Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Samenvatting

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Samenvatting

Neutrofielen spelen een belangrijke rol in de aangeboren immuunafweer door verschillende strategieën te gebruiken, waaronder het vrijgeven van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in een proces dat NETosis wordt genoemd. In de afgelopen twee decennia is echter duidelijk geworden dat de accumulatie van NET in weefsels bijdraagt aan de pathofysiologie van meerdere ontstekings- en auto-immuunziekten. Daarom is de belangstelling voor de ontwikkeling van NETosis-antagonisten toegenomen. Variabele en niet-gestandaardiseerde methoden om NETosis te detecteren en te analyseren werden gelijktijdig ontwikkeld, elk met zijn eigen voordelen en beperkingen. Hier beschrijven we een real-time microscopiemethode voor de kwantificering van menselijke NET-afgifte, die het mogelijk maakt om zowel NETosis als NET-remming op een high-throughput manier te bestuderen. De oppervlakte-gebaseerde semi-geautomatiseerde analyse herkent NET's en onderscheidt ze van niet-netting geactiveerde neutrofielen. We tonen aan dat de niet-fysiologische NETosis-inductoren, calciumionofoor en phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA), de afgifte van NET's met verschillende kenmerken en kinetiek veroorzaken. Verder laten we zien dat deze benadering het mogelijk maakt om NET-afgifte te bestuderen als reactie op ziekterelevante stimuli, waaronder immuuncomplexen, N-formylmethionine-leucyl-fenylalanine (fMLF), mononatriumuraatkristallen en calciumpyrofosfaatkristallen. Om het nut van deze methode voor het bestuderen van NETosis-antagonisten te illustreren, gebruikten we CIT-013, een eersteklas monoklonale antilichaamremmer van NET-afgifte. CIT-013 richt zich op gecitrullineerde histon H2A en H4 en remt efficiënt de NET-afgifte met een IC₅₀ van 4,6 nM. Andere geteste anti-histon-antilichamen misten deze NETosis-remmende capaciteit. Al met al tonen we aan dat dit protocol specifieke, betrouwbare en reproduceerbare kwantificering van NET's met hoge doorvoer mogelijk maakt, waardoor de studie van NET-afgiftekenmerken, kinetiek en farmacologie van NETosis-antagonisten wordt verbeterd.

Inleiding

Neutrofielen zijn overvloedig aanwezig in het bloed en migreren naar weefsel bij infectie of ontsteking. Ze spelen een belangrijke rol in de aangeboren immuunafweer door uitgebreide wapens te gebruiken om de gastheer te beschermen tegen microben. Neutrofielen doden ziekteverwekkers via fagocytose, degranulatie, het genereren van reactieve zuurstofspecies (ROS) en het vrijkomen van gedecondenseerd chromatine, neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) genaamd, door een proces dat NETosis¹ wordt genoemd. NET's zijn extracellulaire structuren van chromatine versierd met onder andere granulaire eiwitten en calprotectine ^2,3, en worden vrijgegeven bij stimulatie met een breed spectrum van moleculen⁴. NETosis kan grofweg worden onderverdeeld in twee hoofdroutes: NADPH-oxidase-afhankelijk of onafhankelijk ^5,6,7. Bovendien is arginine-citrullinatie van N-terminale histonstaarten door peptidylargininedeiminase 4 (PAD4) nauw in verband gebracht met NETosis en bevordert het de decondensatie van chromatine, wat uiteindelijk leidt tot uitdrijving van gedecondenseerd chromatine in de extracellulaire omgeving.

Hoewel NET-afgifte betrokken is bij de eliminatie van ziekteverwekkers, hebben talrijke onderzoeken aangetoond dat abnormale en langdurige NET-afgifte verband houdt met de ontwikkeling van verschillende ontstekingsaandoeningen, waaronder acuut longletsel⁸, reumatoïde artritis (RA)⁹, vasculitis¹⁰ en hidradenitis suppurativa¹¹. De schadelijke rol van NET bij ziekten is veelzijdig, aangezien NET pro-inflammatoir is, een bron van auto-antigenen is, cytotoxisch is voor omliggende weefsels, immunotrombose veroorzaakt en osteoclastdifferentiatie en boterosie bevordert ^9,12,13. Farmacologische remming van de NETosis-route door PAD4-remmers met kleine moleculen toont aan dat NETosis-gerichte therapieën potentieel hebben als behandelingen voor ziekten waarbij NET-accumulatie een belangrijke aanjager is van de pathogenese¹⁴. In plaats van ons te richten op het PAD4-enzym, gebruikten we een eersteklas NETosis-remmend gehumaniseerd anti-gecitrullineerd histon monoklonaal antilichaam, CIT-013, dat specifiek bindt aan gecitrullineerde histonen H2A en H4¹⁵. CIT-013 heeft een uniek dubbel werkingsmechanisme door de afgifte van NET te remmen en macrofaag-gemedieerde NET-fagocytose^{te versterken 16}. CIT-013 en precursormoleculen hebben therapeutische werkzaamheid aangetoond in meerdere muismodellen van NET-geassocieerde ontsteking¹⁷.

Om de afgifte van NET te bestuderen, zijn in de loop der jaren verschillende methoden ontwikkeld, zoals, maar niet beperkt tot, 1) DNA-detectie met behulp van een ondoorlaatbare DNA-tracer van het plasmamembraan in combinatie met een immunofluorescerende plaatlezer, 2) enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)-gebaseerde detectie van DNA en DNA-gecomplexeerd met NET-specifieke eiwitten in supernatanten, 3) co-lokalisatie van NET-geassocieerde moleculen met extracellulair DNA via immunohistochemie, en 4) flowcytometriebenaderingen om nettende neutrofielen te detecteren. Al deze methoden hebben hun eigen voordelen en beperkingen. We hebben een real-time high-throughput benadering ontwikkeld voor microscopische kwantificering van menselijke NET-afgifte, waarbij gebruik wordt gemaakt van een plasmamembraanondoordringbare DNA-kleurstof^16,18. De beschreven methode maakt het mogelijk om de kinetiek en kenmerken van NETosis op een gemakkelijke, betrouwbare en reproduceerbare manier te onderzoeken en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten zoals CIT-013 mogelijk.

Protocol

Alle bloeddonoren gaven geïnformeerde toestemming in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de studie werd uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van Citryll voor onderzoek bij mensen.

OPMERKING: Alle activiteiten met menselijk bloed en geïsoleerde neutrofielen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een laminaire flowkast. Wanneer rem- en acceleratie-instellingen voor centrifugatie niet in het protocol worden vermeld, kunnen deze maximaal worden overwogen.

