Methodenartikel

Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

DOI:

10.3791/67264

⸱

27 september 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een methode voor het induceren van mesenteriale ischemie-reperfusieschade en het visualiseren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in mesenteriale venulen met behulp van intravitale microscopie. De bloedstroom in de superieure mesenteriale slagader werd gedurende 1 uur beperkt, gevolgd door reperfusie, waardoor directe kwantificering van leukocytenadhesie en NETosis mogelijk was.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intestinale ischemie-reperfusie (I/R) beschadiging is een acute aandoening die wordt gekenmerkt door weefselbeschadiging als gevolg van beperkte bloedtoevoer naar de mesenteriale vaten, wat leidt tot zowel lokale als systemische pathologieën met een slechte prognose. Zowel ischemie als reperfusie veroorzaken een reeks cellulaire en moleculaire reacties, waarbij ontstekingscellen dienen als belangrijke regulatoren van de pathologie. Deze interacties met het ischemische endotheel worden gemedieerd door meerdere adhesiereceptoren. Er zijn verschillende diermodellen opgesteld om deze pathologie na te bootsen en de betrokken moleculaire routes te onderzoeken. In deze studie wordt een microchirurgisch model van I/R-letsel gecombineerd met intravitale microscopie om leukocytenrollen, adhesie en vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET) te visualiseren. Dit model wordt toegepast op transgene muizen met een tekort aan endotheliale PAR1 (F2r) om de impact van PAR1 op leukocytenrollen en NET-vorming te beoordelen 1 uur na ischemie en onmiddellijk na reperfusie. In vivo werd Acridine Orange leukocytenkleuring toegepast en werden NET's gevisualiseerd met behulp van een nucleïnezuurkleuring. Interessant is dat verminderde leukocytenadhesie en NET-vorming werden waargenomen bij muizen zonder de endotheliale PAR1-receptor. Dit model maakt de in vivo analyse mogelijk van de belangrijkste regulatoren die betrokken zijn bij I/R-letsel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acute mesenteriale ischemie (AMI) is een zeldzame pathologie1 met een hoog sterfterisico2, gekenmerkt door een verminderde bloedstroom in het mesenterium als gevolg van trombi in de coeliakie-as, of de superieure of inferieure mesenteriale slagader. In 60%-70% van de gevallen zijn acute occlusies van de superieure mesenteriale slagader als gevolg van trombose of embolisatie verantwoordelijk voor acute darmischemie3. Daarentegen is mesenteriale veneuze trombose in 5-15% van de gevallen verantwoordelijk voor mesenteriale ischemie waarbij de superieure mesenteriale ader en, zeldzamer, de inferieure mesenteriale ader betrokken zijn4. De hypoxie en ondervoeding als gevolg van ischemie leiden tot stoornissen in het energiemetabolisme op cellulair niveau5. Een verminderde mitochondriale functie activeert bijvoorbeeld meerdere signaalroutes, waardoor cellulaire doodsmechanismen worden geïnitieerd6. Hoewel snelle reperfusie het herstel van het aërobe metabolisme mogelijk maakt, veroorzaakt het herstel van de bloedtoevoer naar een ischemisch gebied vaak uitgebreide weefselbeschadiging als gevolg van de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS)7, calciumoverbelasting8, endotheeldisfunctie9 en ontstekingsreacties10.

