Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de toepassing van een gemanipuleerd blauw-licht-geactiveerd allosterisch schakelaar (LightR) domein voor omkeerbare spatiotemporele controle van eiwitactiviteit. Door gebruik te maken van Src-tyrosinekinase als model, biedt deze studie een uitgebreid protocol voor het ontwikkelen en karakteriseren van lichtgereguleerde Src (LightR-Src). Het demonstreert de veelzijdigheid van deze aanpak in alle enzymklassen.

Samenvatting

Optogenetica biedt het potentieel voor het nabootsen van complexe spatiotemporele controle van enzymactiviteit tot een subcellulaire resolutie. De meeste optogenetische benaderingen staan echter vaak voor aanzienlijke uitdagingen bij het integreren van meerdere mogelijkheden in één enkel hulpmiddel dat van toepassing is op een breed scala aan doeleiwitten. Het bereiken van nauwkeurige controle over de AAN/UIT-kinetiek, het garanderen van minimale lekkage in het donker en het aantonen van efficiënte prestaties in zoogdiercellen met subcellulaire precisie zijn enkele van de meest voorkomende uitdagingen waarmee u op dit gebied wordt geconfronteerd. Een veelbelovende oplossing ligt in de toepassing van rationeel ontworpen lichtgevoelige domeinen om de eiwitactiviteit allosterisch te sturen. Op basis van die strategie hebben we een optogenetische methode ontwikkeld die alle gewenste eigenschappen combineert. De aanpak omvat de opname van de lichtgereguleerde allosterische schakelmodule (LightR) in het doeleiwit om de enzymactiviteit te reguleren met behulp van blauw (465 nm) licht. Het LightR-domein wordt gegenereerd door twee Vivid (VVD) fotoreceptordomeinen met elkaar te verbinden, waardoor een lichtgevoelige klem ontstaat die kan worden opgenomen in een kleine flexibele lus binnen het katalytische domein van een enzym. In donkere toestand is de LightR-klem open, waardoor het katalytische domein van het enzym wordt vervormd en geïnactiveerd. Bij blootstelling aan blauw licht sluit het LightR-domein en herstelt het de structuur en enzymactiviteit van het katalytische domein. In dit manuscript bespreken we ontwerpstrategieën om een lichtgereguleerde proteïnekinase te genereren en demonstreren we de controle ervan door blauw licht, omkeerbaarheid, kinetiek en nauwkeurige regulatie op subcellulair niveau, waardoor een strakke spatiotemporele precisie mogelijk is. Door Src-tyrosinekinase als model te gebruiken, demonstreren we een protocol voor het effectief reguleren van LightR-Src-kinase-activiteit. We demonstreren ook de toepasbaarheid van LightR in verschillende enzymklassen, waardoor het nut van het toolsysteem wordt uitgebreid bij het aanpakken van mechanistische vragen over signaalroutes bij verschillende ziekten.

Inleiding

Het vermogen van de cel om externe signalen te interpreteren en om te zetten in specifieke reacties in fysiologische of pathologische contexten wordt gestuurd door speciale groepen eiwitten. De bijdrage van een eiwit aan dergelijke complexe reacties wordt vaak bepaald door de subcellulaire locatie, het expressieniveau en de timing van voorbijgaande, aanhoudende of oscillerende activering. Het ontleden van de rol van deze individuele parameters in de regulatie van signalering vereist methoden die in staat zijn om ingewikkelde spatiotemporele controle van eiwitactiviteit op subcellulair niveau te repliceren. Traditionele technieken zoals genetische manipulatie en kleinmolecuulremmers schieten hierin tekort. Optogenetische technieken daarentegen beloven het potentieel voor de ontleding van biologische processen door fysiologische en pathologische processen te manipuleren of na te bootsen. De huidige tools missen echter vaak een brede toepasbaarheid of subcellulaire controle. Verschillende bestaande strategieën zorgen voor een strakke regulatie van eiwitlokalisatie en -interacties; maar gebrek aan directe controle over enzymatische activiteit 1,2,3,4. Anderen maken regulatie van enzymatische activiteit mogelijk, maar hebben mogelijk geen subcellulaire controle of hebben een beperkte toepasbaarheid in verschillende enzymklassen 5,6,7,8,9. In dit protocoldocument beschrijven we een nieuwe methode voor eiwitmanipulatie die de voordelen van optogenetica combineert in één tool: strakke temporele regulatie, afstembare kinetiek, subcellulaire controle en brede toepasbaarheid van enzymen¹⁰. We hebben een lichtgereguleerd (LightR) domein ontworpen dat functioneert als een allosterische schakelaar wanneer deze in het doeleiwit van belang wordt ingevoegd. Deze strategie maakt een strakke spatiotemporele controle mogelijk van de activering en deactivering van een eiwit dat van belang is in levende cellen.

Hier wordt het ontwerp en de toepassingsstrategie voor de optogenetische tool LightR in verschillende enzymklassen besproken. Deze studie biedt een stapsgewijs protocol voor de ontwikkeling, karakterisering en toepassing van lichtgereguleerde tyrosinekinase Src (LightR-Src). De studie toont verder de afstembaarheid van de inactiveringskinetiek van de LightR-schakelaar aan. De langzaam inactiverende LightR-schakelaar kan de enzymactiviteit behouden met een verminderde verlichtingsfrequentie, terwijl de snelcyclische versie, FastLightR, vaker verlichting vereist voor activering, maar een snelle inactivering vertoont wanneer de verlichting is uitgeschakeld. Activering/inactivatie van FastLightR-Src in levende cellen induceert cycli van celspreiding en -intrekking. FastLightR-Src-geïnduceerde celspreiding komt overeen met de fysiologische rol van Src-kinase^11,12. Dankzij de snelle inactiveringskinetiek kan FastLightR-Src ook op subcellulair niveau worden gereguleerd, wat resulteert in stimulatie van lokale uitsteeksels en celpolarisatie. Om de toepasbaarheid van de LightR-tool op andere soorten enzymen aan te tonen, leiden we de lezers kort door vergelijkbaar succes met gemanipuleerd lichtgereguleerde kinase bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) en een plaatsspecifieke DNA-recombinase Cre (LightR-Cre). Over het algemeen heeft deze benadering het potentieel om ons begrip van complexe signaalroutes die de pathofysiologie van diverse ziekten vormgeven, te vergroten.

