Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67261

⸱

4 oktober 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de toepassing van een gemanipuleerd blauw-licht-geactiveerd allosterisch schakelaar (LightR) domein voor omkeerbare spatiotemporele controle van eiwitactiviteit. Door gebruik te maken van Src-tyrosinekinase als model, biedt deze studie een uitgebreid protocol voor het ontwikkelen en karakteriseren van lichtgereguleerde Src (LightR-Src). Het demonstreert de veelzijdigheid van deze aanpak in alle enzymklassen.

Samenvatting

Optogenetica biedt het potentieel voor het nabootsen van complexe spatiotemporele controle van enzymactiviteit tot een subcellulaire resolutie. De meeste optogenetische benaderingen staan echter vaak voor aanzienlijke uitdagingen bij het integreren van meerdere mogelijkheden in één enkel hulpmiddel dat van toepassing is op een breed scala aan doeleiwitten. Het bereiken van nauwkeurige controle over de AAN/UIT-kinetiek, het garanderen van minimale lekkage in het donker en het aantonen van efficiënte prestaties in zoogdiercellen met subcellulaire precisie zijn enkele van de meest voorkomende uitdagingen waarmee u op dit gebied wordt geconfronteerd. Een veelbelovende oplossing ligt in de toepassing van rationeel ontworpen lichtgevoelige domeinen om de eiwitactiviteit allosterisch te sturen. Op basis van die strategie hebben we een optogenetische methode ontwikkeld die alle gewenste eigenschappen combineert. De aanpak omvat de opname van de lichtgereguleerde allosterische schakelmodule (LightR) in het doeleiwit om de enzymactiviteit te reguleren met behulp van blauw (465 nm) licht. Het LightR-domein wordt gegenereerd door twee Vivid (VVD) fotoreceptordomeinen met elkaar te verbinden, waardoor een lichtgevoelige klem ontstaat die kan worden opgenomen in een kleine flexibele lus binnen het katalytische domein van een enzym. In donkere toestand is de LightR-klem open, waardoor het katalytische domein van het enzym wordt vervormd en geïnactiveerd. Bij blootstelling aan blauw licht sluit het LightR-domein en herstelt het de structuur en enzymactiviteit van het katalytische domein. In dit manuscript bespreken we ontwerpstrategieën om een lichtgereguleerde proteïnekinase te genereren en demonstreren we de controle ervan door blauw licht, omkeerbaarheid, kinetiek en nauwkeurige regulatie op subcellulair niveau, waardoor een strakke spatiotemporele precisie mogelijk is. Door Src-tyrosinekinase als model te gebruiken, demonstreren we een protocol voor het effectief reguleren van LightR-Src-kinase-activiteit. We demonstreren ook de toepasbaarheid van LightR in verschillende enzymklassen, waardoor het nut van het toolsysteem wordt uitgebreid bij het aanpakken van mechanistische vragen over signaalroutes bij verschillende ziekten.

Inleiding

Het vermogen van de cel om externe signalen te interpreteren en om te zetten in specifieke reacties in fysiologische of pathologische contexten wordt gestuurd door speciale groepen eiwitten. De bijdrage van een eiwit aan dergelijke complexe reacties wordt vaak bepaald door de subcellulaire locatie, het expressieniveau en de timing van voorbijgaande, aanhoudende of oscillerende activering. Het ontleden van de rol van deze individuele parameters in de regulatie van signalering vereist methoden die in staat zijn om ingewikkelde spatiotemporele controle van eiwitactiviteit op subcellulair niveau te repliceren. Traditionele technieken zoals genetische manipulatie en kleinmolecuulremmers schieten hierin tekort. Optogenetische technieken daarentegen beloven het potentieel voor de ontleding van biologische processen door fysiologische en pathologische processen te manipuleren of na te bootsen. De huidige tools missen echter vaak een brede toepasbaarheid of subcellulaire controle. Verschillende bestaande strategieën zorgen voor een strakke regulatie van eiwitlokalisatie en -interacties; maar gebrek aan directe controle over enzymatische activiteit 1,2,3,4. Anderen maken regulatie van enzymatische activiteit mogelijk, maar hebben mogelijk geen subcellulaire controle of hebben een beperkte toepasbaarheid in verschillende enzymklassen 5,6,7,8,9. In dit protocoldocument beschrijven we een nieuwe methode voor eiwitmanipulatie die de voordelen van optogenetica combineert in één tool: strakke temporele regulatie, afstembare kinetiek, subcellulaire controle en brede toepasbaarheid van enzymen10. We hebben een lichtgereguleerd (LightR) domein ontworpen dat functioneert als een allosterische schakelaar wanneer deze in het doeleiwit van belang wordt ingevoegd. Deze strategie maakt een strakke spatiotemporele controle mogelijk van de activering en deactivering van een eiwit dat van belang is in levende cellen.