Er zijn veel experimentele diermodellen opgesteld die gebruik maken van tijdelijke vasculaire occlusie van de superieure mesenteriale slagader om de moleculaire mechanismen tijdens ischemie-reperfusie (I/R) letsel op tehelderen 11. Het gebruik van dergelijke modellen in combinatie met intravitale microscopie (IVM) is van fundamenteel belang voor het verkrijgen van inzicht in de onderliggende cellulaire interacties en ziekteprogressie11. Disfunctie van de darmbarrière wordt kort na ischemiewaargenomen 12, waarbij het epitheel zijn integriteit verliest13, wat resulteert in bacteriële translocatie naar extra-intestinale plaatsen zoals de mesenteriale lymfeklieren, milt, lever en nier12,14. Reperfusie verergert de slijmvliesbeschadiging verder15. Een ontstekingsreactie in de arteriolen manifesteert zich door de rollende en stevige hechting van leukocyten op de endotheelcellaag, die afhankelijk is van moleculen zoals L-selectine16, P-selectine (CD62P)17, bloedplaatjes GPIIb/IIIa en fibrinogeen18. Interessant is dat de hechting van leukocyten aan mesenteriale venulen wordt beïnvloed door de aanwezigheid van darmmicrobiota19 en Toll-like receptor 4-signalering10. I/R-letsel veroorzaakt ook de vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET)10. Therapeutische targeting van het extracellulaire DNA, afkomstig van geactiveerde leukocyten zoals neutrofielen, verbetert de uitkomst van intestinale I/R-beschadiging20. In de lever wordt I/R-beschadiging ontstoken door residente microfagen21, en microRNA-remming verzwakt met name apoptose22. Merk op dat I/R-letsel in het mesenterium resulteert in darmdysbiose, die omkeerbaar is en verdwijnt na revascularisatie23.

Het endotheel wordt ook beïnvloed door de schadelijke effecten van I/R-letsel, waarbij ROS een cruciale rol speelt in het proces24. Hechting van leukocyten aan de endotheelcellaag, endotheelbeschadiging en veranderingen van het stikstofmonoxide (NO)-metabolisme worden waargenomen9. De betrokken moleculaire routes zijn echter nog niet volledig onderzocht.

Protease-geactiveerde receptor 1 (PAR1, F2r), is een membraanreceptor die tot expressie wordt gebracht door een verscheidenheid aan cellen, waaronder endotheelcellen, en wordt geactiveerd tijdens ontstekingsaandoeningen25. De activering vindt plaats wanneer serineproteasen de receptor splitsen aan het N-eindpunt, waardoor de gebonden ligand wordt blootgelegd die op zijn beurt de receptor activeert door zich te binden aan de tweede extracellulaire lus van het molecuul26. De endotheliale proteïne C-receptor (EPCR)-PAR1-signaleringsroute beïnvloedt de endotheliale NO-homeostase en vergemakkelijkt het herstel van de bloedstroom bij perifere ischemie27.

In deze studie werd I/R-letsel toegepast op een genetisch muismodel dat werd gekenmerkt door endotheelcelspecifieke PAR1-deficiëntie om leukocytenrollen, adhesie en NET-vorming te visualiseren. De combinatie van een genetisch muismodel en intravitale microscopie na I/R-microchirurgie levert waardevolle inzichten op door de specifieke celtypen die betrokken zijn bij de ziekteprogressie te benadrukken. Het toepassen van I/R-letsel op genetische muismodellen is essentieel bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen die kunnen worden gebruikt om het verloop van de ziekte te verbeteren. Bovendien werd het belang van endotheliale PAR1 bij NETosis aangetoond.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij muizen betrokken waren, werden goedgekeurd door het lokale comité voor de wetgeving van dieren (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Duitsland; G21-1-041). 6-8 weken oude mannelijke en vrouwelijke B6. FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc-muizen werden gebruikt voor de studie. De endotheelcelspecifieke regulatie van F2r (PAR1) vindt plaats via de VE-Cadherin Cre-promotor28. In deze studie vertoonde flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2R ΔEC) verminderde F2r (PAR1)-expressie op endotheelcellen, en flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) brengen normale endotheliale F2r (PAR1)-niveaus tot expressie. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding op de operatie

  1. Steriliseer de nodige chirurgische instrumenten (extra smalle schaar recht, tang, vaatklem, enz.).
  2. Bereid het anesthesiesysteem op basis van zuurstof en isofluraan voor met een neuskegel en een verwarmingsplaat.