Protocol

1. Ontwerp en ontwikkeling van LightR ( Figuur 1)

1. Strategische planning
   OPMERKING: Het LightR-domein bestaat uit twee tandem verbonden Vivid (VVD) fotoreceptordomeinen van Neurospora crassa^13,14,15,16. VVD's homodimeren in de aanwezigheid van licht, en een dergelijke dimerisatie omvat een conformationele verandering die de N-terminus van het ene VVD-monomeer naast de C-terminus van een ander VVD-monomeer brengt (Figuur 1A). Door twee VVD-domeinen met een flexibele linker met elkaar te verbinden, ontstaat een klemachtig domein dat in het donker open is en bij verlichting met blauw licht wordt gesloten. Door deze klem in het katalytische domein van een enzym te integreren, kan de activiteit door licht worden gereguleerd. In het donker vervormt de open klem het domein, waardoor het enzym wordt gedeactiveerd; Verlichting met het blauwe licht zorgt ervoor dat de klem sluit, waardoor de activiteit van het enzym wordt hersteld (Figuur 1B). Dit concept kan worden toegepast op enzymen uit verschillende families, waaronder eiwitkinasen en DNA-recombinasen¹⁰ (Figuur 1C).
   1. Ontwerp van LightR
      1. Om twee VVD-moleculen met elkaar te verbinden, gebruikt u een flexibele 22-aminozuurlinker (GGS)4G(GGS)3 tussen elk monomeer.
         OPMERKING: De linker biedt voldoende flexibiliteit en lengte om de associatie en dissociatie van VVD-monomeren op te vangen.
      2. Voeg GPGGSGG- en GSGGPG-linkers toe aan respectievelijk de N- en C-termini van het LightR-domein.
         OPMERKING: De lengte en de samenstelling van de linkers moeten mogelijk worden aangepast voor een specifiek eiwit. Kortere GSG- en enkele Gly-linkers worden routinematig gebruikt wanneer strengere regelgeving nodig is. De grootte van de invoeglus en de nabijheid van katalytische residuen zullen ook van invloed zijn op het dynamische regelbereik. Kortere lussen zorgen waarschijnlijk voor een strakkere regulering van de katalytische activiteit, maar kunnen resulteren in een lagere activiteit na verlichting. De volgorde van het LightR-domein is opgenomen in aanvullende tabel 1.
   2. Invoegen van LightR
      OPMERKING: Een geschikte LightR-invoegplaats maakt een strikte regulering van de beoogde domeinfunctie mogelijk zonder de interacties sterisch te blokkeren of onomkeerbare structurele veranderingen te veroorzaken die de biologische rol ervan zullen beïnvloeden. Een kristalstructuur van het doeleiwit is een ideale leidraad bij de identificatie van dergelijke flexibele lusgebieden voor de insertie van LightR. Indien nodig kan de kristalstructuur van een nauwe homoloog volstaan. Hieronder vindt u enkele algemene criteria waarmee u rekening moet houden.
      1. Zorg ervoor dat de inbrenglus structureel is gekoppeld aan de kritische katalytische elementen van het enzym. Zorg ervoor dat de geselecteerde invoeglus geen bestaande bindingsplaats voor het eiwit is en dat de invoeging van LightR mogelijk geen functionele interacties verstoort als gevolg van sterische effecten.
      2. Vervang als eerste strategie één aminozuur in de invoeglus bij het invoegen van LightR. Richt u op het midden van de invoeglus met een polair of klein aminozuur (bijv. Glu, Arg, Lys, Gly) dat is blootgesteld aan het oplosmiddel en niet betrokken is bij intramoleculaire interacties.
         OPMERKING: Wanneer één aminozuurvervanging niet resulteert in een functioneel eiwit, vereist optimalisatie van het LightR-construct de vervanging van meerdere aminozuren of de gehele invoeglus. Evalueer de functionaliteit van meerdere invoegplaatsen voor LightR binnen de gedefinieerde lus.
      3. Zorg ervoor dat het doelenzym onafhankelijk van endogene regulatie werkt. Bereik dit door een constitutief actieve mutante versie van het enzym te gebruiken voor de insertiesjabloon.
         OPMERKING: Wild-type enzymen kunnen ook worden gebruikt om LightR-constructen te genereren, maar dit kan resulteren in een AND-gated systeem dat wordt gereguleerd door endogene mechanismen en licht.
      4. Positieve en negatieve controles zijn van vitaal belang voor de analyse van de LightR-enzymactiviteit. Gebruik constitutief actieve mutanten van endogene eiwitten als positieve controles en katalytisch inactieve mutante versies van het beoogde LightR-enzym als negatieve controles.
         OPMERKING: Bij het selecteren van inactiverende mutaties is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de mutatie voldoende afstand heeft van de LightR-insertieplaats om te voorkomen dat de onomkeerbaarheid van de vouwing van het LightR-enzym wordt verstoord. Op basis van de bovenstaande criteria wordt de LightR-insertieplaats in Src-kinase geselecteerd in een flexibel lusgebied dat via een bètastreng structureel is gekoppeld aan het sterk geconserveerde GXGXXG-motief in het ATP-bindende G-lus/glycinerijke lusgebied. Belangrijk is dat het uit de buurt van de ATP-bindingszak en het substraatbindingsgebied^10,17 wordt geplaatst (Figuur 1C (i)).
         OPMERKING: Vanwege structurele homologie tussen kinasen wordt de LightR-insertieplaats in bRaf geselecteerd in dezelfde structurele lus als de insertieplaats in Src (Figuur 1C (ii)).
         OPMERKING: Op basis van de principes vermeld in paragraaf 1.1.2 wordt de LightR-insertieplaats in Cre-recombinase, een niet-kinase, gekozen in een van de flexibele lussen ver van de katalytische kern, d.w.z. de DNA-bindingsplaats. De insertielus is echter nog steeds structureel gekoppeld aan kritische katalytische residuen binnen het DNA-bindingsdomein via een α-helix om het succes van de LightR-Cre-functionaliteit te garanderen (Figuur 1C (iii)). Alle insertieplaatsen met positieve en negatieve controles voor verschillende enzymen die in het huidige protocol worden beschreven, worden gedetailleerd beschreven in aanvullende tabel 2.
   3. Ontwikkeling van FastLightR.
      OPMERKING: De introductie van I85V-mutatie in beide VVD's in LightR maakt een snellere activerings-inactivatiedynamiek mogelijk, toegeschreven aan de snelle omzetting van de mutant in de donkere toestand^18,19. De generatie van FastLightR-Src en FastLightR-bRaf met snelle inactiveringskinetiek maakt een strakke temporele controle van activering en inactivatie mogelijk. Het maakt het mogelijk om subcellulaire regulatie van LightR-Src in levende cellen te bereiken.
      OPMERKING: Cre-recombinase-activiteit resulteert in onomkeerbare DNA-recombinatie; daarom zijn de reversibiliteitseigenschappen van LightR niet van toepassing.
      OPMERKING: Om de detectie van het LightR-construct te vereenvoudigen, kan een fluorescerend eiwit of een andere geschikte tag worden bevestigd aan de N- of C-terminus van het doeleiwit. Deze studie gebruikte mCherry-myc voor LightR-Src, Venus voor LightR-bRaf en miRFP670 voor LightR-Cre-recombinase.
2. Strategie voor klonen
   OPMERKING: De kloonbenadering is, in tegenstelling tot traditionele benaderingen, gebaseerd op plaatsgerichte mutagenese die niet afhankelijk is van specifieke beperkingsplaatsen^10,20.
   1. Genereren van een "Megaprimer"
      1. Codon-optimaliseer de LightR-genen om een stabiele expressie van de twee tandem VVD-DNA-sequenties van schimmeloorsprong in zoogdiercellen te garanderen en om de sequenties zo verschillend mogelijk te maken voor foutloos klonen met behulp van PCR. Volg de stappen 1.2.1.2-1.2.1.3 om codonoptimalisatie uit te voeren.
      2. Lijn de aminozuursequentie van VVD's en de geselecteerde linkers naast elkaar uit om de theoretische sequentiekaart van LightR te maken.
      3. Plak de sequentie in een online codonoptimalisatieplatform dat gebruikmaakt van een geavanceerd algoritme voor codonoptimalisatie om de beste sequentieoptie te bepalen met minimale complexiteit. Zorg ervoor dat het doelorganisme wordt geselecteerd, het leesframe wordt onderhouden en de VVD-sequenties worden geselecteerd voor optimalisatie.
      4. Verkrijg LightR-DNA als een op maat gemaakt gesynthetiseerd fragment (zie aanvullende tabel 1) of van een eerder gepubliceerd LightR-construct¹⁰.
      5. Amplificeer het LightR-gen om "Megaprimer" te genereren met behulp van de eerder beschreven^20-strategie zoals beschreven in figuur 1D. Synthese de LightR "Megaprimer" via PCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het specifieke DNA-polymerase en met behulp van het volgende PCR-reactiemengsel:
         5x DNA Polymerase compatibele buffer: 10 μL
         100 μM Forward megaprimer: 0,5 μL
         100 μM Omgekeerde megaprimer: 0,5 μL
         10 nM dNTP-mix: 2 μL
         DNA-polymerase (2000 eenheden/ml): 1 μl (0,02 E/μL)
         50 ng Sjabloon DNA: 1 μL
         Water van PCR-kwaliteit: 35 μL
         OPMERKING: Hier wordt high-fidelity, hotstart DNA-polymerase met universele primergloeitemperaturen gebruikt.
      6. Scheid de resulterende megaprimer door elektroforese van agarosegel. Het product zal ongeveer 1000 nucleotiden lang zijn. Snijd de megaprimer uit de agarosegel en zuiver met behulp van een gelextractiekit, volgens de aanbevelingen van de fabrikant of met behulp van een analoge techniek.
   2. Inbrengen van het LightR-gen met behulp van plaatsgerichte mutagenese: Plaats de LightR en vervang een gewenst aminozuur of een stuk aminozuren. Het sjabloonplasmide is het plasmide waar het LightR-domein wordt ingevoegd. Voer de PCR-reactie uit zoals eerder beschreven²⁰ met behulp van het volgende mengsel.
      5x DNA Polymerase compatibele buffer: 5 μL
      10 nM dNTP-mix: 1 μL
      DNA-polymerase (2000 eenheden/ml): 1 μL (0,02 E/μL)
      50 ng Doelmalplaatje DNA: 1 μL
      Geëxtraheerde Megaprimer (berekende massa): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Water van PCR-kwaliteit: 2,5 μL
      OPMERKING: Megaprimer-massa (ng) = gewenste wisselplaat/vectormolaire verhouding x massa van de vector x verhouding tussen wisselplaat en vectorlengtes. De gewenste insert/vector molaire verhouding die gebruikt wordt is 3/1.
   3. Voeg na voltooiing van de PCR-reactie 1 μL DpnI-enzym (2000 eenheden/ml) toe om selectief alleen het overtollige en gemethyleerde DNA te verteren en het mengsel gedurende 1-1,5 uur bij 37 °C te incuberen. Dit zal het rendement van de gewijzigde constructie aanzienlijk verhogen.
   4. Transformeer 1-2 μL van de PCR-reactie in DH5α-competente cellen volgens de protocollen van de fabrikant.
   5. Plaat getransformeerde bacteriën op Luria Broth (LB)-agarplaat met geschikt antibioticum voor selectie. Incubeer de plaat bij 37 °C 's nachts of bij kamertemperatuur (RT; 25-30 °C) gedurende 72 uur.
      OPMERKING: LB-platen met kolonies die erop zijn gekweekt, kunnen maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard en het protocol kan worden gepauzeerd.
   6. Kolonie screening PCR
      1. Voor PCR-gebaseerde koloniescreening ontwerpt u primers die in het LightR-invoegsel gloeien en zich richten op DNA om ongeveer 400-700 bp-fragmenten te genereren.
      2. Voeg een kleine hoeveelheid van een kolonie van de LB-plaat toe aan de onderstaande PCR-mix en ga verder met thermocycling volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het specifieke DNA-polymerase.
         2x Taq RED Master Mix: 5 μL
         PCR-kwaliteit water : 5 μL
         100 μM Voorwaartse primer : 0,5 μL
         100 μM Omgekeerde primer: 0,5 μL
      3. Controleer op positieve kolonies door middel van agarosegelelektroforese.
      4. Kies de kolonies die de gewenste PCR-productgrootte hebben gegenereerd en inoculeer ze afzonderlijk in 3 ml LB-bouillon met het antibioticum, passend bij de antibioticaresistentie in de plasmide-ruggengraat. Vervolgens incuberen en een nacht schudden bij 37 °C.
      5. Extraheer plasmide-DNA uit vloeibare cultuur volgens de instructies van de fabrikant van de plasmidezuiveringskit voor plasmide-DNA-extractie en verifieer de aanwezigheid van het inzetstuk door sequencing.
         OPMERKING: Kloonprimers zijn samengevat in aanvullende tabel 3.