Hier wordt het ontwerp en de toepassingsstrategie voor de optogenetische tool LightR in verschillende enzymklassen besproken. Deze studie biedt een stapsgewijs protocol voor de ontwikkeling, karakterisering en toepassing van lichtgereguleerde tyrosinekinase Src (LightR-Src). De studie toont verder de afstembaarheid van de inactiveringskinetiek van de LightR-schakelaar aan. De langzaam inactiverende LightR-schakelaar kan de enzymactiviteit behouden met een verminderde verlichtingsfrequentie, terwijl de snelcyclische versie, FastLightR, vaker verlichting vereist voor activering, maar een snelle inactivering vertoont wanneer de verlichting is uitgeschakeld. Activering/inactivatie van FastLightR-Src in levende cellen induceert cycli van celspreiding en -intrekking. FastLightR-Src-geïnduceerde celspreiding komt overeen met de fysiologische rol van Src-kinase11,12. Dankzij de snelle inactiveringskinetiek kan FastLightR-Src ook op subcellulair niveau worden gereguleerd, wat resulteert in stimulatie van lokale uitsteeksels en celpolarisatie. Om de toepasbaarheid van de LightR-tool op andere soorten enzymen aan te tonen, leiden we de lezers kort door vergelijkbaar succes met gemanipuleerd lichtgereguleerde kinase bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) en een plaatsspecifieke DNA-recombinase Cre (LightR-Cre). Over het algemeen heeft deze benadering het potentieel om ons begrip van complexe signaalroutes die de pathofysiologie van diverse ziekten vormgeven, te vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwerp en ontwikkeling van LightR ( Figuur 1)