1. Neutrofiele isolatie uit bloed

1. Verzamel perifeer bloed van gezonde vrijwilligers in lithium-heparinebuisjes en breng het bloed over naar een vers buisje van 50 ml.
2. Spoel lithium-heparinebuisjes met 1x DPBS en breng over naar hetzelfde buisje van 50 ml als waar het bloed naar is overgebracht. Zorg ervoor dat de uiteindelijke bloed/DPBS-verhouding 1:1 is. Meng bloed en DPBS door te pipetteren om een homogene oplossing te verkrijgen.
3. Voeg 13 ml dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een andere verse buis van 50 ml en voeg langzaam (met een pipet van 25 ml) het 1:1 verdunde bloed toe bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing tot een maximum van 50 ml.
4. Centrifugeer bij 400 x g en kamertemperatuur (RT) gedurende 40 minuten met minimale acceleratie en rem.
   OPMERKING: Er worden lagen gevormd. De lagen van boven naar beneden zijn als volgt: 1. plasma; 2. perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's); 3. oplossing voor dichtheidsgradiënt; 4. erytrocyten/neutrofielen.
5. Gooi eerst het plasma weg met een pipet van 10 ml en gooi vervolgens PBMC's en de dichtheidsgradiëntoplossingslaag zoveel mogelijk weg met een plastic Pasteurpipet zonder de erytrocyt/neutrofielenlaag te verstoren.
6. Resuspendeer de erytrocyt/neutrofielenlaag voorzichtig door te schudden en resruteer met een pipet van 25 ml in 15 ml 1x DPBS.
7. Voeg 25 ml 6% Dextran/0,9% NaCl-oplossing toe, meng de tube tien keer om en zet de tube 25 minuten rechtop bij RT.
   OPMERKING: Er worden lagen gevormd. De lagen van boven naar beneden zijn als volgt: 1. Neutrofielen; 2 erytrocyten.
8. Breng de neutrofielenlaag over in een verse buis van 50 ml met een pipet van 10 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 x g en RT.
   OPMERKING: Wees voorzichtig, want de neutrofielenkorrel bevat nog enkele erytrocyten en zit niet stevig vast aan de buis.
9. Gooi het bovenstaande weg door de celpellet te decanteren en opnieuw te suspenderen met een pipet van 10 ml in 10 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ en 0,1 mM Na₂EDTA; pH = 7,2) en voeg dan onmiddellijk 40 ml ACK-lysisbuffer toe.
10. Incubeer bij RT terwijl u de buis continu omkeert totdat de oplossing doorschijnend wordt (dit duurt 1-5 minuten en kan per donor verschillen) en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350 x g en RT.
11. Verwijder het bovenstaande en voeg langzaam en druppelsgewijs 5 ml kweekmedium met L-glutamine toe, aangevuld met 10% (v/v) door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 50 E/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine (hierna kweekmedium 10% genoemd) bovenop de neutrofielenkorrel zonder de neutrofielen in suspensie te brengen. Dit zal de meeste erytrocyten efficiënt uit de neutrofielenkorrel verwijderen.
12. Draai de buis van 50 ml voorzichtig rond totdat de meeste erytrocyten, die bovenop de neutrofielenkorrel aanwezig zijn, opnieuw zijn gesuspendeerd in het kweekmedium 10%. Verwijder vervolgens het bovenstaande door de buis te decanteren.
13. Resuspendeer de neutrofielenkorrel in 10 ml kweekmedium 10%, en wanneer volledig geresuspendeerd, voeg dan tot 50 ml kweekmedium 10% toe. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350 x g en RT.
14. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de celkorrel opnieuw in 10 ml kweekmedium 10%.

2. Neutrofielenkleuring om de zuiverheid te controleren door middel van flowcytometrie

1. Om de celconcentratie te bepalen, verdunt u de neutrofielensuspensie in 0,4% trypanblauwe oplossing (verhouding 1:1) en telt u de neutrofielen met een helderveldcelteller.
   OPMERKING: Andere telmethoden kunnen ook worden gebruikt.
2. Breng 1 x 10⁵ neutrofielen in kweekmedium 10% over in de putjes van een plaat met 96 putjes met V-bodem en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g en RT.
3. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 50 μL 1x DPBS aangevuld met 1% (w/v) runderserumalbumine (BSA) en 0,1% (v/v) NaN₃ (hierna aangeduid als fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer) met Fc-receptorblok (50x verdund).
4. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT en voeg 50 μL FACS-buffer toe met 50x verdund APC-Cy7-geconjugeerd muis anti-humaan CD45-antilichaam, 600x verdund PerCP-Cy5.5-geconjugeerd muis anti-humaan CD16-antilichaam, 133x verdund FITC-geconjugeerd muis anti-humaan CD66b-antilichaam en 500x verdunde fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof eFluor 506.
   OPMERKING: CD45 wordt tot expressie gebracht op leukocyten. CD66b wordt uitsluitend tot expressie gebracht in granulocyten. CD16 komt sterk tot expressie in neutrofielen, komt weinig tot expressie bij eosinofielen en komt niet tot expressie in basofielen.
5. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g en RT.
6. Gooi het supernatant weg, suspendeer de neutrofielen opnieuw in 175 μL FACS-buffer en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g en RT. Herhaal deze stap een keer.
7. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de neutrofielenkorrel opnieuw in 175 μl FACS-buffer. Analyseer monsters met behulp van een flowcytometriesysteem en bijbehorende software.

3. Analyse van de zuiverheid van neutrofielen met behulp van software voor flowcytometrieanalyse

OPMERKING: Analyse van flowcytometriegegevens werd uitgevoerd met behulp van de flowcytometrie-analysesoftware zoals aangegeven in de materiaaltabel.

1. Voer gating uit volgens de volgende stapsgewijze procedure.
   1. Stel een tijdpoort in de grafiek FSC-A vs. Tijd in om een gebied met de juiste celstroom te selecteren.
   2. Stel een celpoort in de grafiek SSC-A versus FSC-A in om cellen te selecteren en puin uit te sluiten.
   3. Stel een levensvatbare celpoort in de grafiek FSC-A vs. AmCyan-A in om levensvatbare cellen te selecteren.
   4. Stel een leukocytenpoort in de grafiek FSC-A vs. APC-Cy7 in om CD45+-cellen te selecteren.
   5. Stel een neutrofielenpoort in de grafiek FITC vs. PerCP-Cy5.5 in om onderscheid te maken tussen CD66b+CD16+ (neutrofielen), CD66b-CD16+ (eosinofielen) en CD66b-CD16- (basofielen, monocyten en lymfocyten).
   6. Stel een enkele celpoort in op de grafiek FSC-H vs. FSC-A om enkele neutrofielen te selecteren.
   7. Bepaal de zuiverheid van neutrofielen door afzonderlijke neutrofielen te presenteren als de frequentie van cellen (in de celpoort).
      OPMERKING: Om verder te gaan, moet de zuiverheid van neutrofielen meer dan 85% bedragen.