2. Celplating en biochemische analyse van de activiteit van het LightR-enzym (Figuur 2A)

1. Voor biochemische analyse van LightR-kinasen (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), plaat 1 x 10⁶ LinXE-cellen per 3,5 cm celkweekschaaltje voor elke experimentele groep. Zie aanvullende tabel 4.
2. Cellen incuberen bij 37 °C en 5 % CO₂ gedurende 16-18 uur.
3. Transfecteer de cellen de volgende dag met het geselecteerde DNA-construct met behulp van een geschikt transfectiereagens volgens de aanbevelingen van de fabrikant (aanvullende tabel 4).
   OPMERKING: Het optimale transfectiereagens hangt af van de constructie, vector en het type cellen dat wordt gebruikt. In deze studie werd 2 μg DNA gebruikt in een schaal van 3,5 cm met behulp van een transfectiereagens. Empirische tests moeten worden uitgevoerd om het optimale transfectiereagens te bepalen. Aangezien getransfecteerde constructen eiwitten tot expressie brengen die worden gereguleerd door blauw licht, moeten alle volgende stappen die met getransfecteerde cellen worden behandeld, worden uitgevoerd onder rood licht. Wikkel de platen met getransfecteerde cellen in aluminiumfolie voordat u ze in de couveuse plaatst om onbedoelde verlichting te voorkomen.
4. Stel de cellen na 16-18 uur transfectie bloot aan blauw licht¹⁰. Om dit uit te voeren, plaatst u een 465 nm light-emitting diode (LED) paneellampsysteem in de weefselkweekincubator. Plaats een geperforeerd plexiglas paneel 10 cm boven de lamp om de gewenste verlichting van 3 mW/cm² te verkrijgen (aanvullend bestand 1). Een geperforeerd paneel is nodig om een ononderbroken luchtcirculatie in de couveuse te behouden. Verlicht de cellen gedurende de gewenste periode.
5. Gebruik voor het activeren van LightR-Src en LightR-bRaf continue verlichting. Voor continue verlichting zet u het LED-paneel handmatig aan en uit.
6. Om de activerings-/inactiveringscyclus van FastLightR Src te behouden, gebruikt u AAN/UIT-cycli die handmatig of door een microcontroller worden bediend.
   OPMERKING: Er kunnen verschillende softwaretoolkits worden gebruikt die een Integrated Development Environment (IDE) bieden voor het schrijven en uploaden van de vereiste code. Deze toolkits ondersteunen C/C++-programmering en bieden algemene input/output (GPIO)-toegang, wat essentieel is voor het regelen van de gepulseerde verlichting. Een gedetailleerde beschrijving van de protocollen en codes die voor deze doeleinden worden gebruikt, wordt beschreven in Aanvullend Dossier 1.
7. Aan het einde van de respectieve tijdstippen van het experiment (aanvullende tabel 4), oogst de cellen onder veilige rode lichten. Zuig de media op en was de cellen met koude PBS.
8. Om eiwit te isoleren, lyseert u cellen met 500 μL 2x Laemmli-monsterbuffer aangevuld met 5% v/v 2-Mercaptoethanol. Incubeer het lysaat bij 100 °C gedurende 5 min. Analyseer cellysaten door middel van eiwitgelelektroforese en Western blotting²¹.
   OPMERKING: De samenstelling van 2x Laemmli-buffer is als volgt: Voor 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glycerol, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g broomfenolblauw, eind-pH 6,8.
9. Beoordeel de LightR-Src-activiteit door het fosforyleringsniveau van endogene p130cas op Tyr249 en paxilline op TyrY118^{te evalueren 22,23} (Figuur 2). Beoordeel de LightR-bRaf-activiteit door het fosforyleringsniveau van MEK1 op Ser217/221 en ERK1/2 op TyrY202/204^24,25 te evalueren.

3. Functionele analyse van de activiteit van LightR-Cre

1. Voor de functionele analyse van de LightR-Cre activiteit, plaat 1 x 10⁶ LinXE cellen per 3,5 cm celkweekschaaltje. Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 16-18 uur.
2. Transfecteer de cellen volgens het protocol dat wordt beschreven in sectie 2, figuur 2A en aanvullende tabel 5. Co-transfect in totaal 2 μg DNA, met een verhouding van 1:9 van LightR-Cre-iRFP670 en een Reporter-plasmide Floxed-STOP-mCherry².
3. Verlicht de cellen na 16-18 uur na transfectie. Een efficiënte activering van LightR-Cre vereist langdurige verlichting. Gebruik daarom, om fototoxiciteit te voorkomen, gepulseerde verlichting gedurende 8 uur met cycli van 2 s AAN en 20 s UIT met behulp van een 465 nm LED-paneellampsysteem dat wordt bestuurd door een microcontroller zoals beschreven in sectie 2 en aanvullend bestand 1.
4. Voer beeldvorming uit met behulp van epifluorescentiemicroscopie met een 20x luchtobjectief. Gebruik voor visualisatie van LightR-Cre-iRFP670 de Cy5-filterset en voor visualisatie van mCherry van Floxed-mCherry-expressie de RFP-filterset.
   OPMERKING: Voor beeldvorming wordt een epifluorescentiemicroscoop gebruikt die is uitgerust met Cy5/RFP-lichtkubussen.