  1. Strategische planning
    OPMERKING: Het LightR-domein bestaat uit twee tandem verbonden Vivid (VVD) fotoreceptordomeinen van Neurospora crassa13,14,15,16. VVD's homodimeren in de aanwezigheid van licht, en een dergelijke dimerisatie omvat een conformationele verandering die de N-terminus van het ene VVD-monomeer naast de C-terminus van een ander VVD-monomeer brengt (Figuur 1A). Door twee VVD-domeinen met een flexibele linker met elkaar te verbinden, ontstaat een klemachtig domein dat in het donker open is en bij verlichting met blauw licht wordt gesloten. Door deze klem in het katalytische domein van een enzym te integreren, kan de activiteit door licht worden gereguleerd. In het donker vervormt de open klem het domein, waardoor het enzym wordt gedeactiveerd; Verlichting met het blauwe licht zorgt ervoor dat de klem sluit, waardoor de activiteit van het enzym wordt hersteld (Figuur 1B). Dit concept kan worden toegepast op enzymen uit verschillende families, waaronder eiwitkinasen en DNA-recombinasen10 (Figuur 1C).
    1. Ontwerp van LightR
      1. Om twee VVD-moleculen met elkaar te verbinden, gebruikt u een flexibele 22-aminozuurlinker (GGS)4G(GGS)3 tussen elk monomeer.
        OPMERKING: De linker biedt voldoende flexibiliteit en lengte om de associatie en dissociatie van VVD-monomeren op te vangen.
      2. Voeg GPGGSGG- en GSGGPG-linkers toe aan respectievelijk de N- en C-termini van het LightR-domein.
        OPMERKING: De lengte en de samenstelling van de linkers moeten mogelijk worden aangepast voor een specifiek eiwit. Kortere GSG- en enkele Gly-linkers worden routinematig gebruikt wanneer strengere regelgeving nodig is. De grootte van de invoeglus en de nabijheid van katalytische residuen zullen ook van invloed zijn op het dynamische regelbereik. Kortere lussen zorgen waarschijnlijk voor een strakkere regulering van de katalytische activiteit, maar kunnen resulteren in een lagere activiteit na verlichting. De volgorde van het LightR-domein is opgenomen in aanvullende tabel 1.
    2. Invoegen van LightR
      OPMERKING: Een geschikte LightR-invoegplaats maakt een strikte regulering van de beoogde domeinfunctie mogelijk zonder de interacties sterisch te blokkeren of onomkeerbare structurele veranderingen te veroorzaken die de biologische rol ervan zullen beïnvloeden. Een kristalstructuur van het doeleiwit is een ideale leidraad bij de identificatie van dergelijke flexibele lusgebieden voor de insertie van LightR. Indien nodig kan de kristalstructuur van een nauwe homoloog volstaan. Hieronder vindt u enkele algemene criteria waarmee u rekening moet houden.
      1. Zorg ervoor dat de inbrenglus structureel is gekoppeld aan de kritische katalytische elementen van het enzym. Zorg ervoor dat de geselecteerde invoeglus geen bestaande bindingsplaats voor het eiwit is en dat de invoeging van LightR mogelijk geen functionele interacties verstoort als gevolg van sterische effecten.
      2. Vervang als eerste strategie één aminozuur in de invoeglus bij het invoegen van LightR. Richt u op het midden van de invoeglus met een polair of klein aminozuur (bijv. Glu, Arg, Lys, Gly) dat is blootgesteld aan het oplosmiddel en niet betrokken is bij intramoleculaire interacties.
        OPMERKING: Wanneer één aminozuurvervanging niet resulteert in een functioneel eiwit, vereist optimalisatie van het LightR-construct de vervanging van meerdere aminozuren of de gehele invoeglus. Evalueer de functionaliteit van meerdere invoegplaatsen voor LightR binnen de gedefinieerde lus.
      3. Zorg ervoor dat het doelenzym onafhankelijk van endogene regulatie werkt. Bereik dit door een constitutief actieve mutante versie van het enzym te gebruiken voor de insertiesjabloon.
        OPMERKING: Wild-type enzymen kunnen ook worden gebruikt om LightR-constructen te genereren, maar dit kan resulteren in een AND-gated systeem dat wordt gereguleerd door endogene mechanismen en licht.
      4. Positieve en negatieve controles zijn van vitaal belang voor de analyse van de LightR-enzymactiviteit. Gebruik constitutief actieve mutanten van endogene eiwitten als positieve controles en katalytisch inactieve mutante versies van het beoogde LightR-enzym als negatieve controles.
        OPMERKING: Bij het selecteren van inactiverende mutaties is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de mutatie voldoende afstand heeft van de LightR-insertieplaats om te voorkomen dat de onomkeerbaarheid van de vouwing van het LightR-enzym wordt verstoord. Op basis van de bovenstaande criteria wordt de LightR-insertieplaats in Src-kinase geselecteerd in een flexibel lusgebied dat via een bètastreng structureel is gekoppeld aan het sterk geconserveerde GXGXXG-motief in het ATP-bindende G-lus/glycinerijke lusgebied. Belangrijk is dat het uit de buurt van de ATP-bindingszak en het substraatbindingsgebied10,17 wordt geplaatst (Figuur 1C (i)).
        OPMERKING: Vanwege structurele homologie tussen kinasen wordt de LightR-insertieplaats in bRaf geselecteerd in dezelfde structurele lus als de insertieplaats in Src (Figuur 1C (ii)).
        OPMERKING: Op basis van de principes vermeld in paragraaf 1.1.2 wordt de LightR-insertieplaats in Cre-recombinase, een niet-kinase, gekozen in een van de flexibele lussen ver van de katalytische kern, d.w.z. de DNA-bindingsplaats. De insertielus is echter nog steeds structureel gekoppeld aan kritische katalytische residuen binnen het DNA-bindingsdomein via een α-helix om het succes van de LightR-Cre-functionaliteit te garanderen (Figuur 1C (iii)). Alle insertieplaatsen met positieve en negatieve controles voor verschillende enzymen die in het huidige protocol worden beschreven, worden gedetailleerd beschreven in aanvullende tabel 2.
    3. Ontwikkeling van FastLightR.
      OPMERKING: De introductie van I85V-mutatie in beide VVD's in LightR maakt een snellere activerings-inactivatiedynamiek mogelijk, toegeschreven aan de snelle omzetting van de mutant in de donkere toestand18,19. De generatie van FastLightR-Src en FastLightR-bRaf met snelle inactiveringskinetiek maakt een strakke temporele controle van activering en inactivatie mogelijk. Het maakt het mogelijk om subcellulaire regulatie van LightR-Src in levende cellen te bereiken.
      OPMERKING: Cre-recombinase-activiteit resulteert in onomkeerbare DNA-recombinatie; daarom zijn de reversibiliteitseigenschappen van LightR niet van toepassing.
      OPMERKING: Om de detectie van het LightR-construct te vereenvoudigen, kan een fluorescerend eiwit of een andere geschikte tag worden bevestigd aan de N- of C-terminus van het doeleiwit. Deze studie gebruikte mCherry-myc voor LightR-Src, Venus voor LightR-bRaf en miRFP670 voor LightR-Cre-recombinase.
  2. Strategie voor klonen
    OPMERKING: De kloonbenadering is, in tegenstelling tot traditionele benaderingen, gebaseerd op plaatsgerichte mutagenese die niet afhankelijk is van specifieke beperkingsplaatsen10,20.
    1. Genereren van een "Megaprimer"
      1. Codon-optimaliseer de LightR-genen om een stabiele expressie van de twee tandem VVD-DNA-sequenties van schimmeloorsprong in zoogdiercellen te garanderen en om de sequenties zo verschillend mogelijk te maken voor foutloos klonen met behulp van PCR. Volg de stappen 1.2.1.2-1.2.1.3 om codonoptimalisatie uit te voeren.
      2. Lijn de aminozuursequentie van VVD's en de geselecteerde linkers naast elkaar uit om de theoretische sequentiekaart van LightR te maken.
      3. Plak de sequentie in een online codonoptimalisatieplatform dat gebruikmaakt van een geavanceerd algoritme voor codonoptimalisatie om de beste sequentieoptie te bepalen met minimale complexiteit. Zorg ervoor dat het doelorganisme wordt geselecteerd, het leesframe wordt onderhouden en de VVD-sequenties worden geselecteerd voor optimalisatie.
      4. Verkrijg LightR-DNA als een op maat gemaakt gesynthetiseerd fragment (zie aanvullende tabel 1) of van een eerder gepubliceerd LightR-construct10.
      5. Amplificeer het LightR-gen om "Megaprimer" te genereren met behulp van de eerder beschreven20-strategie zoals beschreven in figuur 1D. Synthese de LightR "Megaprimer" via PCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het specifieke DNA-polymerase en met behulp van het volgende PCR-reactiemengsel:
        5x DNA Polymerase compatibele buffer: 10 μL
        100 μM Forward megaprimer: 0,5 μL
        100 μM Omgekeerde megaprimer: 0,5 μL
        10 nM dNTP-mix: 2 μL
        DNA-polymerase (2000 eenheden/ml): 1 μl (0,02 E/μL)
        50 ng Sjabloon DNA: 1 μL
        Water van PCR-kwaliteit: 35 μL
        OPMERKING: Hier wordt high-fidelity, hotstart DNA-polymerase met universele primergloeitemperaturen gebruikt.
      6. Scheid de resulterende megaprimer door elektroforese van agarosegel. Het product zal ongeveer 1000 nucleotiden lang zijn. Snijd de megaprimer uit de agarosegel en zuiver met behulp van een gelextractiekit, volgens de aanbevelingen van de fabrikant of met behulp van een analoge techniek.
    2. Inbrengen van het LightR-gen met behulp van plaatsgerichte mutagenese: Plaats de LightR en vervang een gewenst aminozuur of een stuk aminozuren. Het sjabloonplasmide is het plasmide waar het LightR-domein wordt ingevoegd. Voer de PCR-reactie uit zoals eerder beschreven20 met behulp van het volgende mengsel.
      5x DNA Polymerase compatibele buffer: 5 μL
      10 nM dNTP-mix: 1 μL
      DNA-polymerase (2000 eenheden/ml): 1 μL (0,02 E/μL)
      50 ng Doelmalplaatje DNA: 1 μL
      Geëxtraheerde Megaprimer (berekende massa): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Water van PCR-kwaliteit: 2,5 μL
      OPMERKING: Megaprimer-massa (ng) = gewenste wisselplaat/vectormolaire verhouding x massa van de vector x verhouding tussen wisselplaat en vectorlengtes. De gewenste insert/vector molaire verhouding die gebruikt wordt is 3/1.
    3. Voeg na voltooiing van de PCR-reactie 1 μL DpnI-enzym (2000 eenheden/ml) toe om selectief alleen het overtollige en gemethyleerde DNA te verteren en het mengsel gedurende 1-1,5 uur bij 37 °C te incuberen. Dit zal het rendement van de gewijzigde constructie aanzienlijk verhogen.
    4. Transformeer 1-2 μL van de PCR-reactie in DH5α-competente cellen volgens de protocollen van de fabrikant.
    5. Plaat getransformeerde bacteriën op Luria Broth (LB)-agarplaat met geschikt antibioticum voor selectie. Incubeer de plaat bij 37 °C 's nachts of bij kamertemperatuur (RT; 25-30 °C) gedurende 72 uur.
      OPMERKING: LB-platen met kolonies die erop zijn gekweekt, kunnen maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard en het protocol kan worden gepauzeerd.
    6. Kolonie screening PCR
      1. Voor PCR-gebaseerde koloniescreening ontwerpt u primers die in het LightR-invoegsel gloeien en zich richten op DNA om ongeveer 400-700 bp-fragmenten te genereren.
      2. Voeg een kleine hoeveelheid van een kolonie van de LB-plaat toe aan de onderstaande PCR-mix en ga verder met thermocycling volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het specifieke DNA-polymerase.
        2x Taq RED Master Mix: 5 μL
        PCR-kwaliteit water : 5 μL
        100 μM Voorwaartse primer : 0,5 μL
        100 μM Omgekeerde primer: 0,5 μL
      3. Controleer op positieve kolonies door middel van agarosegelelektroforese.
      4. Kies de kolonies die de gewenste PCR-productgrootte hebben gegenereerd en inoculeer ze afzonderlijk in 3 ml LB-bouillon met het antibioticum, passend bij de antibioticaresistentie in de plasmide-ruggengraat. Vervolgens incuberen en een nacht schudden bij 37 °C.
      5. Extraheer plasmide-DNA uit vloeibare cultuur volgens de instructies van de fabrikant van de plasmidezuiveringskit voor plasmide-DNA-extractie en verifieer de aanwezigheid van het inzetstuk door sequencing.
        OPMERKING: Kloonprimers zijn samengevat in aanvullende tabel 3.

