Methodenartikel

Single-molecule FRET-beeldvorming voor het observeren van de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine

DOI:

10.3791/67263

⸱

24 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De functies van dynamine-superfamilie-eiwitten zijn afhankelijk van conformationele veranderingen in combinatie met GTP-hydrolyse. Een systeem wordt beschreven met behulp van de single-molecule FRET (smFRET) -techniek om de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine in verschillende nucleotide-ladende toestanden te volgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rotatie van het stijve lichaam van het drie-helixe middendomein (3HB) ten opzichte van het GTPase-domein van dynamin-achtig eiwit atlastine (ATL) is een cruciale aanjager van homotypische membraanfusie binnen het endoplasmatisch reticulum (ER). Verstoringen in dit proces zijn in verband gebracht met erfelijke spastische dwarslaesie (HSP), een neurodegeneratieve aandoening. Structurele en biochemische studies suggereren dat de conformationele veranderingen in ATL verband houden met GTP-hydrolyse, maar real-time visualisatie van deze conformationele dynamiek tijdens de GTP-hydrolysecyclus blijft een uitdaging. Om de mechanische mechanismen achter de ATL-functie beter te begrijpen, werd Förster-resonantie-energieoverdracht (smFRET) met één molecuul gebruikt. Er werden drie specifieke strategieën gebruikt om het N-terminale cytosolische gebied van humaan ATL1 (ATL1cyto) te immobiliseren in een met streptavidine beklede microfluïdische kamer, waardoor de toepassing van intramoleculaire en intermoleculaire smFRET-beeldvorming wordt vergemakkelijkt. Dit maakte nauwkeurige monitoring van eiwitconformaties in verschillende nucleotide-ladende toestanden mogelijk, wat direct inzicht gaf in individueel moleculair gedrag. Deze methode kan ook worden toegepast om andere mechanochemische eiwitten te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In eukaryote cellen bemiddelen de eiwitten van de dynamine-superfamilie de hermodellering van biologische membranen, inclusief membraantubulatie, splijting en fusie 1,2,3. Mutaties in deze eiwitten leiden tot een verscheidenheid aan ziekten bij de mens, zoals neurodegeneratieve ziekten. De leden van de dynamine-superfamilie bevatten doorgaans een GTPase-domein, een middendomein dat bestaat uit spiraalvormige bundels, een motief voor membraanbinding en een GTPase-effectordomein (GED). Een van die dynamin-achtige GTPase is atlastine (ATL), dat homotypische membraanfusie van het endoplasmatisch reticulum (ER) katalyseert om een netwerk te vormen 4,5,6,7,8,9,10. Er zijn drie ATL's (ATL1-3) bij zoogdieren. Het ATL-molecuul bestaat uit een N-terminaal cytosolisch gebied (ATL-cyto), inclusief een GTPase-domein en een drie-helicaal middendomein (3HB), gevolgd door twee transmembraangebieden, maar mist het typische GED. Als alternatief bevat ATL een C-terminale staart die een cruciale rol speelt bij membraanfusie 11,12,13.

Er is gemeld dat efficiënte membraanfusie berust op de GTP-hydrolyse-afhankelijke domeinherschikking inATL-cyto 14,15,16,17,18,19,20. Vergeleken met het SNARE-complex, dat vouwenergie van conformationele veranderingen gebruikt om heterotypische membraanfusie21 aan te drijven, blijft het homotypische membraanfusieproces gemedieerd door ATL en andere fusiespecifieke dynamin-achtige eiwitten22 echter ongrijpbaar. Drie kristalstructuren van humaanATL1-cyto zijn bepaald in verschillende nucleotide-laadomstandigheden14,15,16,23. In de structuren wijzen de twee 3HB's in het dimeer in verschillende richtingen, maar een uitgebreid model dat uitlegt hoe de conformationele dynamiek van ATLcyto en zijn GTPase-activiteit zijn gekoppeld, ontbreekt nog.