4. Voorbereiding van monsters voor beeldvorming van levende cellen

1. Plaat 2 x 10⁵ HeLa-cellen per 35 mm weefselkweekschaaltje in celkweekmedia en gedurende 2 uur incuberen bij 37 °C en 5% CO_{2 .}
2. Zodra de cellen zich hebben gehecht en de samenvloeiing ongeveer 60%-70% is, co-transfecteert u de HeLa-cellen met een van de volgende mengsels: (i) 0,85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg Stargazin-iRFP, of (ii) 0,75 μg FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg mCherry-ERK2
   OPMERKING: In FastLightR-Src-experimenten wordt de Stargazin-iRFP gebruikt om het plasmamembraan te labelen voor analyse van celspreiding. Als een hogere FastLightR-Src-expressie gewenst is, kan stargazin-iRFP worden weggelaten en kan in plaats daarvan 1 μg FastLightR-Src worden gebruikt. In deze gevallen moet een membraankleurstof worden gebruikt om de cellen te visualiseren. Plasmamembraankleuringen worden routinematig gebruikt voor het labelen van celmembranen.
3. Dek de schaal af met aluminiumfolie om onbedoelde verlichting van de cellen te voorkomen en incubeer gedurende 16-18 uur bij 37 °C en 5% CO₂.
4. Voer alle volgende stappen uit onder roodlichtverlichting om onbedoelde activering van de constructies te voorkomen. Blootstelling aan wit licht induceert de activering van LightR-kinasen en kan de daaropvolgende resultaten beïnvloeden.
5. Smeer op dezelfde dag 3 ronde glazen dekglaasjes (25 mm diameter, 0,17 mm dikte) 's nachts in met 5 mg/L fibronectine in PBS bij 37 °C.
6. Spoel de dekglaasjes 16-18 uur na transfectie af met PBS en leg ~1 x 10⁵ getransfecteerde HeLa-cellen op elk dekglaasje. Incubeer in celkweekmedia gedurende 2 uur bij 37 °C en 5% CO_{2 .}
   OPMERKING: De lage zaaidichtheid is nodig om ervoor te zorgen dat cellen in het gezichtsveld elkaar niet raken.
7. Bereid de beeldvormingsmedia voor door FBS toe te voegen aan de L-15 beeldvormingsmedia van Levobitz tot een eindconcentratie van 5%. Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm en verwarm deze tot 37 °C.
8. Verwarm minerale olie voor tot 37 °C.
9. Was de dekglaasjes met de cellen twee keer met PBS. Als u een membraankleurstof gebruikt, kleurt u de cellen volgens de instructies van de fabrikant voordat u de dekglaasjes wast.
10. Plaats het dekglaasje voorzichtig in een kamer voor live celbeeldvorming. Voeg 1 ml L-15 beeldvormingsmedia toe aan de kamer.
11. Voeg 1 ml minerale olie toe aan de media om verdamping tijdens het beeldvormingsproces te voorkomen.
12. Houd de kamer beschermd tegen licht bij 37 °C totdat deze klaar is om te fotograferen.

5. Globale activering en beeldvorming van FastLightR-Src (Figuur 3)

1. Bevestig een blauw LED-microscopieringlicht aan de microscoopcondensor en plaats deze ongeveer 1.5 cm boven de monsterhouder. Sluit het AC/DC-stuurrelais voor de ringlamp aan op de microscoopcomputer.
   OPMERKING: Voor de experimenten in deze studie werd de verlichting geregeld via een Transistor-Transistor Logic (TTL)-interface via de beeldvormingssoftware. Epifluorescerende verlichting kan ook worden gebruikt om LightR-constructies globaal te activeren als er geen externe verlichtingsbron beschikbaar is. GFP-excitatiegolflengten, zoals het 490/20 nm excitatiefilter, zijn effectief bij het activeren van LightR.
2. Plaats de kamer op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 °C en selecteer cellen die FastLightR-Src-mCherry en Stargazin-iRFP tot expressie brengen (Figuur 3B) of FastLightR-bRaf-Venus en mCherry ERK-2 (Figuur 5B).
3. Gebruik voor de studie van globale verlichtings- en beeldvormingsexperimenten microscoopcompatibele, hoogwaardige objectieven (40x) met apochromatische correctie, vlakveldcorrectie en hoge numerieke apertuur.
   1. Gebruik voor wereldwijde op verlichting gebaseerde studies van Src-kinase 561/10 nm excitatie en 595/40 nm emissiefilters om FastLightR-Src-mCherry te visualiseren en gebruik 640/20 nm excitatie en 655LP-emissiefilter om stargazin-iRFP te visualiseren.
   2. Gebruik voor wereldwijde verlichtingsstudies van bRaf-kinase 514/10 nm excitatie en 540/21 nm emissiefilters om FastLightR-bRaf-Venus te visualiseren en gebruik 561/10 nm excitatie en 595/40 nm emissiefilters om mCherry-ERK-2 te visualiseren.
   3. Gebruik een multiband polychroïsche spiegel in alle fluorescerende beeldvormingskanalen.
4. Neem, afhankelijk van de experimentele omstandigheden, de volgende aanbevelingen in acht.
   1. Beeld de cellen ten minste 10 minuten voorafgaand aan de verlichting af om een basisactiviteit van de cellen vast te stellen.
      OPMERKING: Deze basislijn is nodig om te bepalen of activering van FastLightR-kinase door verlichting veranderingen in het celgedrag of eiwitlokalisatie induceert. Men kan ook langere perioden van basale beeldvorming uitvoeren om een grotere statistische significantie te verkrijgen.
   2. Vanwege de snelle inactiveringskinetiek van FastLightR's, kan het opnemen van veel cellen voor beeldvorming de deactivering van Src/bRaf tussen faseposities veroorzaken en de respons ervan verzwakken. Om een dergelijke fout te voorkomen, maakt u een beeld van 4 cellen/min tijdens het analyseren van de FastLightR-Kinase-activiteit in het beschreven protocol en beeldt u elke geselecteerde cel elke minuut af gedurende in totaal 110 minuten (aanvullend bestand 2).
   3. Gebruik gepulseerde verlichting in plaats van continue verlichting om de mogelijke fototoxische effecten van blauw licht te verminderen. De verlichting gedurende 12 s voor elk van de 4 cellen/min is effectief (aanvullend bestand 2, figuur 3A).
      OPMERKING: De verlichtingscycli moeten empirisch worden bepaald voor verschillende constructies en soorten verlichtingsbronnen.
   4. Schakel de verlichting uit tijdens celbeeldvorming om doorbloeding in de fluorescerende kanalen te voorkomen.
      OPMERKING: Als u te veel cellen tegelijk in beeld brengt, neemt de totale verlichtingstijd die beschikbaar is voor het monster af, wat leidt tot een verzwakte respons door onvoldoende activering.
5. Sla na het maken van de beeldvorming de films op als een . TIF-stackbestandsformaat voor analyse.
   OPMERKING: Vanwege de minder uniforme verlichting met GFP-epifluorescentie in vergelijking met ringlicht, zullen experimenten met GFP-epifluorescentie frequentere verlichting vereisen. Dit heeft tot gevolg dat er per experiment minder cellen in beeld worden gebracht.

6. Subcellulaire activering en beeldvorming van FastLightR-Src (Figuur 4)

1. Plaats de kamer op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 °C en selecteer een enkele cel die zowel FastLightR-Src-mCherry als Stargazin-iRFP tot expressie brengt.
2. Selecteer de specifieke regio's (ROI) binnen de cel die u wilt verlichten. Deze studie kiest een klein gebied aan de periferie van de geselecteerde cel.
   OPMERKING: Voor lokale verlichting wordt een laser van 445 nm gebruikt die is scherpgesteld door een TIRF-module in FRAP-modus of een microspiegelapparaat dat wordt bestuurd via een TTL-interface via de beeldvormingssoftware. Elk verlichtingssysteem met patroon werkt voor deze experimenten. Als een scansysteem wordt gebruikt, bepaal dan de laserintensiteit en homogeniteit voor voldoende activering zonder schade aan de cel.
3. Beeld de geselecteerde cel elke minuut gedurende 20 minuten in de basale toestand vóór de verlichting, 50 minuten tijdens de lokale verlichting en vervolgens 20 minuten na activering gedurende in totaal 90 minuten (aanvullend bestand 2).
4. Geef voor activering en deactivering een geschikte hoeveelheid tijd die geschikt is voor het doeleiwit om volledige deactivering van het LightR-eiwit mogelijk te maken. Laat voor FastLightR-Src ten minste 10 minuten deactivering toe om de resterende activiteit te laten afnemen en laat 20 minuten deactivering toe in de gedemonstreerde experimentele opstelling voor lokale verlichting.
5. Sla de films na het maken van de afbeelding op als . TIF-stackbestandsformaat voor analyse.