2. Celplating en biochemische analyse van de activiteit van het LightR-enzym (Figuur 2A)

  1. Voor biochemische analyse van LightR-kinasen (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), plaat 1 x 106 LinXE-cellen per 3,5 cm celkweekschaaltje voor elke experimentele groep. Zie aanvullende tabel 4.
  2. Cellen incuberen bij 37 °C en 5 % CO2 gedurende 16-18 uur.
  3. Transfecteer de cellen de volgende dag met het geselecteerde DNA-construct met behulp van een geschikt transfectiereagens volgens de aanbevelingen van de fabrikant (aanvullende tabel 4).
    OPMERKING: Het optimale transfectiereagens hangt af van de constructie, vector en het type cellen dat wordt gebruikt. In deze studie werd 2 μg DNA gebruikt in een schaal van 3,5 cm met behulp van een transfectiereagens. Empirische tests moeten worden uitgevoerd om het optimale transfectiereagens te bepalen. Aangezien getransfecteerde constructen eiwitten tot expressie brengen die worden gereguleerd door blauw licht, moeten alle volgende stappen die met getransfecteerde cellen worden behandeld, worden uitgevoerd onder rood licht. Wikkel de platen met getransfecteerde cellen in aluminiumfolie voordat u ze in de couveuse plaatst om onbedoelde verlichting te voorkomen.
  4. Stel de cellen na 16-18 uur transfectie bloot aan blauw licht10. Om dit uit te voeren, plaatst u een 465 nm light-emitting diode (LED) paneellampsysteem in de weefselkweekincubator. Plaats een geperforeerd plexiglas paneel 10 cm boven de lamp om de gewenste verlichting van 3 mW/cm2 te verkrijgen (aanvullend bestand 1). Een geperforeerd paneel is nodig om een ononderbroken luchtcirculatie in de couveuse te behouden. Verlicht de cellen gedurende de gewenste periode.
  5. Gebruik voor het activeren van LightR-Src en LightR-bRaf continue verlichting. Voor continue verlichting zet u het LED-paneel handmatig aan en uit.
  6. Om de activerings-/inactiveringscyclus van FastLightR Src te behouden, gebruikt u AAN/UIT-cycli die handmatig of door een microcontroller worden bediend.
    OPMERKING: Er kunnen verschillende softwaretoolkits worden gebruikt die een Integrated Development Environment (IDE) bieden voor het schrijven en uploaden van de vereiste code. Deze toolkits ondersteunen C/C++-programmering en bieden algemene input/output (GPIO)-toegang, wat essentieel is voor het regelen van de gepulseerde verlichting. Een gedetailleerde beschrijving van de protocollen en codes die voor deze doeleinden worden gebruikt, wordt beschreven in Aanvullend Dossier 1.
  7. Aan het einde van de respectieve tijdstippen van het experiment (aanvullende tabel 4), oogst de cellen onder veilige rode lichten. Zuig de media op en was de cellen met koude PBS.
  8. Om eiwit te isoleren, lyseert u cellen met 500 μL 2x Laemmli-monsterbuffer aangevuld met 5% v/v 2-Mercaptoethanol. Incubeer het lysaat bij 100 °C gedurende 5 min. Analyseer cellysaten door middel van eiwitgelelektroforese en Western blotting21.
    OPMERKING: De samenstelling van 2x Laemmli-buffer is als volgt: Voor 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glycerol, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g broomfenolblauw, eind-pH 6,8.
  9. Beoordeel de LightR-Src-activiteit door het fosforyleringsniveau van endogene p130cas op Tyr249 en paxilline op TyrY118te evalueren 22,23 (Figuur 2). Beoordeel de LightR-bRaf-activiteit door het fosforyleringsniveau van MEK1 op Ser217/221 en ERK1/2 op TyrY202/20424,25 te evalueren.