4. Live beeldvormende microscopie

OPMERKING: Deze test is geoptimaliseerd voor meerdere beeldvormingsplaten met 96 putjes en verschillende NETosis-stimuli en -antagonisten. Het onderstaande protocol beschrijft een algemeen beeld van de aanpak, dat kan worden gespecificeerd aan de hand van de meegeleverde tabellen.

1. Bereid een 0,001% poly-L-lysineoplossing door 0,01% poly-L-lysine te verdunnen in steriel H₂O met een verhouding van 1:10.
2. Voeg aan elk putje 0,001% poly-L-lysineoplossing toe en incubeer ten minste 1 uur bij 37 °C.
   OPMERKING: Het volume per putje is afhankelijk van de beeldvormingsplaat met 96 putjes (tabel 1).
3. Was de putjes 3 keer met 200 μL DPBS om overtollig poly-L-lysine te verwijderen. Voer alle stappen uit in de laminaire stromingskast. Verwijder het deksel van de plaat en droog de putjes aan de lucht door de plaat in de laminaire stromingskast te openen tot ze droog zijn (ongeveer 1 uur).
4. Bereken het aantal neutrofielen dat nodig is voor het experiment en breng een overschot over in een buisje van 15 ml. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350 x g en RT.
   OPMERKING: De hoeveelheid neutrofielen in elk putje varieert op basis van het type beeldvormingsplaat met 96 putjes (tabel 1). De celdichtheid is geoptimaliseerd om een goede scheiding van individuele cellen mogelijk te maken, wat nodig is voor een goede analyse. Als de neutrofielendichtheid te hoog is, zullen cellen en NET overlappen met aangrenzende cellen en NET's, wat de kwaliteit van de analyse beïnvloedt.
5. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de neutrofielen in een kweekmedium zonder fenolrood aangevuld met 2% (v/v) FBS, 50 E/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine, 10 mM HEPES en 1 mM CaCl₂ (hierna NET-assaybuffer genoemd).
6. Bereid de volgende werkoplossingen voor.
   1. Bereid 80 nM DNA-kleurstof voor in de NET-testbuffer.
   2. Bereid NETosis-stimuli voor in de NET-testbuffer.
   3. Bereid NETosis-antagonisten voor in de NET-assaybuffer.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat de concentraties van de hierboven beschreven werkoplossingen 4 keer zo hoog zijn als de uiteindelijke concentratie die nodig is in de put. Aanbevolen concentraties van NETosis-stimuli en NETosis-antagonisten variëren (Tabel 2 en Tabel 3).
7. Voeg 4x geconcentreerde DNA-kleurstof in de NET-testbuffer toe aan elk putje.
8. Voeg 4x geconcentreerde NETosis-stimuli in de NET-assaybuffer toe aan de corresponderende putjes en voeg de NET-assaybuffer alleen toe aan putjes zonder stimulus of aan putjes die gecoate immuuncomplexen bevatten (cIC; protocol in tabel 2).
9. Voeg 4x geconcentreerde NETosis-antagonisten in de NET-assaybuffer toe aan de corresponderende putjes. Voeg de NET-analysebuffer alleen toe aan putjes zonder antagonist.
10. Voeg neutrofiele suspensie toe aan elk putje.
    OPMERKING: Het volume van 4x geconcentreerde DNA-kleurstof, 4x geconcentreerde NETosis-stimuli in NET-assaybuffer, 4x geconcentreerde NETosis-antagonist in NET-assaybuffer, het aantal neutrofielen en het volume van neutrofielensuspensie per putje is afhankelijk van de beeldvormingsplaat met 96 putjes (Tabel 1). Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het pipetteren.
11. Centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 100 x g en RT en plaats de beeldvormingsplaat met 96 putjes in het analysesysteem voor levende celmicroscopie dat in een incubator is geplaatst bij 37 °C en 5% CO₂ .
    OPMERKING: Tijdens de eerste minuut van de incubatie kan er condensatie ontstaan op de bodem van de beeldvormingsplaat met 96 putjes. Dit moet worden verwijderd met een tissue.

5. Het plaatsen van de software van het levende analysesysteem van de celmicroscopie voor de verwerving

OPMERKING: Fasecontrast- en immunofluorescentiebeelden werden verkregen door een analysesysteem voor levende celmicroscopie dat werd aangestuurd door de analysesoftware.

1. Open de software van het analysesysteem voor live celmicroscopie en klik op Verbinden met apparaat. Voer gebruikersnaam en wachtwoord in. Klik op Plannen om te verwerven en klik op de plusknop (Schip lanceren toevoegen). Selecteer vervolgens Scannen op schema en klik op Volgende.
2. Als u een geheel nieuw schip wilt maken, selecteert u Nieuw in de sectie Schip maken en klikt u op Volgende. Selecteer Standaard in de sectie Scantype en klik op Volgende.
3. Selecteer de volgende scaninstellingen en klik op Volgende: Cel voor cel: Geen; Beeldkanalen: Fasecontrast en Groen (acquisitietijd 100 ms); Objectief: 20x.
4. Selecteer het juiste type vaartuig om te scannen in de sectie Scheepsselectie en klik op Volgende.
   1. Als u een plaat met 96 putjes #1 gebruikt, selecteert u Corning, plaat, 96, n.v.t., 3603, Corning met 96 putjes (Blk/Wht), microplaten.
   2. Als u een plaat met 96 putjes #2 gebruikt, selecteert u Nunc, Plaat, 96, N.v.t., 152028, Nunc opt bottom met 96 putjes (Blk/Wht), Microplaten.
5. Geef de locatie van het vat in de lade op en klik op Volgende. Selecteer in het gedeelte Scanpatroon de putjes die gescand moeten worden, selecteer het aantal afbeeldingen per putje (scan 4 afbeeldingen per putje om een representatief overzicht te krijgen) en klik op Volgende.
   OPMERKING: Selecteer geen lege putjes, omdat dit de autofocus beïnvloedt.
6. Geef informatie over het schip door onder andere de naam van de plaat in te voegen in het notitieboekje van het schip en klik op Volgende. Selecteer Analyse uitstellen tot later in de sectie Analyse instellen en klik op Volgende.
7. Definieer het scanschema voor het schip in de sectie Scanschema . Selecteer Maak een nieuw schema met scans met tussenpozen van en selecteer 1 uur. Selecteer Stoppen met scannen en 00:05 uur na de eerste scan. Klik op Volgende en klik op Toevoegen aan planning wanneer de scangegevens correct zijn.
   1. Wanneer het scanschema moet worden bewerkt, dubbelklikt u op het scanschema boven aan het scherm. Klik met de rechtermuisknop op het scanschema en wijzig en pas naar wens aan. Klik op het pictogram Diskette om het scanschema op te slaan.
      OPMERKING: Wanneer u meerdere vaten (platen) in hetzelfde experiment in beeld brengt, kunnen extra vaten worden toegevoegd aan het bestaande scanschema door op de plusknop (Lanceer toevoegen vat) te klikken, Scannen op schema te selecteren en op Volgende te klikken. Maak een geheel nieuw vat (zie stap 5.2 in dit protocol), kopieer een bestaand vat of gebruik een eerder gescand vat. Dit resulteert in sequentieel scannen met dezelfde frequentie en instellingen als de vorige plaat.