7. Analyse van de celverspreiding

1. Bereid afbeeldingen voor op gegevensverwerking en -analyse. Zorg ervoor dat de afbeeldingen in een . TIF-stack-indeling. Sla deze rechtstreeks op vanuit de beeldvormingssoftware of converteer ze met behulp van een open-sourceprogramma.
2. Download het CellGeo-scriptpakket uit de gecomprimeerde bestanden met aanvullende gegevens²⁶.
   LET OP: Het CellGeo pakket bevat verschillende scripts. Kies het gewenste pakket uit de lijst op basis van het type analyse zoals behandeld in de protocolsecties 7-9.
3. Open en voer het script met de titel MovThresh uit om een masker van de cel te maken.
   1. Selecteer Bestand > Importeren (.tif) en selecteer de Stargazin-iRFP-afbeeldingen van de cellen.
   2. Scan door de frames met behulp van de schuifbalk in de linkerbenedenhoek. Als de voorgestelde drempelwaarde geschikt is, gaat u naar stap 7.4.
   3. Als de voorgestelde drempelwaarde niet overeenkomt met het gedrag van de cel, kiest u afgevlakte of aangepaste curven onder Curmeselectie. Maak de aangepaste curve door door de kaders te scrollen en vervolgens de drempel aan de rechterkant van het venster aan te passen.
   4. Klik op Drempel opnieuw instellen.
   5. Klik op Bestand > Opslaan als maskers, Wijzig de naam van het bestand en sla het op met de optie Opslaan als .
4. Open het nieuw gemaakte stapelbestand in een open-source beeldanalyseprogramma.
5. Selecteer Afbeelding > pas > drempelwaarde aan > toepassen.
6. Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren > Weergaveresultaten controleren -> OK.
7. Bereken de verandering in oppervlakte voor elke cel door de oppervlakte op een bepaald moment te delen door de gemiddelde oppervlakte van dezelfde cel voorafgaand aan de bestraling met blauw licht.
8. Teken de gebiedsverandering als een lijn- of staafdiagram.
9. Bereken de gemiddelde waarde en 90% betrouwbaarheidsintervallen voor elk tijdstip van alle cellen die onder dezelfde omstandigheden zijn behandeld.

8. Analyse van de dynamiek van de celrand

1. Bereid de stapelbestanden voor met behulp van de stappen die worden beschreven in protocolsectie 7.
2. Open het script met de naam ProActive en voer het uit.
   1. Selecteer Bestand > Importeren > Maskers (.tif) en selecteer het masker dat is gemaakt met het MovThresh-script .
   2. Selecteer de activiteit die van belang is voor analyse in de rechterbenedenhoek (Uitsteeksel, Intrekkend of Totaal).
   3. Selecteer het type normalisatie. Meestal wordt voor deze analyses gebiedsnormalisatie gebruikt.
   4. Selecteer het beginreferentiekader met behulp van de schuifregelaar aan de linkerkant. De vertragingsschuifregelaar aan de rechterkant bepaalt de vertraging tussen twee tijdstippen die wordt gebruikt om de oppervlakte te meten die door de cel wordt gewonnen en verloren.
   5. Als het geselecteerde frame en het vertragingsgetal bovendien groter zijn dan het aantal frames in de film, wordt de voorbeeldafbeelding niet weergegeven. Stel deze waarden opnieuw in zodat ze gelijk zijn aan minder dan het totale aantal frames.
3. Wijzig de drempelwaarde voor uitsteeksel of intrekking door het vakje voor Vloeiende curve aan te vinken onder de sectie Resultaten . Hiermee worden de drempelwaarden over een specifiek venster gemiddeld, waardoor problemen kunnen worden opgelost waarbij kleine fluctuaties worden gedetecteerd als activiteit.
4. Selecteer Het bereik uitvoeren om de activiteit te berekenen gedurende de tijd die is opgegeven door de schuifregelaars voor frames en vertragingen.
5. Sla de numerieke gegevens op door Bestand > Opslaan als > Resultaten (.mat) te selecteren en gebruik deze om de gemiddelde uitsteeksel- of intrekkingsactiviteit te bepalen.
6. Bepaal de 90%-betrouwbaarheidsintervallen voor elk tijdstip.
   OPMERKING: Hiermee wordt een array van verschillende waarden opgeslagen. Het tekstbestand "Hoe ProActive te gebruiken" dat bij het script is gevoegd, biedt een gedetailleerde beschrijving van wat elke waarde vertegenwoordigt en hoe deze is bepaald²⁶.
7. Sla de visuele weergave van de activiteit op door Bestand > Opslaan als > Afbeeldingen (.tif) te selecteren.

9. Analyse van zwaartepuntverschuiving

1. Gebruik voor de analyse van de zwaartepuntverschuiving alle software die de coördinaten van het zwaartepunt kan bepalen.
2. Open in de analysesoftware de gemaskeerde afbeeldingsstapel van de cel waarin u geïnteresseerd bent, zoals beschreven in protocolsectie 7.
3. Selecteer Meten > Geïntegreerde morfometrieanalyse en klik vervolgens op Voorkeuren > Zwaartepuntmarkering tekenen > Controleren en selecteer vervolgens Meten.
   1. Noteer de coördinaten van het zwaartepunt vóór de beweging (A).
   2. Noteer de coördinaten van het zwaartepunt aan het einde van het experiment (B).
   3. Noteer de coördinaten voor het midden van het verlichtingspatroon (C).
4. Nu de drie punten zijn verzameld, bepaal je de hoek BAC⁸. θ₁ komt overeen met de hoek ABC en θ₂ komt overeen met de hoek CBA (Figuur 4Cii). Doe dit met behulp van de volgende vergelijking:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   OPMERKING: Een rekenmachine kan worden gebruikt om de hoeken en afstanden rechtstreeks van de coördinaten te bepalen voor gebruiksgemak.
5. Bepaal de verplaatsing van het zwaartepunt door de afstand die het zwaartepunt van de cel in pixels heeft afgelegd te vermenigvuldigen met de conversiefactor waarbij 1 pixel gelijk is aan 0,4 μm. De specifieke conversie van pixels naar afstand is afhankelijk van de vergroting en camera-instellingen op het systeem.
6. Zodra de zwaartepuntverschuivingshoek en -afstand zijn bepaald, opent u een grafische software die in staat is om afbeeldingen van polaire coördinaten te produceren.
7. Voer de zwaartepuntverschuivingshoek in als de θ-meting en de afgelegde afstand als de straal. Gebruik ANOVA om te testen op 95% betrouwbaarheidsintervallen.
8. Plot de resultaten en sla de afbeelding op.

Resultaten

De LightR-Src is ontworpen en gegenereerd volgens de strategie beschreven in figuur 1A,B. Biochemische analyse van LightR-Src heeft toegang tot de fosforylering van bekende endogene Src-substraten, p130Cas (Y249)²² en paxilline (Y118)²³ als reactie op blauw licht bij 60 minuten continue verlichting (Figuur 2B). Opmerkelijk is dat er geen achtergrondactivering van Src-kinase wordt waargenomen wanneer LightR-Src alleen in het donker tot expressie wordt gebracht gedurende 16-18 uur na transfectie. Bovendien induceert de katalytisch inactieve mutant van LightR-Src met D388R-mutatie geen fosforylering van het Src-substraat, wat aantoont dat fosforylering wordt uitgevoerd door actief LightR-Src en niet wordt veroorzaakt door een niet-specifiek effect van verlichting met blauw licht (Figuur 2B). Naar aanleiding van meldingen van oscillerende activiteit van Src^27-kinase in levende cellen, onderzochten we of LightR-Src kon worden afgestemd om cyclische activering te vertonen. De originele LightR-Src vertoonde een langzame deactiveringskinetiek (Figuur 2C), wat leidde tot het genereren van een nieuwe variant, Fast-LightR-Src, die de I85V-mutatie in beide VVD's herbergde. Figuur 2D illustreert dat Fast-LightR-Src een duidelijk snellere deactiveringskinetiek vertoont en volledig inactiveert binnen 10 minuten na het uitschakelen van het licht, vergeleken met meer dan een uur voor LightR-Src. Met behulp van FastLightR-Src waren we ook in staat om herhaalde cycli van activering/inactivatie te bereiken (Figuur 2E). Deze resultaten tonen gezamenlijk het vermogen van de LightR-tool aan om specifieke en streng gecontroleerde regulatie van Src-activiteit in levende cellen te bereiken.