3. Functionele analyse van de activiteit van LightR-Cre

  1. Voor de functionele analyse van de LightR-Cre activiteit, plaat 1 x 106 LinXE cellen per 3,5 cm celkweekschaaltje. Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 16-18 uur.
  2. Transfecteer de cellen volgens het protocol dat wordt beschreven in sectie 2, figuur 2A en aanvullende tabel 5. Co-transfect in totaal 2 μg DNA, met een verhouding van 1:9 van LightR-Cre-iRFP670 en een Reporter-plasmide Floxed-STOP-mCherry2.
  3. Verlicht de cellen na 16-18 uur na transfectie. Een efficiënte activering van LightR-Cre vereist langdurige verlichting. Gebruik daarom, om fototoxiciteit te voorkomen, gepulseerde verlichting gedurende 8 uur met cycli van 2 s AAN en 20 s UIT met behulp van een 465 nm LED-paneellampsysteem dat wordt bestuurd door een microcontroller zoals beschreven in sectie 2 en aanvullend bestand 1.
  4. Voer beeldvorming uit met behulp van epifluorescentiemicroscopie met een 20x luchtobjectief. Gebruik voor visualisatie van LightR-Cre-iRFP670 de Cy5-filterset en voor visualisatie van mCherry van Floxed-mCherry-expressie de RFP-filterset.
    OPMERKING: Voor beeldvorming wordt een epifluorescentiemicroscoop gebruikt die is uitgerust met Cy5/RFP-lichtkubussen.

4. Voorbereiding van monsters voor beeldvorming van levende cellen

  1. Plaat 2 x 105 HeLa-cellen per 35 mm weefselkweekschaaltje in celkweekmedia en gedurende 2 uur incuberen bij 37 °C en 5% CO2 .
  2. Zodra de cellen zich hebben gehecht en de samenvloeiing ongeveer 60%-70% is, co-transfecteert u de HeLa-cellen met een van de volgende mengsels: (i) 0,85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg Stargazin-iRFP, of (ii) 0,75 μg FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg mCherry-ERK2
    OPMERKING: In FastLightR-Src-experimenten wordt de Stargazin-iRFP gebruikt om het plasmamembraan te labelen voor analyse van celspreiding. Als een hogere FastLightR-Src-expressie gewenst is, kan stargazin-iRFP worden weggelaten en kan in plaats daarvan 1 μg FastLightR-Src worden gebruikt. In deze gevallen moet een membraankleurstof worden gebruikt om de cellen te visualiseren. Plasmamembraankleuringen worden routinematig gebruikt voor het labelen van celmembranen.
  3. Dek de schaal af met aluminiumfolie om onbedoelde verlichting van de cellen te voorkomen en incubeer gedurende 16-18 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Voer alle volgende stappen uit onder roodlichtverlichting om onbedoelde activering van de constructies te voorkomen. Blootstelling aan wit licht induceert de activering van LightR-kinasen en kan de daaropvolgende resultaten beïnvloeden.
  5. Smeer op dezelfde dag 3 ronde glazen dekglaasjes (25 mm diameter, 0,17 mm dikte) 's nachts in met 5 mg/L fibronectine in PBS bij 37 °C.
  6. Spoel de dekglaasjes 16-18 uur na transfectie af met PBS en leg ~1 x 105 getransfecteerde HeLa-cellen op elk dekglaasje. Incubeer in celkweekmedia gedurende 2 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
    OPMERKING: De lage zaaidichtheid is nodig om ervoor te zorgen dat cellen in het gezichtsveld elkaar niet raken.
  7. Bereid de beeldvormingsmedia voor door FBS toe te voegen aan de L-15 beeldvormingsmedia van Levobitz tot een eindconcentratie van 5%. Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm en verwarm deze tot 37 °C.
  8. Verwarm minerale olie voor tot 37 °C.
  9. Was de dekglaasjes met de cellen twee keer met PBS. Als u een membraankleurstof gebruikt, kleurt u de cellen volgens de instructies van de fabrikant voordat u de dekglaasjes wast.
  10. Plaats het dekglaasje voorzichtig in een kamer voor live celbeeldvorming. Voeg 1 ml L-15 beeldvormingsmedia toe aan de kamer.
  11. Voeg 1 ml minerale olie toe aan de media om verdamping tijdens het beeldvormingsproces te voorkomen.
  12. Houd de kamer beschermd tegen licht bij 37 °C totdat deze klaar is om te fotograferen.