6. Live beeldvorming microscopie NET assay-analyse met behulp van de live celmicroscopie-analysesoftware

OPMERKING: Er werd software voor de analyse van levende celmicroscopie gebruikt om fasecontrast- en immunofluorescentiebeelden te analyseren (Materiaaltabel). Wanneer dit systeem niet wordt gebruikt, kan een vergelijkbare NET-analyse worden uitgevoerd met behulp van een softwarepakket in het publieke domein 4,18,19,20.

1. Open de analysesoftware voor live celmicroscopie en klik op Verbinden met apparaat. Voer uw gebruikersnaam en wachtwoord in en klik op Recente scans bekijken. Open het experiment naar keuze om te analyseren door te dubbelklikken op de scheepsnaam van het experiment.
2. Klik op Analyse starten en selecteer Nieuwe analysedefinitie maken. Klik op Volgende.
3. Selecteer Basisanalyse in de sectie Analysetype en klik op Volgende. Selecteer in de sectie Afbeeldingskanaal de optie Groen, deselecteer Fase en klik op Volgende.
4. Open het venster Afbeeldingslagen , selecteer Groen en deselecteer Fase. Schakel Automatisch schalen uit in het groene gedeelte en stel handmatig min en max in voor het groene kanaal om NET's van de achtergrond te onderscheiden.
   NOTITIE: Fasecontrast kan indien nodig worden in- en uitgeschakeld. Bijvoorbeeld om te bepalen of NET wordt uitgestoten in de extracellulaire omgeving.
5. Open het venster Scantijden van schepen en selecteer de juiste scantijd van het vaartuig waarin NET's aanwezig moeten zijn. Selecteer een reeks afbeeldingen die de variabiliteit binnen het experiment weergeven (afbeeldingen van positieve controleputjes met NET en afbeeldingen van negatieve controleputjes zonder NET). Deze afbeeldingen worden gebruikt om een voorbeeld van de analyse te bekijken en te verfijnen. Klik op Volgende.
6. Open het venster Instellingen voor analysedefinitie en begin met het aanpassen van de analyse-instellingen voor het groene kanaal op een zodanige manier dat de NET-structuren worden geschetst zonder vals-positieve of vals-negatieve NET's te maken. Gebruik de volgende instellingen en klik op Voorbeeld van huidig of Voorbeeld van alles om de instellingen toe te passen op respectievelijk de huidige of alle afbeeldingen.
   1. Selecteer NET's voor de naam van het object.
   2. Selecteer voor segmentatie Geen achtergrond aftrekken - Adaptief.
   3. Selecteer voor drempel-GCU tussen 3 en 5 (afhankelijk van het experiment).
   4. Selecteer voor randsplitsing AAN (tussen -10 en 0).
   5. Selecteer voor het opschonen Gatvulling: 100 μm² en Grootte aanpassen: -1 pixels.
   6. Selecteer voor filters afhankelijk van het experiment, maar de aanbevolen afkapwaarden zijn: Gebied: >200 μm², Gemiddelde intensiteit: <24,6, Geïntegreerde intensiteit: >7000.
      OPMERKING: Structuren die zijn geselecteerd op basis van de gebruikte instellingen zijn omlijnd met magenta. Door met de muis over deze structuren te gaan, krijgt u meer informatie over de parameters van de objecten (d.w.z. oppervlakte, excentriciteit, geïntegreerde intensiteit en gemiddelde intensiteit), wat helpt om de analyse met betrekking tot in- of exclusiecriteria voor NET-parameters te optimaliseren. Controleer meerdere beelden (van positieve en negatieve controleputjes) om te testen of de analyse-instellingen correct zijn.
7. Wanneer de instellingen voor de NET-analyse correct zijn, klikt u op Volgende. Selecteer de tijdstippen en putten die u wilt analyseren in de sectie scantijden en putjes en klik op Volgende. Voeg de definitienaam in de sectie Analyse opslaan en toepassen in de sectie en klik op Volgende. Klik op Voltooien wanneer de analyse-informatie is geverifieerd en correct is.
   OPMERKING: Wanneer u meerdere platen analyseert of analyses van eerdere experimenten gebruikt, start u de analyse en selecteert u Bestaande analysedefinitie kopiëren of Bestaande analysedefinitie gebruiken en klikt u op Volgende. Selecteer de juiste bestaande analysedefinitie en klik op Volgende. Ga voor de daaropvolgende analyseprocedure naar stap 6.4 als er is gekozen voor het kopiëren van de bestaande analysedefinitie , of naar stap 6.7 als er is gekozen voor het gebruik van de bestaande analysedefinitie .
8. Open de experimentanalyse door op de analyse in het betreffende vaartuig te klikken. Open het venster Grafiekstatistieken .
9. Klik op de plusknop (Metriek maken). Gegevens kunnen worden weergegeven als percentage NET-confluentie (het percentage van het beeldgebied gemarkeerd als NET) of percentage salderende neutrofielen (aantal NET's gedeeld door het aantal cellen).
   1. Wanneer u gegevens presenteert als een percentage NETTO samenvloeiing, selecteert u Gebied in de sectie Metriek en selecteert u Samenvloeiing in de sectie Waarde . Wanneer u gegevens presenteert als neutrofielen die een percentage opleveren, selecteert u Aantal objecten in de sectie Metriek en selecteert u Per afbeelding in de sectie Waarde .
   2. Klik op OK. Selecteer NETs-gebiedssamenvloeiing (%) of NETs-objecttelling per afbeelding (per afbeelding) in de sectie Door de gebruiker gedefinieerde metrische gegevens . Selecteer alle tijdstippen die moeten worden geanalyseerd in de sectie Scans selecteren . Selecteer alle putten die moeten worden geanalyseerd in de sectie Putputten selecteren en klik op Gegevens exporteren.
10. Selecteer de volgende instellingen in de sectie Grafische export (Grafieken).
    1. Selecteer Elke scan weergeven als een afzonderlijke tabel (kolommen: 1, 2... rijen: A, B...).
    2. Selecteer Rij- en kolomlabels weergeven.
    3. Selecteer Alle scans in één bestand en klik op Bladeren om de bestandslocatie en -naam aan te passen.
    4. Selecteer Experimentdetails opnemen in de koptekst.
    5. Selecteer Gegevens opsplitsen in afzonderlijke afbeeldingen.
11. Klik op Exporteren om de gegevens te exporteren als een bestand '.txt', dat kan worden geïmporteerd en verder geanalyseerd in een spreadsheet.
    OPMERKING: Om het percentage salderende neutrofielen te bepalen, moet het aantal neutrofielen op t = 0 worden bepaald. Ga hiervoor verder met de volgende stappen van het protocol.
12. Ga naar stap 6.1 om de aanvullende analyse te starten die nodig is om het aantal neutrofielen voor afbeeldingen te tellen op t = 0.
    1. Selecteer in stap 6.3 Fase en deselecteer Groen in het gedeelte Afbeeldingskanaal.
    2. Selecteer in stap 6.4 t = 0 in het gedeelte over de scantijden van het vat.
    3. Schakel in stap 6.5 Groen uit, selecteer Fase en pas de instellingen van het fasekanaal aan indien nodig.
    4. Voeg in stap 6.6 Objectnaam toe, selecteer Classic Confluence in de sectie Segmentatie en stel de segmentatieaanpassing in op 0 (Achtergrond), pas Gatenvulling aan op 100 μm² en pas Gebied aan op 50 μm².
    5. Selecteer in stap 6.7 t = 0 in de sectie scans selecteren.
    6. Open in stap 6.8 de analyse van het aantal neutrofielen.
    7. Selecteer in stap 6.9 Objecttelling per afbeelding (per afbeelding) in de sectie Door de gebruiker gedefinieerde metrische gegevens .
    8. Gebruik ten slotte de volgende berekening om het percentage salderende neutrofielen te genereren: (aantal NET's / aantal neutrofielen op t = 0) x 100%.