De toepassing van FastLightR-Src maakt het ook mogelijk om de effecten van voorbijgaande Src-activering op de celmorfodynamiek te beoordelen. Activering van FastLightR-Src in HeLa-cellen induceert celspreiding, en dit proces stopt zodra FastLightR-Src wordt geïnactiveerd. Bij activering observeerden we de translocatie van FastLightR-Src van het perinucleaire compartiment naar focale verklevingen en plasmamembraan, een gedrag dat wordt vertoond door wild-type Src-kinase^11,12. Verlichtende cellen die de katalytisch inactieve mutant D388RLightR-Src tot expressie brengen, vertonen dergelijke verspreidingseffecten niet (Figuur 3B,C). Dit bevestigt verder dat FastLightR-Src op dezelfde manier werkt als zijn wild-type tegenhanger. Lokale verlichting van een celgebied resulteert in gelokaliseerde activering van FastLightR-Src, aangegeven door lokale accumulatie LightR Src in focale adhesie en vergezeld van de vorming van lokale membraanuitsteeksels (Figuur 4B (i), (ii)) en celzwaartepuntverschuiving (Figuur 4C (i), (ii)) resulterend in celbeweging naar licht. Nadat we de toepassing van de LightR-tool voor de regulatie van Src-kinase hebben vastgesteld, demonstreren we het brede nut van LightR dat zich uitstrekt tot de regulatie van bRaf-kinase en DNA-recombinase Cre. Analyse van LightR-bRaf toont door licht geïnduceerde fosforylering van het endogene substraat van bRaf, MEK1, en stroomafwaartse fosforylering van ERK1/2-kinasen^24,25 op niveaus die vergelijkbaar zijn met die van de constitutief actieve bRaf-mutant (V600E) (Figuur 5A). Omgekeerd vertoont de katalytisch inactieve D575RLightR-bRaf geen MEK1- en ERK1/2-fosforylering, vergelijkbaar met niet-verlichte LightR-bRaf-monsters, wat de specificiteit van LightR-bRaf-regulatie bevestigt. Live beeldvorming van cellen toonde aan dat herhaalde cycli van FastLightR-bRaf-activering/-inactivatie herhaalde translocatie van ERK2 in en uit de kern induceren, wat bevestigt met de bekende resultaten van bRaf-activering²⁸ (Figuur 5B). De activering van LightR-Cre resulteert in de succesvolle recombinatie van een reporter mCherry-gen, wat de toepasbaarheid van LightR op verschillende klassen van enzymen aantoont (Figuur 5C).

Figuur 1: Ontwikkelingsstrategie van de LightR-benadering. (A) Kristalstructuren van twee Vivid-monomeren in donkere toestand (PDB: 2PD7) en het dimeer in verlichte toestand (PDB: 3RH8). (B) Cartoonweergave van het LightR-ontwerp. Twee tandem verbonden VVD-fotoreceptoren die in het katalytische domein zijn ingebracht, verstoren de katalytische activiteit van het eiwit in het donker. Dimerisatie van VVD als reactie op blauw licht herstelt de eiwitactiviteit. (C) Kristalstructuren van (i) Src (PDB 1Y57) en (ii) bRaf (PDB 4MNF) katalytische domeinen. (ii) Structuur van Cre-recombinase (PDB 1MA7). Gele pijlen geven de LightR-invoegplaats aan en geven het gesubstitueerde aminozuur aan. (D) Schematisch diagram van de kloonstrategie voor het invoegen van het LightR-domein in een doelenzymsequentie¹⁹. In stap 1 worden speciaal ontworpen primers gebruikt voor PCR-synthese van een LightR-fragment geflankeerd door plaatsen die voor en na de insertieplaats in het doelgen gloeien. In stap 2 wordt aangetoond dat het aldus geproduceerde LightR-fragment wordt gebruikt als een "megaprimer" voor het invoegen van LightR in het doelenzymgen door middel van Quick change site-directed mutagenese. Panelen A-C zijn aangepast en aangepast met toestemming van Shaaya et ^al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Biochemische karakterisering van gemanipuleerde LightR-eiwitten. (A) Schematische weergave van het experimentele protocol voor biochemische karakterisering van LightR Src. (B) LinXE-cellen die tijdelijk het LightR Src-construct tot expressie brengen met een mCherry en een myc-tag aan de C-eindpunt, werden gedurende 60 minuten continu verlicht met blauw licht, met behulp van een 465 nm LED-opstelling. Cellysaten werden onderzocht op fosforylering van Src-substraten, paxilline en p130Cas. Western Blot-resultaten tonen fosforylering van endogene paxilline en p130Cas als reactie op activering van LightR-Src in levende cellen. (C,D) LinXE-cellen die tijdelijk de aangegeven LightR-Src-constructen tot expressie brengen met een tandem mCherry-myc-tag aan de C-terminus, werden gedurende bepaalde tijden (0 minuten en 30 minuten) continu blootgesteld aan blauw licht en vervolgens gedurende aangegeven perioden in het donker geplaatst. Cellysaten werden onderzocht op fosforylering van Src-substraten, wat de vergelijking van de activerings- en deactiveringskinetiek tussen (C) LightR-Src en (D) FastLightR-Src aantoonde. (E) LinXE-cellen die tijdelijk de aangegeven LightR-Src-constructen tot expressie brengen met een tandem mCherry-myc-tag aan de C-terminus, werden gedurende 20 minuten continu blootgesteld aan blauw licht, gevolgd door herhaalde incubatie in het donker gedurende 10 minuten en in het licht gedurende 20 minuten. Cellysaten werden verzameld en onderzocht op fosforylering van Src-substraten, wat de efficiëntie aantoonde van Src-kinasecycli tussen activerings- en inactiveringstoestanden. Alle experimenten werden minstens drie keer herhaald met vergelijkbare resultaten. De getallen die naast elk western blot-paneel B-E worden weergegeven, vertegenwoordigen de molecuulgewichten van de eiwitten, gemeten in kilodalton (kDa). Panelen B-E zijn aangepast en aangepast met toestemming van Shaaya et ^al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Controle van de globale en temporele verlichting en effect op de activiteit van FastLightR-Src. (A) Cartoonweergave van het experimentele schema van globale en temporele cyclische verlichting en de daaropvolgende gegevensanalyses. (B,C) Regulatie van celmorfologie en FastLightR-Src-lokalisatie door blauw licht wordt weergegeven in representatieve beelden van HeLa-cellen verkregen uit een time-lapse-reeks met behulp van breedveldfluorescentiemicroscopie. Deze cellen brachten tijdelijk FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 cellen) of katalytisch inactief D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 cellen) samen met Stargazin-iRFP670 (plasmamembraanmarker) tot co-expressie. Beeldvorming van levende cellen werd elke minuut uitgevoerd, terwijl cellen wereldwijd werden verlicht met blauw licht (blauwe contouren). (B) Gele pijlen markeren de lokalisatie van FastLightR-Src bij structuren die lijken op focale verklevingen. De beelden werden verkregen uit een time-lapse-reeks HeLa-cellen met behulp van breedveldfluorescentiemicroscopie. (C) De kwantificering van veranderingen in het celgebied geïnduceerd door activering van FastLightR-Src vs. D388RLightR-Src wordt op elk paneel weergegeven. Het verlichtingsvenster wordt aangegeven als blauwe rechthoeken. Grafieken geven gemiddelde ± 90% betrouwbaarheidsintervallen weer. Panelen B en C zijn aangepast en aangepast met toestemming van Shaaya et ^al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Lokale controle van subcellulaire verlichting en effect op FastLightR-Src-activiteit. (A) Cartoonweergave van een experimenteel schema voor lokale subcellulaire verlichtingsregeling. (B) (i) Time-lapse-sequentie ter illustratie van een HeLa-cel die FastLightR-Src-mCherry tot expressie brengt, lokaal verlicht met blauw licht (weergegeven door een blauwe cirkel). Elke minuut werden beelden vastgelegd met behulp van fluorescentiemicroscopie met totale interne reflectie (60x objectief). De beelden worden gepresenteerd als beelden met omgekeerd contrast die met bepaalde tijdsintervallen zijn verkregen. (ii) Celprojectiebeelden die uitsteeksels tonen die zijn gevormd tijdens gespecificeerde tijdsintervallen. Het drempelen en maskeren van de celmorfologie over de experimentele tijdlijn vertegenwoordigt het platform voor het analyseren van celspreiding en celranddynamiek. Het gespecificeerde verlichte gebied van de cel wordt omlijnd door een blauwe cirkel. (C) (i) Polaire grafiek voor cellen die de migratieafstand van het zwaartepunt (d) en de afwijkingshoek (θ) ten opzichte van de lokale verlichting van blauw licht vertegenwoordigen. Zwarte stippen vertegenwoordigen individuele HeLa-cellen die katalytisch inactieve D388RLightR-Src (N = 6 cellen) of FastLightR-Src (N = 10 cellen) tot expressie brengen. (ii) Schematische weergave van de zwaartepuntverschuivingsafstand (d) die het zwaartepunt van de cel heeft afgelegd vanaf het begin (1) tot het einde (2) van lokale blauwlichtstimulatie. De afwijkingshoek (θ) geeft de mate van divergentie van de zwaartepuntbeweging van de cel aan ten opzichte van de locatie van blauw licht. De lichtgrijze arcering geeft het gebied aan dat door de cel uitsteekt als reactie op lokale FastLightR-Src-stimulatie. Het gespecificeerde verlichte gebied van de cel wordt aangegeven door een ononderbroken blauwe cirkel. Panelen B en C zijn aangepast en aangepast van Shaaya et ^al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Brede toepasbaarheid van de LightR-aanpak. (A) Regulering van LightR-bRaf. LinXE-cellen die tijdelijk LightR-bRaf-Venus, katalytisch inactieve D575R LightR-bRaf Venus of constitutief actieve bRaf (V600E)-Venus tot expressie brengen, werden gedurende de aangegeven periode blootgesteld aan continu blauw licht. Cellysaten werden onderzocht op de fosforylering van geïndiceerde eiwitten. (B) Representatieve beelden verkregen uit een time-lapse-reeks van live celbeeldvorming met behulp van breedveldfluorescentiemicroscopie illustreren de regulatie van de globale blauwlichtrespons in LinXE-cellen die tijdelijk FastLightR-bRaf-Venus en mCherry-ERK2 tot co-expressie brengen. Deze cellen werden wereldwijd verlicht met blauw licht (50 ms pulsen per seconde, 50 pulsen per minuut) gedurende een gespecificeerde duur die in blauw is omlijnd. Live-cell beeldvorming van mCherry-ERK2 werd elke minuut uitgevoerd. Gele pijlen markeren stadia van nucleaire ERK2-lokalisatie geïnduceerd door activering met blauw licht van gemanipuleerde bRaf. (C) LinXE-cellen werden tijdelijk geco-transfecteerd met een Floxed-stop-mCherry reporter en LightR-Cre-iRFP670. Cellen werden gedurende maximaal 8 uur blootgesteld aan donkere omstandigheden of pulserend blauw licht (2 s aan, 10 s uit). Beelden voor alle tijdstippen van elk kanaal werden verkregen met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop (10x objectief) bij identieke instellingen en werden aangepast aan consistente helderheids- en contrastniveaus om vergelijking van eiwitexpressieniveaus tussen monsters te vergemakkelijken. Het experiment werd minstens drie keer herhaald en leverde vergelijkbare resultaten op. De figuur is aangepast en aangepast van Shaaya et ^al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: LightR-sequentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 2: Beschrijving van LightR-insertieplaatsen en checklist voor LightR-Protein-ontwerp. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 3: Primers voor het klonen van LightR. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 4: Transfectievoorwaarden voor biochemische analyse van LightR-Protein-activiteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 5: Transfectievoorwaarden voor op beeldvorming gebaseerde analyse van de activiteit van LightR-Protein. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Gepulseerde verlichting met behulp van Integrated Development Environment (IDE). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Instellingen voor microscoopverlichting. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Onze studie presenteert een optogenetische benadering voor het onderzoek van diverse signaalroutes en toont de brede toepasbaarheid ervan aan bij het aanpakken van verschillende biologische vragen. Het LightR-toolsysteem biedt verschillende essentiële voordelen: (1) Allosterische regulatie van eiwitactiviteit, (2) Strakke temporele controle van activiteit die kan worden afgestemd om verschillende kinetieken van activering en inactivatie te bereiken, (3) Ruimtelijke resolutie van activiteit op subcellulair niveau, (4) Specificiteit van signaalmodulatie en biologische activiteit en (5) Breed scala aan toepasbaarheid op verschillende doeleiwitten. Met name LightR integreert al deze voordelen op unieke wijze in één tool, waardoor een aanzienlijke stap voorwaarts wordt gezet.