5. Globale activering en beeldvorming van FastLightR-Src (Figuur 3)

  1. Bevestig een blauw LED-microscopieringlicht aan de microscoopcondensor en plaats deze ongeveer 1.5 cm boven de monsterhouder. Sluit het AC/DC-stuurrelais voor de ringlamp aan op de microscoopcomputer.
    OPMERKING: Voor de experimenten in deze studie werd de verlichting geregeld via een Transistor-Transistor Logic (TTL)-interface via de beeldvormingssoftware. Epifluorescerende verlichting kan ook worden gebruikt om LightR-constructies globaal te activeren als er geen externe verlichtingsbron beschikbaar is. GFP-excitatiegolflengten, zoals het 490/20 nm excitatiefilter, zijn effectief bij het activeren van LightR.
  2. Plaats de kamer op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 °C en selecteer cellen die FastLightR-Src-mCherry en Stargazin-iRFP tot expressie brengen (Figuur 3B) of FastLightR-bRaf-Venus en mCherry ERK-2 (Figuur 5B).
  3. Gebruik voor de studie van globale verlichtings- en beeldvormingsexperimenten microscoopcompatibele, hoogwaardige objectieven (40x) met apochromatische correctie, vlakveldcorrectie en hoge numerieke apertuur.
    1. Gebruik voor wereldwijde op verlichting gebaseerde studies van Src-kinase 561/10 nm excitatie en 595/40 nm emissiefilters om FastLightR-Src-mCherry te visualiseren en gebruik 640/20 nm excitatie en 655LP-emissiefilter om stargazin-iRFP te visualiseren.
    2. Gebruik voor wereldwijde verlichtingsstudies van bRaf-kinase 514/10 nm excitatie en 540/21 nm emissiefilters om FastLightR-bRaf-Venus te visualiseren en gebruik 561/10 nm excitatie en 595/40 nm emissiefilters om mCherry-ERK-2 te visualiseren.
    3. Gebruik een multiband polychroïsche spiegel in alle fluorescerende beeldvormingskanalen.
  4. Neem, afhankelijk van de experimentele omstandigheden, de volgende aanbevelingen in acht.
    1. Beeld de cellen ten minste 10 minuten voorafgaand aan de verlichting af om een basisactiviteit van de cellen vast te stellen.
      OPMERKING: Deze basislijn is nodig om te bepalen of activering van FastLightR-kinase door verlichting veranderingen in het celgedrag of eiwitlokalisatie induceert. Men kan ook langere perioden van basale beeldvorming uitvoeren om een grotere statistische significantie te verkrijgen.
    2. Vanwege de snelle inactiveringskinetiek van FastLightR's, kan het opnemen van veel cellen voor beeldvorming de deactivering van Src/bRaf tussen faseposities veroorzaken en de respons ervan verzwakken. Om een dergelijke fout te voorkomen, maakt u een beeld van 4 cellen/min tijdens het analyseren van de FastLightR-Kinase-activiteit in het beschreven protocol en beeldt u elke geselecteerde cel elke minuut af gedurende in totaal 110 minuten (aanvullend bestand 2).
    3. Gebruik gepulseerde verlichting in plaats van continue verlichting om de mogelijke fototoxische effecten van blauw licht te verminderen. De verlichting gedurende 12 s voor elk van de 4 cellen/min is effectief (aanvullend bestand 2, figuur 3A).
      OPMERKING: De verlichtingscycli moeten empirisch worden bepaald voor verschillende constructies en soorten verlichtingsbronnen.
    4. Schakel de verlichting uit tijdens celbeeldvorming om doorbloeding in de fluorescerende kanalen te voorkomen.
      OPMERKING: Als u te veel cellen tegelijk in beeld brengt, neemt de totale verlichtingstijd die beschikbaar is voor het monster af, wat leidt tot een verzwakte respons door onvoldoende activering.
  5. Sla na het maken van de beeldvorming de films op als een . TIF-stackbestandsformaat voor analyse.
    OPMERKING: Vanwege de minder uniforme verlichting met GFP-epifluorescentie in vergelijking met ringlicht, zullen experimenten met GFP-epifluorescentie frequentere verlichting vereisen. Dit heeft tot gevolg dat er per experiment minder cellen in beeld worden gebracht.

6. Subcellulaire activering en beeldvorming van FastLightR-Src (Figuur 4)

  1. Plaats de kamer op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 °C en selecteer een enkele cel die zowel FastLightR-Src-mCherry als Stargazin-iRFP tot expressie brengt.
  2. Selecteer de specifieke regio's (ROI) binnen de cel die u wilt verlichten. Deze studie kiest een klein gebied aan de periferie van de geselecteerde cel.
    OPMERKING: Voor lokale verlichting wordt een laser van 445 nm gebruikt die is scherpgesteld door een TIRF-module in FRAP-modus of een microspiegelapparaat dat wordt bestuurd via een TTL-interface via de beeldvormingssoftware. Elk verlichtingssysteem met patroon werkt voor deze experimenten. Als een scansysteem wordt gebruikt, bepaal dan de laserintensiteit en homogeniteit voor voldoende activering zonder schade aan de cel.
  3. Beeld de geselecteerde cel elke minuut gedurende 20 minuten in de basale toestand vóór de verlichting, 50 minuten tijdens de lokale verlichting en vervolgens 20 minuten na activering gedurende in totaal 90 minuten (aanvullend bestand 2).
  4. Geef voor activering en deactivering een geschikte hoeveelheid tijd die geschikt is voor het doeleiwit om volledige deactivering van het LightR-eiwit mogelijk te maken. Laat voor FastLightR-Src ten minste 10 minuten deactivering toe om de resterende activiteit te laten afnemen en laat 20 minuten deactivering toe in de gedemonstreerde experimentele opstelling voor lokale verlichting.
  5. Sla de films na het maken van de afbeelding op als . TIF-stackbestandsformaat voor analyse.