Resultaten

Real-time high-throughput microscopie, in combinatie met een ondoorlaatbare DNA-kleurstof, maakt het mogelijk om de kinetiek, kenmerken en onderliggende routes van NETosis te bestuderen en maakt het mogelijk om potentiële remmers van NET-afgifte te beoordelen. Met deze benadering werden NET's gedefinieerd als structuren die positief zijn voor DNA-kleurstof met een significant groter oppervlak in vergelijking met het oppervlak van gezonde neutrofielen (Figuur 1A), wat aangeeft dat chromatine is uitgestoten in de extracellulaire omgeving¹⁸. De oppervlakte-gebaseerde analyse stelde ons in staat om onderscheid te maken tussen NET en geactiveerde neutrofielen met een gecompromitteerde plasmamembraanintegriteit, met heldere intracellulaire DNA-kleuring (Figuur 1A).

Calciumionofoor (A23187) en PMA worden vaak gebruikt om NETosis in vitro te induceren. Ondanks dat het niet-fysiologische stimuli zijn, zijn ze waardevol omdat ze verschillende NETosis-routes activeren en zorgen voor een consistente NETosis-inductie met een lage variabiliteit tussen donoren. A23187 veroorzaakt calciuminstroom, wat leidt tot PAD4-activering en afgifte van NET's die rijk zijn aan gecitrullineerde histonen, terwijl PMA het NADPH-oxidasecomplex activeert, wat resulteert in de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) en de daaropvolgende afgifte van NET's met lage niveaus van gecitrullineerde histonen ^5,16,21. De snelheid en omvang van de NETosis-respons zijn afhankelijk van de concentratie van elke stimulus (Figuur 1B,C), waarbij A23187 snellere NETosis induceert en PMA resulteert in een groter deel van de neutrofielen die NET's afgeven (Figuur 1D-F). NET's als gevolg van A23187-stimulatie (Figuur 1D; rode pijl) verschilden van PMA-geïnduceerde NET's (Figuur 1D; gele pijl) doordat ze meer diffuus waren buiten het neutrofiele plasmamembraan, terwijl PMA-geïnduceerde NET meer naast het neutrofiele plasmamembraan bleef. Bovendien resulteerde A23187-stimulatie in permeabele niet-nettende DNA-kleurstof-positieve neutrofielen (Figuur 1D; blauwe pijl), die hun DNA niet in de extracellulaire ruimte verdreven. De detectie van permeabele niet-nettende DNA-kleurstofpositieve neutrofielen was afhankelijk van de concentratie van A23187 (Figuur 1G) en bijna afwezig, ongeacht de concentratie PMA die werd gebruikt om NETosis te stimuleren (Figuur 1D,H). Naast het gebruik van de niet-fysiologische NETosis-stimuli A23187 en PMA, is deze test ook geschikt voor het bestuderen van ziekterelevante triggers van NETosis. Neutrofielen geactiveerd met oplosbare immuuncomplexen (sIC) of kristallen die aanwezig zijn bij calciumpyrofosfaatdispositieziekte (CPPD) vertoonden bijvoorbeeld een significant verhoogde NET-afgifte in vergelijking met geen stimulus. Een trend naar verhoogde NET-niveaus werd waargenomen wanneer neutrofielen werden geactiveerd met gecoate immuuncomplexen (cIC), fMLP en mononatriumuraat (MSU) kristallen (Figuur 1I); Voor deze stimuli zagen we echter een aanzienlijke variatie tussen donoren.

