Methodenartikel

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

DOI:

10.3791/67260

⸱

9 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IDH1-mutant diffuse laaghangstroomgliomen zijn zeldzame tumoren die moeilijk te kweken zijn. We introduceren een eenvoudige, niet-enzymatische explant-methode die de expressie van IDH1-mutante eiwitten behoudt en culturen maandenlang in stand houdt. Belangrijk is dat deze techniek werkt met diepvriesgeconserveerde tumoren en een waardevolle bron biedt voor glioomonderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diffuse glioma's, de meest voorkomende primaire hersentumoren, worden ingedeeld in laag- en hooggradige tumoren op basis van histopathologische criteria en genetische mutaties. Diffuse laaggradige glioma's vormen een subgroep, die voornamelijk jonge volwassenen treft en vatbaarheid voor hooggradige glioma's veroorzaken. Er zijn twee hoofdtypen diffuse laaggradige glioma's: astrocytomen en oligodendrogliomen, elk gedefinieerd door specifieke genetische en histologische kenmerken. Deze tumoren vertonen kenmerkend een gemuteerde variant van het metabolische enzym IDH1, wat cellulaire differentiatie verstoort. Ze zijn heterogeen en bevatten zowel proliferatieve stamcellen als meer gedifferentieerde, rustige gliacellen.

Patintspecifieke, in vitro tumormodellen hebben een groot potentieel voor het ontrafelen van oncogeen mechanismen en het afstemmen van geneesmiddelkeuze voor gepersonaliseerde therapie. Echter, het ontbreken van betrouwbare in vitro modellen specifiek voor IDH1-mutante laaggradige glioma's heeft fundamenteel en translationeel onderzoek belemmerd. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het kweken van IDH1-mutante tumoren als explantaten in gedefinieerde media zonder enzymatische dissociatie nodig te hebben. Deze explantaten kunnen langere perioden worden gehandhaafd, waarbij de expressie van IDH1-mutante eiwitten evenals markers voor oligodendrocyte voorlopercellen zoals ASCL1 (MASH1), OLIG1, en OLIG2 en voor astrocyten (GFAP, SOX9) behouden blijft. Ze kunnen ook worden gevestigd vanuit bevroren tumoren in DMSO. Deze culturen kunnen dienen als een waardevolle platform voor geneesmiddelscreening, videomicroscopie en genstudies, waardoor vooruitgang in het begrijpen en behandelen van deze uitdagende tumoren wordt vergemakkelijkt. Ze bieden ook de mogelijkheid om IDH1-mutante cellijnen af te leiden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diffuse gliomen zijn de meest voorkomende primaire hersentumoren. Deze tumoren zijn momenteel ongeneeslijk ondanks zeer intensieve behandeling (chirurgie, radio- en chemotherapie)1. Toenemend bewijs ondersteunt de hypothese dat gliomagenese ontstaat uit volwassen stam- of gliale voorlopercellen die in de hersenen aanwezig zijn2. Hoewel glioblastoma's het meest agressieve type vertegenwoordigen, zijn diffuse laaggradige gliomen (DLGG, graad 2 tumoren) ook prevalent (15% van diffuse gliomen)1,3. DLGG's groeien langzaam en migreren langs witte stofbanen, een kenmerk van deze 'diffuse' neoplasma4. Deze DLGG komen zeer vaak terug ondanks behandeling, uiteindelijk progresserend tot hooggradige maligniteiten (graden 3 en 4)5.

DLGG's worden gekenmerkt door een missense-mutatie in het isocitraatdehydrogenase 1 of 2-gen (IDH1 of IDH2), resulterend in de abnormale productie van de oncometabolite 2-hydroxyglutaraat (2HG). Dit verstoort celdifferentiatie door epigenetische dysregulaties6. IDH1-mutante gliomen worden verder ingedeeld in subtypes: astrocytomen hebben typisch mutaties in ATRX en P53, terwijl oligodendrogliomen worden gekenmerkt door 1p19q-deleties7. Deze tumoren vertonen een heterogeniteit van tumorcellen. Single-cell RNA-sequencing en immunokarakterisering hebben een diverse populatie tumorcellen onthuld, die stamcel-achtige, astrocyt-achtige en oligodendrocyte-achtige fenotipen vertonen binnen deze tumoren8,9.