7. Analyse van de celverspreiding

  1. Bereid afbeeldingen voor op gegevensverwerking en -analyse. Zorg ervoor dat de afbeeldingen in een . TIF-stack-indeling. Sla deze rechtstreeks op vanuit de beeldvormingssoftware of converteer ze met behulp van een open-sourceprogramma.
  2. Download het CellGeo-scriptpakket uit de gecomprimeerde bestanden met aanvullende gegevens26.
    LET OP: Het CellGeo pakket bevat verschillende scripts. Kies het gewenste pakket uit de lijst op basis van het type analyse zoals behandeld in de protocolsecties 7-9.
  3. Open en voer het script met de titel MovThresh uit om een masker van de cel te maken.
    1. Selecteer Bestand > Importeren (.tif) en selecteer de Stargazin-iRFP-afbeeldingen van de cellen.
    2. Scan door de frames met behulp van de schuifbalk in de linkerbenedenhoek. Als de voorgestelde drempelwaarde geschikt is, gaat u naar stap 7.4.
    3. Als de voorgestelde drempelwaarde niet overeenkomt met het gedrag van de cel, kiest u afgevlakte of aangepaste curven onder Curmeselectie. Maak de aangepaste curve door door de kaders te scrollen en vervolgens de drempel aan de rechterkant van het venster aan te passen.
    4. Klik op Drempel opnieuw instellen.
    5. Klik op Bestand > Opslaan als maskers, Wijzig de naam van het bestand en sla het op met de optie Opslaan als .
  4. Open het nieuw gemaakte stapelbestand in een open-source beeldanalyseprogramma.
  5. Selecteer Afbeelding > pas > drempelwaarde aan > toepassen.
  6. Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren > Weergaveresultaten controleren -> OK.
  7. Bereken de verandering in oppervlakte voor elke cel door de oppervlakte op een bepaald moment te delen door de gemiddelde oppervlakte van dezelfde cel voorafgaand aan de bestraling met blauw licht.
  8. Teken de gebiedsverandering als een lijn- of staafdiagram.
  9. Bereken de gemiddelde waarde en 90% betrouwbaarheidsintervallen voor elk tijdstip van alle cellen die onder dezelfde omstandigheden zijn behandeld.

8. Analyse van de dynamiek van de celrand

  1. Bereid de stapelbestanden voor met behulp van de stappen die worden beschreven in protocolsectie 7.
  2. Open het script met de naam ProActive en voer het uit.
    1. Selecteer Bestand > Importeren > Maskers (.tif) en selecteer het masker dat is gemaakt met het MovThresh-script .
    2. Selecteer de activiteit die van belang is voor analyse in de rechterbenedenhoek (Uitsteeksel, Intrekkend of Totaal).
    3. Selecteer het type normalisatie. Meestal wordt voor deze analyses gebiedsnormalisatie gebruikt.
    4. Selecteer het beginreferentiekader met behulp van de schuifregelaar aan de linkerkant. De vertragingsschuifregelaar aan de rechterkant bepaalt de vertraging tussen twee tijdstippen die wordt gebruikt om de oppervlakte te meten die door de cel wordt gewonnen en verloren.
    5. Als het geselecteerde frame en het vertragingsgetal bovendien groter zijn dan het aantal frames in de film, wordt de voorbeeldafbeelding niet weergegeven. Stel deze waarden opnieuw in zodat ze gelijk zijn aan minder dan het totale aantal frames.
  3. Wijzig de drempelwaarde voor uitsteeksel of intrekking door het vakje voor Vloeiende curve aan te vinken onder de sectie Resultaten . Hiermee worden de drempelwaarden over een specifiek venster gemiddeld, waardoor problemen kunnen worden opgelost waarbij kleine fluctuaties worden gedetecteerd als activiteit.
  4. Selecteer Het bereik uitvoeren om de activiteit te berekenen gedurende de tijd die is opgegeven door de schuifregelaars voor frames en vertragingen.
  5. Sla de numerieke gegevens op door Bestand > Opslaan als > Resultaten (.mat) te selecteren en gebruik deze om de gemiddelde uitsteeksel- of intrekkingsactiviteit te bepalen.
  6. Bepaal de 90%-betrouwbaarheidsintervallen voor elk tijdstip.
    OPMERKING: Hiermee wordt een array van verschillende waarden opgeslagen. Het tekstbestand "Hoe ProActive te gebruiken" dat bij het script is gevoegd, biedt een gedetailleerde beschrijving van wat elke waarde vertegenwoordigt en hoe deze is bepaald26.
  7. Sla de visuele weergave van de activiteit op door Bestand > Opslaan als > Afbeeldingen (.tif) te selecteren.