Het ontwerp van LightR als allosterische schakelaar biedt verschillende voordelen. Het vermogen van LightR om de eiwitactiviteit te regelen wanneer het in een kleine flexibele lus wordt ingebracht, biedt een aanzienlijke veelzijdigheid voor toepassing op verschillende eiwitten met diverse structuren en functies. Omdat het een allosterische schakelaar is, reguleert LightR alleen het doeldomein van het betreffende eiwit en heeft het geen invloed op de andere domeinen van het eiwit. Daarom maakt deze methode een specifieke regulatie van de activiteit mogelijk zonder essentiële functies van het eiwit in gevaar te brengen, zoals interacties met zijn bindingspartners of native lokalisatie in de cellen. Tweecomponenten optogenetische systemen zijn met succes toegepast voor de regulatie van eiwitlokalisatie, interacties of andere essentiële functies door gebruik te maken van lichtgemedieerde controle van homo- of heterodimerisatie 29,30,31,32,33,34,35 . Deze systemen vereisen echter vaak een geoptimaliseerde equimolaire expressie van twee eiwitten, waardoor hun toepassing uitdagender wordt. Allosterische regulatie met behulp van het LightR-systeem wordt bereikt binnen een enkel eiwit en biedt dus een veel veelzijdigere benadering voor het ondervragen van celsignalering.

Het brede scala aan toepasbaarheid van de LightR-switch op verschillende eiwitklassen wordt mede bereikt door de optimalisatie van verschillende modules binnen het LightR-domein. De linkers die LightR verbinden met het eiwit van belang en de linker die twee VVD-domeinen binnen LightR verbindt (inter-VVD-linker) kunnen de efficiëntie van de regulatie beïnvloeden. De keuze voor de inter-VVD flexible linker (GGS)4G(GGS)3 biedt voldoende flexibiliteit en lengte om de associatie en dissociatie van de VVD-monomeren binnen het LightR-domein te waarborgen. Deze linker heeft tot nu toe gezorgd voor de succesvolle regulatie van alle beoogde eiwitten. In gevallen waarin het LightR-domein het eiwit in het donker niet voldoende inactiveert, kan echter een stijvere linker worden geïntroduceerd die VVD-domeinen verder uit elkaar houdt om de opening van de LightR-klem te verbeteren, waardoor het enzym inactief blijft. De linker moet nog steeds voldoende flexibiliteit behouden om dimerisatie van de VVD's en activering van het beoogde eiwit mogelijk te maken. Om LightR te verbinden met het eiwit van belang, gebruiken we korte flexibele linkers, GPGGSGG en GSGGPG, toegevoegd aan de N- en C-termini van het LightR-domein. Ze zorgen voor voldoende flexibiliteit in de verbinding, waardoor onomkeerbare verstoring van het doeleiwit wordt voorkomen. Toch zijn ze kort genoeg om vervorming van het beoogde eiwit in het donker mogelijk te maken en tegelijkertijd het herstel van de eiwitfunctie in het licht te vergemakkelijken. Deze linkers ondersteunen de regulatie door LightR voor veel eiwittoepassingen. In bepaalde gevallen, wanneer deze linkers mogelijk niet voldoende inactivatie van het eiwit in het donker bieden, kan verkorting van de linkers nuttig zijn. Een dergelijke Linker-verkorting kan de flexibiliteit verminderen en de vervorming versterken die wordt veroorzaakt door de open LightR-klem in het donker, waardoor eventuele lekkage tot een minimum wordt beperkt. Desalniettemin kan deze aanpassing de maximale activiteit van het enzym in gevaar brengen als gevolg van mogelijke structurele verstoringen in de verlichte toestand. Als alternatief kan het vervangen van meerdere aminozuren in de invoeglus vergelijkbare voordelen van evenwichtige flexibiliteit bieden in gevallen waarin conformationele instabiliteit geen significant probleem is.