In tegenstelling tot glioblastoom, dat profiteert van direct beschikbare, langetermijncultures en cellijnen, bestaat er een opmerkelijke schaarste aan cellulaire tools die zijn aangepast voor het onderzoeken van IDH1-mutante tumoren1. Dit vormt een aanzienlijk obstakel voor het bevorderen van therapeutische ontwikkeling en het verdiepen van ons begrip van IDH1-mutante gliomagenese en ziekteprogressie. Traditionele, in serum gekweekte cellijnen, hoewel lang gebruikt, repliceren de originele tumoren onvoldoende en vertonen gewijzigde transcriptieprofielen. Alternatief, serumvrije kweekomstandigheden, hetzij in 2D of 3D tumoroïde modellen, behouden effectiever de transcriptieprofielen van tumorcellen en hun in vivo-fenotypen, zoals invasie in normaal hersenweefsel10,11.

Daarnaast behouden kortetermijncellencultures, afgeleid van een patiënts chirurgisch specimen, het moleculaire profiel en de cellulaire diversiteit van de tumor, waardoor ze de biologische eigenschappen van tumoren beter vertegenwoordigen in vergelijking met cellijnen12. Hierin introduceren we een eenvoudige niet-enzymatische methode voor het kweken van IDH1-mutante diffuse laaggradige gliomen, gekweekt als explantaten afgeleid van verse of bevroren patiëntresecties, met als doel te voldoen aan de behoefte aan verbeterde in vitro-modellen voor glioomonderzoek en therapeutische ontwikkeling. Ze bieden ook het potentieel om IDH1-mutante cellijnen te ontwikkelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tumorfragmenten die in dit protocol worden gebruikt, zijn verkregen uit een goed gekarakteriseerd en ethisch goedgekeurd collectie, met toestemming van de patiënt. Dit onderzoek werd uitgevoerd onder het project met de titel Gliomacult: Karakterisering en primaire culturen van laaggradige gliomen (Projectnr. RECH/P722/1-5) en werd goedgekeurd door de wetenschappelijke raad van de tumorbiobank op 28 augustus 2023.

1. Voorbereiding van kweekplaten

OPMERKING: Voer deze stappen uit onder een steriele tissue-kweek-laminaire stroomkap.

  1. Bereid ten minste 1 uur voor het kweken poly-D-lysine (PDL) en laminine-gecoate 24-well platen.
    1. Verdun 10 mg PDL-poeder in 100 ml boraatbuffer (pH 8,4) voor een eindconcentratie van 100 µg/mL. Eenmaal opgelost, filter de oplossing (0,22 µm) voor steriliteit. PDL is klaar voor gebruik; bereid 3 mL aliquoten en bewaar ze bij -20 °C.
    2. Ontdooi de 1-2 mg/mL laminine-buis bij 4 °C om gelvorming te voorkomen. Bereid 50 µL aliquoten en bewaar ze bij -20 °C.
      OPMERKING: Herhaald ontdooien en invriezen moet worden vermeden.
    3. Plate coating
      1. Optionele stap: plaats steriele deksels Ø, 13 mm, geschikt voor celkweekschotels, in een 24-well plaat, één deksel per putje.
        OPMERKING: Deze stap is voor verdere immunokleuring van glioma-explanten.
      2. Voor het coaten van de putjes, meng de 3 mL van de PDL-oplossing in 9 mL 1x PBS en voeg 50 µL laminine toe. Voeg 500 µL van deze oplossing toe aan elke put voor een coatingconcentratie van 1-2 µg/cm². Incubeer de gecoate platen op kamertemperatuur, bij voorkeur met langzaam schudden (15 RPM), gedurende ten minste 1 uur.
      3. Verwijder onmiddellijk voorafgaand aan de cultuur de PDL-laminine-oplossing en spoel tweemaal met steriele 1x PBS.
        OPMERKING: Laat de putjes niet uitdrogen.