In het vorige model vormen de monomere ATL-moleculen dimeren over verschillende membranen op een GTP-afhankelijke manier om membraanfusie aan te drijven. Hier worden drie strategieën beschreven om Förster-resonantie-energieoverdracht (smFRET) met één molecuul toe te passen om het gedrag van individuele ATL1-cytomoleculen direct te observeren en nauwkeurigte detecteren. smFRET is een krachtige techniek die op grote schaal wordt gebruikt om conformationele dynamiek en interacties van individuele biomoleculen in realtime te onderzoeken, zoals GPCR-gemedieerde β-arrestine-activering24, chromatine-remodellering door Snf225 en domeinherschikkingen van dynamin-achtig eiwit MxA in combinatie met GTP-hydrolysecycli26. Aangezien smFRET alleen effectief veranderingen in afstand van ~3 nm tot ~8 nm kan detecteren, zijn zowel intermoleculaire als intramoleculaire smFRET-experimenten nodig om de conformaties vanATL1-cyto voor elke nucleotide-ladende toestand uitgebreid te analyseren. We genereerden drie constructen vanATL1-cyto, waarbij alle inheemse cysteïnen werden gesubstitueerd door alanines en K400 (ATL1cyto-K) of het T51/K400-paar (ATL1cyto-TK) gemuteerd naar cysteïne voor fluorofoorlabeling. De strategieën voor het immobiliseren van het ATL1-cytodimeer of monomeer in een met streptavidine beklede microfluïdische kamer (Figuur 1A) voor intermoleculaire of intramoleculaire smFRET-experimenten worden weergegeven in Figuur 1B-D. Deze methode geeft meer details over de conformationele dynamiek van dynamin-achtige eiwitten in elke stap van GTP-hydrolyse27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van gemodificeerd dekglaasje voor eiwitimmobilisatiekamer

  1. Voorbereiding
    1. Bereid 50 ml piranha-oplossing (samengesteld uit geconcentreerd zwavelzuur en waterstofperoxide in een verhouding van 3:1) door langzaam waterstofperoxide toe te voegen aan geconcentreerd zwavelzuur om te hoge temperaturen te voorkomen. Plaats het voorzichtig in een zuurkast.
    2. Bereid een natriumethoxideoplossing voor. Los 2 g NaOH op in 15 ml ddH2O, voeg 35 ml absolute ethanol toe en meng volledig. Laat op kamertemperatuur staan.
    3. Bereid een zoutrijke oplossing (0,1 M NaHCO3 en 0,6 M K2SO4). Los volledig op en aliquot 500 μL/buisje. Bewaren bij -20 °C.
    4. Aliquot SVA-mPEG en SVA-mPEG-biotine in ongeveer 30 mg per tube en 3 mg per tube. Bewaren bij -20 °C.
    5. Personaliseer microscoopglaasjes (75 mm × 26 mm × 1 mm) met 6 paar gaten met een diameter van 1,2 mm.
  2. Reiniging van het oppervlak van het dekglaasje
    1. Gebruik een pincet om acht dekglaasjes op te pakken en plaats ze in een kleurpotje. Voeg aceton (~50 ml) toe om de dekglaasjes te bedekken, plaats het kleurpotje 30 minuten in een ultrasone reiniger en spoel de dekglaasjes vervolgens drie keer af met ddH2O.
    2. Was de dekglaasjes met methanol zoals in stap 1.2.1.