Farmacologische remming van de NETosis-route en NETosis-geassocieerde enzymen heeft aangetoond dat NETosis-gerichte therapieën effectieve behandelingen kunnen zijn voor ziekten waarbij NETosis-accumulatie de pathologie aanzienlijk stimuleert 14,17,22,23,24. Deze real-time microscopie NET-assay is een gemakkelijke, betrouwbare en reproduceerbare benadering om NETosis-antagonisten op een high-throughput manier te bestuderen. Om dit te illustreren, hebben we een eersteklas gehumaniseerd monoklonaal antilichaam gebruikt, CIT-013, dat zich richt op gecitrullineerde histon H2A en H4 met hoge affiniteit^15,16. A23187 activeert de NETosis-route, wat resulteert in NET's die gecitrullineerde histonen bevatten die vervolgens het doelwit zijn van CIT-013 om zijn NETosis-remmende functie uit te voeren¹⁶. Inderdaad, NET-release als reactie op A23187 werd volledig geremd door CIT-013 (Figuur 2A en Aanvullende Video 1), met een IC₅₀ van 4,6 nM (Figuur 2B). De NETosis-remmende capaciteit van CIT-013 is uniek omdat andere commerciële antilichamen gericht tegen verschillende (niet-) gecitrullineerde histonen niet in staat waren om de NET-afgifte te remmen (Figuur 2C).

Eerder hebben we aangetoond dat een zeer vergelijkbaar voorlopermolecuul van CIT-013 (dat twee aminozuren verschilt maar vergelijkbare epitopen met gelijke affiniteit bindt) NETosis blokkeert als reactie op fysiologische stimuli zoals geactiveerde bloedplaatjes, jicht gewrichtsvloeistof en RA synoviale vloeistof¹⁷. Hier laten we zien dat NET-afgifte geïnduceerd door sIC kan worden geremd door CIT-013 (Figuur 2D). De therapeutische relevantie van het remmen van NETosis geïnduceerd door deze stimulus wordt benadrukt door SLE, RA en andere auto-immuunziekten, waarbij auto-antilichamen in serum of gewrichtsvloeistof de vorming van IC ondersteunen, die NETosis veroorzaakt^25,26.

Samen tonen deze gegevens aan dat deze real-time high-throughput microscopiebenadering geschikt is voor het bestuderen van de kinetiek en kenmerken van NET-afgifte en de studie van remmers van NETosis mogelijk maakt. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor het gebruik van menselijke neutrofielen, kan het met aanpassingen ook geschikt zijn om neutrofielen van andere soorten te bestuderen. De gegevens die met deze test worden gegenereerd, zijn een hoeksteen van de grondgedachte voor CIT-013 als een krachtige en effectieve therapie voor NET-gestuurde ziekten.

Figuur 1: Real-time high-throughput microscopie voor het bestuderen van NET release. Neutrofielen geïsoleerd uit het bloed van gezonde vrijwilligers werden gestimuleerd met A23187 of PMA om de NETosis-route op gang te brengen. NET-release werd gevisualiseerd met real-time high-throughput microscopie met behulp van een ondoorlaatbare DNA-kleurstof van een plasmamembraan en gekwantificeerd op basis van het oppervlak met de software van het live celmicroscopie-analysesysteem. (A) Analyse van het oppervlak van niet-gestimuleerde gezonde neutrofielen (grijs), extracellulaire NET en permeabele niet-settende neutrofielen met intracellulaire DNA-kleuring (groen). (B,C) Kwantificering van de NET-afgifte in de loop van de tijd door neutrofielen gestimuleerd met de aangegeven A23187- of PMA-concentraties (n = 2). (D) Representatieve beelden van NET-release als reactie op A23187 (rode pijlen) en PMA (gele pijlen) op verschillende tijdstippen. Voorbeelden van permeabele neutrofielen die niet net vormen, zijn aangegeven met blauwe pijlen. (E) Kwantificering van de NET-afgifte in de loop van de tijd, gepresenteerd als een percentage van de NET-confluentie (n = 5). Statistieken werden uitgevoerd op t = 240 min. (F) Kwantificering van de NET-afgifte in de tijd, gepresenteerd als een percentage van de salderende neutrofielen (n = 2). (G, H) Kwantificering van permeabele niet-settende neutrofielen in de loop van de tijd uit neutrofielen die zijn gestimuleerd met de aangegeven A23187- of PMA-concentraties (n = 2). (I) Kwantificering van de NET-afgifte bij t = 240 minuten geïnduceerd door oplosbare immuuncomplexen (sIC), gecoat IC (cIC), fMLP, mononatriumuraat (MSU)-kristallen en kristallen aanwezig in calciumpyrofosfaatdispositieziekte (CPPD) (n = 8-28). De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. **P < 0,01 en ****P < 0,0001, Herhaalde metingen eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett (B), Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingstest van Dunn (I). Panelen A-F is aangepast met toestemming van van der Linden et ^al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: CIT-013 remt de NET-afgifte. (A) Kwantificering van A23187-geïnduceerde NET-afgifte bij t = 240 min bij afwezigheid (Geen Ab) of aanwezigheid van CIT-013 of isotypecontrole-antilichaam (cIgG). (B) Dosisafhankelijke remming van A23187-geïnduceerde NET-afgifte met CIT-013 bij t = 240 min (n = 3). Gegevens werden genormaliseerd naar cIgG (ingesteld als 100% NET release). (C) Kwantificering van A23187-geïnduceerde NET-afgifte bij t = 240 min in aanwezigheid van aangegeven concentraties van CIT-013, anti-histon H4-antilichaam, anti-gecitrullineerde histon H3-antilichaam #1 of anti-gecitrullineerde histon H3-antilichaam #2 (n = 6). (D) Kwantificering van de NET-afgifte bij t = 240 min geïnduceerd door oplosbare immuuncomplexen (IC's) in aanwezigheid van CIT-013 of cIgG. De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. P < 0,0001, Herhaalde metingen eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingen (A) of tweezijdige Wilcoxon-gematchte paren ondertekende rangschikkingstest (D). Panelen A, B en D zijn gewijzigd met toestemming van van Van der Linden et ^al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	Plaat met 96 putjes #1	Plaat met 96 putjes #2
Volume: 0,001% poly-L-lysine-oplossing per putje	50 μL	100 μL
Volume neutrofiele suspensie per putje	50 μL	87,5 μL
Aantal neutrofielen per putje	2 x 104 cellen	3,5 x 104 cellen
Volume: 4x geconcentreerd (= 80 nM) DNA kleurstof in NET assay buffer per putje	50 μL	87,5 μL
Volume: 4x geconcentreerde NETosis-stimuli in NET-assaybuffer per putje	50 μL	87,5 μL
Volume: 4x geconcentreerde NETosis-antagonisten in NET-assaybuffer per putje	50 μL	87,5 μL

Tabel 1: Volumes en celaantallen geoptimaliseerd voor verschillende beeldvormingsplaten met 96 putjes.