2. Voorbereiding van dieren

  1. Weeg het dier.
  2. Anesthesie uitvoeren: Verdoof muizen via intraperitoneale (i.p.) injectie van een oplossing die midazolam (5 mg/kg), medetomidine (0,5 mg/ml) en fentanyl (0,5 mg/kg) bevat (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  3. Verwijder haar uit de nek en buik operatiegebied met een elektrisch scheerapparaat voor kleine dieren.
  4. Plaats de muis in dorsale lighouding op het verwarmingskussen en sluit hem via een neuskegel aan op het zuurstofsysteem. Bevestig de ledematen van de muis aan een verwarmd kussen met chirurgische tape. Zorg ervoor dat het latex neuskegelmembraan stevig over het hoofd van de muis past. Houd de lichaamstemperatuur van het dier rectaal in de gaten met behulp van een knaagdierspecifieke thermometer.
  5. Breng ontharingscrème aan om eventueel achtergebleven haar uit het operatiegebied van de nek te verwijderen en veeg de huid van het operatiegebied af met 70% ethanol.
  6. Voer een teenknijptest (pedaalreflex) uit om er zeker van te zijn dat het dier volledig verdoofd is.

3. Chirurgische ingreep

  1. Katheterimplantatie in de halsader
    1. Maak een transversale incisie (~0,5 cm) over de luchtpijp, verwijder de huid die de nek bedekt en isoleer de rechter halsader.
    2. Gebruik een zijden draad van ongeveer 5 cm, sluit het distale uiteinde van de ader en fixeer deze met een chirurgische tang. Plaats drie zijden draden ongeveer 2 cm onder de ader: één dicht bij het distale uiteinde en twee dicht bij het proximale uiteinde van de halsader. Leg een chirurgische knoop, maar sluit het vat niet.
    3. Bereid een polyethyleenkatheter (0,28 mm ID, 0,61 mm OD) voor, gevuld met 0,9% NaCl en afgesloten met een spuit van 1 ml. Gebruik een schaar om een gat tussen de tweede en derde knoop te knippen en implanteer de katheter in de halsader. Zuig de spuit op om er zeker van te zijn dat er bloed in de katheter aanwezig is.
    4. Bevestig de katheter in de ader door de zijden draad vast te binden en ervoor te zorgen dat deze stevig vastzit. Gebruik medische tape om de spuit vast te zetten.
    5. Bereid Acridine orange: verdun 1:4 een 2 mg/ml stockoplossing met steriele zoutoplossing (0,5 mg/ml eindconcentratie) in een spuit van 1 ml. Houd de spuit in het donker en injecteer 50 μL in de muis.
    6. Bereid nucleïnezuurkleurstof: verdun 1:1000 a 5 mM stockoplossing met steriele zoutoplossing (5 μM eindconcentratie) in een spuit van 1 ml. Houd de spuit in het donker en injecteer 50 μL in de muis.
    7. Injecteer in vivo Acridine oranje (50 μg/μL, 50 μL per muis) via de halsaderkatheter om gekleurde leukocyten en een extracellulaire DNA-fluorescerende kleurstof te visualiseren, vergelijkbaar met kleurstof neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) (5 μM, 50 μL per muis). NET en leukocyten worden gelijktijdig in beeld gebracht.
  2. Mesenterisch I/R-letselmodel
    1. Desinfecteer de buikhuid met 70% ethanol.
    2. Voer een laparotomie van 3-5 cm uit langs de linea alba met behulp van een chirurgische schaar.
    3. Gebruik twee met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes, verwijder voorzichtig de darm en identificeer een locatie met minimale vetbedekking. Plaats dunne darmtakken op een zwart deeg om het achtergrondsignaal te verminderen.
    4. Verkrijg de video's vóór I/R (pre-ischemie).
    5. Maak een kompres vocht met NaCl en plaats de darm erin. Zorg ervoor dat de darm tijdens stap 5.6 wordt omgeven door het kompres en vocht vasthoudt.
    6. Sluit de superieure mesenteriale slagader af met een kleine vasculaire klem.
    7. Duw de darm voorzichtig terug in de buikholte met behulp van met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes en gebruik een 7-0 hechting om de buikwand te sluiten om verlies van vocht en temperatuur te voorkomen. Houd ischemie 60 minuten vol en controleer de anesthesie ten minste elke 20 minuten.
    8. Start na 1 uur de reperfusie door de klem te verwijderen.
      OPMERKING: Een goede uitvoering van de ischemieprocedure resulteert in een zichtbare verandering. In eerste instantie zal het getroffen gebied bleek of wit lijken vanwege het gebrek aan bloedstroom. Na verwijdering van de klem zal de bloedstroom geleidelijk terugkeren naar het ischemische gebied, dat zijn normale kleur terugkrijgt, wat een succesvolle occlusie betekent. Het is absoluut noodzakelijk om de muis tijdens het ischemiestadium continu nauwlettend te observeren.
    9. Breng na de ischemische periode een paar druppels zoutoplossing aan op het geknipte gebied en verwijder vervolgens voorzichtig de microvasculaire clips met behulp van een clip-applier.
    10. Verwijder met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes de darm voorzichtig weer, plaats de kleine vertakkingen van de ader op een zwart deeg, injecteer opnieuw 50 μL Acridine-sinaasappel en leg de video's van dezelfde ader op dezelfde locatie vast (post-ischemie).

