentiemicroscopieLeica Microsystems 
Trypsine-EDTA oplossingSigma-Aldrich/MerckT3924
WavePro 7300A OscilloscoopTeledyne LeCroy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
  2. Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  3. Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
  4. Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
  5. Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
  6. Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
  7. Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue. Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).
  8. Batista Napotnik, T., et al. Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells. Sci Rep. 14 (1), 720(2024).
  9. McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
  10. Tian, H., et al. Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators. Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).
  11. Sweeney, D. C., et al. Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses. Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).
  12. Pakhomov, A. G., et al. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).
  13. Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electroporation EffectsAction Potential GenerationSpiking HEK CellsTet On SystemExcitable CellsFluorescence MicroscopyPotentiometric DyeElectric Pulse StimulationIon Channel ActivityMATLAB Analysis

Related Articles