	Concentratie werkoplossing (4x geconcentreerd)	Uiteindelijke concentratie
Calciumionofoor (A23187)	50 μM	12,5 μM
PMA	16 nM	4 nM
fMLP	4 μM	1 μM
Mononatriumuraat (MSU) kristallen	400 μg/ml	100 μg/ml
Kristallen van calciumpyrofosfaatdispositieziekte (CPPD)	400 μg/ml	100 μg/ml
Oplosbare immuuncomplexen (sIC)	1. Voeg 5 μg/ml humaan serumalbumine (HSA) in DPBS toe aan 282,5 μg/ml polyklonaal anti-HSA-antilichaam van konijnen in DPBS.
	2. Incubeer gedurende ten minste 90 minuten bij 37 °C.
	3. Homogeniseer door vortexen en voeg 50 μL sIC-oplossing toe aan de overeenkomstige putjes.
Gecoate immuuncomplexen (cIC)	1. Voeg 10 μg/ml HSA in DPBS toe in de overeenkomstige putjes van de plaat met 96 putjes.
	2. Incubeer een nacht bij 4 °C.
	3. Was de putjes 3 keer met 200 μL 0,05% Tween-20 in DPBS (hierna PBS/0,05%Tween genoemd).
	4. Blokkeer de putjes met 200 μL 1% (m/v) runderserumalbumine in PBS/0,05% Tween (hierna blokkeerbuffer genoemd).
	5. Incubeer gedurende 120 minuten bij kamertemperatuur en zachtjes roeren (400 tpm).
	6. Was de putjes 3 keer met 200 μL PBS/0,05% Tween.
	7. Voeg 50 μL polyklonaal konijn anti-HSA-antilichaam in blokkeerbuffer toe aan de overeenkomstige putjes.
	8. Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en zachtjes roeren (400 tpm).
	9. Was de putjes 3 keer met 200 μL PBS/0,05% Tween.
	10. Was ten slotte de putjes 3 keer met 200 μL DPBS. Putten zijn nu klaar voor stap 4.7 in het protocol.

Tabel 2: Aanbevolen concentraties voor NETosis stimuli.

	Concentratie werkoplossing (4x geconcentreerd)	Uiteindelijke concentratie
Anti-Hen ei lysozym antilichaam (controle antilichaam; cIgG)	80 nM	20 nM
CIT-013	80 nM	20 nM

Tabel 3: Aanbevolen concentraties voor NETosis-antagonist.

Aanvullende video 1. Neutrofielen werden gestimuleerd met A23187 in aanwezigheid van cIgG (links) of CIT-013 (rechts), en de NET-afgifte werd in de loop van de tijd gevisualiseerd met behulp van de ondoordringbare DNA-kleurstof van het plasmamembraan. De afgifte van NET wordt geremd in aanwezigheid van CIT-013. De film is een overlay van DNA-kleurstof (groen) en fasecontrast. Deze video is verkregen met toestemming van van der Linden et ^al.16. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Sinds de ontdekking van NET's in 2004 zijn er veel strategieën ontwikkeld om de afgifte van NET in vitro experimenteel te onderzoeken, waarbij immunofluorescentiemicrokopie de meest gebruikelijke techniek is om NETosis te kwantificeren^27,28. Hoewel microscopie nuttig is om NET-afgifte te visualiseren, heeft het beperkingen omdat niet-geautomatiseerde microscopische kwantificering van beelden met een vast tijdstip nogal onnauwkeurig is en kan lijden aan vooringenomenheid van de waarnemer. Een andere techniek die wordt gebruikt om de afgifte van NET te bestuderen, is multispectrale beeldvormingsflowcytometrie^29,30, die grote aantallen nettende neutrofielen meet en een onbevooroordeelde analyse toepast, maar zich richt op neutrofielen in de vroege stadia van NETosis en niet kwantificeert neutrofielen die hun NET hebben vrijgegeven. Veel onderzoeken naar NETosis-kinetiek gebruiken een DNA-kleurstof om de NET-afgifte te kwantificeren in combinatie met een fluorescentieplaatlezer³¹. Deze techniek is niet in staat om NET's te onderscheiden van geactiveerde of stervende neutrofielen met intracellulaire DNA-kleuring en is daarom niet geschikt voor het kwantificeren van NET-afgifte en het bestuderen van NETosis-antagonisten. Het bovenstaande benadrukt dat benaderingen die momenteel worden gebruikt om NETosis te bestuderen waardevol zijn, maar hun beperkingen hebben.

De real-time microscopiemethode die in deze studie wordt beschreven, pakt veel problemen aan die in eerder gerapporteerde technieken zijn aangetroffen. Het biedt onbevooroordeelde, semi-geautomatiseerde, high-throughput, reproduceerbare en nauwkeurige NET-kwantificering. Deze benadering minimaliseert inderdaad pipetteerartefacten, zoals de uitgerekte morfologie van NET's^18, en het is in staat om NETosis te onderscheiden van necrose en apoptose door de verschillende morfologie en kinetiek van DNA-afgifte^18,32. Bovendien biedt deze benadering de mogelijkheid om verschillende biochemische routes voor gereguleerde celdood te bestuderen, zoals NET-vorming in necroptotische neutrofielen, die structuren genereren die voldoen aan de functionele en fenotypische criteria van NET³³.

Er zijn verschillende cruciale stappen in dit protocol die moeten worden gevolgd voor een succesvolle kwantificering van NET's. Ten eerste is het juiste aantal cellen per put belangrijk voor een nauwkeurige NET-kwantificering. Wanneer de dichtheid van neutrofielen te hoog is, zullen cellen en NET overlappen met aangrenzende cellen en NET's, waardoor ze moeilijk te onderscheiden zijn, en als gevolg daarvan zal kwantificering onnauwkeurig worden. Ten tweede is het een vereiste om een lage concentratie niet-toxische plasmamembraanondoordringbare DNA-bindende kleurstof te gebruiken om NET's te kleuren wanneer ze worden uitgescheiden in de extracellulaire omgeving. Plasmamembraanpermeabele DNA-bindende kleurstoffen kunnen gemakkelijk neutrofielenactivering of celdood induceren. Ten derde moeten meerdere beelden per putje worden gescand voor een representatief overzicht van de NET-afgifte onder de heterogene neutrofielenpopulatie. Ten vierde is het fasecontrastbeeld van neutrofielen op t = 0 nodig om het aantal neutrofielen per afbeelding te corrigeren en het percentage salderende neutrofielen te berekenen.