4. Intravitale high-speed video-epifluorescentiemicroscopie

  1. Visualiseer leukocyten en NET met een snelle groothoekfluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een langeafstandscondensor, een monochromator, een 10x wateronderdompelingsobjectief en een camera met gekoppelde lading. De beeldacquisitie werd uitgevoerd met een belichtingstijd van 30 ms en Alexa Fluor 488 (495/519) en Rhodamine Red (570/590) filters.
  2. Gebruik beeldvormingssoftware voor het verzamelen en analyseren van afbeeldingen.
  3. Kwantificeer de rekrutering van cellen binnen een interessegebied van 0,06 mm².
  4. Kwantificeer adherente leukocyten als cellen die gedurende een observatieperiode van 20 s stil blijven of aan de endotheelbekleding vastzitten.
  5. Identificeer NET als extracellulaire structuren die zijn gelabeld met zowel leukocyten als extracellulaire nucleïnezuur fluorescerende kleurstoffen.
  6. Euthanaseer dieren door cervicale dislocatie aan het einde van het experiment (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).

5. Isolatie van endotheelcellen (LEC) in de lever en kwantitatieve RT-PCR

  1. Isoleer LEC's via magnetische celsortering (MACS)29.
  2. Isoleer het totale RNA.
  3. Voer complementaire DNA (cDNA) synthese27 uit door 2 μg totaal RNA te mengen met 2 μL RT Buffer, 0,8 μL dNTP Mix, 2 μL RT Random Primers, 1 μL Reverse Transcriptase en 4,2 μL steriel gedestilleerd H2O.
  4. cDNA-transcriptie werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: 25 °C gedurende 10 min, 37 °C gedurende 120 min, 85 °C gedurende 5 min.
  5. Gebruik 20 ng cDNA voor qPCR.
  6. Gebruik de volgende primers: F2r (vooruit): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (achteruit): CCAGCAGGACGCTTTTTTT, L32 (vooruit): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (achteruit): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Gebruik de volgende omstandigheden: 95 °C 30 s, 45 cycli van (95 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 25 s), 60 °C tot 95 °C gedurende 6 s met ΔΤ 1 °C.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de endotheelcelafhankelijke effecten op de leukocytenrol en -adhesie en op de NET-vorming te bestuderen, werd in eerste instantie de werkzaamheid van de VE-Cadherin Cre-induceerbare F2r-deficiëntie in endotheelcellen onderzocht. Magnetische celsortering werd gebruikt om lever-endotheelcellen te isoleren. Vervolgens werd RNA geïsoleerd, gevolgd door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). De F2rΔEC-muizen , waarin de Cre-recombinase die tot expressie wordt gebracht onder controle van de VE-Cadherin-promotor afwezig is, vertoonden significant verlaagde F2r (PAR1) mRNA-niveaus (ongeveer met een derde) in vergelijking met WT-controles (Figuur 1).