    3. Voeg de piranha-oplossing (stap 1.1.1) toe aan het kleurpotje en verwarm het gedurende 2 uur in een waterkoker met een waterbad van 95 °C. Nadat het kleurpotje is afgekoeld tot kamertemperatuur, spoelt u de dekglaasjes minstens zesmaal af met ddH2O.
    4. Voeg de natriumethoxideoplossing toe aan de kleurpot, plaats deze 15 minuten in een ultrasone reiniger en spoel vervolgens drie keer af met ddH2O.
    5. Voeg ddH2O toe aan het kleurpotje om de dekglaasjes te bedekken, plaats 15 minuten in een ultrasone reiniger en spoel vervolgens 3 keer af met ddH2O.
  3. Aminosilanisatiemodificatie van het dekglaasje.
    1. Klem de dekglaasjes in het kleurpotje op een schoon bankje, droog ze af met stikstof en doe ze in een ander kleurpotje (vooraf gedroogd).
    2. Bak het kleurpotje 30 minuten in een droogoven op 120 °C en laat vervolgens in een exsiccator afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Voeg 47,5 ml methanol, 2,5 ml azijnzuur en 0,5 ml 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) toe aan het bekerglas (vooraf gedroogd), meng gelijkmatig, voeg toe aan de kleurpot en incubeer gedurende 10 min.
    4. Spoel de dekglaasjes in het kleurpotje minstens driemaal af met ddH2O en soniceer gedurende 5 min.
    5. Haal de dekglaasjes er één voor één uit, spoel ze af met ddH2O, föhn ze droog met stikstof en doe ze in een petrischaaltje van 10 cm om ze voor te bereiden op de PEG-modificatie.
      OPMERKING: APTES-modificatie moet worden uitgevoerd in een droge omgeving.
  4. Wijziging van het dekglaasoppervlak met SVA-mPEG-Biotine en SVA-mPEG
    OPMERKING: Biotinemodificatie van het dekglaasoppervlak helpt gebiotinyleerde eiwitten (of eiwitten die binden aan biotine-anti-His) via streptavidine vast te houden.
    1. Los de verpakte SVA-mPEG en SVA-mPEG-Biotine volledig op in de zoutrijke oplossing (1 mg overeenkomend met 10 μL zoutrijke oplossing). Voeg de SVA-mPEG-Biotine-oplossing toe aan de SVA-mPEG-oplossing in een verhouding van 1:100.
      OPMERKING: Gebruik een vortex om de oplossing te schudden om ervoor te zorgen dat SVA-mPEG of SVA-mPEG-Biotine volledig is opgelost. De waterige oplossing SVA-mPEG of SVA-mPEG-Biotine moet voor gebruik worden bereid.
    2. Laat de bereide mixoplossing op een dekglaasje vallen en bedek het met een ander dekglaasje. Dit proces moet het ontstaan van bubbels voorkomen. Incubeer dekglaasjes volledig met de juiste vochtigheid gedurende meer dan 2 uur of een nacht.
    3. Scheid de dekglaasjes nadat de modificatie is voltooid, spoel ze af met ddH2O en föhn ze droog met stikstof. Markeer het oppervlak van het dekglaasje dat niet is gemodificeerd met SVA-mPEG en SVA-mPEG-biotine.
    4. Plaats het gemodificeerde dekglaasje voorzichtig in een microcentrifugebuisje van 50 ml. Na het stofzuigen bewaren bij -20 °C.
      LET OP: Het aangepaste dekglaasje kan 1 maand onder vacuüm bewaard worden.