Hoewel deze real-time microscopiebenadering met hoge doorvoer veel voordelen heeft ten opzichte van andere NET-detectietests, zijn er beperkingen aan deze methode omdat, voor zover we weten, er geen fluorescerende kleurstoffen beschikbaar zijn om extra NET-componenten te detecteren om de afgifte van NET's te bevestigen. Fluorescerend gelabelde antilichamen voor het detecteren van extra NET-componenten kunnen worden gebruikt, maar kunnen ongewenste effecten hebben, aangezien antilichaam-immuuncomplexen de activering van neutrofielen en mogelijk NETosis beïnvloeden. Daarom geven we er de voorkeur aan om geen extra antilichamen te gebruiken in deze testopstelling en raden we aan om in plaats daarvan bekende NETosis-inducerende stimuli te gebruiken. Wanneer nog niet vastgestelde NETosis-stimuli worden gebruikt, pleiten we voor het gebruik van een ELISA om DNA te detecteren dat is gecomplexeerd met NET-specifieke eiwitten zoals gecitrullineerde histonen voorafgaand aan de live beeldvormingstest. Ten tweede kan variatie binnen en tussen tests het gevolg zijn van variabiliteit tussen donoren en donoren, waarbij neutrofielen van gezonde donoren anders reageren op verschillende NETosis-stimuli als gevolg van heterogeniteit binnen de gezonde populatie. Om de variatie in de test tot een minimum te beperken, moeten neutrofielen binnen 1 uur uit vers afgenomen bloed worden geïsoleerd en onmiddellijk in het experiment worden gebruikt, aangezien neutrofielen een korte levensduur hebben en niet kunnen worden ingevroren. Verder is het belangrijk dat een neutrofielenisolatieprotocol wordt gevalideerd en aangenomen om de activering van neutrofielen te minimaliseren. Neutrofielen zijn gevoelige cellen en kunnen tijdens het zuiveringsproces hun reactie op prikkels veranderen als gevolg van mechanische en andere soorten stress. De activeringsstatus van neutrofielen en de NET-afgifte kunnen worden beïnvloed door het type naald, de gebruikte bloedafnamebuisjes, de incubatietemperatuur, de centrifugatiesnelheid en de tijd van bloedafname tot neutrofielenisolatie 34,35,36,37. Een aanvullende isolatiemethode voor neutrofielen die kan worden overwogen, wordt beschreven door Krémer et ^al.36 met behulp van een negatieve immunomagnetische selectiemethode zonder lysis van rode bloedcellen. Deze methode lijkt op onaangeroerde neutrofielen in volbloed en kan geschikt zijn om activering van neutrofielen tijdens het zuiveringsproces te voorkomen. Al het bovenstaande zou moeten dienen om het veld te waarschuwen dat gegevens van verschillende onderzoeksgroepen met grote zorg moeten worden vergeleken.

Over het algemeen maakt de beschreven real-time high-throughput microscopiemethode een nauwkeurige kwantificering van NET's op een reproduceerbare en efficiënte manier mogelijk en kan deze worden gebruikt om de kenmerken, omvang en kinetiek van NET-afgifte te bestuderen en maakt het mogelijk om de activiteit van NETosis-antagonisten te onderzoeken. Als voorbeeld van het laatste gebruikten we het gehumaniseerde anti-gecitrullineerde histon H2A en H4 monoklonale antilichaam CIT-013, dat momenteel in klinische ontwikkeling is.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A-23187 Free Acid (Calcimycin)	Thermo Fisher	A1493
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma Aldrich	A9434
Anti-Hen egg lysozyme (control antibody; cIgG)	CrownBio	C0001
APC-Cy7-conjugated mouse anti-human CD45 antibody (Clone 2D1)	Biolegend	368515	Gebruik bij 1 µg/mL eindconcentratie
BD FACSCantoTM II system + FACSDiva software (versie 8.0.1)	BD	n/a	Flow cytometry systeem
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V	Roche	10735108001
CaCl2 (1 M)	VWR	E506
Calcium pyrophosphate disposition disease (CPPD) crystals	InvivoGen	lrl-cppd
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter + analysis software (versie 3.3.9.5)	Nexcelom Bioscience	n/a	Bright field cell counter
CIT-013	Citryll B.V.	n/a
Costar black 96-well plate, clear bottom	Corning	3603	96-well plate #1
Dextran T500	Pharmacosmos	551005009006
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Serena	S-FBS-SA-015
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Density gradient oplossing
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b antibody (Clone G10F5)	eBioscience	17-0666-42	Gebruik bij 1,5 µg/mL eindconcentratie
Fixable viability dye eFluor 506	eBioscience	65-0866-14
Flow cytometry analysis software	FLowJo	Versie 10.8.0
fMLP	Sigma Aldrich	47729-10MG-F
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Human serum albumin (HSA)	VWR	31020
Human TruStain FcX	Biolegend	422302	Fc receptor blokker
IBIDI 96-well plate, clear bottom	IBIDI	89626	96-well plate #2
IncuCyte SX3 + analysis software (versie 2022B Rev1)	Satorius	n/a	Live cell microscopische analyse systeem
Monosodium urate crystals	InvivoGen	tlrl-msu
Mouse anti-histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody	Cayman	17939	Clone 11D3; aangeduid als #1
Mouse anti-histone H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) antibody (Clone KM-2)	Absolute Antibodies	Ab01681-2.0
Na2EDTA	Sigma Aldrich	E5134
NaCl (0.9%)	B. Braun	25900
Penicillin (5000 U/mL) - Streptomycin (5000 µg/mL)	Gibco	15070-063
PerCP-Cy5.5-conjugated mouse anti-human CD16 antibody (Clone 3G8)	Biolegend	302027	Gebruik bij 0,33 µg/mL eindconcentratie
PMA	Sigma Aldrich	P1585
Polyclonal rabbit anti-HSA antibody	Sigma Aldrich	A0433-2ml
Poly-L-Lysine (0.01%)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma Aldrich	237205
Rabbit anti-histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody	Abcam	ab281584	Multiclonal; aangeduid als #2
RPMI 1640 with GlutaMAXTM supplement	Gibco	61870-010	Cultuurmedium met L-glutamine
RPMI 1640 without phenol red	Gibco	11835-030	Cultuurmedium zonder fenolrood
Sodium azide (NaN3)	Sigma Aldrich	S2002
Sterile H2O	Gibco	15230204
Sytox Green Nucleid Acid Stain	Thermo Fisher	S7020	DNA kleurstof
Trypan blue solution (0.4%)	Gibco	15250-061
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Vacutainer blood tubes Li-Heparin (17 IU/mL)	BD	367526