Na bevestiging van de deficiëntie in de muislijn, werd mesenteriale I/R-beschadiging uitgevoerd om de impact van PAR1 tot expressie gebracht door vasculaire endotheelcellen op leukocytenrollen en adhesie te onderzoeken, gevisualiseerd door intravitale microscopie (Figuur 2A,B). Na 1 uur ischemie werd de klem verwijderd en liet men het vat opnieuw perfuseren. Leukocytenrollen en adhesie werden waargenomen en geregistreerd (groen gekleurd, aangegeven door witte pijlen). Hoewel beide groepen een verhoogd aantal adherente leukocyten vertoonden na I/R-beschadiging, resulteerde de deficiëntie van endotheliale F2r (PAR1) in een duidelijk maar niet significant verminderde leukocytenadhesie aan het I/R-geactiveerde mesenteriale endotheel, wat wijst op een actieve rol van endotheliale PAR1-activering bij de rekrutering van leukocyten naar de ischemische mesenteriale venulen (Figuur 2C).

Het volgende doel was om te onderzoeken of endotheliale PAR1-expressie de door I/R-letsel geïnduceerde NET-vorming reguleert. Daarom werden extracellulaire nucleïnezuren gekleurd met een celondoorlaatbare kleurstof30 en werden de gegenereerde NET's gevisualiseerd met behulp van intravitale microscopie (aangegeven met zwarte pijlen) (Figuur 2A,B). Na I/R-letsel werden NET's alleen waargenomen in de WT-groep die normale niveaus van PAR1 op de endotheelcellen tot expressie bracht, wat wijst op een regulerende rol van PAR1 bij NETosis (Figuur 2C,D). Met name wanneer endotheliale F2r-expressie werd onderdrukt, waren er geen NET's aanwezig in de I/R-beschadigde mesenteriale venulen.

figure-results-1
Figuur 1: F2r (PAR1) mRNA-expressie. F2r lever endotheelcelexpressie van WT (n = 6) en F2rΔEC (n = 9) muizen ten opzichte van het L32-huishoudgen . Gegevens worden gepresenteerd als een mediaan met een betrouwbaarheidsinterval van 95%. De Mann-Whitney-test werd gebruikt om twee onafhankelijke groepen te vergelijken, *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Endotheliale PAR1 beïnvloedt de adhesie van leukocyten en de vorming van NET in I/R-beschadigde mesenteriale venulen. Representatieve intravitale microscopiebeelden van aanhangende leukocyten gekleurd met Acridine oranje (witte pijlen) en NET's gekleurd met Sytox Orange (zwarte pijlen) van WT- en F2rΔEC-muizen voor (voor) en na (post) I/R-letsel (A) 10x en (B) 20x vergroting. Schaalbalken: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Leukocytenadhesie en (D) NET's per mm2 van WT (n = 7) en F2rΔEC (n = 4) muizen voor (voor) en na (post) I/R-letsel. Alle gegevens werden weergegeven als mediaan met een betrouwbaarheidsinterval van 95%. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de Two-way ANOVA-test, **p< 0,01, en de meervoudige vergelijkingstests van Sídák om de gemiddelden van verschillende genotypen op elk tijdstip (pre- en post-ischemie) te vergelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mesenteriale I/R-beschadiging in combinatie met intravitale microscopie werd toegepast op een genetisch muismodel van F2r (PAR1)-deficiëntie in endotheelcellen voor de in vivo analyse van leukocyten en NET na 1 uur ischemie. Het mesenteriale I/R-letselmodel wordt vaak gebruikt bij knaagdieren met zowel ischemie- als reperfusietijden variërend van minuten tot enkele uren23,31, wat de ontstekingsuitkomstbeïnvloedt 32 en mortaliteit33. Het model is ook afhankelijk van verschillende factoren, waaronder microbiota19,34, immuunreceptoren 10,35,36,37, geslacht38,39 enleeftijd 35. Afgezien van het variëren van I/R-tijden, is een andere variabele in dit model de differentiële respons van verschillende delen van de darm op letsel, waarbij de dunne darm grotere slijmvliesschade vertoont dan de dikke darm40. De positionering van de microvasculaire clip die het ischemische gebied beïnvloedt, is cruciaal voor de reproduceerbaarheid van de methode32,33. Belangrijk is dat superieure occlusie van de mesenteriale slagader in combinatie met onderbreking van de collaterale stroom sterftecijfers oplevert die consequent gerelateerd zijn aan de duur van ischemie41.