9. Analyse van zwaartepuntverschuiving

  1. Gebruik voor de analyse van de zwaartepuntverschuiving alle software die de coördinaten van het zwaartepunt kan bepalen.
  2. Open in de analysesoftware de gemaskeerde afbeeldingsstapel van de cel waarin u geïnteresseerd bent, zoals beschreven in protocolsectie 7.
  3. Selecteer Meten > Geïntegreerde morfometrieanalyse en klik vervolgens op Voorkeuren > Zwaartepuntmarkering tekenen > Controleren en selecteer vervolgens Meten.
    1. Noteer de coördinaten van het zwaartepunt vóór de beweging (A).
    2. Noteer de coördinaten van het zwaartepunt aan het einde van het experiment (B).
    3. Noteer de coördinaten voor het midden van het verlichtingspatroon (C).
  4. Nu de drie punten zijn verzameld, bepaal je de hoek figure-protocol-1BAC8. θ1 komt overeen met de hoek figure-protocol-2ABC en θ2 komt overeen met de hoek figure-protocol-3CBA (Figuur 4Cii). Doe dit met behulp van de volgende vergelijking:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    OPMERKING: Een rekenmachine kan worden gebruikt om de hoeken en afstanden rechtstreeks van de coördinaten te bepalen voor gebruiksgemak.
  5. Bepaal de verplaatsing van het zwaartepunt door de afstand die het zwaartepunt van de cel in pixels heeft afgelegd te vermenigvuldigen met de conversiefactor waarbij 1 pixel gelijk is aan 0,4 μm. De specifieke conversie van pixels naar afstand is afhankelijk van de vergroting en camera-instellingen op het systeem.
  6. Zodra de zwaartepuntverschuivingshoek en -afstand zijn bepaald, opent u een grafische software die in staat is om afbeeldingen van polaire coördinaten te produceren.
  7. Voer de zwaartepuntverschuivingshoek in als de θ-meting en de afgelegde afstand als de straal. Gebruik ANOVA om te testen op 95% betrouwbaarheidsintervallen.
  8. Plot de resultaten en sla de afbeelding op.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De LightR-Src is ontworpen en gegenereerd volgens de strategie beschreven in figuur 1A,B. Biochemische analyse van LightR-Src heeft toegang tot de fosforylering van bekende endogene Src-substraten, p130Cas (Y249)22 en paxilline (Y118)23 als reactie op blauw licht bij 60 minuten continue verlichting (Figuur 2B). Opmerkelijk is dat er geen achtergrondactivering van S...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Onze studie presenteert een optogenetische benadering voor het onderzoek van diverse signaalroutes en toont de brede toepasbaarheid ervan aan bij het aanpakken van verschillende biologische vragen. Het LightR-toolsysteem biedt verschillende essentiële voordelen: (1) Allosterische regulatie van eiwitactiviteit, (2) Strakke temporele controle van activiteit die kan worden afgestemd om verschillende kinetieken van activering en inactivatie te bereiken, (3) Ruimtelijke resolutie van activite...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen Dr. Mark Shaaya voor zijn bijdrage aan de ontwikkeling van LightR-enzymen en bijbehorende protocollen. pCAG-iCre was een geschenk van Wilson Wong (Addgene plasmide #89573), pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry was een geschenk van Mositoshi Sato (Addgene plasmide #122963), bRaf-Venus construct dragende V600E mutatie was een geschenk van Dr. John O'Bryan (MUSC); Het ERK2-gen van pCEFL-ERK2 (een geschenk van het laboratorium van Dr. Channing Der, UNC) werd gekloond in de mCherry-C1-ruggengraat om mCherry-ERK2-plasmide te verkrijgen; en pmiRFP670-N1 was een geschenk van Vladislav Verkhusha (Addgene plasmide # 79987). Het werk werd ondersteund door NIH-subsidies R33CA258012, R35GM145318 en P01HL151327 aan AK. Dit werk werd verder ondersteund door de T32 VBST training fellowship T32HL144459 naar NL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#1.5 Glass Coverslips 25 mm RoundWarner Instruments 64-0715 
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli BufferVoor 500 mL: 5,18 g van  Tris-HCL, 131,5 mL glycerol, 52,5 mL van 20% SDS, 0,5 g bromofenolblauw, eind-pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Microscoop Ring LightBoli OpticsML46241324Blauwe LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose GoldBiotechA-201
Anti-Erk 1/2 AntilichaamCell Signaling9102
Anti-GAPDH AntilichaaminvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry AntilichaaminvitrogenM11217
Anti-MEKCell Signaling9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
Anti-paxillinCell Signaling2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 AntilichaamCell Signaling9101
Anti-phospho-pY249 p130CasCell Signaling4014
Anti-phospho-Y118 PaxillinCell Signaling2541
Anto-phospho-S217/221 MEKCell Signaling9121
Arduino Compatible VoedingCorporate ComputerLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎A000066
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0,1 µm sterieel gefilterd 
bRaf-V600E-VenusGift van Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicillin (Disodium)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Deep Red plasma membraandyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
DH5a competent cellen NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Dpn1 Enzym NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents 
EGTAAcros 409910250
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronectin van bovien plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfectie Reagens PromegaE2692Transfectiereagens
Gel Green Nucleic Zuur Stain GoldBioG-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEBB7024A
GeneJET Gel Extractie Kit Thermo Scientific K0692Gel Extractie Kit 
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
HEK 293T Cellen ATCC CRL-11268
HeLa Cellen ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot RelayDigital LoggersDLI 705020645490AC/DC control relais voor verlichting
Kanamycin MonosulfaatGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
LED Grow Light SysteemHQRP884667106091218LED paneel lamp systeem 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aSoftware voor het uitvoeren van CellGEO Scripts
MetamorphMolecular DevicesBeeldanalyse Software
MgCl2 Fisher ChemicalM33-500
Mineral OilSigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 wellBio-Rad4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV 
Multiband Polychroic Spiegel89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS w/o Ca en Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ER

Referenties

  1. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
  2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
  3. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  4. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  5. Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
  6. Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788(2020).
  7. Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
  8. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  9. Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
  10. Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647(2020).
  11. Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
  12. Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
  13. Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
  14. Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50(2011).
  15. Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
  16. Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
  17. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  18. Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
  19. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
  20. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256(2015).
  21. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
  23. Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12(2009).
  24. Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
  25. Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
  26. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  27. Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
  28. Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
  29. Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024(2018).
  30. Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042(2018).
  31. Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
  32. Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
  33. Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141(2020).
  34. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
  35. Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708(2020).
  36. Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
  37. Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
  38. Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
  39. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
  40. Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354(2017).
  41. Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
  42. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  43. Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
  44. Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
  45. Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
  46. Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
  47. Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
  48. Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509(2021).
  49. Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
  50. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Optogenetische regulatieLightR-domeinblauwlichtactivatieproteïnekinasecontrolesubcellulaire precisiecelmigratiefocale adhesies
Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.