2. Voorbereiding van microscoopglaasjes voor eiwitimmobilisatiekamer

  1. Was de objectglaasjes van de microscoop zoals beschreven voor dekglaasjes in stap 1.2.
  2. Blaas de microscoopglaasjes droog met stikstof en doe ze in microcentrifugebuisjes van 50 ml.
  3. Bewaar de objectglaasjes van de microscoop zoals beschreven in stap 1.4.4.

3. Eiwitexpressie en -zuivering

  1. Voorbereiding
    1. Plasmiden: Kloon atlastine familielid van belang of de pathogene mutatie van belang in een bacteriële expressievector, bijvoorbeeld pET-28a, en voeg een Avitag27 toe. Introduceer cysteïnen op relevante posities door plaatsgerichte mutagenese (bijvoorbeeld T51C en K400C27).
    2. Bereid de volgende buffers voor.
      1. Luria-Bertani (LB) kweekmedium: Meng 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride in 1 L ddH2O. Autoclaaf bij 121°C gedurende 20 min.
      2. Lysisbuffer: Meng 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1x complete EDTA-vrije proteaseremmercocktail, 10 mM imidazool en 0,5 mM TCEP. Bewaren bij 4 °C.
      3. Wasbuffer: Meng 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 30 mM imidazool en 0,5 mM Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP). Bewaren bij 4 °C.
      4. Elutbuffer: Meng 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 150 mM imidazool en 0,5 mM TCEP. Bewaren bij 4 °C.
      5. Zuiveringsbuffer: 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP. Bewaren bij 4 °C.
  2. Eiwit zuivering
    1. Breng de plasmiden27 over naar Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli-cellen met behulp van hitteschokmethoden voor bacteriële transformatie. Suspendeer de overgebrachte cellen in LB-kweekmedium met een eindconcentratie van 50 μg/μl kanamycine toegevoegd.
      1. Kweek bij 37 °C totdat de absorptie van het kweekmedium bij 600 nm 0,6-0,8 is. Voeg isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) toe in een eindconcentratie van 50 μM om de eiwitexpressie gedurende 20-24 uur bij 16 °C te induceren.
        OPMERKING: De groeisnelheid van bacteriële of andere microbiële celculturen kan worden gecontroleerd door de optische dichtheid (absorptie) van de celgroeicultuur bij 600 nm te meten.
    2. Oogst de cellen door centrifugatie bij 4000 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg.
    3. Resuspendeer de celpellet met 30 ml lysisbuffer. Verbreek de cellen drie keer met behulp van een hogedruk celbreker.
    4. Klar de lysaten door centrifugeren bij 2,00,000 g × g gedurende 1 uur bij 4 °C met behulp van een ultracentrifugerotor.
    5. Isoleer het eiwit met behulp van een Ni-NTA-kolom. Was de Ni-NTA-kolom met wasbuffer voor volumes van 5 kolommen. Elute eiwit met elutiebuffer voor 1 kolomvolume. Verzamel het eluaat en concentraat met behulp van centrifugaalfilters tot ~ 500 μL.
    6. Zuiver het eiwit verder door chromatografie met uitsluiting van grootte27. Vang het eluaat op (500 μL per buisje).
    7. Bevestig het doeleiwit aan de hand van het molecuulgewicht bepaald door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)27. Verzamel het doeleiwit voor verdere modificatie.

4. Biotinylering van eiwitten

  1. Voorbereiding
    1. Bereid de volgende voorraadoplossingen voor.
      1. Los magnesiumacetaattetrahydraat (MgOAc·4H2O) op in 25 mM HEPES-buffer (pH 7,7) in een concentratie van 100 mM (10×). Eet 100 μL per tube en bewaar bij -20 °C.
      2. Los adenosine-5-trifosfaatdinatriumzout (ATP) op in ddH2O in een concentratie van 100 mM (10×). Pas de pH aan op 7,4 met behulp van NaOH. Eet 100 μL per tube en bewaar bij -80 °C.
      3. Los d-biotine op in ddH2O bij een concentratie van 500 μM. Aliquot 100 μL per buisje en bewaar bij -20 °C.
      4. Los streptavidine op in ddH2O in een concentratie van 1 mg/ml. Eet 20 μL per tube en bewaar bij -20 °C.
    2. Eiwitbiotinyleringsbuffer: Voeg 25 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM L-glutaminezuurkalium en 0,5 mM TCEP toe. Bewaren bij 4 °C.
    3. BirA biotineligase zuiveren en bewaren bij -80 °C.
  2. Biotinylering van eiwitten
    1. Verander de eiwitbuffer in de eiwitbiotinyleringsbuffer. Meng voor biotinylering 100 μl 100 mM ATP, 100 μl 100 mM MgOAc, 100 μl 500 μM d-biotine, 10 μl 100 μM BirA biotineligase, 50 μM eiwit tot een eindvolume van 1 ml en incubeer een nacht bij 4 °C.
    2. Verwijder de vrije d-biotine met behulp van een 10 K MWCO centrifugaalfilter.
    3. Incubeer 20 μL gebiotinyleerd eiwit met 20 μL 15 μM streptavidin gedurende 20 minuten op ijs. Detecteer de efficiëntie van eiwitbiotinylering door SDS-PAGE27.