In deze studie werden muizen onderworpen aan 1 uur ischemie en in vivo leukocytenadhesie en NET-vorming werden onmiddellijk na reperfusie gevisualiseerd om de vroege ontstekingsreactie te onderzoeken die werd veroorzaakt door de ischemische toestand in afwezigheid van endotheliale F2r-expressie . Door deze methoden toe te passen op genetische muismodellen kan worden onderzocht hoe bepaalde doelmoleculen het cellulaire gedrag en de ontstekingsreactie beïnvloeden, zowel na ischemie als tijdens reperfusie.

Er zijn verschillende cruciale stappen in het protocol, waaronder het behoud van de darmintegriteit. Het hanteren van de darm moet voorzichtig gebeuren om weefselbeschadiging te voorkomen. Voor dit doel zijn vochtige wattenstaafjes het juiste hulpmiddel om de darm tijdelijk los te maken van de buikholte. Het is van cruciaal belang dat de darm vochtig blijft totdat deze in de buik wordt geplaatst. Kleine verwondingen bij het hanteren kunnen de activering van verschillende celtypen veroorzaken, zoals bloedplaatjes en endotheelcellen, wat de resultaten kan beïnvloeden.

Voor consistentie is het van cruciaal belang om dezelfde plaats van darmsegmenten voor en na ischemie te visualiseren. Dit kan een uitdaging zijn omdat de darm na ischemie in de buikholte wordt verplaatst. Om dit probleem aan te pakken, is een benadering om een klein stukje vochtig kompres te plaatsen op het deel van de darm dat vóór ischemie werd gevisualiseerd.

Om leukocytenrollen en adhesie en NET-vorming in vivo te visualiseren, werden muizen via de halsader geïnjecteerd met zowel een leukocyt als een nucleïnezuurfluorescentiekleurstof. De leukocytenkleurstof (zie Materiaaltabel) is een celdoorlatende metachromatische fluorescentiekleurstof die zich bindt aan witte bloedcellen maar niet aan rode bloedcellen en die veel wordt gebruikt voor het kleuren van leukocyten in vivo17,42. De kleurstof wordt intraveneus aangebracht en zorgt binnen enkele seconden voor sterke leukocytenkleuring. Specificiteit kan echter een beperking zijn, omdat het ook andere kerncellen, zoals endotheelcellen, kleurt. Desalniettemin houden bloedsomloopcellen de kleuring langer vast als gevolg van een uitwaseffect43. De nucleïnezuurfluorescentiekleurstof (zie Materiaaltabel) is een celondoorlaatbare nucleïnezuurkleuring die vaak wordt gebruikt om NET-vorming te visualiseren 30,44,45. Het kan ook intraveneus worden aangebracht, bindt met hoge affiniteit en is snel en gemakkelijk te gebruiken. Nogmaals, specificiteit is een nadeel, aangezien de kleurstof zich bindt aan elke cel met een niet-intact membraan. Idealiter zou het moeten worden gecombineerd met een neutrofielenmarker (bijv. CD15, CD11b) of een NETosis-marker (bijv. anti-citH3-antilichamen) om de specificiteit te verbeteren. Deze kleurstoffen maken in vivo beeldvorming van leukocyten in de mesenteriale venulen van proefdieren mogelijk.

De belangrijkste beperking van de techniek is de aanwezigheid van visceraal vet, dat de visualisatie van darmcapillairen beperkt en het verkrijgen van beelden sterk belemmert. Om deze complicatie te voorkomen, is het noodzakelijk om jonge proefdieren (6-8 weken oud) te gebruiken die een verminderde viscerale vetvorming hebben. Bovendien wordt ex vivo histologische analyse belemmerd door het gebruik van in vivo kleuring. Een andere beperking is de impact van de darmmicrobiota en het dieet op dit model, die sterk kan variëren tussen verschillende muizenhouderijen46. Om deze beperking aan te pakken, kan de studie van gnotobiotische muismodellen worden overwogen10.