Veel kritische signaleringsprocessen worden tijdelijk geactiveerd of op een oscillerende manier gereguleerd 36,37,38,39,40,41,42,43. De afstembaarheid van de LightR-tool stelt ons in staat om complexe signaleringspatronen na te bootsen en biedt zo een krachtige aanpak voor het ondervragen van tijdelijk gecontroleerde biologische processen. We bereiken dit door de off-kinetiek van LightR te moduleren door de introductie van de I85V-mutatie in beide VVD-domeinen. Deze mutatie verkort de halfwaardetijd van VVD-dimeer in donkere toestand van 18.000 s tot 780 s¹⁹, waardoor een snellere inactivatie in het FastLightR-enzym wordt vergemakkelijkt.

Snelle inactivatiekinetiek maakt ook de regulatie van eiwitactiviteit bij subcellulaire resolutie mogelijk. De LightR-enzymen, met langzame kinetiek, kunnen het moeilijk maken om de effecten van subcellulaire activering waar te nemen als gevolg van intracellulaire diffusie van het geactiveerde construct. Met fast-off kinetiek wordt elk FastLightR-enzym dat buiten de zone van lokale verlichting diffundeert, snel gedeactiveerd. Door selectief specifieke subcellulaire regio's te activeren, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de lokale functies van de eiwitten voor een beter begrip van hun bijdrage aan de complexe cellulaire routes en signaleringsnetwerken.

Hoewel FastLightR's van onschatbare waarde zijn voor ruimtelijk en tijdelijk beperkte optische controle van eiwitactiviteiten in cellen, zijn er nog steeds toepassingen waar langzame kinetiek wenselijk kan zijn. LightR met slow-off kinetiek kan worden geïmplementeerd in onderzoeken waar aanhoudende en verbeterde blauw licht-induceerbare activiteit vereist is. Deze toepassingen vereisen slechts onregelmatige verlichtingspulsen om continue optogenetische activiteit te behouden, waardoor ook problemen zoals fototoxiciteit tot een minimum worden beperkt. Voor verschillende scenario's kan een breed scala aan kinetische modificaties^10,18 alleen of in combinatie met elkaar worden geïmplementeerd om een veelbelovende oplossing te bieden voor het afstemmen van de LightR-prestaties om de toepassing ervan voor een specifiek experiment te optimaliseren.

De toepasbaarheid van LightR-enzymen wordt bepaald door hun vermogen om de biologische functie van hun endogene tegenhangers na te bootsen. Als zodanig is het van cruciaal belang om hun substraatspecificiteit, stroomafwaartse signalering en subcellulaire lokalisatie te beoordelen. De specificiteit van de activiteit van LightR-Src wordt bevestigd door de fosforylering van Src-substraten, waaronder paxilline en p130Cas^22,23. FastLightR-Src pendelt tussen het perinucleaire gebied en focale verklevingen onder cyclische verlichting, wat resulteert in celverspreiding. Een dergelijk fenomeen lijkt met succes op eerdere waarnemingen met native Src-kinase en bevestigt verder de effectiviteit van het huidige instrument bij het verkennen van Src-biologie 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf vertoont ook specificiteit bij het richten op signaalcomplexen zoals MEK- en ERK-kinasen^24,25. Bovendien vertoont FastLightR-bRaf cyclische oscillaties van de ERK-nucleaire shuttle als reactie op blauw licht, wat een bekend gevolg is van bRaf-activering²⁸. Het vermogen van LightR-enzymen om de functies van endogene eiwitten nauwkeurig na te bootsen, biedt een hulpmiddel van onschatbare waarde voor het ondervragen van hun functie.

De bovenstaande bespreking toont het vermogen van LightR-kinasen om nauwkeurige cellulaire signaalroutes te repliceren binnen gedefinieerde cellulaire compartimenten. In lijn met zo'n succes met kinasen, dient LightR-Cre als een illustratief model dat de functionaliteit demonstreert van de originele Cre-recombinase afgeleid van de P1-bacteriofaag. De Cre-recombinase behoort tot de integrasefamilie van plaatsspecifieke recombinasen en werkt door recombinatie tussen twee herkenningsplaatsen, loxP genaamd, op doel-DNA te vergemakkelijken. Een dergelijke recombinatie resulteert in DNA-herschikking door middel van een crossover-gebeurtenis. Op basis van de directionele oriëntatie van de loxP-site op het doel-DNA, kan de crossover-gebeurtenis leiden tot deletie, duplicatie of translocatie van chromosomale elementen⁴⁸. Cre-recombinase is op grote schaal gebruikt voor het genereren van in vivo modellen van induceerbare genregulatie^49,50. Andere spontane, chemisch induceerbare of optogenetisch induceerbare cre-recombinasesystemen bieden echter beperkte controle over wanneer en waar DNA-recombinatie wordt geïnduceerd in het diermodel. LightR-Cre overwint deze beperkingen door een strakke temporele en ruimtelijke controle van DNA-recombinatie mogelijk te maken. Bovendien stelt de afstembaarheid van LightR ons in staat om ongewenste lekkende activiteit te elimineren en de regulering van Cre met hoge precisie te garanderen. Deze mogelijkheden openen nieuwe mogelijkheden voor het modelleren van ziektepathologie en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

De precieze regulatie van LightR in kinasen en DNA-recombinase levert verder bewijs dat dit hulpmiddel kan worden toegepast op verschillende eiwitten met dezelfde strategie. Naast het activeren van verschillende enzymklassen, kan LightR mogelijk worden gehecht aan andere eiwittypen, waar de allosterische modulatie kan worden gebruikt om eiwitten te lokaliseren in specifieke subcellulaire regio's, eiwit-eiwitinteracties te induceren, blauw-licht induceerbare biosensoren te ontwikkelen en meer. Vanwege de allosterische voordelen van specifieke domeintargeting, kunnen LightR's ook worden gecombineerd met andere chemogenetische en optogenetische benaderingen in hetzelfde eiwit om een hogere mate van afstembaarheid te bereiken om biologische processen te bestuderen.

We hebben LightR met succes toegepast op meerdere andere eiwitten (manuscripten in voorbereiding). Ondanks dit succes kan de ontwikkeling van een functioneel LightR-eiwit voor potentiële uitdagingen komen te staan, met name bij het selecteren van een geschikte invoegplaats en het nauwkeurig nabootsen van de biologische functie van het doeleiwit. Wanneer de kristalstructuur niet beschikbaar is, moeten onderzoekers vertrouwen op voorspelde structuren of informatie over aminozuursequenties, waardoor meer probleemoplossing nodig is om eiwitten met meerdere invoegplaatsen of aminozuursubstituties te engineeren. Bovendien moet de gemanipuleerde eiwitactiviteit nauwkeurig worden afgestemd om de biologische functie in de cel nauwkeurig na te bootsen. Het succes van deze experimenten hangt af van de precieze functionele nabootsing van het gemanipuleerde eiwit, met zijn endogene homoloog, die vaak rigoureuze probleemoplossing vereist en kan variëren op basis van celtype, doeleiwitklasse en type, evenals de sterkte en duur van activering van blauw licht.

Concluderend is het LightR-systeem een krachtig hulpmiddel voor het bereiken van nauwkeurige spatiotemporele controle over de eiwitfunctie. Zijn robuustheid, afstembaarheid en veelzijdigheid maken het van onschatbare waarde voor het bestuderen van complexe cellulaire processen, het ontrafelen van signaalroutes en het ophelderen van genregulatiemechanismen. Door onderzoekers ongekende controle te geven over de eiwitactiviteit, belooft het LightR-systeem ons begrip van fundamentele biologische processen te vergroten en de weg vrij te maken voor innovatieve therapeutische interventies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			Voor 500 mL: 5,18 g van  Tris-HCL, 131,5 mL glycerol, 52,5 mL van 20% SDS, 0,5 g bromofenolblauw, eind-pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscoop Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blauwe LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antilichaam	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antilichaam	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antilichaam	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antilichaam	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatible Voeding	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0,1 µm sterieel gefilterd
bRaf-V600E-Venus			Gift van Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membraandye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cellen	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzym	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin van bovien plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfectie Reagens	Promega	E2692	Transfectiereagens
Gel Green Nucleic Zuur Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel Extractie Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extractie Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cellen	ATCC	CRL-11268
HeLa Cellen	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relais voor verlichting
Kanamycin Monosulfaat	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light Systeem	HQRP	884667106091218	LED paneel lamp systeem
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software voor het uitvoeren van CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Beeldanalyse Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Spiegel	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca en Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ER