2. Media

  1. Kweek IDH1-mutante explanten in een gedefinieerd medium bestaande uit DMEM/F12 gesupplementeerd met L-glutamine, samen met een serumvervangende mix bestaande uit N2 en B27 zonder Vitamine A. Gebruik antibiotica, inclusief ciprofloxacine, gentamicine en fungine, om bacteriële en schimmelbesmetting te voorkomen. Voeg bovendien groeifactoren heparine, EGF en FGF2 toe aan het medium, filter het (0,2 µm) en bewaar het maximaal 2 weken bij 4 °C.
    OPMERKING: Voor details over media-ingrediënten en bereiding, verwijs naar Tabel 1 en de Tabelle van Materialen.

3. Explant voorbereiding

  1. Voor de bewerking van het monster, bereid de werkruimte en steriele gereedschappen voor zoals afgebeeld in Figuur 1A. Desinfecteer een koelpak door het te besproeien met 70% ethanol. Steriliseer schaar en pincetten door ze onder te dompelen in 70% ethanol en ze af te spoelen met PBS.
  2. Breng de tumorresectie onmiddellijk voor het kweken op ijs over, idealiter binnen 2 uur na chirurgische extractie (Figuur 1B).
    OPMERKING: Het tumormonster moet een minimale diameter van 9-10 mm hebben om betere resultaten te garanderen. Het weefsel wordt zonder kweekmedium getransporteerd omdat deze methode wordt voorgeschreven voor histologische doeleinden. De afwezigheid van vloeistof voorkomt ijskristalvorming tijdens snel bevriezen, waardoor de weefselintegriteit voor latere histologische onderzoeken behouden blijft, indien nodig.
  3. Plaats de kweekschotel met het tumorspecimen boven het koelpak en spoel het voorzichtig af met 1X PBS om overtollig bloed te verwijderen.
  4. De geresecteerde tumor vertoont vaak aanzienlijke grootte en heterogeniteit, bestaande uit tumormassa, geïnfiltreerd weefsel en niet-tumoraal weefsel (Figuur 1C). Selecteer delen met een grijze kleur en een zachte of geleiachtige textuur voor tumorcelisolatie, omdat ze meer tumorcellen bevatten. Vermijd daarentegen harde en witte gebieden, omdat deze minder tumorcellen bevatten die geschikt zijn voor kweek (Figuur 1D), evenals verzwarte gebieden, omdat deze waarschijnlijk het gevolg zijn van elektrocauterisatie en mogelijk niet betrouwbare resultaten voor analyse opleveren.
  5. Breng de geselecteerde monsters over naar een 1,5 mL microtube of cryobuisje voor het snijden. Voeg 1 mL steriele media toe aan de 1,5 mL microtube of cryobuis en hak het monster met de steriele schaar tot kleine stukken (1-2 mm3) worden verkregen.
    OPMERKING: Ongeveer 1-2 minuten snijden is nodig om kleine fragmenten te verkrijgen, typisch 1-2 mm3 in grootte (Figuur 1E).
  6. Met steriele schaar, knip voorzichtig het uiteinde van een blauwe 1.000 µL pipettip om een brede opening te maken, ongeveer 3-4 mm in diameter. Gebruik deze aangepaste tip om 50-200 µL van de gehakte weefselfragmenten op te zuigen en verdeel ze gelijkmatig over elke put. Omdat de kleinere stukken snel zinken, herhomogeniseer de suspensie voorzichtig in elke put om een uniforme verdeling te garanderen.
    ​OPMERKING: Vermijd overbevolking en houd een balans door niet te veel fragmenten in elke put te introduceren (Figuur 1F).
  7. Incubeer de tumorfragmenten bij 37°C in een 5% CO2-incubator met 100% vochtigheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na een paar dagen zullen sommige tumorfragmenten zich hechten aan de welborden en het uitgroeien van cellen uit de explanten initiëren. De tijd tussen het aanleggen en het verschijnen van tumorale groeiende cellen verschilt van monster tot monster. De eerste culturen bevatten vaak aanzienlijke celdeeltjes, waardoor het moeilijk wordt om de aanwezigheid van levensvatbare cellen te beoordelen. Bijgevolg moet de cultuur minimaal 4 weken worden onderhouden. Zodra de cellen beginnen te groeien, worden langwerpige cellen met e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontwikkelen van in vitro- en preklinische modellen voor IDH1-mutante laaggradige gliomen is bijzonder uitdagend vanwege de langzame groei van deze tumoren en de complexiteit van het repliceren van de uitgebreide genomische en epigenetische veranderingen veroorzaakt door de IDH-mutatie. Bovendien interageren deze infiltratieve tumorcellen actief met omliggende cellen, inclusief immuun-, endotheel-, glial- en neuronencellen, en zijn mogelijk afhankelijk van hen voor hun overleving. Deze complexe interactie is moeilijk ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tumorfragmenten die hier worden gebruikt, maken deel uit van de NEUROLOGY collectie van verse weefselmonsters die worden onderhouden door het Biological Resource Center van het Universitair Ziekenhuis van Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Dit onderzoek werd uitgevoerd onder het project met de titel "Gliomacult: Karakterisering en Primaire Cultuurs van Laaggradige Gliomen," onder leiding van Prof. J. P. Hugnot (Projectnr. RECH/P722/1-5). Dit werk werd ondersteund door La ligue contre le cancer, ARC (Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C wordt ondersteund door de National Council of Humanities Science and Technology (CONAHCYT), Mexico, en de Association for Brain Tumor Research (ARTC), Frankrijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-ASCL1BD Pharmingen™556604Verdunning 1:500