5. Etikettering van eiwitfluorofoor

  1. Voorbereiding
    1. Los fluoroforen LD555 (donor) en LD655 (acceptor) op in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een eindconcentratie van 5 mM. Bewaren bij -20 °C.
    2. Bereid de etiketteringsbuffer voor: Meng 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl en 5 mM MgCl2. Bewaren bij 4 °C.
    3. Verander de eiwitbuffer in de etiketteerbuffer.
  2. Fluorofoor etikettering
    1. Meng voor intramoleculaire smFRET-assays ATL1cyto-TK met LD555 en LD655 in een verhouding van 1:1,2:1,2 tot een eindvolume van 100 μl (het totale volume fluoroforen mag niet groter zijn dan 1 μl) en incubeer gedurende 5 uur bij 4 °C.
    2. Voor intermoleculaire smFRET-experimenten wordt ATL1cyto-K of ATL1cyto-T geïncubeerd met LD555 in een verhouding van 1:1,2 en tegelijkertijd gebiotinyleerd ATL1cyto-K met LD655 in een verhouding van 1:1,2 gedurende 5 uur bij 4 °C (hetzelfde incubatievolume als in 5.2.1).
      OPMERKING: Co-incubatie van eiwitten en kleurstoffen zorgt voor flexibiliteit in etiketteringsposities voor LD555 (donor) en LD655 (acceptor). Het feit dat LD555 is gelabeld met T51C of K400C heeft geen invloed op de resultaten van het FRET-experiment. Er wordt een schematisch diagram verstrekt van de donor die op de T51C-locatie wordt geëtiketteerd (Figuur 1C,D).
    3. Verwijder overtollige vrije fluoroforen met behulp van 7 K MWCO spin-ontziltingskolommen27.
    4. Voeg TCEP toe aan fluorofoor-gelabelde eiwitten in een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM.
    5. Detecteer de labelingsefficiëntie van eiwitten met behulp van een spectrofotometer. Meet de eiwitabsorptie bij 280 nm, de LD555-absorptie bij 555 nm en de LD555-absorptie bij 655 nm en bereken de molaire concentraties met behulp van respectievelijk hun extinctiecoëfficiënten. Efficiëntie van eiwitetikettering = (molaire concentratie van fluorescerende kleurstof/molaire concentratie van eiwit) x 100%.