In deze studie werd de onmiddellijke cellulaire respons na ischemie onderzocht en werd verminderde afzetting van leukocyten op het geactiveerde mesenteriale endotheel en NET-vorming in vivo waargenomen. NET-afbraak door intraveneuze toediening van DNase 1 uur na ischemie vermindert de vroege pro-inflammatoire respons en verbetert de verstoring van de darmbarrière47. Behandeling met trombomoduline, een transmembraanglycoproteïne dat de trombineactiviteit remt48, verbeterde de overleving van muizen met ernstig intestinaal I/R-letsel, waardoor de ontstekingsreactie van endotheeldisfunctie werd verzwakt en de intense histonaccumulatie in afgelegen organen werd verminderd49. Hier werd aangetoond dat de endotheliale trombinereceptor de I/R-uitkomst beïnvloedde, wat het belang benadrukt van het combineren van het intestinale I/R-letselmodel met intravitale microscopie bij genetisch gemanipuleerde muizen om belangrijke mediatoren van de ziektepathologie te onderzoeken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs onthullen geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.R. erkent financiering van het Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz en ReALity (project MORE), de BMBF Cluster4Future CurATime (project MicrobAIome; 03ZU1202CA), de Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) en het Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) Innovation Fund "Microbiome" (81X2210129). C.R. is wetenschapper bij het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK). C.R. is lid van het Center for Translational Vascular Biology (CTVB), het Research Center for Immunotherapy (FZI) en het Potentialbereich EXPOHEALTH aan de Johannes Gutenberg-Universiteit Mainz. C.R. is lid van de DFG Research Unit 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. ontving een Fellowship van het Gutenberg Research College aan de Johannes Gutenberg-Universiteit Mainz. K.K. wordt ondersteund door het DZHK "Promotion of Women Scientists" Excellence Programme en is lid van Young DZHK. Z.G en O.D. zijn promovendi aan de Mainz Research School of Translational Biomedicine (TransMed).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acridine orangeSigma-Aldrich  A-6014
96-well plate Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Anaesthesia Systems for RodentsGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
black doughStaedtlermodelleringsklei
CD146 Microbeads, mouseMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3software
charge-coupled device cameraHamamatsu PhotonicsORCA-R2camera
cotton swabsBöttger09-119-9100
Curved Hemostat 125mm/5"Indigo Instruments 22466
Depilatory creamBaleaniet van toepassing
Dorbene Vetzoetis
Dumont ForcepsFine Science Tools11251-35
Ethanol p.a. 99,5 %Roth5504.20
Extra Narrow Scissors – Straight/Sharp-Sharp/10.5FST14088-10
FentanylJanssen-Cilag GmBH
Forceps "Dumont #5" (Inox, tip 0.1mm, length 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10software
isoflurane Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Leukofix medical tapeBSNMedical0213600
Liver Dissociation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Separation columns MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 µmMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
Needle holderFST12001-13
Nonabsorbable Braided Silk Suture, Size: 7/0, 91 Meters Fine Science Tools18020-70
Olympus BX51WI fluorescence microscopeOlympusmicroscoop
PCR for Tube StripsSarstedt72985002.00
PCR Tube LidsSarstedt65989002.00
Plyethylene CatheterSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polypropylen 6-0, Nahtmaterial Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Reverse Transcription Kit (High Capacity cDNA)Applied Biosystems4368813.00
School scale KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Spring Scissors - Angled to SideFST15006-09
Stereo microscopeLeicaM50
Straight Hemostats 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Syringe 1 mLBraun9166017V
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Temperature Controller TC-1000FMI Föhr Medical Instruments GmbHniet van toepassing
Tissue Forceps - 1x2 TeethFST18057-14
vascular clampFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leukocytenadhesieendotheel PAR1kiemvrije muizenfluorescentiemicroscopieleukocytenrolling

Gerelateerde artikelen