Anti-ATRXSigma-AldrichHPA001906Verdunning 1:100
Anti-CD68AgilentM081401-2Verdunning 1:500
Anti-GFAPAves LabsAB_2313547Verdunning 1:500
Anti-IBA1Fujifilm Wako Antibodies019-19741Verdunning 1:1000
Anti-IDH1 (R132H) mouse Monoclonal AntibodyDianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen™556003Verdunning 1:1000
Anti-OLIG1R&D Systems®AF2417Verdunning 1:300
Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN50Verdunning 1:250
Anti-SOX9Abcam®EPR14335-78Verdunning 1:100
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AThermo Fisher Scientific12587010
Bovine Serum Albumin (BSA)CiteAbA-421-100
Ciprofloxacin HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning®432000Cell Freezing Container, voor 12 x 1 mL of 2 mL Cryogenic Vials
Cover slip Ø, 13 mmKarl Hecht™ Assistent™328017
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DMEM/F-12, zonder glutamineThermo Fisher Scientific21331020
DNAse ISigma-Aldrich10104159001
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture DishCorning®353003
Falcon 24-well Clear Flat BottomCorning®353047TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, met Deksel, Sterile 
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamicinThermo Fisher Scientific15750-037
HeparineSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
Human EGFPeproTechAF-100-15-1MG
Human FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LaminineSigma-AldrichL2020
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-024
N-2 Supplement (100x )Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
Serum acrodisc 37 mm spuitfilter met GF/0.2 µm SuporPALL Corporation4525
Trypsine InhibitorThermo Fisher Scientific17075-029
Trypsin-EDTA (0,05%), fenol roodThermo Fisher Scientific25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 microscoopZeissstraight widefield epifluorescentiemicroscoop

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. Preclinical models of low-grade gliomas. Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).
  2. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  3. Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review. Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).
  4. Louis, D. N. Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).
  5. Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data. J Pers Med. 11 (8), 818(2021).
  6. Pirozzi, C. J., Yan, H. The implications of idh mutations for cancer development and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).
  7. Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma. J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).
  8. Suva, M. L., Tirosh, I. The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).
  9. Augustus, M., et al. Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis. Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).
  10. Hubert, C. G., Rich, J. N. Patient-derived explants as tumor models. Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).
  11. Abdullah, K. G., et al. Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma. Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).
  12. Yuzhakova, D. V., et al. Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging. Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).
  13. Kloosterman, D., et al. Morphology of microglia across contexts of health and disease. Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).
  14. Thomas, D. L. 2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review. Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).
  15. Azar, S., et al. Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation. Glia. 66 (2), 239-255 (2018).
  16. Bhaduri, A., et al. Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma. Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

IDH1 mutante gliomentumor explantprotocololigodendrocytenprogenitorenastrocytenmarkerstumormicro omgevingcryopreservatieprotocol3D tumormodellengepersonaliseerde drugscreening

Gerelateerde artikelen