6. FRET-beeldvorming met één molecuul

  1. Voorbereiding
    1. Bereid de incubatiebuffer voor: Meng 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl en 5 mM MgCl2. Bewaren bij 4 °C.
    2. Bereid 1 mg/ml streptavidine (opgelost in ddH2O) en 1 mg/ml gebiotinyleerd anti-His antilichaam voor immobilisatie van eiwitten.
    3. Bereid 25 mM benzoëzuur (pH 7,4; opgelost in de buffer zoals beschreven in 7.1.1) en 100 mM protocatechuaat 3,4-dioxygenase (PCD) (opgelost in 40% glycerineoplossing) om fotobleken tijdens de smFRET-experimenten tot een minimum te beperken.
    4. Bereid 100 mM Guanosine 5'-difosfaat natriumzout (GDP), Guanosine 5'-O-[gamma-thio]trifosfaat (GTPγS) en AlCl3 stamoplossingen opgelost in ddH2O. Bereid 1 M NaF stamoplossing opgelost in ddH2O.
    5. Haal het vacuümgeconserveerde dekglaasje en het microscoopglaasje eruit en plak ze voorzichtig aan elkaar met op maat gemaakte dubbelzijdige tape op een schone bank. Installeer slangen en tips om een microfluïdische kamer te vormen met zes kanalen27.
      NOTITIE: Stel het gewijzigde dekglaasje niet gedurende langere tijd bloot aan lucht. Bereid de microfluïdische kamer27 voor voordat u met de smFRET-experimenten begint.
  2. Correctie in kaart brengen
    OPMERKING: Tijdens het experiment moeten fluorescentiesignalen worden verzameld van respectievelijk de donor- en acceptorkanalen. Door het gebruik van microscopen kunnen er kleine afwijkingen optreden in de meetvelden van de donor- en acceptorkanalen. Om de afwijking in de bewakingsvelden te verminderen, moet de mappingkalibratie worden uitgevoerd voordat het experiment wordt gestart.
    1. Meng 10% polystyreendeeltjes (diameter 3 μm) grondig, voeg 10 μL deeltjes toe aan een microscoopglaasje (niet gewijzigd) en dek af met een dekglaasje (niet gewijzigd).
    2. Selecteer een gezichtsveld met zoveel mogelijk piepschuimdeeltjes. Leg een video vast onder een helder veld met behulp van TIRF-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence).
      OPMERKING: Een olie-immersieobjectief met een hoge numerieke apertuur (100x) werd gebruikt voor beeldvorming met hoge resolutie. Voor smFRET-experimenten werden signalen vastgelegd met frame-intervallen van 30 ms met behulp van een EMCCD-camera.
    3. Gebruik een aangepast script om de middenlocatie van hetzelfde polystyreendeeltje in het donorkanaal en het acceptorkanaal uit te lijnen en sla het kaartbestand op als een txt-bestand. De aangepaste MATLAB-code die in dit onderzoek is gebruikt, is beschikbaar op https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Immobilisatie van de eiwitten in de kamer
    1. Meng voor intermoleculaire smFRET-experimenten LD555-gelabeld ATL1cyto-K of ATL1cyto-T en LD655-gelabeld ATL1cyto-K-biotine in een verhouding van 1:1 met een eindconcentratie van 1 mM GTPγS of GDP/AlF4-, en incubeer gedurende 1 uur op ijs om het eiwit te dimeriseren.
    2. Meng voor ATL1cyto-T en ATL1cyto-K intermoleculaire smFRET-experimenten LD555-gelabeld ATL1cyto-T en LD655-gelabeld ATL1cyto-K-biotine in een verhouding van 1:1 met een eindconcentratie van 1 mM GTPγS of GDP/AlF4-, en incubeer gedurende 1 uur op ijs om gedimeriseerde eiwitten te verkrijgen.
    3. Voor intramoleculaire smFRET-assays incubereert LD555 en LD655-gelabeld ATL1cyto-TK met 1 mM BBP gedurende 1 uur op ijs voordat u de smFRET-experimenten onder GDP-omstandigheden uitvoert.
    4. Voor intermoleculaire smFRET-experimenten incubeer 10 μg/ml streptavidine (verdund met 200 μL incubatiebuffer) gedurende 10 minuten om eiwitten te immobiliseren. Voeg voor intramoleculaire smFRET-testen 10 μg/ml gebiotinyleerd anti-His antilichaam toe (verdund met 200 μL incubatiebuffer) en incubeer gedurende 10 minuten om eiwitten te immobiliseren. Spoel het kanaal eenmaal door met een incubatiebuffer voordat u elke oplossing toevoegt.
    5. Verdun ATL1-dimeer tot ~0,3 nM of monomeer tot ~1 nM in een incubatiebuffer van 200 μL en incubeer gedurende 10 minuten om eiwitten in het kanaal te immobiliseren. Spoel het kanaal twee keer met incubatiebuffer. Voeg benzoëzuur en PCD toe aan het kanaal in een eindconcentratie van 2,5 mM (verdund met 200 μL buffer).
      OPMERKING: Om de verschillende stadia van ATL1-cytomoleculen in het GTP-hydrolyseproces te simuleren, werd nucleotide (GDP, GTPγS en GDP/AlF4-) in een eindconcentratie van 1 mM toegevoegd aan de buffers in elke stap na immobilisatie van het eiwit in het kanaal. GTPγS-toevoeging bootst GTP-binding na, GDP/AlF 4-toevoeging bootst GTP-hydrolyse na, GDP-toevoeging bootst Pi-afgifte na en aposate vertegenwoordigt GDP-vrijgave.
  4. smFRET-beeldvorming
    1. Pas het brandpuntsvlak aan. Gebruik de grove en fijne scherpstelknoppen, pas het brandpuntsvlak aan om de sample scherp in beeld te brengen. Hier werd een geautomatiseerd focussysteem gebruikt om de optimale focus te bereiken.
    2. Stel de excitatiebron in. Gebruik de 532 nm laser als excitatielichtbron. Stel het laservermogen in op een geschikt niveau om de fluoroforen te prikkelen. Hier werd een laservermogen van 20-40 mW gebruikt.
    3. Sluit de EMCCD-camera aan op de microscoop. Stel de camera in om op te nemen met een frame-interval van 30 ms. Zorg ervoor dat de camera is ingesteld om foto's te maken in de 16-bits modus voor gegevens met een hoge resolutie.
    4. Neem de film op en zorg ervoor dat de focus tijdens de acquisitie stabiel blijft. Verleng de 532nm laserbestralingstijd zo lang mogelijk totdat de meeste fluorescerende moleculen zijn gedoofd bij het opnemen van de fluorescentiesignalen.
    5. Sla de opgenomen films op in 16-bits TIFF-formaat voor verdere analyse.

7. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Laad het map txt-bestand voor correctie voordat u de FRET-trajecten uit de opgenomen films extraheert. Selecteer de FRET-trajecten en sla alle FRET-trajectgegevens op in txt-formaat voor verdere analyse.
  2. Extraheer de gegevens uit de txt-bestanden en bereken de FRET-waarden met behulp van zelfgemaakte scripts in Matlab2022a. De aangepaste MATLAB-code is verkrijgbaar bij https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    OPMERKING: De FRET-waarde wordt berekend met behulp van de vergelijking ILD655/(γILD555+ILD655). ILD555 en ILD655 vertegenwoordigen respectievelijk de LD555 en LD655 fluorescentie-intensiteiten. γ is een parameter die wordt verkregen door de formule γ = FA/FD. FA staat voor de afname van de acceptorintensiteit en FD is de toename van de donorintensiteit.
  3. Pas de smFRET-gegevens van GaussAmp in Origin 2022 aan om het distributiehistogram te verkrijgen.
    OPMERKING: Voor gegevens met meerdere FRET-toestanden (de gegevens onder GTPγS-conditie in intermoleculaire smFRET of de gegevens van intramoleculaire smFRET onder GDP- of Apo-conditie) kan multi-peak fitting worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De smFRET-experimenten werden uitgevoerd op een TIRF-microscoop door elke 30 ms de fluorescentie-intensiteit van fluoroforen vast te leggen. Representatieve beelden van LD555 (donor) en/of LD655 (acceptor)-gelabelde ATL1cytomoleculen in afwezigheid of aanwezigheid van verschillende nucleotiden worden getoond in figuur 2A-C. De fluorescentie-intensiteiten van de twee fluoroforen op individuele deeltjes werden gereg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET-technologie is gebaseerd op energieoverdracht tussen twee fluorescerende kleurstoffen (donor en acceptor). In het geval dat ze dicht bij elkaar liggen (meestal 1-10 nm), draagt de geëxciteerde donor zijn energie over aan de acceptor, wat resulteert in een afname van de donorfluorescentie-intensiteit en een toename van de acceptorfluorescentie-intensiteit.

In smFRET-experimenten worden de moleculen verdund tot zeer lage concentraties en geïmmobiliseerd op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32371287), de Fundamental Research Funds for the Central Universities (63223043 en 63233053) en het Talent Training Project van Nankai University (035-BB042112). Y.L. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (12022409 en T2221001) en het CAS Key Research Program of Frontier Sciences (ZDBS-LY-SLH015). L.M. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32271274 en 31770812).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilaan (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-trifosfaat dinatriumzout (ATP)Roche11140965001
BenzoëzuurSigma-Aldrich242381
Biotine-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Gebiotinileerd anti His-antilichaamBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotineSigma-AldrichB4501
EDTA-vrije proteaseremmercocktailRoche11873580001
EMCCD-cameraAndorIX897
Guanosine 5'-difosfaat natriumzout (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]trifosfaat (GTP'S)Roche10220647001
Olie-immersieobjectief met hoge numerieke apertuurNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oliejmersie
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-β-D-thiogalactosidSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutaminezuurkaliumSigma-AldrichG1501
MagnesiumacetaattetrahydraatSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
MicroscoopdekglasFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
MicroscoopglaasjesAangepast, (75 mm × 26 mm × 1 mm) met 6 paren doorgaande gaten met een diameter van 1,2 mm
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyreen-deeltjesQDSphereAG1265
Protocatechuaat 3,4-dioxygeenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidineSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF-microscoopNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP)Thermo75259

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568(2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744(2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746(2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Atlastine GTPaseGTP hydrolyseeiwitimmobilisatieintramoleculaire FRETintermoleculaire FRETfusie van het endoplasmatisch reticulumtotale interne reflectieEMCCD camera

Gerelateerde artikelen